JP2009543099A - 親和性捕捉中の変性剤の使用 - Google Patents

親和性捕捉中の変性剤の使用 Download PDF

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Abstract

標的分子の親和性捕捉方法であって、標的分子を含む試料を得るステップと、変性剤の存在下で、担体に固定された、標的分子に特異的に結合する単鎖親和性分子又はその抗原結合部分で標的分子を親和性捕捉するステップとを含む方法が開示される。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本特許出願は、２００６年７月７日に出願された米国特許仮出願６０／８１８，９５７号明細書の利益を主張するものであり、該明細書は参照により組み込まれる。
発明の背景
親和性捕捉プロトコル、例えば、固体担体に結合された（ｃｏｕｐｌｅｄ又はｂｏｕｎｄ）抗体又は抗体様分子による標的タンパク質の捕捉は、当技術分野では周知である。これらのプロトコルには、単一の認識捕捉（例えば、免疫沈降）又は複数の認識捕捉（例えば、サンドイッチアッセイ）を含めることができる。非特異的結合（例えば、タンパク質が接触するビーズ若しくはプラスチックなどの材料との試料中の標的タンパク質を含むタンパク質の非特異的結合、又は非標的タンパク質と標的タンパク質との間の相互作用）は、結果に悪影響を与え得るため、これらのプロトコルは、例えば、（担体に結合された）抗体又は抗体様分子によるタンパク質の捕捉、及びこれに続く、非特異的結合物質を除去するための洗浄緩衝液での弱い界面活性剤又は塩類による（捕捉したタンパク質を有する）担体の洗浄により、非特異的結合を減少させようとするものである。界面活性剤又は塩類は、標的タンパク質構造を変性又は著しく変化させることはないが、その結果タンパク質を喪失させる。しかし、大規模な洗浄は、一般に標的タンパク質のある程度の喪失をもたらす。
本発明は、従来技術の少なくとも幾つかの短所を改善する。本発明のこれら及び他の長所は、以下に示す説明から明らかとなろう。
発明の簡単な概要
本発明の実施形態は、標的分子の親和性捕捉方法であって、少なくとも１つの変性剤の存在下で、担体に固定化された単鎖親和性分子又はその抗原結合部分で標的物質を親和性捕捉するステップを含む方法を提供する。本発明の好ましい実施形態は、少なくとも１つの変性剤の存在下で、固定化されたラクダ抗体又はその抗原結合部分で標的タンパク質を親和性捕捉するステップを含む。
本発明の別の実施形態は、担体と、担体に固定化された単鎖親和性分子又はその抗原部分と、少なくとも１つの緩衝液と、固定化された親和性分子又はその抗原結合部分を含有するのに適切なデバイスとを含む、標的分子の親和性捕捉用キットを提供する。典型的には、デバイスは、スピンデバイス、マルチプルウェルプレート（マルチプルウェルプレートは、スピンデバイスを含み得る）及び／又はクロマトグラフィーカラムを含む。好ましくは、キットは、キットを使用するための書面での説明書を含む挿入物を含む。
一実施形態では、キットは、担体に固定化された単鎖親和性分子を含むバイオチップを含む。
発明の詳細な説明
本発明の実施形態によれば、標的分子の親和性捕捉方法は、標的分子を含む試料を得るステップと、変性剤の存在下で、担体に固定化された、標的分子に特異的に結合する単鎖親和性分子又はその抗原結合部分で標的分子を親和性捕捉するステップとを含む。
本発明の別の実施形態では、標的分子の親和性捕捉用キットは、担体と、担体に固定化された単鎖親和性分子又はその抗原結合部分と、少なくとも１つの緩衝液と、固定化された親和性分子又はその抗原結合部分を含有するのに適切なデバイスとを含む。
好ましい実施形態では、単鎖親和性分子は、ラクダ抗体又はその抗原結合部分である。
任意の特定の機構に限定されるものではないが、変性剤は、試料中の標的分子及び他の分子の高次構造（例えば、３Ｄ構造）を変化させ、故に標的分子と非標的分子との間の結合を妨げる又は最小限にし、並びに担体及び親和性分子との非標的分子の結合を妨げる又は最小限にすると考えられる。しかし、変性剤が標的分子の高次構造を変化させると考えられる一方で、親和性分子は、試料中に存在する標的分子に特異的に結合する能力を維持する。
また、やはり任意の特定の機構に限定されるものではないが、非特異的結合は、これが生じた後で破壊されるというよりも、妨げられると考えられる。
有利には、本発明の実施形態は、非特異的結合物質、例えば、非特異的結合タンパク質を除去するための大規模な洗浄を必要としない、非特異的結合を減少させる方法、キット、及びシステムを提供する。
本発明の各構成要素は、これより、以下により詳細に記載される。
ジスルフィド結合で相互に結合した２つの重鎖（Ｈ）及び２つの軽鎖（Ｌ）である、４つのポリペプチド鎖を含む自然発生抗体（例えば、ＩｇＧ）とは対照的に、本発明の好ましい実施形態による親和性分子は、単鎖抗体、より好ましくは、重鎖抗体、さらにより好ましくは、ラクダ抗体の全部又は一部を含む。
別の実施形態では、親和性分子は、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（Ｈｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５、５８７９〜５８８３頁（１９８８年））として知られる、単一タンパク質鎖を含むことができる。
ラクダ抗体（例えば、ラクダ、ヒトコブラクダ、又はラマ由来の）は軽鎖がなく、重鎖が、単一のドメインである、ＶＨＨと呼ばれる免疫グロブリン重鎖の可変領域で抗原に結合する。ＶＨＨは、ＶＨＩＩＩファミリーの重鎖の可変ドメインと相同性を示す（Ｄｕｍｏｕｌｉｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、１１：５００〜５１５頁（２００２年））。
適切なラクダ抗体（例えば、所望の結合特異性を有する）及びこのフラグメント（すなわち、抗原結合部分を有す）は、当技術分野で周知の通り作製することができ、担体に固定化することができる（例えば、ｔｅｎ Ｈａａｆｔら、「Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｎｏｍｉｃｓ：Ｕｓｅ ｏｆ Ｃａｍｅｌｉｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｓｍａ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ、Ｓｍｅｊｋａｌ及びＬａｚａｒｅｖ（編）ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、２９〜４０頁（２００５年））。適切なラクダ抗体は市販もされている（例えば、商標名ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（登録商標）、ＢＡＣ Ｂ．Ｖ．社製（ナールデン、オランダ））。
抗体又はこのフラグメントは、標的分子抗原に特異的に結合又は特異的に免疫応答する。「特異的に結合する」とは、抗体結合がランダムではなく、抗体が、無関係の生物学的部分と比べて標的分子に差次的に（又は優先的に）結合することを意味する。抗体又はこのフラグメントは、抗原に対する何らかの親和性又は結合活性レベルを有することができる。
親和性分子は、種々の担体に固定化することができる。適切な担体には、例えば、ビーズ又は不規則形状粒子（例えば、直径約０．１ｍｍ以上のサイズ、典型的には直径５ミクロンから約５００ミクロンの範囲のサイズ）が挙げられる。ビーズ又は粒子は、クロマトグラフィーカラムに充填するのに使用できるクロマトグラフィー媒体を形成することができる。或いは、担体は、繊維（中空又はその他）、膜、又は例えば、ミクロンから数ミリメートルのサイズの孔で充満したスポンジ様材料の形態であってよい。
さらに別の実施形態では、担体は、「バイオチップ」又はマイクロアレイフォーマットが使用された場合、固体基質を含み、基質は、親和性分子又はその抗原結合部分が結合する、概して平坦な表面上に存在している。特定の実施形態では、固体担体は透明であってよい。バイオチップは、質量分析計プローブであってよい。この場面で好ましい固体担体には、金属、金属酸化物、シリコン、ガラス、ポリマー（例えば、プラスチックなどの有機ポリマー）、及び複合材料が挙げられる。これらの担体表面は、当技術分野で周知の通り、親和性分子又は結合タンパク質を結合するために修飾することができる。適切な金属には、例えば、金、アルミニウム、鉄、チタン、クロム、白金、銅及びこれらそれぞれの合金が挙げられる。このような金属は、結合反応基を提供するのに、例えば、二酸化シリコンで表面を誘導体化することができる。金属表面を誘導体化する１つの方法は、酸化シリコンなどの金属酸化物を金属表面にスパッタリングすることである。
本発明の実施形態によれば、担体は、有機材料を含んでよい。例示的な有機材料は、セルロース、デンプン、寒天、アガロース、及びデキストランなどの多糖類である。置換又は非置換のポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリビニル親水性ポリマー、ポリスチレン、ポリスルホン、並びにコポリマー又はスチレン及びジビニルベンゼンを含む、親水性合成ポリマーが意図される。或いは、無機材料が固体担体材料として使用されてよい。このような無機材料には、シリカなどの多孔質無機材料；ヒドロゲル含有シリカ、ジルコニア、チタニア、アルミナ；及び他のセラミック材料が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，２６８，０９７号明細書、第５，２３４，９９１号明細書、及び第５，０７５，３７１号明細書に開示されたもののような、例えば、２つの材料のコポリマー化により又は相互侵入網目により形成された、これらの材料の混合物、又は複合材料を使用することもできる。
担体、特に膜を含む担体として使用するための他の適切なポリマーには、多環芳香族、ポリスルホン（ポリエーテルスルホン、ビスフェノールＡポリスルホン、及びポリフェニルスルホンなどの芳香族ポリスルホンを含む）、ポリアミド、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリスチレン、ポリカルボネート、酢酸セルロース及び硝酸セルロース、フルオロポリマーなどのセルロースポリマー、並びにＰＥＥＫが挙げられる。
本発明の実施形態によれば、種々の変性剤は、個別に、連続して、又は併用して使用することができる。
変性剤は、例えば、１つ又は複数のカオトロピック剤、離液剤（ｌｙｏｔｒｏｐｉｃ ａｇｅｎｔ）、有機変性剤、及び／又は界面活性剤を含んでよい。好ましくは、変性剤が界面活性剤を含むような実施形態では、変性剤は、１つ又は複数のカオトロピック剤、離液剤、及び／又は有機変性剤も含む（例えば、変性剤は、カオトロピック剤、離液剤及び／又は有機変性剤に加えて、界面活性剤をさらに含む。）
カオトロピック剤には、種々の異なる化合物、例えば、尿素、ＣＮＳ−、及びＣＣｌ３ＣＯＯ−、グアニジンＨＣｌ、ＮＯ３ −、及びＣｌＯ４ −などを挙げることができる。
離液剤には、例えば、ＳＯ４ ２−、ＨＰＯ４ ２−、及び酢酸（ＣＨ３ＣＯＯ−）、例えば、酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）を挙げることができる
有機変性剤には、例えば、アセトニトリル（ＡＣＮ）を挙げることができる。
界面活性剤には、アニオン性、カチオン性、非イオン性、又は両イオン性界面活性剤を挙げることができる。
アニオン性界面活性剤には、例えば、デオキシコール酸、コール酸、及び望ましさは劣るが、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）を挙げることができ、カチオン性界面活性剤には、例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）を挙げることができる。非イオン性界面活性剤には、例えば、ジギトニン、トリトン、トウィーン及びノニデット４０（ＮＰ４０）を挙げることができ、両イオン性界面活性剤には、例えば、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＢｉｇＣＨＡＰ、ＣＨＡＰＳ、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−０８、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１０、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１２、ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１４、及びＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ３−１６を挙げることができる。
好ましくは、変性剤は、例えば、少なくとも１つの変性剤を含む変性剤液を提供するため、緩衝剤と共に利用される。種々の緩衝液、例えば、両イオン性、リン酸、酢酸、及び炭酸緩衝液が適切である。両イオン性緩衝液には、例えば、トリス緩衝液を挙げることができる。リン酸緩衝液、例えば、リン酸緩衝溶液には、例えば、リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム緩衝液を挙げることができる。
一実施形態では、変性剤は、尿素、ＣＨＡＰＳ、グアニジンＨＣｌ、ＣＴＡＢ、酢酸、及びアセトニトリルから成る群から選択される。
少なくとも１つの変性剤が尿素である幾つかの実施形態では、尿素は、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、少なくとも約．８Ｍ、又は少なくとも約１Ｍの濃度を有する。例えば、尿素は、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、約１Ｍから約９Ｍの範囲、又は、約１Ｍから約６Ｍの範囲の濃度を有してよい。
少なくとも１つの変性剤がＣＨＡＰＳである幾つかの実施形態では、ＣＨＡＰＳは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、少なくとも約０．１％、又は少なくとも約０．２５％の濃度を有する。例えば、ＣＨＡＰＳは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、約０．２５％から約２％の範囲の濃度を有してよい。
少なくとも１つの変性剤がグアニジンＨＣｌである幾つかの実施形態では、グアニジンＨＣｌは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、少なくとも約０．０３Ｍ、又は少なくとも約０．０５Ｍの濃度を有する。例えば、グアニジンＨＣｌは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、約０．０５Ｍから約２Ｍの範囲の濃度を有してよい。
少なくとも１つの変性剤がアセトニトリルである幾つかの実施形態では、アセトニトリルは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、少なくとも約８％、又は少なくとも約１０％の濃度を有する。例えば、アセトニトリルは、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、約１０％から約４０％の範囲の濃度を有してよい。
少なくとも１つの変性剤が酢酸である幾つかの実施形態では、酢酸は、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、少なくとも約３０ｍＭ、又は少なくとも約５０ｍＭの濃度を有する。例えば、酢酸は、試料及び／又は親和性分子と接触させる場合、約５０ｍＭから約２００ｍＭの範囲の濃度を有してよい。
上述の通り、変性剤は、個別に、連続して、又は併用して（例えば、２つ以上の薬剤を連続して、又は併用して、幾つかの実施形態では、３つ以上の薬剤を連続して、又は併用して）使用することができる。例えば、少なくとも２つの薬剤を利用する一実施形態では、カオトロピック剤（例えば、尿素）が、緩衝液で界面活性剤（例えば、ＣＨＡＰＳ）と併用して利用される。
標的分子と接触させる変性剤の濃度は、場合により、標的分子の変性及び／又は非特異的結合の減少を最適化するように調節することができる。
例えば、初期の高濃度の変性剤を、試料を含有する標的分子と混合することができ、変性剤の濃度は、この後の希釈で低下させることができる。例示的な例として、ヒト血清試料を、５Ｍの尿素濃度及び１．１％のＣＨＡＰＳ濃度が得られるように、９Ｍ尿素及び２％ＣＨＡＰＳを含有する変性剤と混合することができる。処理された血清は、次いで、２．２５Ｍ尿素及び０．５％ＣＨＡＰＳの変性剤濃度が得られるように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈することができる。初期の高濃度の変性剤は、有利には、試料中に存在する変性耐性標的分子を変性することができる。
親和性捕捉媒体への標的分子含有試料の適用は、恐らく、変性剤濃度も低下させる可能性がある。例えば、例えば緩衝溶液を含み得る親和性捕捉媒体への試料の適用は、変性剤濃度を低下させる可能性がある。しかし、このような低下は、標的分子の変性を著しく損ねることはないであろう。例示的な例として、親和性捕捉ビーズ及び緩衝溶液のスラリーは、スピンデバイス（例えば、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイス）で遠心分離することができ、ビーズ間及び／又はビーズ内に液体をほとんど残さない又は液体を残さない液体を提供する。ビーズ内及び／又はビーズ間に残った何らかの液体が、変性剤濃度をわずかに低下させる可能性はあるが、試料中の標的分子の変性を著しく損ねる可能性はない。
親和性捕捉媒体は、場合により、親和性捕捉媒体が、媒体に適用されるべき試料で見出される濃度と同じ又は類似の変性剤濃度を有するよう、媒体に試料を適用する前に平衡化することもできる。カラムの平衡化は、変性剤を媒体に適用した後、変性剤濃度を維持することで標的分子の変性を実質的に維持することができる。例示的な例として、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）樹脂を含むクロマトグラフィーカラムは、ＰＢＳ中２．２５Ｍ尿素を含む血清試料の適用前に、ＰＢＳ中２．２５Ｍ尿素溶液で洗浄することができる。カラムの平衡化は、親和性捕捉媒体中の液体が、標的分子の変性を損ねるように変性剤濃度を変えない場合には、必要としなくてよい。
一実施形態では、試料を、少なくとも１つの変性剤と接触させる。例えば、標的分子含有試料液を、変性剤含有液と結合させ、標的分子及び変性剤含有液を、この後、固定化された親和性分子と接触させる。
別の実施形態では、少なくとも１つの変性剤を試料及び固定化された親和性分子と接触させる前に、試料を、固定化された親和性分子と接触させる。例えば、少なくとも１つの変性剤を含有する液体を、１つ又は複数の標的分子及び１つ又は複数の固定化された親和性分子を含むスラリーに添加する。
さらに別の実施形態では、試料を少なくとも１つの変性剤と接触させる前に、少なくとも１つの変性剤を、固定化された親和性分子と接触させる。例えば、標的分子含有試料液体を、少なくとも１つの変性剤及び１つ又は複数の固定化された親和性分子を含むスラリーに添加する。
さらに別の実施形態では、標的分子含有試料液、少なくとも１つの変性剤、及び１つ又は複数の固定化された親和性分子を、同時に、又は本質的には同時に、互いに接触させる。
本発明の実施形態は、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、免疫沈降アッセイ、フローサイトメトリー、凝集反応、免疫拡散アッセイ、免疫電気泳動アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、及び免疫電子顕微鏡法を含むが、これらに限定されない、任意の親和性捕捉プロトコルによる使用に適しており、並びに試料の調製、臨床診断アッセイ、及び被検物、例えば、医薬研究における薬剤のスクリーニングに適しているが、これらに限定されない。
本発明の実施形態は、固定層、流動層、及びバッチクロマトグラフィーを使用する調製方法を含む、種々の方法において使用するのに適応し得る。或いは、実施形態は、スピンカラム又はマルチプルウェルプレート形式などのデバイスを利用する分離法、好ましくはハイスループット分離法の場面で実施することができる。所望であれば、このようなデバイスは、デバイス容積が測定可能な程度に小さい、例えば、数ナノリットルであり得る小型デバイスであってよい。
本発明は、病院及び実験室を含むがこれらに限定されない、任意の適切な状況で使用することができる。
本発明の実施形態は、例えば、液体試料中に存在する１つ又は複数の所望の標的分子を精製及び／若しくは濃縮する（例えば、親和性結合された（複数の）標的分子は、この後溶出及び回収される）ため、並びに／又は、例えば、これに限定されないが、プロテオミクス適用で使用するために、１つ又は複数の標的分子を除去した液体試料を提供するため、種々の試料及び／又は標的分子と共に使用するのに適している。本発明の実施形態は、２つ以上の異なる所望の標的分子を精製及び／若しくは濃縮するステップ、並びに／又は２つ以上の異なる標的分子を除去した液体試料を提供するステップを含む。
本発明の実施形態は、種々の標的分子、例えば、タンパク質、ペプチド、ウイルス、核酸、炭水化物、及び脂質を含む生物学的物質を親和性捕捉するのに適用できる。好ましくは、標的分子は、タンパク質又はペプチドである。より好ましくは、タンパク質は、免疫グロブリン、アルブミン、ホルモン、凝固因子、サイトカイン、又は酵素である。１つのより好ましいタンパク質は、免疫グロブリン、例えば、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体を含む全免疫グロブリンの他、このＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｃ及びＦｖフラグメントである。
生物学的物質は、典型的には、唾液、体液、尿、リンパ液、前立腺液、精液、乳汁、乳清、器官抽出物、植物抽出物、細胞抽出物、細胞培養培地、上清、発酵ブロス、腹水、溶解物、トランスジェニック植物及び動物抽出物、並びに緩衝液などの液体試料を含むが、これらに限定されない供給源に由来する、又は含有される。
本発明の実施形態は、生物医薬品産業で使用される液体（例えば、タンパク質性物質、例えば、抗体（例えば、モノクローナル抗体）、増殖因子などの組換えタンパク質、又は所望のペプチドなどの所望の物質を含む生物療法用液体（ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｌｕｉｄ））などのプロセス液体の処理に適し得る。親和性捕捉された所望の物質は、この後回収することができる。或いは、例示的な実施形態は、標的分子の体液を除去するため体液を処理するのに適し得る。例示的には、ヒト血清アルブミン及び／又はヒトＩｇＧは、血清及び／又は血漿試料から除去され得る。ヒト血清アルブミン及び／又はヒトＩｇＧは、血液循環中に他のタンパク質に結合し得る（並びにこれらのタンパク質−タンパク質相互作用は、血液採取、プロセシング、及び凍結融解サイクルの間維持されるほど十分に強力であり得る）ため、本発明の実施形態による体液からのいずれか一方のタンパク質又は両タンパク質の除去は、本来アルブミン及び／又はＩｇＧに結合する可能性のある他のタンパク質の喪失を減少させる又は最小限にする。
体液には、生体、特に血液（全血、温血又は冷血、及び保存血又は新鮮血；生理食塩水、栄養物、及び／又は抗凝固溶液を含むがこれらに限定されない、少なくとも１つの生理溶液で希釈された血液などの処理された血液；濃厚血小板（ＰＣ）、多血小板血漿（ＰＲＰ）、乏血小板血漿（ＰＰＰ）、無血小板血漿、血漿、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）、血漿から得られた成分、濃厚赤血球（ＰＲＣ）、移行領域（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ ｚｏｎｅ）物質又はバフィーコート（ＢＣ）などの血液成分；血液若しくは血液成分由来又は骨髄由来の血液産物；幹細胞；血漿から分離され、生理液又は凍結保護液に再懸濁された赤血球；及び血漿から分離され、生理液又は凍結保護液に再懸濁された血小板を含む）と関連した、任意の処理又は非処理液が挙げられる。体液は、本発明による処理前に、白血球の幾つかを除去するのに処理されていてよい。本明細書では、血液産物又は体液とは、上述の成分、並びに他の手段で得られた及び類似の特性を有する類似の血液産物又は体液を指す。
標的分子含有液が、ヒト血清又は血漿を含み、及び１回を超えて使用される幾つかの実施形態では、タンパク質の望ましくない変化及び／又は沈殿物増加の原因となり得る、複数の凍結融解サイクルを避けるため、液体は容器に分割することができる。
所望であれば、１つ又は複数の標的分子を含有する液体（例えば、ヒト血清又は血漿）は、変性剤と接触させる前に著しい沈殿物の存在について目視検査する。著しい沈殿物が存在する場合、標的分子含有液は、液体が希釈される（例えば、標的分子含有液は、液体試料を提供するため緩衝液と混合される）前後に濾過及び／又は遠心分離することができる。
１つ又は複数の標的分子を含有する液体試料は、固定化された親和性分子への少なくとも１つの標的分子の結合を可能にするのに十分な時間、少なくとも１つの変性剤の存在下で、固定化された単鎖親和性分子と接触される。典型的には、接触時間は、約３０秒から約１２時間の間である。
標的分子除去液は、好ましくは、固定化された親和性分子を含有するデバイスから除去液を通過させて、（標的分子が特異的に結合している）固定化された親和性分子から分離される。例えば、標的分子除去液は、（親和性分子が固定化されたビーズ又は粒子を充填された）クロマトグラフィーカラムから、又は（例えば、ウェル中に多孔質媒体を有し、親和性分子が多孔質媒体に固定化された）マルチプルウェルプレートから通過され得る。或いは、例えば、標的分子除去液は、ピペットで取り除くこともでき、親和性分子が固定化されたビーズ又は粒子を保持し、標的分子除去液の通過を可能にするスピンカラム又は（スピンデバイスも含み得る）マルチプルウェルプレートから通過させることもできる。
所望であれば、（複数の）標的分子を親和性分子から溶出し回収して、例えば、標的分子を精製及び／又は濃縮することができる。
種々のスピンデバイス、好ましくは分離媒体（例えば、ビーズ又は粒子に固定化された親和性分子がこの中を通過するのを防ぐのに十分な孔径を有する、膜又はフリットを含む）を含むスピンデバイスが、本発明の実施形態により使用され得る。適切な市販のスピンデバイスには、例えば、マイクロフュージ管の他、ＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅ及びＭＩＣＲＯＳＥＰ（商標）Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ ＤｅｖｉｃｅとしてＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（イーストヒルズ、ＮＹ）から入手可能な遠心分離デバイスなどのスピンカラムが挙げられる。或いは、適切な市販のスピンデバイスには、例えば、マルチプルウェル遠心分離デバイス又はマルチプルウェルプレート（例えば、商標名ＡＣＲＯＷＥＬＬ（商標）及びＡＣＲＯＰＲＥＰ（商標）のＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社製マルチプルウェルフィルタープレート）及び／又は、例えば、国際公開第２００２／０９６５６３号パンフレットに記載されたものが挙げられる。
種々の分離媒体は、本発明の実施形態によるスピンデバイス及び／又はマルチプルウェルプレートでの使用に適している。好ましい媒体は膜であり、幾つかの実施形態では、低タンパク質結合膜である。膜は、何らかの適切な多孔性を有することができる。幾つかの実施形態では、膜は微多孔膜である。幾つかの他の例示的な実施形態では、膜は、例えば、１０，０００分子量カットオフ（ｍｗｃｏ）以上、好ましくは、３０，０００ｍｗｃｏ以上、例えば、５０，０００ｍｗｃｏ、又は１００，０００ｍｗｃｏ、又はこれを超える限外濾過膜である。
しかし、本発明の他の実施形態は、スピンデバイスの使用を必要としない。例えば、上述の通り、クロマトグラフィーカラム（例えば、親和性分子又は抗原結合部分が固定化されたビーズ又は粒子を充填された）又はマルチプルウェルプレート（例えば、各ウェルが、親和性分子又は抗原結合部分が固定化された少なくとも１つの多孔質媒体（微多孔膜など）を含む）を利用することができる。また上述の通り、マルチプルウェルプレートを、スピンデバイス又は非スピンデバイスとして利用することができる。
本発明の実施形態によれば、担体；担体に固定化された単鎖親和性分子又はその抗原結合部分；少なくとも１つの緩衝液；及び、固定化された親和性分子又はその抗原結合部分を含有するのに適切なデバイスを含む、標的分子の親和性捕捉用キットが提供される。
好ましい実施形態では、単鎖親和性分子は、ラクダ抗体又はその抗原結合部分である。
幾つかの実施形態では、キットは、２つ以上の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含み、該分子又はその抗原結合部分は、異なる結合特異性を有する。例えば、キットは、１つのペプチド又はタンパク質、例えば、（例えば、１つの担体又は担体セット（例えば、ビーズ）に結合された）ＨＳＡに特異的な第１の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分、及び別のペプチド又はタンパク質、例えば、（例えば、別の担体又は担体セット（例えば、ビーズ）に結合された）ＩｇＧに特異的な第２の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含むことができる。
キットの実施形態は、１つ又は複数の以下のものをさらに含むことができる：キットを使用するための印刷された説明書、１つ又は複数の変性剤、１つ又は複数の容器、例えば、１つ又は複数の緩衝液、担体に結合された親和性分子の各々を含有するための個別容器、及び／又は１つ又は複数の変性剤の各々を含有するための個別容器。
キットの幾つかの実施形態では、担体は、ビーズ若しくは粒子、又は膜、繊維、又はバイオチップを含む。或いは、又はさらに、キットの幾つかの実施形態では、固定化された親和性分子を含有するのに適切なデバイスは、スピンデバイス及び／又はマルチプルウェルプレートを含む。
以下の実施例は、本発明をさらに説明するものであるが、当然のことながら、本発明の範囲をどんな形であれ限定すると解釈されてはならない。
以下の実施例では、変性剤の「低」、「中」、及び「高」濃度とは、種々の変性剤に言及する場合に、言及しやすさのため使用されているにすぎない。例えば、中濃度とは、ある例では３つの濃度が言及されており、及び中濃度は、この例で使用される別の濃度よりも低く、この例で使用されるさらに別の濃度よりも高いことを意味するにすぎない。
実施例１
この実施例は、異なる濃度の変性剤の存在下で、ヒト血清試料からのＨＳＡの除去を実証する。
この実施例の第１項では、ＨＳＡを、中濃度の変性剤の存在下で血清から除去する。
ヒト血清試料を調製する。除去の小さな低下（変性剤の存在による標的タンパク質に対するリガンドの親和性の小さな低下に相当）でさえもより容易に気付くようにリガンドを飽和させるため、ヒト血清を、別のＨＳＡ（３５ｍｇ／ｍＬ）でスパイクし、リガンドの飽和レベル、すなわち、５０ｍｇ／ｍＬに近いＨＳＡ濃度を得る。
変性剤バッチを調製する。高純度水を使用して、トリス緩衝液で調製した９Ｍ尿素＋２％ＣＨＡＰＳ、ｐＨ９．０の変性剤を得る。
スパイクしたヒト血清試料を変性剤で処理する。５０μＬの上記のスパイクしたヒト血清試料を、尿素及びＣＨＡＰＳの最終濃度が、それぞれ５Ｍ及び１．１１％となるように、トリス緩衝液で調製した６４μＬの９Ｍ尿素＋２％ＣＨＡＰＳ、（に結合する。処理した血清試料を室温で３０分間インキュベートする。
変性剤を含む試料をさらに希釈する。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液（１３６μＬ）を、処理した血清試料に添加し、処理した血清試料を下記のスラリーに添加する前に、２．２５Ｍ尿素及び０．５％ＣＨＡＰＳを有する容積２５０μＬを得る。
抗ＨＳＡスラリーを調製する。ＨＳＡに特異的なラクダ抗体を、商標名ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（登録商標）（ＢＡＣ Ｂ．Ｖ．社、ナールデン、オランダ）で得る。抗体を、グリオキシル反応によりアガロースビーズに結合する。結合ビーズを、保存緩衝液（０．０２％アジドを含むＰＢＳ緩衝液）に結合して５０％スラリーを得る。
スラリー（４００μＬ）を、孔径サイズ０．４５μｍを有するＧＨＰ親水性ポリプロピレン膜を含むＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）ＭＦ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、イーストヒルズ、ＮＹ）に移し、２分間３，０００ｒｐｍで遠心分離する。保存緩衝液を捨てる。
スラリーを、４００μＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、ボルテックスにかける。ボルテックスにかけたスラリーを、２分間３，０００ｒｐｍで遠心分離する。流出洗浄液を捨てる。
上記の通りに変性させ希釈したヒト血清試料２５０μＬを、調製したスラリーを含むＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに入れる。血清試料をボルテックスにかけて十分に混合し、室温で１５分間回転させる。混合した血清試料を１．５分間３，０００ｒｐｍで遠心分離する。流出液を回収し、除去試料を得る。
最初の試料中のＨＳＡ量、及び最初の血清試料から除去したＨＳＡ量を、酵素免疫定量法（ＥＬＩＳＡ）で測定する。ＥＬＩＳＡは、ヒトアルブミンＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社、モンゴメリー、ＴＸ）を用いて、メーカーの指示に従い行う。
スパイクした試料から除去したＨＳＡ量は、９０％を超える。
低濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＨＳＡを除去するには、１．５Ｍ尿素及び０．３３％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料（５０μＬのスパイクした試料を、４２μＬの９Ｍ尿素＋２％ＣＨＡＰＳに結合し、ＰＢＳを添加して容積２５０μＬを得る）を、調製したスラリーに適用する以外は、一般に上記の手順に従う。低濃度の変性剤の存在下で血清から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９０％を超える。
高濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＨＳＡを除去するには、３Ｍ尿素及び０．６７％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料（５０μＬのスパイクした試料を、８３μＬの９Ｍ尿素＋２％ＣＨＡＰＳに結合し、ＰＢＳを添加して容積２５０μＬを得る）を、調製したスラリーに適用する以外は、一般に上記の手順に従う。低濃度の変性剤の存在下で血清から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９０％を超える。
低、中、及び高濃度各々の変性剤の存在下でヒト血漿試料からＨＳＡを除去するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えて上記の手順に従う。血漿から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定する。該量は、低、中及び高濃度各々の変性剤の存在下で９０％を超える。
実施例２
この実施例では、（対照）ＨＳＡを、変性剤の非存在下でヒト血清から除去する。実施例１の変性剤存在下でのＨＳＡ除去から得られた結果と比較した場合、この実施例は、変性剤存在下におけるヒト血清からのＨＳＡの除去が、ＨＳＡに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証する。
実施例１に記載の手順に従う。ここで、２００μＬのＰＢＳを５０μＬの血清試料に添加し、変性剤は血清に添加しない。２５０μＬの血清及びＰＢＳを、実施例１に記載の通り調製したスラリーを含有するＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに添加する。
血清から除去したＨＳＡ量を、実施例１に記載の通りＥＬＩＳＡで測定し、９０％を超えることが分かる。
変性剤存在下におけるヒト血漿からのＨＳＡの除去が、ＨＳＡに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えてこの実施例に記載の手順に従う。血漿から除去したＨＳＡ量を、実施例１に記載の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９０％を超える。
実施例３
この例は、異なる濃度の変性剤の存在下で、ヒト血清からのＩｇＧの除去を実証する。
この実施例の第１項では、ＩｇＧを、中濃度の変性剤の存在下で血清から除去する。
ヒト血清試料を調製する。ヒト血清を、別のＩｇＧ（７ｍｇ／ｍＬ）でスパイクして１４．７ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度を得る。
抗ＩｇＧスラリーを調製する。ＩｇＧに特異的なラクダ抗体（ＣＡＰＴＵＲＥＳＥＬＥＣＴ（登録商標））を、アガロースビーズに結合し、実施例１に記載の通り緩衝液に結合して抗ＩｇＧスラリーを得る。
スパイクしたヒト血清を、実施例１に記載の通り変性させ、除去する。
最初に存在したＩｇＧ量、及び血清試料から除去したＩｇＧ量をＥＬＩＳＡで測定する。ＥＬＩＳＡは、ヒトＩｇＧ ＥＬＩＳＡ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社）を用いて、メーカーの指示に従い行う。スパイクした血清から除去したＩｇＧ量は、９５％を超える。
低濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＩｇＧを除去するには、１．５Ｍ尿素及び０．３３％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料を、調製したスラリーに適用する以外は、一般に上記の手順に従う。血清から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
高濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＩｇＧを除去するには、３Ｍ尿素及び０．６７％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料を、調製したスラリーに適用する以外は、一般に上記の手順に従う。血清から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
低、中、及び高濃度各々の変性剤の存在下でヒト血漿試料からＩｇＧを除去するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えてこの実施例に記載の手順に従う。ヒト血漿を、７ｍｇ／ｍＬの別のＩｇＧでスパイクしてＩｇＧ濃度１６．１ｍｇ／ｍＬに達する。血漿から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
実施例４
この実施例では（対照）ＩｇＧを、変性剤の非存在下でヒト血清から除去する。実施例３の変性剤存在下でのＩｇＧ除去から得られた結果と比較した場合、この実施例は、変性剤存在下におけるヒト血清からのＩｇＧの除去が、ＩｇＧに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証する。
実施例３に記載の手順に従う。ここで、２００μＬのＰＢＳを５０μＬの血清試料に添加し、変性剤は血清に添加しない。２５０μＬの血清及びＰＢＳを、実施例３に記載の通り抗ＩｇＧスラリーを含有するＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに添加する。
血清から除去したＩｇＧ量を、実施例３に記載の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
変性剤存在下におけるヒト血漿からのＩｇＧの除去が、ＩｇＧに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えてこの実施例に記載の手順に従う。血漿から除去したＩｇＧ量を、実施例３に記載の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
実施例５
この例は、変性剤存在下で、同じヒト血清試料からのＩｇＧ及びＨＳＡタンパク質両方の除去を実証する。
ヒト血清試料を調製する。ヒト血清を、別のＨＳＡ（３５ｍｇ／ｍＬ）及び別のＩｇＧ（７ｍｇ／ｍＬ）でスパイクして５０ｍｇ／ｍＬのＨＳＡ濃度及び１４．７３ｍｇ／ｍＬのＩｇＧ濃度を得る。
スパイクした血清試料を、実施例１に記載の通り中濃度変性剤で処理し、ＰＢＳ緩衝液で希釈して２．２５Ｍ尿素及び０．５％ＣＨＡＰＳを有する容積２５０μＬを得る。
抗ＨＳＡスラリーを実施例１に記載の通り調製し、抗ＩｇＧスラリーを実施例３に記載の通り調製する。
抗ＨＳＡスラリー(４００μＬ)を、実施例１に記載の通りＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに移し、遠心分離する。保存緩衝液を捨てる。抗ＩｇＧスラリー(４００μＬ)を、実施例１に記載の通り抗ＨＳＡスラリーを含有するＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに移し、遠心分離する。保存緩衝液を再び捨てる。
スラリーを、実施例１に記載の通りＰＢＳ緩衝液で洗浄し、ボルテックスにかけ、遠心分離する。流出洗浄液を捨てる。
上記の通りに変性させ希釈したヒト血清試料２５０μＬを、調製した抗ＨＳＡ／抗ＩｇＧスラリーを含むＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに入れる。血清試料を、実施例１に記載の通り混合し、回転させ、遠心分離する。流出液を回収し、除去試料を得る。
最初に存在したＨＳＡ及びＩｇＧの量、並びに最初の血清試料から除去したＨＳＡ及びＩｇＧの量を、それぞれ実施例１及び３に記載の通りＥＬＩＳＡで測定する。上記の通りスパイクした血清から除去したＨＳＡ量は、９０％を超える。上記の通りスパイクした血清から除去したＩｇＧ量は、９５％を超える。
低濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＨＳＡ及びＩｇＧを除去するには、１．５Ｍ尿素及び０．３３％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料を、調製したスラリーに適用する以外は、一般にこの実施例の手順に従う。血清から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９０％を超える。血清から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
高濃度の変性剤の存在下でヒト血清試料からＨＳＡ及びＩｇＧを除去するには、３Ｍ尿素及び０．６７％ＣＨＡＰＳを含むヒト血清試料を、調製したスラリーに適用する以外は、一般に上記の手順に従う。血清から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９０％を超える。血清から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
低、中、及び高濃度各々の変性剤の存在下でヒト血漿試料から、組み合わせたＨＳＡ及びＩｇＧの両方を除去するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えてこの実施例の手順に従う。血漿から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は、低、中、及び高濃度各々の変性剤の存在下で９０％を超える。血漿から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は、低、中、及び高濃度各々の変性剤の存在下で９５％を超える。
実施例６
この実施例では、（対照）ＨＳＡ及びＩｇＧの両方を、変性剤の非存在下でヒト血清から除去する。実施例５の変性剤存在下でのＨＳＡ及びＩｇＧ両方の除去から得られた結果と比較した場合、この実施例は、変性剤存在下におけるヒト血清からのＨＳＡ及びＩｇＧ両方の除去が、ＨＳＡ又はＩｇＧに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証する。
実施例５に記載の手順に従う。ここで、２００μＬのＰＢＳを５０μＬの血清試料に添加し、変性剤は血清に添加しない。２５０μＬの血清及びＰＢＳを、実施例５に記載の通り抗ＨＳＡ／抗ＩｇＧスラリーを含有するＮＡＮＯＳＥＰ（登録商標）デバイスに添加する。
血清から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、９０％を超えることが分かる。血清から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
変性剤存在下におけるヒト血漿から、組み合わせたＨＳＡ及びＩｇＧの両方を除去することが、ＨＳＡに対するラクダ抗体の親和性を著しく低下させることはないことを実証するには、ヒト血清をヒト血漿に置き換えてこの実施例に記載の手順に従う。血漿から除去したＨＳＡ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、９０％を超えることが分かる。血漿から除去したＩｇＧ量を、上記の通りＥＬＩＳＡで測定し、該量は９５％を超える。
実施例７の実施では、結合したタンパク質量を以下の通り決定する。余分な純ＨＳＡを、抗ＨＳＡスラリー（アガロースビーズに結合したラクダ抗体）に添加する。結合しないＨＳＡ量を決定し、結合量の算出（添加量−デバイスから流出する量＋抗ＨＳＡスラリー）に使用する。種々の変性剤の非存在下又は存在下における結合したＨＳＡ量の比較は、各条件の効果（陽性、中間、又は陰性）を示す。
さらに、非特異的結合を測定するため、ＢＳＡを用いて同じプロトコルを実施する。
実施例７は、室温で以下の通り実施する。
特異的結合を判定するための調製では、タンパク質溶液（４０ｍｇ／ｍｌ ＨＳＡ）を、１．５ｍｌ微小遠心管で１．０ｍｌの１×ＰＢＳに４０ｍｇ ＨＳＡを溶解して調製する。溶液を３０分間回転させる。
非特異的結合を判定するための調製では、４０ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡを同様の方法で調製する。
５つの異なる緩衝変性剤を、以下の「手順」の項に記載の通り調製する。結合は、以下の手順に記載の通り実施する。
手順
（ａ）２００μＬの抗ＨＳＡ樹脂（実施例１に記載の通り、５０％スラリー）を、１．５ｍｌ微小遠心管にピペッティングする。
（ｂ）スラリーを１．５分間９００ｇで遠心分離して保存緩衝液（０．０２％アジドを含むＰＢＳ緩衝液）を除去し、１００μＬの充填樹脂を得る。
（ｃ）スラリーを４００μＬのＰＢＳ（洗浄緩衝液）に再懸濁し、管を５分間回転させてビーズを洗浄する。
（ｄ）管を１．５分間９００ｇで遠心分離して緩衝液を除去する。
（ｅ）２回洗浄するためステップ（ａ）〜（ｄ）を繰り返す。
（ｆ）ビーズを４００μＬのテストする緩衝変性剤に再懸濁し、管を５分間回転させてビーズを平衡化する。
（ｇ）管を１．５分間９００ｇで遠心分離して緩衝変性剤を除去する。
（ｈ）５０μＬのタンパク質溶液及び２００μＬの緩衝変性剤を、回転させながら１５分間インキュベートする。さらに、天然の結合を判定するため、別の管で、５０μＬのタンパク質溶液及び変性剤なしのいずれかの２００μＬの緩衝液（ＣＴＡＢ、グアニジンＨＣｌ、尿素／ＣＨＡＰＳ、又はアセトニトリルなしのＰＢＳ）を、回転させながら１５分間インキュベートする。
（ｉ）希釈した試料を抗ＨＳＡ樹脂に添加し、試料を、１時間管を回転させてビーズと共にインキュベートする。
（ｊ）試料を１．５分間９００ｇで遠心分離し、流出液を回収する。
（ｋ）ビーズを、１０分間回転させながら４００μＬのＰＢＳ（洗浄緩衝液）で洗浄し、１．５分間９００ｇで遠心分離して洗浄緩衝液を除去及び回収する。
各テスト用の流出液及び洗浄緩衝液をプールする。該流出液及び洗浄緩衝液は、非結合ＨＳＡを含有する。同様に、各テスト用の流出液及び洗浄緩衝液をプールする。該流出液及び洗浄緩衝液は、非結合ＢＳＡを含有する。
非結合ＨＳＡ量を、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ（商標）Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキット ＃２３２２７）を用いてメーカーの指示に従い、プールした試料のタンパク質濃度を測定して判定する。
非結合ＨＳＡの合計量＝［ＨＳＡ］×プールした試料の容積
ＢＳＡの非特異的結合＝［ＢＳＡ］×プールした試料の容積
ＨＳＡ容量＝［添加したＨＳＡ量］−［非結合ＨＳＡ量］−［添加したＢＳＡ量］−［非結合ＢＳＡ量］。非特異的結合を、テストした各変性剤及び天然の結合条件について判定する。
実施例７
この例は、５つの異なる緩衝変性剤、すなわち、ＣＴＡＢ（１．６％）、グアニジンＨＣｌ（０．４Ｍ及び０．８Ｍ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）（８％及び１６％）、８．１Ｍ尿素＋１．６％ＣＨＡＰＳ、及び８０ｍＭ（０．０８Ｍ）酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）ｐＨ４．５の存在下における精製ＨＳＡの結合、並びに比較として、非変性緩衝液（ＰＢＳ）の存在下における精製ＨＳＡの結合を実証する。
２％ＣＴＡＢを、１００ｍＬ ＰＢＳに２ｇのＣＴＡＢを溶解して調製する。
０．５ＭグアニジンＨＣｌを、最終容積１００ｍＬに対しＰＢＳ（ｐＨ７．２）に４．７８ｇグアニジンＨＣｌを溶解して調製する。
１．０ＭグアニジンＨＣｌを、最終容積１００ｍＬに対しＰＢＳ（ｐＨ７．２）に９．５６ｇグアニジンＨＣｌを溶解して調製する。
１０％アセトニトリルを、最終容積１００ｍＬに対し１０ｍＬのアセトニトリルにＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して調製する。
２０％アセトニトリルを、最終容積１００ｍＬに対し２０ｍＬのアセトニトリルにＰＢＳ（ｐＨ７．２）を添加して調製する。
９Ｍ尿素／２％ＣＨＡＰＳを、最終容積１００ｍＬに対しＰＢＳ（ｐＨ７．２）に５．４８ｇの尿素及び２ｇのＣＨＡＰＳを添加して調製する。
１００ｍＭ（０．１Ｍ）酢酸ナトリウムを、８００ｍＬ ｄＨ２Ｏに１３．６１ｇの酢酸ナトリウムを添加して調製し、ｐＨをＮａＯＨで４．５に調節し、ｄＨ２Ｏを１Ｌになるまで添加する。
緩衝変性剤を、溶液中でアルブミンと混合し、結合ステップ時の最終変性剤濃度の２０％の低下（すなわち、試料の５倍の希釈）をもたらす。
結合は、上記「手順」の項に記載の通り実施する。
以下に示す通り、非変性条件下（すなわち、ＰＢＳ中の結合）でのＨＡＳ結合能は８．０ｍｇ／ｍＬである。１６％アセトニトリル（７．５ｍｇ／ｍｌ）、０．０８Ｍ ＮａＯＡＣ ｐＨ４．５（８．９ｍｇ／ｍｌ）、及び８．１Ｍ尿素／１．６％ＣＨＡＰＳ（８．４ｍｇ／ｍｌ）の存在下におけるＨＳＡ結合能は、天然の結合能に類似し、変性剤の有意な効果を示すものではない。
以下に示す通り、８％アセトニトリル（６．３ｍｇ／ｍｌ）、０．４ＭグアニジンＨＣｌ（５．４ｍｇ／ｍｌ）、０．８グアニジンＨＣｌ（４．８ｍｇ／ｍｌ）及び１．６％ＣＴＡＢ（５．７ｍｇ／ｍｌ）の存在下におけるＨＳＡ結合容量は、天然の結合能より幾分低いものの、依然として有意な結合を示し、故に、標的タンパク質及びラクダ抗体の相互作用の破壊は限定的である。
Figure 2009543099
本明細書で引用された出版物、特許出願、及び特許を含む全ての参照は、各参照が、参照により組み込まれることが個別及び具体的に示され、並びに本明細書に各参照全体が記載される場合と同程度に、参照によりここに組み込まれる。
本発明を記載する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ある（ａ）」及び「ある（ａｎ）」及び「この（ｔｈｅ）」及び同様の指示対象は、本明細書に特に指示がない限り、又は文脈による明らかな矛盾がない限り、単数及び複数のいずれをも網羅すると解釈される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ（含む）」、及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特に断りのない限り非限定的用語（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ ｔｅｒｍ）（すなわち、「含むが、これに限定されない」の意）として解釈される。本明細書での値の範囲の記載は、本明細書に特に指示のない限り、範囲内のそれぞれ別個の値を個々に指す簡略な方法となることが意図されるにすぎず、それぞれ別個の値は、これが本明細書で個々に記載されるかのごとく本明細書に組み込まれる。本明細書に記載された全ての方法は、本明細書に特に指示がない限り、又は特に文脈による明らかな矛盾がない限り、任意の適切な順序で行うことができる。本明細書に提供された任意の及び全ての例、又は例示的用語（例えば、「など（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることが意図されるにすぎず、特に請求のない限り本発明の範囲を制限するものではない。本明細書における用語は、本発明の実施に不可欠な何らかの請求されない構成要素を示すと解釈されるべきではない。
本発明を実施するため本発明者らに既知の最良の様式を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形形態は、上述の説明を読んだ後に当業者には明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変形形態を用いることを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載された以外に実施されることを意図する。したがって、本発明は、全ての改変形態、及び適用法により認められた添付の特許請求の範囲に記載された主題の均等物を含む。さらに、全ての可能性のある変形形態における上記構成要素の任意の組み合わせは、本明細書に特に指示がない限り、又は特に文脈による明らかな矛盾がない限り、本発明により包含される。

Claims (30)

  1. 標的分子の親和性捕捉方法であって、
    標的分子を含む試料を得るステップと、
    変性剤の存在下で、
    担体に固定化された、標的分子に特異的に結合する単鎖親和性分子又はその抗原結合部分で標的分子を親和性捕捉するステップと
    を含む方法。
  2. 変性剤が界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 担体がビーズを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. ビーズがクロマトグラフィーカラムに配置されている、請求項３に記載の方法。
  5. ビーズがスピンデバイスに配置されている、請求項３に記載の方法。
  6. ビーズがマルチプルウェルプレートに配置されている、請求項３に記載の方法。
  7. 担体が膜を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 膜がマルチプルウェルデバイスに配置されている、請求項７に記載の方法。
  9. 膜がスピンデバイスに配置されている、請求項７に記載の方法。
  10. 試料及び変性剤を親和性分子と接触させる前に、試料を変性剤と混合するステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 変性剤を試料及び親和性分子と接触させる前に、試料を親和性分子と接触させるステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  12. 試料を親和性分子及び変性剤と接触させる前に、変性剤を親和性分子と接触させるステップを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
  13. 親和性分子から標的分子を溶出するステップと、溶出された標的分子を回収するステップとをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 標的分子除去液を得るステップをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
  15. 親和性分子が、ラクダ抗体又はこのフラグメントである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
  16. 標的分子がタンパク質である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 標的分子がペプチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 変性剤が、尿素、ＣＨＡＰＳ、ＣＴＡＢ、グアニジンＨＣＬ、アセトニトリル、及び酢酸から成る群から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
  19. 担体と、
    担体に固定化された、単鎖親和性分子又はその抗原結合部分と、
    少なくとも１つの緩衝液と、
    固定化された親和性分子又はその抗原結合部分を含有するのに適切なデバイスと
    を含むキット。
  20. 少なくとも第１及び第２の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含み、第１の単鎖親和性分子が、第２の単鎖親和性分子と異なる結合特異性を有する、請求項１９に記載のキット。
  21. 第１及び第２の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分が、別々の担体に固定化されている、請求項２０に記載のキット。
  22. キットを使用するための印刷された説明書をさらに含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載のキット。
  23. 担体に固定化された、少なくとも１つの単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含むバイオチップを含む、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載のキット。
  24. 担体に固定化された単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含有する容器をさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載のキット。
  25. 担体に固定化された第１の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含有する第１の容器、及び担体に固定化された第２の単鎖親和性分子又はその抗原結合部分を含有する第２の容器を含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のキット。
  26. 変性剤をさらに含む、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載のキット。
  27. スピンデバイスをさらに含む、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載のキット。
  28. 標的分子がアルブミンである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  29. 標的分子がＩｇＧである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
  30. 試料が２つ以上の異なる標的分子を含み、少なくとも２つの異なる標的分子を親和性捕捉するステップを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
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