JP2010022326A - 幹細胞から分化誘導した線維芽細胞及び人工真皮 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】紫麦の種子抽出物により、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導を顕著に促進させることで、幹細胞から線維芽細胞または人工真皮の作製を極めて効率的に行うことが可能となる。また、作製した線維芽細胞または人工真皮は、皮膚組織へ移植した場合、組織の再生能力を著しく向上させる。
【選択図】なし
Description
さらに、近年、骨髄以外にも、肝臓、膵臓、脂肪など、あらゆる臓器・組織に幹細胞が存在することが明らかにされ、各臓器・組織の再生および恒常性維持を司っていることがわかってきた(非特許文献2〜5参照)。また、各組織に存在する幹細胞は可塑性に優れており、今まで自己複製が不可能であった臓器や組織の再生にも利用できる可能性がある。
近年、これらの幹細胞を、臓器や組織の再生へ応用するため、細胞移植治療や組織工学(再生医療や再生美容)の分野において研究が進められている(非特許文献6)。
また、幹細胞は他の細胞に比べて分裂能が高く、胚性幹細胞(ES細胞)などは、ほぼ無限に増殖すると考えられている(非特許文献7)。
幹細胞の持つこの能力は、今後の再生医療や再生美容には極めて重要である。すなわち、再生医療や再生美容では組織を再生するための細胞が必要であり、この細胞に限りがあっては、十分に組織を再生できない。この点、幹細胞は無限に増殖することが可能であり、かつ多能性も備えていることから、組織再生用の細胞又は組織を無限に調製できる細胞として期待が大きい。
すなわち、生体外において幹細胞を培養し、目的の細胞に自由自在に分化誘導させ、再生したい臓器や組織に類似した三次元的な構築を行う技術を開発できれば、今後の再生医療や再生美容の飛躍的な発展が望める。
Phillips T. et al., J. Am. Acad. Dermatol., 1989,21,191−199 H.Green et al., PNAS,2003,100,15625−15630 H.Green,O.Kehinde,J.Thomas,PNAS USA,1979,76,5665−5668
(1)幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、線維芽細胞。
(2)幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、人工真皮。
(3)幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、線維芽細胞又は人工真皮の製造方法。
(4)紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進剤。
(5)前記(1)記載の線維芽細胞を含有することを特徴とする、医薬組成物。
(6)幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養した、線維芽細胞及び/又は人工真皮を用いることを特徴とする、皮膚の再生方法。
紫麦の種子50gに精製水500mLを加え、95〜100℃で1時間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦(種子)の熱水抽出物を9.2g得た。
紫麦の種子50gに50(v/v)%エタノール500mLを加え、常温で5日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦(種子)の50%エタノール抽出物を3.8g得た。
紫麦の種子50gにエタノール500mLを加え、常温で5日間抽出した後、濾過し、その濾液を濃縮乾固して、紫麦(種子)のエタノール抽出物を1.2g得た。
ヒト幹細胞培養液(TOYOBO社製)を用いて培養したヒト体性幹細胞(DSファーマバイオメディカル社製)を96wellプレートに5x103個播種し、紫麦の種子抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加して7日間培養を続けた。7日後、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導効率について評価した。線維芽細胞への分化誘導効果の指標としては、1型コラーゲンの遺伝子発現(発現が高いほど線維芽細胞へ分化が促進した)を測定した。具体的には、細胞からTaqMan GENE Expression Cells−to−CtTMkit(アプライドバイオシステム社)を用いてmRNAを抽出し、リアルタイムPCRにより1型コラーゲンの遺伝子発現を測定した。
抽出物未添加時のコラーゲン遺伝子の発現をコントロール(100%)とした場合の、紫麦の種子抽出物(製造例1〜3)添加時のコラーゲン発現の増減(%)を算出し、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進効果の評価を行った。
なお、本実験例では、一般的に線維芽細胞の分化誘導因子として使用されているFibroblast Growth Factor(FGF:線維芽細胞成長因子)10ng/mL(Pepro Tech社製)を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞(ES細胞)、その他、未分化な状態の細胞(体性幹細胞)についても試験を行ったところ、同様な効果が確認できた。
幹細胞用無血清培地STK2(DSファーマバイオメディカル社製)を用いて、マウス皮下脂肪組織由来幹細胞を培養し、増殖した幹細胞を、6cmディッシュに1x106個播種した。播種1日後、細胞の生着を確認し、線維芽細胞へ分化誘導を行った。具体的には、Dulbeco‘s Modifide Eagle Medium(D−MEM)培地(GIBCO社製)に、ITS−Xサプリメント(100倍希釈、GIBCO社製)、ペニシリン(100unit/mL、Sigma社製)とストレプトマイシン(100μg/mL、Sigma社製)、ウシ血清(Sigma社製、2%)に紫麦の種子抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加した分化誘導用の培養液に換え、引き続き14日間培養を続けた。これにより、幹細胞から線維芽細胞へ分化誘導した。なお、抽出物(製造例1〜3)を添加しない培養液にて、同様に作製した線維芽細胞をコントロールとし、また、一般的に線維芽細胞の分化誘導因子として使用されているFibroblast Growth Factor(FGF:線維芽細胞成長因子)10ng/mL(Pepro Tech社製)を陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
バイオプシーパンチ(KAI社)を用いて、ヌードマウスの背部に直径5mmの創傷部位を作製し、実験例2で作製した線維芽細胞(コントロール、FGFまたは各抽出物を添加して作製したもの)をそれぞれ創傷部位に移植した。具体的には、調製した線維芽細胞1x108個を生理食塩水(大塚製薬工業社製)10μLに懸濁し、創傷部に注射器にて直接投与した。その後、移植部位はテガダームTM(3M社)で保護し、14日間飼育を行った。14日目にそれぞれの創傷部位の直径mmを測定し、コントロールを移植した創傷部位の直径mmをコントロール(100%)とし、これに対して、FGFまたは紫麦の種子抽出物(製造例1〜3)を用いて作製した各線維芽細胞を移植した創傷部位の直径mmを算出し、創傷部位の再生能力について比較した。
すなわち、コントロールより皮膚の再生能力が高ければ、創傷部位の直径mmは小さくなることから、この変化を相対的に算出し、再生能力(%)として示した。
以上より、本製造方法により幹細胞から紫麦の種子抽出物を用いて分化誘導させた線維芽細胞は、極めて高い皮膚の再生能力を示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞(ES細胞)、その他、未分化な状態の細胞(体性幹細胞)についても同様な試験を行ったところ、いずれも顕著な皮膚の再生能力の向上が認められた。
ヒト幹細胞培養液(TOYOBO社製)を用いて培養したヒト体性幹細胞(DSファーマバイオメディカル社製)を、1型コラーゲンゲル(新田ゼラチン社製)に1.5x105個/mLの濃度で包埋し、24wellプレートに播種して人工真皮をさらに7日間培養し、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導を促進させつつ人工真皮を作製した。この時に、紫麦の抽出物(製造例1〜3)を最終濃度が0.001%になるように添加し7日間培養した。なお、紫麦の抽出物(製造例1〜3)を添加しないで作製した人工真皮をコントロールとし、また、一般的に線維芽細胞の分化誘導因子として使用されているFibroblast Growth Factor(FGF:線維芽細胞成長因子)10ng/mL(Pepro Tech社製)を添加した培養液にて作製したものを陽性コントロールとして設定し、比較対象とした。
バイオプシーパンチ(KAI社)を用いて、ヌードマウスの背部に直径5mmの創傷部位を作製し、実験例4で作製した各人工真皮(コントロール及び各抽出物を添加して作製したもの)をそれぞれ創傷部位に移植した。移植部位はテガダームTM(3M社)で保護し、その後7日間飼育を行った。7日目にそれぞれの創傷部位の直径mmを測定し、コントロールを移植した創傷部位の直径mmをコントロール(100%)とし、これに対して、FGFまたは紫麦の種子抽出物(製造例1〜3)を用いて作製した各人工真皮を移植した創傷部位の直径mmを算出し、創傷部位の再生能力について比較した。
すなわち、コントロールより皮膚の再生能力が高ければ、創傷部位の直径mmは小さくなることから、この変化を相対的に算出し、再生能力(%)として示した。
なお、本実験例で用いた幹細胞以外にも、胚性幹細胞(ES細胞)、その他、未分化な状態の細胞(体性幹細胞)についても同様な試験を行ったところ、いずれも顕著な皮膚の再生能力の向上が認められた。
すなわち、本発明は、再生医療、再生美容における、幹細胞から線維芽細胞への分化誘導促進剤であり、かつ、幹細胞からの線維芽細胞や人工真皮の作製技術及び皮膚の再生技術として利用が可能である。
Claims (6)
- 幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、線維芽細胞。
- 幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、人工真皮。
- 幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養することを特徴とする、線維芽細胞又は人工真皮の製造方法。
- 紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物を含有することを特徴とする、幹細胞の線維芽細胞への分化誘導促進剤。
- 請求項1記載の線維芽細胞を含有することを特徴とする、医薬組成物。
- 幹細胞を紫麦(学名:Hordeum vulgare L.)の種子抽出物の存在下で培養した、線維芽細胞及び/又は人工真皮を用いることを特徴とする、皮膚の再生方法。
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