JP2010044059A - 新規錯体化合物、並びにそれを用いた酸素濃度測定試薬および癌の診断薬 - Google Patents
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Abstract
【課題】新規なイリジウム錯体及びそれを用いた酸素濃度検出試薬を提供する。
【解決手段】下記の、Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を細胞や組織に投与して、同錯体が発するりん光に基づいて細胞や組織内の酸素濃度を測定する。
【選択図】図１
【解決手段】下記の、Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を細胞や組織に投与して、同錯体が発するりん光に基づいて細胞や組織内の酸素濃度を測定する。
【選択図】図１
Description
本発明は新規錯体化合物、並びにそれを用いた細胞や組織中の酸素濃度をリアルタイムで可視化し定量することのできる試薬に関する。
生体組織あるいは細胞中の酸素濃度を非侵襲的にリアルタイムで検出する方法の開発は，細胞生物学や医療の分野において重要な課題となっている。生体組織中の酸素濃度を定量するための従来法としては、（１）微小電極を組織に挿入して測定する方法、（２）常磁性プローブ分子のESR信号幅が周辺の酸素濃度に依存して変化することを利用する方法、（３）ニトロイミダゾール系低酸素組織診断薬剤を使う方法、（４）水溶性ポルフィリン誘導体、ルテニウム錯体等の発光測定に基づく酸素濃度測定法、などが知られている。（１）の微小電極を用いる方法は、電極近傍の一点における酸素分圧しか測定できない。また、侵襲性であるという欠点を持つ。（２）のESR信号に基づく方法では、リアルタイムでの酸素濃度計測はできない、（３）のニトロイミダゾール系薬剤を用いる方法は、低酸素細胞内でニトロイミダゾールが還元されて細胞内タンパク質に結合しトラップされることを利用する。この方法では、薬剤の代謝に時間を要するため、薬剤投与後数時間経過しないとデータが得られない、という欠点をもつ。（４）の方法は、水溶性ポルフィリン誘導体やルテニウム錯体のりん光寿命が血中酸素濃度に依存して変化する（消光を受ける）ことを利用して酸素濃度を定量する方法である。この方法は、非侵襲で組織における酸素分圧を可視化できるという大きな利点を有するが、試薬が水溶性であるため、得られるデータは血中酸素濃度に限られる。
イリジウム（III）錯体（非特許文献１〜４）はりん光を発することが知られており、有機ELディスプレイなどへの応用が期待されている。しかしながら、イリジウム（III）錯体のりん光に基づいて酸素濃度を測定することや、癌の診断への応用は知られていない。
そこで、本発明者らは，下記式（A）で示されるイリジウム錯体（(btp)2Ir(acac)）の室温りん光（強度，寿命）を用いた生体組織中における酸素濃度計測方法を開発した（特許文献１）。また、(btp)2Ir(acac)のりん光強度，寿命の測定から，リポソーム膜中の酸素濃度の定量，癌細胞中の酸素濃度の可視化，担癌マウス中の腫瘍の可視化に成功した（特許文献１）。
S. Lamansky, P. Djurovich, D. Murphy, F. Abdel-Razzaq, H. Lee, C. Adachi, P. E. Burrows, S. R. Forrest, and M. E. Thompson, J. Am. Chem. Soc., 123, 4303 (2001).
H. Konno，Chem. Times, 199, 13 (2006).
M. Nonoyama, Bull. Chem. Soc. Jpn., 47, 767 (1974).
S. Sprouse, K. A. King, P. J. Spellane, and R. J. Watts, J. Am. Chem. Soc., 106, 6647 (1984).
しかしながら，(btp)2Ir(acac)は，吸収極大波長483nm，りん光極大波長616nmであるため，生体組織内部の酸素濃度や皮膚から深い位置にある腫瘍の可視化は十分ではない。これまで，近赤外光領域にりん光を示すイリジウム錯体は報告されているが，りん光量子収率が0.02と非常に小さく，また，りん光寿命も短いため，酸素濃度定量試薬として用いることは困難である。
そこで、本発明は、新規な近赤外光領域にりん光を示す新規イリジウム錯体及びそれを用いた酸素濃度測定試薬を提供することを課題とする。
そこで、本発明は、新規な近赤外光領域にりん光を示す新規イリジウム錯体及びそれを用いた酸素濃度測定試薬を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、下記のイリジウム錯体(btq)2Ir(acac)、(btiq)2Ir(acac)、(btph)2Ir(acac)、(btbq)2Ir(acac)を合成することに成功し、該錯体が近赤外光領域にりん光を示すこと、さらには、そのりん光を検出することで細胞や組織内の酸素濃度が測定できることを見出した。また、同錯体を生体に投与したときに、そのりん光に基づいて癌組織を特異的に検出できることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を含む、酸素濃度測定試薬であって、前記錯体が下記のいずれかの錯体である、酸素濃度測定試薬。
（２）前記いずれかの錯体を含む、癌の診断薬。
（３）前記いずれかの錯体。
（１）Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を含む、酸素濃度測定試薬であって、前記錯体が下記のいずれかの錯体である、酸素濃度測定試薬。
（３）前記いずれかの錯体。
（４）下記一般式で表わされる錯体。
ｚは０〜３の整数であり、ｍが２または３、かつｎが０〜３の整数であるか、ｍが０〜３の整数、かつｎが２または３である。
XおよびYは 水素、またはアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基から選択される置換基を示す。
（５）ｚが１であり、ｍが２かつｎが０であるか、またはｍが０かつｎが２である、（４）に記載の錯体。
（６）ＸおよびＹが水素である、（５）に記載の錯体。
（７）（４）〜（６）のいずれかに記載の錯体を含む酸素濃度測定試薬。
（８）（４）〜（６）のいずれかに記載の錯体を含む癌の診断薬。
XおよびYは 水素、またはアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基から選択される置換基を示す。
（５）ｚが１であり、ｍが２かつｎが０であるか、またはｍが０かつｎが２である、（４）に記載の錯体。
（６）ＸおよびＹが水素である、（５）に記載の錯体。
（７）（４）〜（６）のいずれかに記載の錯体を含む酸素濃度測定試薬。
（８）（４）〜（６）のいずれかに記載の錯体を含む癌の診断薬。
なお、各略称は以下の化合物名の略称である。
(btq)2Ir(acac)：ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btiq)2Ir(acac)：ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btph)2Ir(acac)：ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btbq)2Ir(acac)：ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-ベンゾキノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btq)2Ir(acac)：ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btiq)2Ir(acac)：ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btph)2Ir(acac)：ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
(btbq)2Ir(acac)：ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-ベンゾキノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）
本発明によれば、細胞や組織中の低酸素領域を可視化することができ、さらにりん光寿命の値から酸素濃度を定量することができる。また、癌組織を特異的に検出することができるため、癌の診断に使用することもできる。本発明の錯体は、(btp)2Ir(acac)よりも長波長領域にりん光を発するため、癌の診断薬として用いたときに，皮膚から深い低酸素領域を可視化できると期待される。
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明の酸素濃度測定試薬は、下記のIr(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体（以下、イリジウム錯体と呼ぶ）を含む。
これらのイリジウム錯体は、後述の実施例に記載の方法に従って合成することができる。
なお、これらのイリジウム錯体においてキノリナート基やフェナンスリナート基の水素原子はアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基などで置換されてもよい。
本発明の酸素濃度測定試薬は、下記のIr(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする金属錯体（以下、イリジウム錯体と呼ぶ）を含む。
これらのイリジウム錯体は、後述の実施例に記載の方法に従って合成することができる。
なお、これらのイリジウム錯体においてキノリナート基やフェナンスリナート基の水素原子はアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基などで置換されてもよい。
XおよびYは 水素、またはアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基から選択される置換基を示す。
これらのイリジウム錯体は、後述の実施例に記載の方法またはそれに準ずる方法に従って合成することができる。
この中では、以下のイリジウム錯体が例示される。
上記のようなイリジウム錯体は、細胞や組織、特に、それらの生体膜に集積し、酸素濃度が低いときにより強いりん光を発する。したがって、りん光の強度に基づいて細胞や組織の酸素濃度を測定することができる。すなわち、りん光が強いときに酸素濃度が低いというような判定ができる。また、あらかじめ酸素濃度とりん光強度の関係を求めておくことにより、酸素濃度を定量的に測定することも可能である。
測定対象としての細胞の種類は特に制限されず、株化培養細胞や初代培養細胞などが例示される。
また、マウスやラットなどの実験動物にイリジウム錯体を投与し、酸素濃度が低下している部位の検出などを行うこともできる。
細胞や組織にイリジウム錯体を添加する場合、イリジウム錯体を適当な溶媒に溶解して添加すればよく、添加濃度は使用するイリジウム錯体の種類にもよるが、5〜500μMが好ましく、25〜75 μMが特に好ましい。
イリジウム錯体を添加してインキュベートした後、イリジウム錯体を励起してりん光を観察できるような蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置などを用いてりん光を観察することができる。
また、マウスやラットなどの実験動物にイリジウム錯体を投与し、酸素濃度が低下している部位の検出などを行うこともできる。
細胞や組織にイリジウム錯体を添加する場合、イリジウム錯体を適当な溶媒に溶解して添加すればよく、添加濃度は使用するイリジウム錯体の種類にもよるが、5〜500μMが好ましく、25〜75 μMが特に好ましい。
イリジウム錯体を添加してインキュベートした後、イリジウム錯体を励起してりん光を観察できるような蛍光顕微鏡、蛍光測定装置、蛍光イメージング装置などを用いてりん光を観察することができる。
また、イリジウム錯体は、生体に投与したときに、癌組織を特異的に染色できるため、癌の検出に使用できる。これは、癌組織では酸素供給が不足しているのでイリジウム錯体のりん光が癌組織で特異的に観察できることによると考えられる。
したがって、上記イリジウム錯体は癌の診断薬として使用することもできる。
例えば、イリジウム錯体を検体に投与し、検体に生体外から可視光を照射することでりん光を観察することができる。これにより、癌組織を非侵襲的かつ高感度・選択的に可視化できる。また、りん光は画像化できるため、癌検出用のイメージング試薬としても使用できる。
また、イリジウム錯体は、実験動物を用いた癌の研究や癌治療薬の評価などにも使用することができる。
したがって、上記イリジウム錯体は癌の診断薬として使用することもできる。
例えば、イリジウム錯体を検体に投与し、検体に生体外から可視光を照射することでりん光を観察することができる。これにより、癌組織を非侵襲的かつ高感度・選択的に可視化できる。また、りん光は画像化できるため、癌検出用のイメージング試薬としても使用できる。
また、イリジウム錯体は、実験動物を用いた癌の研究や癌治療薬の評価などにも使用することができる。
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
合成例１
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btq)2Ir(acac)）の合成
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btq)2Ir(acac)）の合成
2-ベンゾチエニルキノリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（990mg，5.6mmol），2-クロロキノリン（937mg，5.7mmol）をトルエン（20ml），エタノール（10ml）に溶解させ，パラジウム触媒（200mg，0.17mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。
反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をトルエンで洗浄した（収量：888mg，収率：61%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.20-8.17(1H, d), 8.15-8.12(1H, d), 7.98(1H, S), 7.96-7.93(1H, d), 7.91-7.88(1H, q), 7.86-7.83(1H, q), 7.82-7.79(1H, d), 7.75-7.70(1H, t), 7.55-7.50(1H, t), 7.39-7.36(2H, q)
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（990mg，5.6mmol），2-クロロキノリン（937mg，5.7mmol）をトルエン（20ml），エタノール（10ml）に溶解させ，パラジウム触媒（200mg，0.17mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。
反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をトルエンで洗浄した（収量：888mg，収率：61%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.20-8.17(1H, d), 8.15-8.12(1H, d), 7.98(1H, S), 7.96-7.93(1H, d), 7.91-7.88(1H, q), 7.86-7.83(1H, q), 7.82-7.79(1H, d), 7.75-7.70(1H, t), 7.55-7.50(1H, t), 7.39-7.36(2H, q)
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
2-ベンゾチエニルキノリン（581mg，2.2mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，392mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（304mg，0.20mmol）に2-メトキシエタノール（25ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（170mg）を加え還流を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：262mg，収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.17-8.14(2H, d), 8.01-7.98(2H, d), 7.85-7.83(2H, d), 7.75-7.73(2H, d), 7.71-7.68(2H, d), 7.37-7.32(2H, t), 7.73-7.23(2H, t), 7.02-6.97(2H, t), 6.57-6.52(2H, t), 6.32-6.30(2H, d), 4.63(1H, s), 1.55(6H, s)
2-ベンゾチエニルキノリン（581mg，2.2mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，392mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（304mg，0.20mmol）に2-メトキシエタノール（25ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（170mg）を加え還流を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：262mg，収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.17-8.14(2H, d), 8.01-7.98(2H, d), 7.85-7.83(2H, d), 7.75-7.73(2H, d), 7.71-7.68(2H, d), 7.37-7.32(2H, t), 7.73-7.23(2H, t), 7.02-6.97(2H, t), 6.57-6.52(2H, t), 6.32-6.30(2H, d), 4.63(1H, s), 1.55(6H, s)
合成例２
ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btiq)2Ir(acac)）の合成
ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btiq)2Ir(acac)）の合成
1-ベンゾチエニルイソキノリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（997mg，5.6mmol），1-クロロイソキノリン（94
6mg，5.8mmol）をトルエン（20ml），エタノール（10ml）に溶解させ，パラジウム触媒（220mg，0.19mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.16g，収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.62-8.60(2H, d), 7.96-7.87(3H, m), 7.84(1H, s), 7.78-7.73(1H, d), 7.71-7.67(1H, d), 7.65-7.63(1H, d), 7.42-7.39(2H, m)
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（997mg，5.6mmol），1-クロロイソキノリン（94
6mg，5.8mmol）をトルエン（20ml），エタノール（10ml）に溶解させ，パラジウム触媒（220mg，0.19mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.16g，収率：79%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.62-8.60(2H, d), 7.96-7.87(3H, m), 7.84(1H, s), 7.78-7.73(1H, d), 7.71-7.67(1H, d), 7.65-7.63(1H, d), 7.42-7.39(2H, m)
ビス[1-(2'-ベンゾチエニル)-キノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
1-ベンゾチエニルイソキノリン（574mg，2.2mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，398mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（250mg，0.17mmol）に2-メトキシエタノール（30ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（150mg）を加え還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：50mg，収率：18%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.92-8.88(2H, d), 8.22-8.19(2H, d), 7.88-7.84(2H, m), 7.68-7.64(4H, m), 7.56-7.54(2H, d), 7.32-7.27(2H, m), 6.94-6.91(2H, d), 6.56-6.53(2H, m), 6.18-6.14(2H, d), 5.12(1H, s), 1.63(6H, s)
1-ベンゾチエニルイソキノリン（574mg，2.2mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，398mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（250mg，0.17mmol）に2-メトキシエタノール（30ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（150mg）を加え還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：50mg，収率：18%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.92-8.88(2H, d), 8.22-8.19(2H, d), 7.88-7.84(2H, m), 7.68-7.64(4H, m), 7.56-7.54(2H, d), 7.32-7.27(2H, m), 6.94-6.91(2H, d), 6.56-6.53(2H, m), 6.18-6.14(2H, d), 5.12(1H, s), 1.63(6H, s)
合成例３
ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btph)2Ir(acac)）の合成
ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btph)2Ir(acac)）の合成
9-クロロフェナンスリジンの合成
フェナンスリジノン（2.0g）にオキシ塩化リン（15ml），ジメチルアニリン（0.63ml）を加え，3時間還流した。溶液を水に注ぎクロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：2.1g，収率：96%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.63-8.60(1H, d), 8.55-8.52(1H, d), 8.50-8.48(1H, d), 8.11-8.09(1H, d), 7.94-7.92(1H, t), 7.79-7.66(3H, m)
フェナンスリジノン（2.0g）にオキシ塩化リン（15ml），ジメチルアニリン（0.63ml）を加え，3時間還流した。溶液を水に注ぎクロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：2.1g，収率：96%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.63-8.60(1H, d), 8.55-8.52(1H, d), 8.50-8.48(1H, d), 8.11-8.09(1H, d), 7.94-7.92(1H, t), 7.79-7.66(3H, m)
9-ベンゾチエニルフェナンスリジリンの合成
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（884mg，5.0mmol），9-クロロフェナンスリジリン（1.0g，4.8mmol）をテトラヒドロフラン（30ml），パラジウム触媒（160mg，0.14mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.15g，収率：78%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.74-8.71(1H, d), 8.67-8.65(1H, d), 8.62-8.59(1H), 8.26-8.23(1H, d), 7.97-7.88(3H, m), 7.86(1H, s), 7.80-7.67(3H, m), 7.44-7.41(2H)
ベンゾ[b]チオフェン-2-イルボロン酸（884mg，5.0mmol），9-クロロフェナンスリジリン（1.0g，4.8mmol）をテトラヒドロフラン（30ml），パラジウム触媒（160mg，0.14mmol），2M炭酸ナトリウム水溶液（20ml）を加え，N2置換下，5時間還流した。反応溶液を水に注ぎ，クロロホルムで抽出を行い，クロロホルム溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：1.15g，収率：78%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.74-8.71(1H, d), 8.67-8.65(1H, d), 8.62-8.59(1H), 8.26-8.23(1H, d), 7.97-7.88(3H, m), 7.86(1H, s), 7.80-7.67(3H, m), 7.44-7.41(2H)
ビス[9-(2'-ベンゾチエニル)-フェナンスリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
9-ベンゾチエニルフェナンスリジリン（706mg，2.3mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，398mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（343mg，0.20mmol）に2-メトキシエタノール（20ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（180mg）を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：293mg，収率：80%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 9.35-9.33(2H, d), 8.72-8.70(2H, d), 8.46-8.44(2H, d), 7.98-7.87(4H, m), 7.85-7.82(2H, d), 7.73-7.70(2H, d), 7.43-7.38(2H, t), 7.20-7.15(2H, t), 7.04-6.99(2H, m), 6.52-6.51(4H, d), 4.50(1H, s), 1.39(6H, s)
9-ベンゾチエニルフェナンスリジリン（706mg，2.3mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，398mg，1.0mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（343mg，0.20mmol）に2-メトキシエタノール（20ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（180mg）を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて生成した（収量：293mg，収率：80%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 9.35-9.33(2H, d), 8.72-8.70(2H, d), 8.46-8.44(2H, d), 7.98-7.87(4H, m), 7.85-7.82(2H, d), 7.73-7.70(2H, d), 7.43-7.38(2H, t), 7.20-7.15(2H, t), 7.04-6.99(2H, m), 6.52-6.51(4H, d), 4.50(1H, s), 1.39(6H, s)
（合成例４）
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-ベンゾキノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btbq)2Ir(acac)）の合成
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-ベンゾキノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）（(btbq)2Ir(acac)）の合成
3-アミノ-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレンの合成
3-アミノ-2-ナフトエ酸（1g，5.3mmol）を乾燥テトラヒドロフラン（40ml）に溶解させ，水素化アルミニウムリチウム（0.46g，12mmol）をゆっくりと加え，N2置換下，3時間還流した。反応溶液に水を加え，ろ過し，ろ液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル）を用いて精製した（収量：910mg，収率：99%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ7.69-7.67(1H, d), 7.61-7.58(1H, d), 7.58(1H,
s), 7.39-7.34(1H, t), 7.26-7.20(1H, t), 7.03(1H, s), 4.86-4.84(2H, d), 4.38(2H,
br), 3.50-3.48(1H, s)
3-アミノ-2-ナフトエ酸（1g，5.3mmol）を乾燥テトラヒドロフラン（40ml）に溶解させ，水素化アルミニウムリチウム（0.46g，12mmol）をゆっくりと加え，N2置換下，3時間還流した。反応溶液に水を加え，ろ過し，ろ液を酢酸エチルで抽出した。酢酸エチル溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル）を用いて精製した（収量：910mg，収率：99%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ7.69-7.67(1H, d), 7.61-7.58(1H, d), 7.58(1H,
s), 7.39-7.34(1H, t), 7.26-7.20(1H, t), 7.03(1H, s), 4.86-4.84(2H, d), 4.38(2H,
br), 3.50-3.48(1H, s)
3-(トリメチルアセトアミド)-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレンの合成
3-アミノ-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレン（1g，5.5mmol），ジイソプロピルエチルアミン（0.86g，8.6mmol）をクロロホルム（40ml）に溶解させ，0℃に冷却し，トリメチルアセチルクロリド（0.84g，7.0mmol）のクロロホルム溶液（10ml）を約15分かけて滴下した。0℃で1時間撹拌し，さらに室温で１晩撹拌した。反応液に水を加え，クロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル：クロロホルム（9:1））を用いて精製した（収量：795mg，収率：56%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ9.14(1H, br), 8.72(1H, s), 7.82-7.80(1H, d),
7.75-7.72(1H, d), 7.64(1H, s), 7.46-7.42(2H, m), 4.90-4.89(2H, d), 1.38(9H, s)
3-アミノ-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレン（1g，5.5mmol），ジイソプロピルエチルアミン（0.86g，8.6mmol）をクロロホルム（40ml）に溶解させ，0℃に冷却し，トリメチルアセチルクロリド（0.84g，7.0mmol）のクロロホルム溶液（10ml）を約15分かけて滴下した。0℃で1時間撹拌し，さらに室温で１晩撹拌した。反応液に水を加え，クロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：酢酸エチル：クロロホルム（9:1））を用いて精製した（収量：795mg，収率：56%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ9.14(1H, br), 8.72(1H, s), 7.82-7.80(1H, d),
7.75-7.72(1H, d), 7.64(1H, s), 7.46-7.42(2H, m), 4.90-4.89(2H, d), 1.38(9H, s)
3-(トリメチルアセトアミド)-2-ナフトアルデヒドの合成
3-(トリメチルアセトアミド)-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレン（0.8g，2.9mmol）をクロロホルム（90ml）に溶解させ二酸化マンガン（3.6g，41mmol）を加え撹拌した。薄層クロマトグラフで反応を追跡し，適宜，二酸化マンガン（総量5.47g，63mmol）を加え，室温で１晩撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し，ろ液を減圧乾固した（収量：753mg，収率：99%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ11.24(1H, br), 10.11(1H, s), 9.22(1H, s), 8.23(1H, s), 7.92-7.89(1H, d), 7.86-7.83(1H, d), 7.64-7.60(1H, t), 7.47-7.44(1H, t
), 1.40(9H, s)
3-(トリメチルアセトアミド)-2-(ヒドロキシルメチル)ナフタレン（0.8g，2.9mmol）をクロロホルム（90ml）に溶解させ二酸化マンガン（3.6g，41mmol）を加え撹拌した。薄層クロマトグラフで反応を追跡し，適宜，二酸化マンガン（総量5.47g，63mmol）を加え，室温で１晩撹拌した。反応溶液をセライトでろ過し，ろ液を減圧乾固した（収量：753mg，収率：99%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ11.24(1H, br), 10.11(1H, s), 9.22(1H, s), 8.23(1H, s), 7.92-7.89(1H, d), 7.86-7.83(1H, d), 7.64-7.60(1H, t), 7.47-7.44(1H, t
), 1.40(9H, s)
3-アミノ-2-ナフトアルデヒドの合成
3-(トリメチルアセトアミド)-2-ナフトアルデヒド（0.8g，3.1mmol）を2NHCl（120ml），エタノール（60ml）に溶解させ１晩（15時間）還流した。溶液を室温まで空冷し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でpH8にした。析出物をろ過し，ろ液をクロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した（収量：300mg，収率：57%）。1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ10.09(1H, s), 8.08(1H, s), 7.78-7.75(1H, d),
7.57-7.53(1H, d), 7.47-7.43(1H, t), 7.22-7.20(1H, t), 6.93(1H, s), 5.77(2H, br)
3-(トリメチルアセトアミド)-2-ナフトアルデヒド（0.8g，3.1mmol）を2NHCl（120ml），エタノール（60ml）に溶解させ１晩（15時間）還流した。溶液を室温まで空冷し，飽和炭酸水素ナトリウム水溶液でpH8にした。析出物をろ過し，ろ液をクロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した（収量：300mg，収率：57%）。1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ10.09(1H, s), 8.08(1H, s), 7.78-7.75(1H, d),
7.57-7.53(1H, d), 7.47-7.43(1H, t), 7.22-7.20(1H, t), 6.93(1H, s), 5.77(2H, br)
2-ベンゾチエニルベンゾキノリンの合成
2-アセチルベンゾチオフェン（0.37g，2.1mmol），3-アミノ-2-ナフトアルデヒド（0.35g，2mmol）をエタノール（45ml）に溶解させ，飽和水酸化カリウムのエタノール溶液（1ml）を加え，N2置換下，１晩還流した。反応液に水を加え，クロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をトルエンに溶かし，大量のヘキサンを加え析出させた（収量：500mg，収率：80%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ8.73(1H, s), 8.37(1H, s), 8.37-8.34(1H, d), 8.11-8.08(1H, d), 8.04-8.00(1H, t), 8.02(1H, s), 7.95-7.92(2H, d), 7.88-7.85(1H,
m), 7.55-7.54(2H, m), 7.40-7.38(2H, m)
2-アセチルベンゾチオフェン（0.37g，2.1mmol），3-アミノ-2-ナフトアルデヒド（0.35g，2mmol）をエタノール（45ml）に溶解させ，飽和水酸化カリウムのエタノール溶液（1ml）を加え，N2置換下，１晩還流した。反応液に水を加え，クロロホルムで抽出し，硫酸ナトリウムで乾燥し，ろ過後，ろ液を減圧乾固した。得られた固体をトルエンに溶かし，大量のヘキサンを加え析出させた（収量：500mg，収率：80%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ8.73(1H, s), 8.37(1H, s), 8.37-8.34(1H, d), 8.11-8.08(1H, d), 8.04-8.00(1H, t), 8.02(1H, s), 7.95-7.92(2H, d), 7.88-7.85(1H,
m), 7.55-7.54(2H, m), 7.40-7.38(2H, m)
ビス[2-(2'-ベンゾチエニル)-ベンゾキノリナート- N,C3']イリジウム（アセチルアセトン）の合成
2-ベンゾチエニルベンゾキノリン（500mg，1.61mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，300mg，0.77mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（340mg，0.2mmol）に2-メトキシエタノール（20ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（170mg）を加え還流を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて精製した（収量：60mg，収率：33%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.61-8.60(2H, d), 8.34-8.32(4H, m), 7.95-7.88(4H, m), 7.89(2H, s), 7.67-7.65(4H, d), 6.98-6.95(4H, m), 6.49-6.47(4H, d), 4.51(1H, s), 1.60(6H, s)
2-ベンゾチエニルベンゾキノリン（500mg，1.61mmol），塩化イリジウム三水和物（純度：90％，300mg，0.77mmol）に2-エトキシエタノール（30ml），水（10ml）を加え，16時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体（340mg，0.2mmol）に2-メトキシエタノール（20ml），アセチルアセトン（1ml），炭酸ナトリウム（170mg）を加え還流を加え2時間還流した。溶液を室温まで冷却し生成した固体をろ過した。得られた固体をカラムクロマトグラフィー（展開溶媒：クロロホルム）を用いて精製した（収量：60mg，収率：33%）。
1H HNR (300 MHz, CDCl3, TMS, RT)：δ 8.61-8.60(2H, d), 8.34-8.32(4H, m), 7.95-7.88(4H, m), 7.89(2H, s), 7.67-7.65(4H, d), 6.98-6.95(4H, m), 6.49-6.47(4H, d), 4.51(1H, s), 1.60(6H, s)
りん光スペクトルの測定
上記で合成された (btq)2Ir(acac)、(btiq)2Ir(acac)、(btph)2Ir(acac)、(btbq)2Ir(acac)と、対照の(btp)2Ir(acac)を１，２−ジクロロエタンに溶解し、室温で吸収、りん光スペクトルの測定を行った。結果を図１と表１に示す。
上記で合成された (btq)2Ir(acac)、(btiq)2Ir(acac)、(btph)2Ir(acac)、(btbq)2Ir(acac)と、対照の(btp)2Ir(acac)を１，２−ジクロロエタンに溶解し、室温で吸収、りん光スペクトルの測定を行った。結果を図１と表１に示す。
(btq)2Ir(acac)，(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac)，(btbq)2Ir(acac)の吸収帯は，(btp)2Ir(acac)の吸収帯と比較して，約60nm長波長側に観測され（図１），また分子吸光係数も増加しており，(btph)2Ir(acac), (btbq)2Ir(acac)においては約2倍に増加している。(btq)2Ir(acac)，(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac), (btbq)2Ir(acac)のりん光は，(btp)2Ir(acac)のりん光と比較して長波長側に観測され，特に(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac), (btbq)2Ir(acac)においては，りん光極大波長が近赤外領域に観測される。(btph)2Ir(acac)のりん光量子収率は0.29（(btp)2Ir(acac)では0.32）であり，りん光量子収率をほとんど減少させることなく，長波長化に成功している。以上のことから，(btq)2Ir(acac)，(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac), (btbq)2Ir(acac)は，(btp)2Ir(acac)を用いたときよりも，皮膚から深い低酸素領域を可視化できると期待される。
(btq)2Ir(acac)のりん光強度に対する溶存酸素の効果
細胞膜のモデルとしてリン脂質DMPC（dimyristoyl-phosphatidylcholine）でできた単層ベシクル (ULV; unilamellar vesicle)を用い、(btq)2Ir(acac)のりん光強度に対する溶存酸素の効果を調べた。図２にDMPC膜存在下（1mM）における(btq)2Ir(acac)（10μM）のりん光スペクトルを、Ar（アルゴン）置換溶液，空気飽和溶液，1atm酸素飽和溶液で測定した結果を比較して示す。その結果、３５℃と１５℃のいずれの場合においても、Ar置換溶液に比べて溶存酸素存在下では(btq)2Ir(acac)のりん光強度が著しく減少し，酸素による消光を大きく受けていることが分かる。35℃でのこれらの溶液中におけるりん光強度比は，6:1:0.2，15℃では3:1:0.3であった。
なお、DMPC単層膜はエタノールインジェクション法を用いて作成した。DMPC膜は温度23℃で相転移し、23℃以下ではゲル状態、23℃以上では液晶状態を取る。
細胞膜のモデルとしてリン脂質DMPC（dimyristoyl-phosphatidylcholine）でできた単層ベシクル (ULV; unilamellar vesicle)を用い、(btq)2Ir(acac)のりん光強度に対する溶存酸素の効果を調べた。図２にDMPC膜存在下（1mM）における(btq)2Ir(acac)（10μM）のりん光スペクトルを、Ar（アルゴン）置換溶液，空気飽和溶液，1atm酸素飽和溶液で測定した結果を比較して示す。その結果、３５℃と１５℃のいずれの場合においても、Ar置換溶液に比べて溶存酸素存在下では(btq)2Ir(acac)のりん光強度が著しく減少し，酸素による消光を大きく受けていることが分かる。35℃でのこれらの溶液中におけるりん光強度比は，6:1:0.2，15℃では3:1:0.3であった。
なお、DMPC単層膜はエタノールインジェクション法を用いて作成した。DMPC膜は温度23℃で相転移し、23℃以下ではゲル状態、23℃以上では液晶状態を取る。
癌細胞中における酸素濃度の可視化
癌細胞（Hela細胞）を低酸素（5%O2）の状態と、通常の状態（20%O2）で培養し、(btq)2Ir(acac) （5% DMSO溶液：最終濃度50 μM)を加えて37℃で2時間培養し、けい光顕微鏡でりん光を観測した。りん光測定結果を図３に示す。
その結果、低酸素状態では通常の状態に比べてより強く明瞭な赤色りん光が観測された。(btq)2Ir(acac)投与後、4時間でも明瞭な赤色りん光が見られることから、(btq)2Ir(acac)の細胞に対する毒性は低く、細胞内での安定性も高いことが分かる。
癌細胞（Hela細胞）を低酸素（5%O2）の状態と、通常の状態（20%O2）で培養し、(btq)2Ir(acac) （5% DMSO溶液：最終濃度50 μM)を加えて37℃で2時間培養し、けい光顕微鏡でりん光を観測した。りん光測定結果を図３に示す。
その結果、低酸素状態では通常の状態に比べてより強く明瞭な赤色りん光が観測された。(btq)2Ir(acac)投与後、4時間でも明瞭な赤色りん光が見られることから、(btq)2Ir(acac)の細胞に対する毒性は低く、細胞内での安定性も高いことが分かる。
以上より、(btq)2Ir(acac)のりん光を測定することにより、低酸素細胞（hypoxia）を可視化することができ、さらにFLIM (Fluorescence Lifetime Imaging) 法等の技術を用いてりん光寿命を測定することにより、細胞内や組織の酸素濃度を非侵襲的に定量するこ
とができることが示唆された。
また、(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac)，(btbq)2Ir(acac)についても同様の効果が予測された。
とができることが示唆された。
また、(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac)，(btbq)2Ir(acac)についても同様の効果が予測された。
癌組織の可視化
図４に扁平上皮癌を移植したマウスの尻尾の静脈から(btq)2Ir(acac) （10% DMSO溶液：最終濃度50 μM)を投与し、投与直後と投与30分後にin vivo イメージングシステムMaestro（Krabo社）を用いて発光を観測した結果を示す。励起波長は503〜555nm、検出波長は＞580nmである。
投与後30分に腫瘍部からりん光が観測された。癌細胞は正常細胞に比べて低酸素状態にあるため、酸素による消光を受けにくく、より強い発光が現れている。なお、(btq)2Ir(acac)を投与していないコントロールマウスの各臓器では、胃、腸の一部を除き上記環境下ではりん光、けい光は観測できなかった。胃、腸のけい光は餌によるものである。
図４に扁平上皮癌を移植したマウスの尻尾の静脈から(btq)2Ir(acac) （10% DMSO溶液：最終濃度50 μM)を投与し、投与直後と投与30分後にin vivo イメージングシステムMaestro（Krabo社）を用いて発光を観測した結果を示す。励起波長は503〜555nm、検出波長は＞580nmである。
投与後30分に腫瘍部からりん光が観測された。癌細胞は正常細胞に比べて低酸素状態にあるため、酸素による消光を受けにくく、より強い発光が現れている。なお、(btq)2Ir(acac)を投与していないコントロールマウスの各臓器では、胃、腸の一部を除き上記環境下ではりん光、けい光は観測できなかった。胃、腸のけい光は餌によるものである。
以上の実験結果が示すように、(btq)2Ir(acac)を投与しそのりん光を測定することにより、低酸素状態にある癌組織を非侵襲的かつ高感度・選択的に可視化できる。また、(btq)2Ir(acac)を用いた場合、(btp)2Ir(acac)で用いる励起光(445〜490nm)よりも長波長の光を用いることができ，皮膚から深い場所にある腫瘍の可視化が期待される。また、(btiq)2Ir(acac)，(btph)2Ir(acac)，(btbq)2Ir(acac)についても同様の効果が予測された。
本発明の酸素濃度検出試薬によれば、生きた細胞や組織中の酸素濃度を非侵襲的に高感度かつリアルタイムで定量することができ、細胞内酸素濃度定量試薬，低酸素細胞画像化薬などとして有用である。また、癌組織が低酸素状態にあることを利用した癌組織の診断にも利用でき、低酸素腫瘍診断試薬などとしても有用である。
Claims (8)
- Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を含む酸素濃度測定試薬であって、前記錯体が下記いずれかである、酸素濃度測定試薬。
- Ir(III)を中心金属とし、芳香族系分子を配位子とする錯体を含む癌の診断薬であって、前記錯体が下記いずれかである、癌の診断薬。
- 下記いずれかの錯体。
- 下記一般式で表わされる錯体。
XおよびYは 水素、またはアルキル基，アルコキシ基，アミノ基，ジメチルアミノ基，トリフルオロメチル基，シアノ基，アセチル基、カルボキシル基，アルキルエステル基，およびアルキルアミド基から選択される置換基を示す。 - ｚが１であり、ｍが２かつｎが０であるか、またはｍが０かつｎが２である、請求項４に記載の錯体。
- ＸおよびＹが水素である、請求項５に記載の錯体。
- 請求項４〜６のいずれか一項に記載の錯体を含む酸素濃度測定試薬。
- 請求項４〜６のいずれか一項に記載の錯体を含む癌の診断薬。
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