JP2010046099A - 標的化された切断及び組換えの方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本明細書は、ゲノム配列の標的化された切断、ゲノム配列の標的化された変更、及びゲノム領域とそのゲノム領域と相同な外来性ポリヌクレオチドの間の標的化された組換えのための方法及び組成物を開示する。これらの組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及び操作されたジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質並びにこれをコードするポリヌクレオチドを含む。標的化された切断の方法は、このような融合タンパク質、又はこれをコードするポリヌクレオチドを細胞へ導入することを含む。標的化された組換えの方法は更に、ゲノム領域に相同な外来性ポリヌクレオチドを、開示された融合タンパク質を含む細胞へ導入することを含む。
【選択図】図3
Description
本出願は、2003年8月8日に出願された米国特許仮出願第60/493,931号;2003年11月7日に出願された米国特許仮出願第60/518,253号;2003年12月18日に出願された米国特許仮出願第60/530,541号;2004年2月5日に出願された米国特許仮出願第60/542,780号;2004年3月26日に出願された米国特許仮出願第60/556,831号;及び、2004年6月1日に出願された米国特許仮出願第60/575,919号の恩典を請求するものであり、これらの特許仮出願はそれらの全体が全ての目的のために本明細書に参照として組入れられている。
なし。
本開示は、ゲノム工学及び相同組換えの分野内である。
ゲノム生物学において興味深い大きい領域は、特に多くのゲノムの完全なヌクレオチド配列の決定を考慮した、ゲノム配列の標的化された変更である。単なる一例を提示すると、鎌状細胞貧血は、ヒトβ-グロビン遺伝子の1個のヌクレオチド対の変異により引き起こされる。従って安定した状態でこの変異体ヌクレオチド対の内在性ゲノムコピーを野生型配列へ転換し、正常なβ-グロビンを生じる能力は、鎌状細胞貧血の治癒をもたらすであろう。
従って、いずれかのゲノムにおける配列の標的化された変更のための組成物及び方法の必要性が存在し続ける。
本発明の開示は、所定の領域における細胞クロマチンの標的化された切断及び/又は細胞内の予め決定された所定の領域での相同組換えのための組成物及び方法を提供する。細胞は、培養細胞、生物の細胞、並びに細胞及び/又はそれらの後代が処置後生物に戻されるような場合に処置のために生物から取出された細胞を含む。細胞クロマチンの所定の領域は、例えば、ゲノム配列又はそれらの一部であることができる。組成物は、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン(例えば、新規特異性を有するジンクフィンガー結合ドメイン)及び切断ドメインを含む融合ポリペプチド、並びに操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含む融合ポリペプチドを含む。切断ドメイン及び切断ハーフ-ドメインは、例えば様々な制限エンドヌクレアーゼ及び/又はホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。
(i)第一のヌクレオチド配列を含む第一のポリヌクレオチド;
(ii)第一の融合タンパク質をコードしている第二のポリヌクレオチドであり、第一の融合タンパク質は第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含むもの;及び、
(iii)第二の融合タンパク質をコードしている第三のポリヌクレオチドであり、第二の融合タンパク質は第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含むもの;と接触させる工程を含み、
ここで第一及び第二の融合タンパク質が発現され、第一の融合タンパク質は第二の配列に結合し、及び第二の融合タンパク質は第三の配列に結合し、これにより細胞クロマチンが所定の領域で切断され;並びに、所定の領域が、第一のヌクレオチド配列で置換されるように、切断ハーフ-ドメインを位置決めする。
例えば外来性ポリヌクレオチド(細胞ヌクレオチド配列と相同である1種又は複数の領域を含む)とゲノム配列の間の、標的化された切断、それに続く非-相同末端連結によるか、又は標的化された切断、それに続く相同組換えによる、細胞クロマチンの標的化された切断及び細胞ヌクレオチド配列の標的化された変更に有用な組成物及び方法が、本明細書において明らかにされている。ゲノム配列は、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム(例えばミトコンドリア、葉緑体)、人工染色体、並びに細胞中に存在する他の種類の核酸、例えば増幅された配列、二重微小染色体及び内在性又は感染性細菌及びウイルスのゲノム中に存在するものを含む。ゲノム配列は、正常(すなわち野生型)又は変異体であることができ;変異体配列は、例えば、挿入、欠失、転座、再構成、及び/又は点変異を含むことができる。ゲノム配列は、多くの異なるアレルのひとつを含むこともできる。
これらの方法の実践に加え、本明細書に示された組成物の調製及び使用は、特に記さない限りは、分子生物学、生化学、クロマチン構造及び解析、コンピュータケミストリー、細胞培養、組換えDNA及び当該技術分野である関連した分野内の通常の技術を使用する。これらの技術は、文献において完全に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及び第3版、2001;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987及び定期最新版;シリーズのMETHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press, San Diego, 1998;METHODS IN ENZYMOLOGY、304巻、「Chromatin」(P. M. Wassarman及びA. P. Wolffe編集)、Academic Press, San Diego, 1999;及び、METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、119巻、「Chromatin Protocols」(P. B. Becker編集)、Humana Press, Totowa, 1999を参照のこと。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」、及び「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、1本鎖又は2本鎖のいずれかの形の、線状又は環状のコンホメーションのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを意味する。本発明の開示を目的とし、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定を構成するものではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログに加え、塩基、糖及び/又はリン酸部分が修飾されたヌクレオチドを包含することができる(例えば、ホスホロチオエート骨格)。一般に特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し;すなわち、AのアナログはTと塩基対形成する。
開示された方法及び組成物は、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)及びジンクフィンガードメインを含む融合タンパク質を含み、ここでジンクフィンガードメインは、細胞クロマチン内の配列への結合により(例えば、標的部位又は結合部位)、切断ドメイン(又は切断ハーフ-ドメイン)のその配列の近傍への活性を指示し、その結果標的配列の近傍での切断を誘導する。本開示の別所において示したように、ジンクフィンガードメインは、事実上あらゆる所望の配列へ結合するように操作することができる。従って切断又は組換えが望ましい配列を含む所定の領域の同定後、1個又は複数のジンクフィンガー結合ドメインを、所定の領域の1個又は複数の配列に結合するように操作することができる。細胞における、ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質の(又は、各々ジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ハーフ-ドメインを含むふたつの融合タンパク質の)発現は、所定の領域の切断に作用する。
ジンクフィンガー結合ドメインは、1個又は複数のジンクフィンガーを含む。Millerら、EMBO J., 4:1609-1614 (1985);Rhodes, Scientific American, Feb:56-65 (1993);米国特許第6,453,242号。典型的には、単独のジンクフィンガードメインは、長さが約30個のアミノ酸である。構造試験は、各ジンクフィンガードメイン(モチーフ)は、2個のβシート(2個の不変システイン残基を含むβターンで支えられた)及びαヘリックス(2個の不変ヒスチジン残基を含む)を含み、これらは特定のコンホメーション中に、2個のシステイン及び2個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を介して特定の立体配置に保持されていることを明らかにしている。
本明細書に明らかにされた融合タンパク質の切断ドメイン部分は、エンド-又はエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来することができるエンドヌクレアーゼの例は、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されるものではない。例えば2002-2003カタログ、New England Biolabs, Beverly, MA;及び、Belfortら、Nucleic Acids Res., 25: 3379-3388 (1997)を参照のこと。DNAを切断する追加の酵素が知られている(例えば、S1ヌクレアーゼ;サヤインゲンヌクレアーゼ;膵臓DNase I;ミクロコッカスヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;同じく、Linnら、(編集) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993を参照のこと)。1種又は複数のこれらの酵素(又はそれらの機能的断片)を、切断ドメイン及び切断ハーフ-ドメインの給源として使用することができる。
融合タンパク質(及びこれをコードしているポリヌクレオチド)をデザイン及び構築する方法は、当業者に公知である。例えば、ジンクフィンガータンパク質(及びそれをコードしているポリヌクレオチド)を含む融合タンパク質をデザイン及び構築する方法は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示されている。ある態様において、このような融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドが構築される。これらのポリヌクレオチドはベクターに挿入することができ、このベクターは細胞へ導入することができる(ポリヌクレオチドの細胞への導入のためのベクター及び方法に関する追加の開示については下記参照)。
明らかにされた方法及び組成物を用い、DNAを細胞クロマチン内の所定の領域で切断することができる(例えば、変異体又は野生型のいずれかの遺伝子において、ゲノム内の所望の部位又は予め決定された部位で)。このような標的化されたDNA切断に関して、ジンクフィンガー結合ドメインは、予め決定された切断部位の又はその近くの標的部位に結合するように操作され、この操作されたジンクフィンガー結合ドメイン及び切断ドメインを含む融合タンパク質が細胞において発現される。融合タンパク質のジンクフィンガー部分の標的部位への結合時に、DNAは、切断ドメインにより、標的部位の近くで切断される。正確な切断部位は、ZCリンカーの長さに応じて左右される。
HQRTHQNKKQLV (配列番号:26)
ここで、ジンクフィンガーのC-末端部分の2個の保存されたヒスチジン及びFokI切断ハーフ-ドメイン中の最初の3残基には下線を付けた。従ってこの構築体中のリンカー配列は、QNKKである。Bibikovaら、Mol. Cell. Biol., 21: 289-297 (2001)。本発明者らは、様々なZCリンカー長及び配列を有する多くのZFP-FokI融合ヌクレアーゼを構築し、これらのヌクレアーゼの一連のZFP結合部位の間の距離が異なる基質に対する切断効率について分析した。実施例4参照のこと。
ZFPと切断ハーフ-ドメインの間の融合体(例えば、ZFP/FokI融合体など)の使用に関連した標的化された切断法には、各々一般に異なる標的配列に方向付けられたようなふたつの融合分子の使用が必要である。これらのふたつの融合タンパク質の標的配列は、先に考察されたように、標的化された切断がゲノム内の独自の部位に方向付けられるように選択することができる。低下した切断特異性の可能性のある給源は、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体のひとつのホモ二量体化から生じる。これは、例えばゲノム内の機能的二量体を形成することができる方向及びスペーシングにより、同じ融合タンパク質のふたつのコピーが結合することができるように配置された、2種のZFP/切断ハーフ-ドメイン融合体のひとつのための標的配列の逆方向反復の存在により生じるであろう。
ゲノム配列(例えば、細胞クロマチン中の所定の領域)を相同な非-同一配列と交換する方法(すなわち、標的化された組換え)も、本明細書において説明されている。特定の配列を交換する先行する試みは、細胞の、染色体の領域と相同性を有する配列を含むポリヌクレオチド(すなわちドナーDNA)との接触、その後のドナーDNA分子がゲノム内で相同組換えを受けた細胞の選択に関連している。相同組換えの効率の悪さ及びドナーDNAの標的部位以外のゲノム領域への高頻度の非-特異的挿入のために、これらの方法の成功率は低い。
相同組換えは、DNA末端の修飾及びいくつかの細胞因子のタンパク質複合体への動員が必要である多-工程プロセスであるので、ドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体をコードしているベクターと共に、1種又は複数の外来性因子を追加することは、標的化された相同組換えを促進するために使用することができる。このような1種又は複数の因子を同定する例証的方法は、異なる細胞のmRNA発現パターンを比較するためにマイクロアレイ(例えば、Affymetrix Gene Chip(登録商標)アレイ)を使用する遺伝子発現の分析を使用する。例えばドナーDNA及びジンクフィンガー-切断ドメイン融合体の存在下での2本鎖切断-駆動された相同組換えを刺激するより高い能力を示す細胞は、助けを受けないか又は遺伝子修正のレベルを増加することがわかっている条件下のいずれかにおいて、それらの遺伝子発現パターンについて、そのような能力を欠いた細胞と比較し分析することができる。相同組換えの増加したレベルと直接相関する方法でアップレギュレーション又はダウンレギュレーションされた遺伝子は、これにより同定され、及び多くの発現ベクターのひとつにクローニングすることができる。これらの発現構築体は、ジンクフィンガー-切断ドメイン融合体及びドナー構築体と共に同時-トランスフェクションされ、高効率の相同組換えを実現する改善された方法を生じることができる。あるいは、このような遺伝子の発現は、1種又は複数のこれらの遺伝子の発現(活性化又は抑制のいずれか)を変調する操作されたジンクフィンガータンパク質を用い、適宜調節することができる。遺伝子発現を調節するための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成法については、例えば共有の米国特許第6,534,261号を参照のこと。
1種又は複数のZFP又はZFP融合タンパク質をコードしている核酸は、複製及び/又は発現のために原核細胞又は真核細胞へ形質転換するためのベクターにクローニングすることができる。ベクターは、原核細胞ベクター、例えば、プラスミド、又はシャトルベクター、昆虫ベクター、又は真核細胞ベクターであることができる。ZFPをコードしている核酸は、植物細胞、動物細胞、好ましくは哺乳類細胞もしくはヒト細胞、真菌細胞、細菌細胞、又は原生動物細胞に投与するために、発現ベクターにもクローニングすることもできる。
通常のウイルス及び非-ウイルスベースの遺伝子導入法を用い、操作されたZFPをコードしている核酸を、細胞(例えば哺乳類細胞)及び標的組織へ導入することができる。このような方法は、ZFPをコードしている核酸の細胞へのin vitro投与にも使用することができる。ある態様において、ZFPをコードしている核酸は、in vivo又はex vivo遺伝子治療の用途のために投与される。非-ウイルスベクター送達システムは、DNAプラスミド、ネイキッド核酸、及びリポソーム又はポロキサマーなどの送達ビヒクルに複合された核酸を含む。ウイルスベクター送達システムは、細胞への送達後エピソーム性又は組込まれたゲノムのいずれかを有する、DNA及びRNAウイルスを含む。遺伝子治療手法の検証については、Anderson, Science, 256: 808-813 (1992);Nabel & Felgner, TIBTECH, 11: 211-217 (1993);Mitani & Caskey, TIBTECH, 11: 162-166 (1993);Dillon, TIBTECH, 11: 167-175 (1993);Miller, Nature, 357: 455-460 (1992);Van Brunt, Biotechnology, 6(10): 1149-1154 (1988);Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience, 8: 35-36 (1995);Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin, 51(1): 31-44 (1995);Haddadaら、Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm(編集)(1995);及び、Yuら、Gene Therapy, 1:13-26 (1994)を参照のこと。
ZFP融合タンパク質などのポリペプチド化合物の投与における重要な因子は、このポリペプチドが、細胞の形質膜、又は核のような細胞内区画の膜を横断する能力を有することを保証することである。細胞膜は、小型、非イオン性親油性化合物は自在に透過し、かつ極性化合物、巨大分子、及び治療的又は予防的物質に対しては本来の非透過性である、脂質-タンパク質二層で構成されている。しかしZFPのようなポリペプチドが細胞膜を超えて移行する能力を有する、タンパク質及びリポソームのような他の化合物が説明されている。
本開示の状況において、治療的適用に関して、患者へ、又は患者へ導入される細胞へ投与される投与量は、患者において経時的に有益な治療的反応を実現するのに十分でなければならない。加えて特定の投与計画は、例えば、機能的ゲノム試験、及び細胞又は動物モデルにおいてなど、実験の状況において表現型の変化を決定するために有益であることができる。投与量は、使用される特定のZFPの効率及びKd、標的細胞の核容積、並びに患者の状態に加え、治療される患者の体重及び体表面積により決定される。投与量のサイズは、特定の患者における特定の化合物又はベクターの投与に付随する有害な副作用の存在、性質、及び程度によっても決定されるであろう。
ZFP+標的部位←→複合体
すなわち、DNA+タンパク質←→DNA:タンパク質複合体
Kd=[DNA][タンパク質]/[DNA:タンパク質複合体]
50%ZFPが結合した場合、Kd=[タンパク質]
そのため[タンパク質]=25nMでありかつ核容積が10-12Lである場合
[タンパク質]=(25x10-9moles/L)(10-12L/核)(6x1023分子/mole)
=50%結合について15,000分子/核
99%標的が結合した場合;100xKd=[タンパク質]
100xKd=[タンパク質]=2.5μM
(25x10-6moles/L)(10-12L/核)(6x1023分子/mole)
=標的部位の99%結合について約1,500,000分子/核
ZFP及びZFPをコードしている発現ベクターは、標的化された切断及び/又は組換えのため、並びに例えば癌、虚血、糖尿病、網膜症、黄斑変性、関節リウマチ、乾癬、HIV感染症、鎌状細胞貧血、アルツハイマー病、筋ジストロフィー、神経変性疾患、血管疾患、嚢胞性線維症、卒中などの治療的もしくは予防的適用のために、直接患者へ投与することができる。ZFP遺伝子治療により阻害することができる微生物の例は、病原菌、例えば、クラミジア、リケッチア菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌、及びcono球菌、クレブシエラ属、プロテウス属、セラチア属、シュードモナス属、レジオネラ属、ジフテリア属、サルモネラ属、バチルス属、コレラ菌、破傷風菌、ボツリヌス菌、炭疽菌、ペスト菌、レプトスピラ菌、及びライム病菌;感染性真菌、例えばアスペルギルス、カンジダ種;原生動物、例えば、胞子虫(例えばマラリア原虫)、根足虫(例えば赤痢アメーバ)及び鞭毛虫(トリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルディアなど);ウイルス疾患、例えば、肝炎(A、B、又はC型)、ヘルペスウイルス(例えば、VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV、及びEBV)、HIV、エボラ、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器合胞体(RS)ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、HTLVウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、及びアルボウイルスの脳炎ウイルスなどを含む。
明らかにされた標的化された切断の方法及び組成物を使用し、例えば、ふたつの部位で切断し、その間の配列を欠失することにより、単部位での切断後に、続けて非-相同末端連結することにより、及び/又は1もしくは2又は数個のヌクレオチドを除去するように部位で切断することにより、ゲノム配列に変異を誘導することができる。標的化された切断も、遺伝子ノックアウトを作製するために(例えば、機能的ゲノム又は標的バリデーションのために)及び配列のゲノムへの標的化された挿入を促進するため(すなわち遺伝子ノックイン)に;例えば、細胞操作又はタンパク質過剰発現を目的として、使用することができる。挿入は、相同組換え又は標的化された組込みによる、染色体配列の交換によることができ、ここで染色体において所定の領域と相同な配列が側方に位置した新規配列(すなわち、所定の領域に存在しない配列)は、予め決定された標的部位で挿入される。
同じ方法を、野生型配列の変異体配列との交換、又はひとつのアレルの異なるアレルへの転換にも使用することができる。
標的化された組換えの明らかにされた方法を用い、ゲノム配列を、相同の非-同一配列と交換することができる。例えば変異体ゲノム配列は、その野生型対応部分と交換し、これにより例えば、遺伝子疾患、遺伝性障害、癌、及び自己免疫疾患の治療法を提供することができる。同様の様式で、遺伝子のひとつのアレルを、異なるアレルと、本明細書に明らかにされた標的化された組換えの方法を用い、交換することができる。
hSMC1L1遺伝子は、出芽酵母遺伝子の第1染色体構造維持(structural maintenance of chromosomes 1)のヒトオルソログである。Walker ATPaseドメインを含むタンパク質のアミノ-末端部分をコードしているこの遺伝子の領域を、標的化された切断及び組換えにより変異誘発した。切断は、ジンクフィンガーDNA-結合ドメイン及びこのコドンの近傍に結合するFokI切断ハーフ-ドメインを含むキメラヌクレアーゼをデザインすることにより、メチオニン開始コドン(ヌクレオチド24-26、図1)の領域に標的化した。従って2種のジンクフィンガー結合ドメインがデザインされ、その一方はヌクレオチド23-34を認識し(図1に示したように上側鎖に沿って一次接触する)、及び他方はヌクレオチド5-16を認識する(下側鎖に沿って一次接触する)。ジンクフィンガータンパク質は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示したようにデザインした。これらのジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列については、表2を参照のこと。
IL-2Rγ遺伝子は、いくつかのインターロイキン受容体(IL-2R、IL-4R、IL-7R、IL-9R、IL-15R及びIL-21Rを含む)のサブユニットとして機能する「共通サイトカイン受容体γ鎖」として知られているタンパク質をコードしている。この遺伝子の変異は、第三エキソンの5'末端(例えば、チロシン91コドン)を取り囲むものを含むが、これは、X-連鎖重症複合型免疫不全症(SCID)を引き起こす。例えば、Puckら、Blood, 89: 1968-1977 (1997)を参照。チロシン91コドンの変異(配列番号:7のヌクレオチド23-25;図7)を、標的化された切断及び組換えにより、IL2Rγ遺伝子に導入した。切断は、ジンクフィンガータンパク質の2種の対をデザインすることにより、この領域に標的化した。第一の対(表4の最初の2列)は、ヌクレオチド29-40に結合するようにデザインされたジンクフィンガータンパク質(図7に示された上側鎖に沿って一次接触する)、及びヌクレオチド8-20に結合するようにデザインされたジンクフィンガータンパク質(下側鎖に沿って一次接触する)を含む。第二の対(表4の第三及び第四列)は、ふたつのジンクフィンガータンパク質を含み、そのひとつは、ヌクレオチド23-34を認識し(図7に示された上側鎖に沿って一次接触する)、及び第二は、ヌクレオチド8-16を認識する(下側鎖に沿って一次接触する)。ジンクフィンガータンパク質は、共有の米国特許第6,453,242号及び第6,534,261号に開示されたようにデザインした。ジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列については、表4を参照のこと。
ヒトβグロビン遺伝子は、成人赤血球のヘモグロビンの構造及び機能に寄与するふたつの遺伝子産物のひとつである。β-グロビン遺伝子の変異は、鎌状細胞貧血を生じる。変異された場合に鎌状細胞貧血を引き起こすヌクレオチドの位置の傍、この配列内に結合するふたつのジンクフィンガータンパク質をデザインした。図13に、ヒトβ-グロビン遺伝子の一部のヌクレオチド配列を示し、ふたつのジンクフィンガータンパク質の標的部位には、図13に示した配列において下線を付けている。ふたつのジンクフィンガータンパク質の認識領域のアミノ酸配列は、表6に示した。これら2種のZFP結合ドメインの各々をコードしている配列を、先に説明したように、FokI切断ハーフ-ドメインをコードしている配列に融合し、内在性βグロビン遺伝子を標的化した操作されたZFP-ヌクレアーゼを作出した。その後これらの融合配列の各々を、哺乳類の発現ベクターpcDNA3.1においてクローニングした(図14)。
切断効率に対するZCリンカー長の作用を試験するために、様々な長さのZCリンカーを用い、4-フィンガーZFP結合ドメインを、FokI切断ハーフ-ドメインに融合した。ZFPの標的部位は、5'-AACTCGGATAAT-3' (配列番号:84)であり、各ジンクフィンガーの認識領域のアミノ酸配列(α-ヘリックスの開始点に対して-1から+6の位置)は、以下であった(ここでF1は最もN-側、及びF4は最もC-側のジンクフィンガーである):
F1:DRSTLIE (配列番号:85)
F2:SSSNLSR (配列番号:86)
F3:RSDDLSK (配列番号:87)
F4:DNSNRIK (配列番号:88)
前述のZFP結合ドメイン及びFokI切断ハーフ-ドメインが、2、3、4、5、6又は10アミノ酸残基により分離されているZFP-FokI融合体を構築した。これらのタンパク質の各々を、4、5、6、7、8、9、12、15、16、17、22、又は26塩基対により分離した反復配列を伴う、ZFP標的部位の逆方向反復を有する基質の切断について試験した。
10-残基リンカー HTKIHLRQKDAARGSQLV (配列番号:89)
6-残基リンカー HTKIHLRQKGSQLV (配列番号:90)
5-残基リンカー HTKIHLRQGSQLV (配列番号:91)
4-残基リンカー HTKIHLRGSQLV (配列番号:92)
3-残基リンカー HTKILGSQLV(配列番号:93)
2-残基リンカー HTKIHGSQLV (配列番号:94)
ZFP/FokI融合タンパク質対(5-8及び5-10と示した)は、標的部位間の領域の切断を促進するために、IL-2Rγ遺伝子の5番目のエキソンで標的部位に結合するようにデザインした。ふたつの融合タンパク質の標的配列を含むこの遺伝子の関連領域を、図19に示した。5-8タンパク質のアミノ酸配列は図20に示し、及び5-10タンパク質のアミノ酸配列は図21に示した。両方のタンパク質は、10アミノ酸ZCリンカーを含む。これらのタンパク質のジンクフィンガー部分に関して、DNA標的配列に加え、ジンクフィンガーの認識領域のアミノ酸配列を、表9に示した。
増強されたグリーン蛍光タンパク質(eGFP)は、アミノ酸64(フェニルアラニンからロイシン)及び65(セリンからトレオニン)の変化を含む、グリーン蛍光タンパク質(GFP;例えば、Tsien, Ann. Rev. Biochem., 67: 509- 544 (1998)参照)の修飾形である。Heimら、Nature, 373: 663-664 (1995);Cormackら、Gene, 173: 33-38 (1996)。終止コドン及び2-bpフレームシフト変異を含む、eGFP遺伝子の欠損型を作製することにより、eGFP-ベースのレポーターシステムを構築した。eGFP遺伝子の配列は、図22に示した。これらの変異は、Platinum(登録商標)Taq DNAポリメラーゼHigh Fidelityキット(Invitrogen)並びにプライマーとしてオリゴヌクレオチドGFP-Bam、GFP-Xba、stop sense2、及びstop anti2(オリゴヌクレオチド配列は下記表11に列記した)を用いる、重複PCR変異誘発により挿入した。GFP-Bam及びGFP-Xbaは、外部プライマーとして使用したのに対し、プライマーstop sense2及びstop anti2はヌクレオチド変化をコードしている内部プライマーとして使用した。完全長eGFP遺伝子をコードしているpeGFP-NIベクター(BD Biosciences)を、ふたつの個別の増幅反応においてDNA鋳型として使用し、第一ではGFP-Bam及びstop anti2オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、第二ではGFP-Xba及びstop センス2オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用した。これは、その配列が重複した2種の増幅産物を作製した。これらの産物は一緒にし、外部GFP-Bam及びGFP-Xbaオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する、第三の増幅反応の鋳型として使用し、修飾されたeGFP遺伝子を作製し、これはヌクレオチド280-287の配列GACCACAT(配列番号:124)が、配列TAACAC(配列番号:125)と交換されていた。全ての増幅反応のPCR条件は以下であった:鋳型は最初に94℃で2分間変性し、その後反応液を、94℃で30秒間、46℃で45秒間、及び68℃で60秒間インキュベーションすることにより、25サイクル増幅した。最終の伸長ラウンドは、68℃で10分間行った。最終増幅産物の配列は、図23に示した。この795bp断片は、pCR(R)4-TOPOベクターへ、TOPO-TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてクローニングし、pCR(R)4-TOPO-GFPmut構築体を作製した。
ヌクレオチド271-294(番号付けは図23に従う)に対応する変異されたGFP遺伝子(実施例6)の領域に結合するように、 2種類の3-フィンガーZFPをデザインした。これらのタンパク質の結合部位は、ふたつの結合部位を分離する6塩基対とは反対配向で生じた。図23参照。ZFP 287Aは、非-コード鎖上のヌクレオチド271-279に結合するのに対し、ZFP 296は、コード鎖上のヌクレオチド286-294に結合する。ZFPの認識領域のDNA標的及びアミノ酸配列は、以下及び表12に列記した:
287A:
F1 (GCGg) RSDDLTR (配列番号:130)
F2 (GTA) QSGALAR (配列番号:131)
F3 (GGG) RSDHLSR (配列番号:132)
296S:
F1 (GCA) QSGSLTR (配列番号:133)
F2 (GCA) QSGDLTR (配列番号:134)
F3 (GAA) QSGNLAR (配列番号:135)
pCR(R)4-TOPO-GFPmut構築体(実施例6)を用い、287及び296ジンクフィンガータンパク質の、それらの標的部位を特異的に認識し及びこのeGFPの修飾型をin vitroにおいて切断する能力を試験するための鋳型を提供した。
変異eGFPをコードしているDNA断片eGFPmutを、pCR(R)4-TOPO-GFPmutベクター(実施例6)から切出し、pcDNA4/TOのHindIII及びNotI部位にクローニングし、これによりこの遺伝子を、テトラサイクリン-誘導性CMVプロモーターの制御下に配置した。得られるプラスミドを、pcDNA4/TO/GFPmut(図26)と称した。T-Rex 293細胞(Invitrogen)を、10%Tet-非含有ウシ胎仔血清(FBS)(Hyclone)を補充したダルベッコの変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen)において増殖した。細胞は、50%の集密度で6-ウェル皿に播種し、ふたつのウェルを各々、pcDNA4/TO/GFPmutでトランスフェクションした。これらの細胞は、48時間かけて回収し、その後両方のウェルからの細胞を一緒にし、選択培地、すなわち400μg/ml Zeocin(Invitrogen)を補充した培地中の10xl5-cm2皿に分けた。この培地は3日毎に交換し、10日後に単独のコロニーを単離し、更に増殖させた。各クローン株を、定量的RT-PCR(TaqMan(登録商標))により、eGFPmut遺伝子のドキシサイクリン(dox)-誘導性発現について個別に試験した。
欠損eGFPmut遺伝子の修正に関する遺伝子情報を含むドナー構築体を、PCRにより構築した。PCR反応を、peGFP-NIベクターを鋳型として用い、先に説明したように行った。標的化された組換え実験におけるドナー構築体のバックグラウンド発現を防止するために、最初の12bp及び開始コドンを、プライマーGFPnostart及びGFP-Xba(表14に示した配列)を用いるPCRにより、ドナーから除去した。得られたPCR断片(734bp)を、哺乳類細胞プロモーターを含まないpCR(R)4-TOPOベクターにTOPO-TAクローニングによりクローニングし、pCR(R)4-TOPO-GFPdonor5(図28)を作製した。この構築体のeGFP挿入断片の配列(図22に示した配列のヌクレオチド64-797に相当)を、図29(配列番号:20)に示した。
T18安定細胞株(実施例9)を、製造業者のプロトコールに従い、Opti-MEM I低(reduced)血清培地においてLipofectAMINE 2000試薬(Invitrogen)300ngを使用し、ZFP-FokI発現プラスミド(pcDNA3.1-GFP287-FokI及びpcDNA3.1-GFP296-FokI、実施例7)の一方又は両方及びドナープラスミドpCR(R)4-TOPO-GFPdonor5(実施例10)でトランスフェクションした。欠損染色体eGFP遺伝子の発現は、培養培地への2ng/mlドキシサイクリンの添加により、トランスフェクション後5〜6時間誘導した。トランスフェクション後24時間での100ng/mlノコダゾール(図30)又は0.2μMビンブラスチン(図31)の添加により、細胞を、細胞周期のG2相で停止した。G2停止は24〜48時間継続することができ、その後培地の除去により解放(release)した。これらの細胞をPBSで洗浄し、培地をテトラサイクリン-非含有FBS及び2ng/mlドキシサイクリンを含有するDMEMと交換した。これらの細胞を24〜48時間回収し、蛍光標示式細胞分取器(FACS)分析により、eGFP蛍光を示す細胞数をモニタリングすることにより、遺伝子修正効率を測定した。FACS分析は、Beckman-Coulter EPICS XL-MCL装置及びシステムII Data Acquisition and Displayソフトウェア、ver.2.0を用いて行った。eGFP蛍光は、アルゴンレーザーによる488nmでの励起、及び525nm(x-軸)の放出モニタリングにより検出した。バックグランド又は自己蛍光を、570nm(y-軸)での放出をモニタリングすることにより測定した。525nmでの高蛍光放出及び570nmでの低放出を示す細胞(領域E)を、遺伝子修正のために正(positive)スコア化した。
その配列が二量体化界面で変更されたジンクフィンガーヌクレアーゼを、欠損染色体eGFP遺伝子の修正を触媒するそれらの能力について試験した。ZFPヌクレアーゼのヌクレアーゼ部分(すなわち、FokI切断ハーフ-ドメイン)を実施例5に説明っしたように変更した以外は、実施例11に示したプロトコールを用いた。従って、E490K切断ハーフ-ドメインは、GFP296 ZFPドメインに融合され(表12)、及びQ486E切断ハーフ-ドメインは、GFP287 ZFPに融合されている(表12)。
実施例11に説明した実験に類似した実験において、ドナー配列長の標的化された組換え頻度に対する作用を試験した。実施例11のように、T18細胞を、2種のZFPヌクレアーゼでトランスフェクションし、eGFP発現をドキシサイクリンで誘導した。細胞は、実施例11のような734bpのeGFP挿入断片(図29)を含むpCR(R)4-TOPO-GFPドナー5プラスミド(図28)か、又は変異された染色体eGFP遺伝子に相同な 1527bpの配列挿入断片(図32)を含む類似したプラスミドのいずれかでもトランスフェクションした。加えて、ノコダゾールによるG2停止の組換え頻度に対する作用を評価した。
各々ヒトIL-2Rγ遺伝子に標的化されたZFP-ヌクレアーゼをコードしているふたつの発現ベクターを構築した。各ZFP-ヌクレアーゼは、4個のアミノ酸のZCリンカーを介して(実施例4参照)、IIS型制限酵素FokIのヌクレアーゼドメイン(Wahらの論文の配列のアミノ酸384-579(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 10564-10569 (1998))に融合したジンクフィンガータンパク質-ベースのDNA結合ドメイン(表17参照)を含んだ。これらのヌクレアーゼは、コドン228及び229(この遺伝子における変異のホットスポット)を取り囲む染色体IL-2Rγ遺伝子のエキソン5の位置に結合し、かつそれらの結合部位の間にDNAの2本鎖切断を導入するようにデザインした。
ACTCTGTGGAAG(配列番号:152)に標的化されたヌクレアーゼ
MAERPFQCRICMRNFSRSDNLSVHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNAHRINHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTNHTKIHLRGS (配列番号:162)
AAAGCGGCTCCG (配列番号:157)に標的化されたヌクレアーゼ
MAERPFQCRICMRNFSRSDTLSEHIRTHTGEKPFACDICGRKFAARSTRTTHTKIHTGSQKPFQCRICMRNFSRSDSLSKHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQRSNLKVHTKIHLRGS (配列番号:163)
F R V R S R F N P L C G S (配列番号:164)
TTTCGTGTTCGGAGCCGGTTTAACCCGCTCTGTGGAAGT (配列番号:165)。
K562は、ヒト慢性骨髄性白血病に由来した細胞株である。標的化された切断に使用したタンパク質は、5-8G及び5-9DジンクフィンガーDNA-結合ドメインへのFokI融合体であった(実施例14、表17)。ドナー配列は、実施例14に説明した、変異により導入されたBsrBI部位を含むヒトIL-2Rγ遺伝子の1.5kbp断片であった。
エキソン5フォワード:GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (配列番号:168)
エキソン5リバース:TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (配列番号:169)
遺伝子疾患(例えば、重症複合型免疫不全症(SCID)及び鎌状細胞貧血)は、疾患に寄与する特異的DNA配列変更の相同組換え-媒介型修正により治療することができる。ある症例において、治療の最大効率及び安定性は、多能性細胞における遺伝子欠損の修正から生じる。この目的のために、本実施例は、ヒトCD34-陽性骨髄細胞におけるIL-2Rγ遺伝子の配列の変更を明らかにしている。CD34+細胞は、赤血球、骨髄及びリンパ球系統を生じる多能性造血幹細胞である。
トランスフェクションに使用した細胞数及びDNAを、表21に示した。
ex5 1.5detF3 GCTAAGGCCAAGAAAGTAGGGCTAAAG (配列番号:170)
ex5 1.5detR3 TTCCTTCCATCACCAAACCCTCTTG (配列番号:171)
ドナーDNAとそれと組換えする染色体配列の間の相同性の程度の相同組換え頻度に対する作用を、実施例9において説明したように、T18細胞株において試験した。この株は、染色体に組込まれた欠損eGFP遺伝子を含み、ドナーDNAは、この欠損を修正する染色体遺伝子に関する配列変化を含む。
非-相同末端連結(NHEJ)に関連したタンパク質の細胞レベルの減少は、標的化された相同組換えを促進するかどうかを試験するために、Ku70タンパク質のレベルを、siRNA阻害により減少した実験を行った。Ku70遺伝子に標的化されたsiRNA分子は、Ku70 cDNAの転写、それに続くダイサー酵素による2本鎖転写産物の切断により作製した。
ゲノムDNA中の2本鎖切断の修復は、ふたつの異なる細胞経路に沿って進行することができる;相同組換え(HR)又は非-相同末端連結(NHEJ)。Ku70は、ゲノムDNA内の2本鎖切断から生じる自由な(free)DNA末端に結合する、NHEJに関連したタンパク質である。NHEJに関連したタンパク質の細胞内濃度の低下が、HR頻度を増加するかどうかを試験するために、実施例18に説明されたように調製した低分子干渉RNA(siRNA)を用い、Ku70 mRNAの発現を阻害し、これによりKu70タンパク質のレベルを低下し、細胞において、ドナーDNA及びキメラヌクレアーゼをコードしているプラスミドにより同時-トランスフェクションした。
ヒトβ-グロビン遺伝子に標的化された多くの4-フィンガージンクフィンガーDNA結合ドメインがデザインされ、及びFokI切断ハーフ-ドメインに融合された各ジンクフィンガードメインをコードしているプラスミドが構築された。各ジンクフィンガードメインは、4ジンクフィンガーを含み、及び鎌状細胞貧血の原因となる変異をコードしているヒトβ-グロビン遺伝子の領域の12bp標的部位を認識した。これらの各タンパク質のその標的配列に対する結合親和性を評価し、強力な結合を示している4種のタンパク質(sca-r29b、sca-36a、sca-36b及びsca-36c)を、FokI融合エンドヌクレアーゼの構築に用いた。
先の実験において説明されたFokI切断ハーフ-ドメイン及び4種のZFP DNA結合ドメインのひとつを含む融合タンパク質を、推定された配列特異性によるin vitroにおいてDNAを切断するそれらの能力について試験した。これらのZFPドメインは、先に説明したように、pcDNA3.1発現ベクターに、KpnI及びBamHI部位でクローニングし、FokI切断ドメインへ4種のアミノ酸ZCリンカーによりインフレームで融合した。700bpのヒトβ-グロビン遺伝子を含むDNA断片を、K562細胞から得たゲノムDNAからクローニングした。この断片の単離及び配列は、前記実施例3に説明した。
実施例20に説明したようなZFNにより標的化されたヒトβ-グロビン遺伝子配列を含むDNA断片を合成し、及びeGFPレポーター遺伝子のSpeI部位にクローニングし、これによりeGFP発現を破壊した。この断片は、以下の配列を含み、ここで鎌状細胞変異の原因となるヌクレオチドには、太字で下線を付けた:
CTAGACACCATGGTGCATCTGACTCCTGTGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTAG (配列番号:200)
染色体DNA配列の転写は、そのクロマチン構造の変更に関連しているので (一般に転写された配列はよりアクセス可能となる)、活性のある転写された遺伝子は、標的化された相同組換えにとってより好ましい基質であることが可能である。この考えは、その転写が、ドキシサイクリン-誘導性プロモーターの制御下にある欠損eGFP遺伝子をコードしている染色体配列を含むT18細胞株(実施例9)を用いて試験した。
K562細胞を、5-8GL0及び5-9DL0ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)をコードしているプラスミド(実施例14;表17参照)及び1.5kbp DraIドナー構築体でトランスフェクションした。DraIドナーは、IL2Rγ遺伝子の5番目のエキソンをコードしている領域と相同な配列で構成されたが、ZFN-結合部位の間に余分な塩基を挿入し、フレームシフトを生じ及びDraI部位を作製している。
Claims (7)
- ゲノム配列の標的された置換方法であって、以下:
(a)第一、第二、第三及び第四の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、当該融合タンパク質のそれぞれは、
(i)DNAにおいて標的部位に結合するジンクフィンガーDNA-結合ドメイン、及び
(ii)切断ハーフドメイン
を含み;
ここで、第一及び第二融合タンパク質は、第一及び第二標的部位にそれぞれ結合し、第一切断部位は第一標的部位と第二標的部位との間に存在し、そして、
第三及び第四融合タンパク質は、第三及び第四標的部位にそれぞれ結合し、第二切断部位は第三標的部位と第四標的部位との間に存在し;
それによって、第一及び第二融合タンパク質は第一切断部位でDNAを切断し、第三及び第四融合タンパク質は第二切断部位でDNAを切断する;並びに
(b)細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させるステップであって、当該ドナーポリヌクレオチドは、
(i)第一及び第二切断部位に隣接するゲノム配列と相同の配列;及び
(ii)第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列と相同であるが同一でない配列
を含み;
それによって、第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列は、ドナーポリヌクレオチドと相同であるが同一でない配列によって置換される、前記方法。 - 前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の欠失を含む、請求項1記載の方法。
- 前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の挿入を含む、請求項1記載の方法。
- 前記相同であるが同一でない配列は、ゲノム配列の置換を含む、請求項1記載の方法。
- ゲノム配列の標的された置換方法であって、以下:
(a)第一、第二、第三及び第四の融合タンパク質を細胞中で発現するステップであって、当該融合タンパク質のそれぞれは、
(i)DNAにおいて標的部位に結合するジンクフィンガーDNA-結合ドメイン、及び
(ii)切断ハーフドメイン
を含み;
ここで、第一及び第二融合タンパク質は、第一及び第二標的部位にそれぞれ結合し、第一切断部位は第一標的部位と第二標的部位との間に存在し、そして、
第三及び第四融合タンパク質は、第三及び第四標的部位にそれぞれ結合し、第二切断部位は第三標的部位と第四標的部位との間に存在し;
それによって、第一及び第二融合タンパク質は第一切断部位でDNAを切断し、第三及び第四融合タンパク質は第二切断部位でDNAを切断する;並びに
(b)細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させるステップであって、当該ドナーポリヌクレオチドは、
(i)第一及び第二切断部位に隣接するゲノム配列と相同の配列;及び
(ii)第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列と相同でない配列
を含み;
それによって、第一切断部位と第二切断部位との間のゲノム配列は、ドナーポリヌクレオチドの非-相同配列によって置換される、前記方法。 - (a)細胞の細胞クロマチン中の所定の領域内の、第一のヌクレオチド配列;
(b)第一の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一のFokI切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第一のジンクフィンガードメインは、所定の領域内の第二のヌクレオチド配列に結合し、当該第二の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含む;
(c)第二の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二のFokI切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第二のジンクフィンガードメインは、所定の領域中の第三のヌクレオチド配列に結合し、当該第三の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み、かつ第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する;並びに
(d)第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ここで当該第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と相同であるが同一ではない、
を含む、細胞。 - 細胞クロマチン中の所定の領域に第一のヌクレオチド配列を変更するための医薬組成物であって、以下:
(a)第一の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで当該第一の融合タンパク質は、第一のジンクフィンガー結合ドメイン及び第一の切断ハーフ-ドメインを含み;
当該第一のジンクフィンガードメインは、所定の領域内の第二のヌクレオチド配列に結合し、当該第二の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み;
(b)第二の融合タンパク質又はそれをコードするポリヌクレオチド、ここで、当該第二の融合タンパク質は、第二のジンクフィンガー結合ドメイン及び第二の切断ハーフ-ドメインを含み、
当該第二のジンクフィンガードメインは第三のヌクレオチド配列に結合し、当該第三の配列は少なくとも9ヌクレオチドを含み、かつ第二の配列から2〜50ヌクレオチドに位置する;並びに
(c)第四のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ここで当該第四のヌクレオチド配列は第一のヌクレオチド配列と相同であるが同一ではない、
を含む、前記組成物。
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