JP2009541389A - アファニゾメノン・フロスアクアエ(AphanizomenonFlosAquae)の抽出物、ならびに同抽出物を含む栄養、美容および薬剤組成物 - Google Patents
アファニゾメノン・フロスアクアエ(AphanizomenonFlosAquae)の抽出物、ならびに同抽出物を含む栄養、美容および薬剤組成物 Download PDFInfo
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Abstract
Description
藍藻の多種類のうちの1つである、アファニゾメノン・フロスアクアエ(AFA)は、オレゴン州南部のアッパークラマス湖において豊富に見出される。それは、少数の食用微細藻類の1つで、広範にわたるビタミンおよび有機ミネラル、タンパク質およびアミノ酸、オメガ3脂肪酸を含み、真に注目すべき栄養プロファイルの発現を可能とする最適な環境において野生で生育する限りにおいて、スピルリナおよびクロレラなど、池で生育する他の微細藻類と異なる。それは、クロロフィルおよびカロテンなど、抗酸化特性に恵まれた一定数の栄養物を含むことも知られている。最近数年間における多様な研究は、微細藍藻スピルリナのフィコシアニンが保有する顕著な抗酸化および抗炎症特性を示してきた、より近年、AFA未精製抽出物のin vitroにおける抗酸化特性が報告されている(Benedetti S., Scoglio S., Canestrari F.ら、「Antioxidant properties of a novel phycocyanin extract from the blue-green alga Aphanizomenon Flos Aquae」、Life Sciences、第75巻、2004年、2353〜2362頁)。
本発明は、クラマス湖産微細藻類(アファニゾメノン・フロスアクアエ(Aphanizomenon Flos Aquae Aquae Ralfs ex Born.& Flah.Var.flos aquae))の活性成分、すなわち、
a)i)C−フィコシアニン(C−PC)およびフィコエリスロシアニン(PEC)―以下、「AFAフィコシアニン」と表す―からなり、その特異的な発色団フィコビオロビリンを含む、フィコビリソーム;ii)AFA特異的なフィトクロム(本明細書では「AFAフィトクロム」と表す)を含み、AFA藻類に固有の、特異的なフィコビリタンパク質複合体;
b)MAA(マイコスポリン様アミノ酸)、クロロフィル、およびカロテン
を濃縮する、その藻類の抽出物を提供する。
a)採取直後のAFA藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥AFA粉末である場合は、水で希釈したAFA粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する;
b)ステップa)の生成物を遠心分離し、沈殿物(細胞壁分画の大半を保持する)から上清(細胞質分画の大半を保持する)を分離する;
c)水溶性成分(基本抽出物)を含む上清を回収する、
に従い、水性抽出物(本明細書では基本抽出物と表す)を調製することである。
a)乾燥させた沈殿物を100%エタノール溶液中に懸濁させ、ホモジナイズし暗所、室温において、24時間定常攪拌下にホモジネートを保持する;
b)結果として得られる懸濁液を、4℃、3000rpmで5分間(5’)、遠心分離する;
c)上清を回収する;
d)場合によって、ステップa)からc)に従い、ペレットを第2のエタノール抽出にかける;
e)上清を乾燥させて、脂溶性濃縮物(抽出物C)を得る
に従い、エタノールベースの抽出により得ることが好ましい。
AFA藻類フィコビリソーム(AFAフィコシアニン)の構造決定および特異的特性
無傷のシアノバクテリア細胞において、フィコシアニン(PC)は、機能的形態(αβ)6でフィコビリソームの内部に存在する(1)。その細胞の破砕後、タンパク質は、分析される生体に応じて、異なる凝集状態(単量体、二量体、三量体、六量体)に見出すことができる。クラマス湖産AFA藻類の場合、AFA抽出物中に含まれるPCおよび抽出物自体から精製されるPCの両方とも、PCの電気泳動解析は、タンパク質が、大半の場合、総分子量121000を有する、その三量体形態(αβ)3で見出されることを示している。モノマーαβは、約40000(18500のサブユニットα+21900のサブユニットβ)の分子量である。これとは別に、スピルリナから精製したPCに関する研究の大半が、タンパク質は、スピルリナ中において、約37500の分子量を有する単量体形態αβで見出され、したがって、AFAから精製したPCと比較して異なる凝集状態を示すことを示唆する。
AFA−PCおよびその発色団PCBは、基本抽出物から出発して精製した。PCは、以下の通りに、乾燥AFA抽出物から精製した。
・ 500mgの抽出物を、50mlの100mMリン酸Na緩衝液pH7.4中に懸濁させる;
・ 4℃、2500rpmで10分間(10’)遠心分離する;
・ 上清を回収し、固体の硫酸アンモニウムを50%飽和まで添加する;
・ 試料を攪拌状態に保ちつつ、4℃で60分間タンパク質を沈殿させる;
・ 4℃、10000rpmで30分間遠心分離する;
・ 無色透明の上清を廃棄し、少量の5mMリン酸Na緩衝液pH7.4中に青色の沈殿物を再懸濁させる;
・ 同じ緩衝液に対して、4℃で一晩透析する;
・ 5mMのリン酸Na緩衝液pH7.4で平衡化した2.5×25cmのヒドロキシアパタイト製カラム(米国、カリフォルニア州、Bio−Rad Laboratories社製)内に透析済みPCを入れる;
・ リン酸Na緩衝液pH7.0のイオン強度を上昇(5〜150mM)させながら、試料を溶出する;
・ 分画を回収し、分光光度計により620nmおよび280nmにおける吸光度を読み取る;
・ Abs620/Abs280>4(純PCの指標)である分画をプールする;
・ 50%飽和の硫酸アンモニウムにより、4℃で1時間PCを沈殿させる;
・ 4℃、10000rpmで30分間(30’)遠心分離する;
・ 上清を廃棄し、150mMのリン酸Na緩衝液pH7.4中にPCを再び懸濁させる;
・ 同じ緩衝液に対して、4℃で透析する;
・ 精製済みPCをフラスコに移し、暗所中+4℃または−20℃で保存する。
純PCのモル濃度を測定するため、本発明者らは、三量体形態(αβ)3では770000M-1cm-1に等しい、620nmにおけるモル吸光係数εを用いた。1MのPC溶液が、620nmにおいて吸光値770000を有することを意味する。
・ 500mgの抽出物を、50mlの蒸留済みH2O中に懸濁させる。
・ 4℃、2500rpmで10分間(10’)遠心分離する。
・ 藍色の上清を静かに移し、1%のトリクロロ酢酸でPCを沈殿させる。
・ 攪拌しつつ、暗所中4℃で1時間インキュベートする。
・ 4℃、10000rpmで30分間(30’)遠心分離する。
・ PCを含むペレットを回収し、メタノールで3回洗浄する。
・ 1mg/mlのHgCl2を含む10mlのメタノール中にそのペレットを再懸濁させる。
・ 暗所中42℃で20時間インキュベートし、PCからPCBを放出させる。
・ 2500rpmで10分間(10’)遠心分離し、タンパク質を除去する。
・ PCBを含む上清にβメルカプトエタノール(1μl/ml)を添加し、HgCl2を沈殿させる。
・ −20℃で24時間インキュベートする。
・ 4℃、10000rpmで30分間(30’)遠心分離し、白色の沈殿物を除去する。
・ 上清に10mlの塩化メチレン/ブタノール(2:1、v/v)を添加する。
・ 20mlの蒸留済みH2Oで洗浄し、3000rpmで10分間(10’)遠心分離する。
・ 上層を除去し、PCBを含む下層部分を回収する。
・ 15ml H2O中で、PCBを3回洗浄する。
・ 窒素下で乾燥させ、−20℃で保存する。
フィコシアニン(PC)は、すべての微細藍藻類の典型的な青色色素であるが、各特定の微細藻類において、異なる構造的および機能的特性を有する(22)。栄養補助食品および潜在的な天然薬剤として用いられるPCの源について、今までの研究は、スピルリナに焦点を合わせている。スピルリナのフィコシアニンは、肝臓(27)、呼吸器系(28)、および脳(29、30)などの異なる生理的領域に対する顕著な活性を伴う、抗酸化(23)および抗炎症(24、25、26)特性を有することを示している。クラマス湖産藻類のフィコシアニンなど他のフィコシアニンに関する研究の欠如を踏まえ、本発明者らは、AFA(クラマス湖産)藻類に由来する水性抽出物の抗酸化能を、微細藻類スピルリナ・プラテンシス(Spirulina platensis)に由来するPCを濃縮する液体抽出物である、製品Serum Bleu(商標)との関連で比較的に測定した。
AAPHにより酸化したラット肝ミクロソーム上のその抗脂質過酸化特性について調べたところ、スピルリナ由来のC−PCは、TBARS(共役(conjugated)ジエン、MDA)の産生を、11.35μMのIC50で阻害した(23、Bhatら)。スピルリナ由来のC−PCは、AAPHにより誘導されたヒト赤血球溶解に対してもまた、RomayおよびGonzales(41)により調べられている:この場合のIC50は35μMであった。
ORAC(酸素ラジカル吸収能)法は、基準分子としてのトロロックス(ビタミンEの水溶性の類似体(analog))との比較においてその活性を測定し、純粋なおよび構成する物質の総抗酸化能を決定するのに広く用いられる(31)。しかしながら、それは、今まで、PCおよびPCBなど、シアノバクテリアに由来する純天然分子の抗酸化能を決定するのに用いられたことがない。
AA、GSH、PCおよびPCB濃度(x)に対するORAC値(y)の線形回帰分析は、相関係数により評価されるデータを十分に説明した。
基本抽出物から出発し、既に述べた手法に従い、本発明者らは、そのC−PC/PEC複合体を伴う、AFAフィコシアニンを精製し、培養生細胞上のその抗酸化特性を調べた。AFA−PCおよびPCB用量の増加とともにかまたは伴わずに、ジャーカット細胞(白血病Tリンパ球の不死化細胞株)に、500μM H2O2による酸化ストレスを与えた。H2O2に由来する酸化に続き、細胞内プローブ(ジクロロフルオレセイン)により放出される(emitted)蛍光を、H2O2によるインキュベーションの30分後に蛍光計により記録した(492nmにおける励起および520nmにおける発光)。細胞をAFA−PC(範囲:0.1〜10μM)および500μM H2O2と共に30分間インキュベートすることにより、本発明者らは、H2O2が誘発する細胞内蛍光の低減とともに、0.5μMのIC50、および10μMにおける100%阻害(非酸化細胞)を伴う、用量依存的な保護効果を観察する(図13)。
本発明者らは、C−PC/PEC複合体を有する、AFA−PCが、スピルリナなどの他の藻類に由来する純C−PCよりも顕著により強力であるということを見てきた。しかし、クラマス湖産藻類中には、その主要な抗酸化および抗炎症性の本質(principle)である、フィコシアニン/フィコエリスロシアニン複合体と比べて、基本抽出物から出発する、その抽出物の優位性を説明する他の因子が存在する。
フィトクロムは、植物が光を検出するのに用い、可視スペクトルの赤色および遠赤色領域における光に対して感受性のある、光受容体、色素である。これらは、(日周期のリズム(rythms)を通して)開花の調節、発芽およびクロロフィルの合成を含む、植物における多くの異なる機能を果たす。AFAにおけるこのフィトクロムの固有の種類の存在が、光合成過程においてCフィコシアニンを補うよう他のシアノバクテリアが通常用いる他のフィコビリタンパク質、すなわち、アロフィコシアニン、の欠如により説明しうるので、後者(クロロフィルの合成)は、AFA藻類との関連で特に重要である。一方、本発明者らが見たように、クラマス湖産藻類におけるアロフィコシアニンの位置はPECにより占められるが、特に、クラマス湖産藻類が、高い光回収能力を必要とする非熱帯環境において生育することを考えると、PECのみでは十分でないと思われ、したがって、AFA藻類は、そのより高い必要性を独自のフィトクロムで調和させていると思われる。
AFAフィトクロムは、相対的に固有の構造を有する一方で、赤色/遠赤色スペクトルにおける光を吸収するその発色団として、ビリタンパク質を有する。その構造および活性を確立するため、本発明者らは、以下のプロトコールによりフィトクロムを精製した。
精製済みAFAフィトクロムは、極めて強力な抗酸化物質であることを示した。100μMにおける酸化作用物質CuCl2と共にヒト血漿試料を2時間インキュベートすると、チオバルビツール酸との反応後535nmにおける分光光度計により測定(TBA試験)される、脂質過酸化の後期副生成物(a late byproduct)である、マロンジアルデヒド(MDA)レベルの上昇が生じる。AFA藻類から抽出したAFAフィトクロム量を増加させながら(2〜16nM)100μMのCuCl2と共に37℃で2時間、血漿をインキュベートすると、MDAレベルの極めて強力な用量依存的減少を観察することができる(図17)。実際、本発明者らは、わずか16nMのAFAフィトクロムにより、対照に近いMDAレベルを伴う、ほぼ完全な脂質過酸化の阻害を得る。3.6nMのIC50が、PCBに対して得られるIC50を45倍下回ることが注目される。本明細書に記載のフィトクロムが、AFA−PCと比べて、基本抽出物に観察される、より高い抗酸化活性の原因であることは疑いない。
MAAは、アミノ酸またはそのアミノアルコールを置換している、窒素原子で接合した(conjugated)シクロヘキセノンまたはシクロヘキセニミン発色団を特徴とする、水溶性の化合物である(図4に示す)。
MAAは、既に報告されているように抽出された(6)。簡潔に言うと、45℃の水浴中に2.5時間インキュベートすることにより、2mlの20%(v/v)含水メタノール(HPLCグレード)中で20mgのAFA粉末または20mgの抽出物を抽出した。遠心分離(5000g;米国、パロアルト、Beckman社製、GS−15R型遠心分離機)後、上清を蒸発乾燥させ、2mlの100%メタノール中に再溶解し、2〜3分間ボルテックスし、10000gで10分間遠心分離した。上清を蒸発させ、HPLCにおける分析用に同じ容量の0.2%酢酸中か、または、抗酸化特性の評価用に200μlのリン酸緩衝液(PBS)中に抽出物を再溶解させた。試料は、HPLC分析、または抗酸化特性試験(下記を参照のこと)にかける前に、0.2μm孔径のシリンジフィルター(イタリア、ミラノ、VWR International社製)により濾過した。
a)クラマス湖産藻類について、シノリンに対して0.49mgg-1DWの濃度およびポルフィラ334に対して7.09mgg-1DWの濃度;したがって、そのMAA総含量は、0.76%藻類DWに等しい;
b)抽出物について、MAAに対して17〜21mgの濃度(すなわち、1.7〜2.1% DW)
を計算した。
抽出物中に含まれるMAAの抗酸化特性を評価するため、ヒト赤血球試料を、フリーラジカル鎖の形成を誘発し、その結果、ドラブキン溶液によりヘモグロビンを定量することにより測定される(33)、赤血球溶血の並行な上昇と共に膜のリン脂質の酸化を誘発する、100mM AAPHとともに、漸増量のMAA(5〜80μM)と共に、37℃で3時間インキュベートした。結果を図18に示すが、ここで、AAPHが誘発する赤血球溶血における用量依存的な低減を、MAAがいかにしてもたらし、これにより細胞を酸化的損傷から保護するのかを、観察することができる。
クラマス湖産AFA藻類は、異なる機能活性に恵まれた広範な栄養基質(matrix)を含む。特に、クラマス湖産藻類およびその抽出物は、クロロフィル;ベータカロテンおよび他のプロビタミンAカロテノイド;カンタキサンチンなどのキサントフィル類カロテン;抗酸化ビタミンおよびミネラルなどの重要な活性本質を含む。
最近数年間において、クロロフィル(CHL)の半合成類似体である、クロロフィリン(CHLN)という分子に関する研究が力強く発展している。多様な研究が、CHLNの顕著な抗酸化特性、特に、肝臓および脳などの重要器官との関連において、より共通の抗酸化物質(ビタミンCおよびE、GSH、など)よりも顕著に高い抗酸化特性を明示している(9)。その抗酸化特性は、CHLNがCOX−2を選択的に阻害する能力に起因する、特異的な抗炎症特性と関連する(10)。クロロフィルがCOX−2を選択的に阻害する能力は、フィコシアニンによる同じ能力と共に、抽出物を天然の抗炎症剤として特に強力なものとしている。このことは、抽出物が、その中に含まれるフィコシアニンよりもより強力なCOX−2阻害剤である、事実を説明する一助にもなる。
1回目の抽出により、本発明者らは、96.11μg/mlのクロロフィルa濃度を得、2回目および3回目の抽出により、4.63および0.68μg/mlの濃度を得た。したがって、AFA試料中のクロロフィルaの総含量は、101.42μg/mlまたは10.14mg/g DW(1.014% DW)である。
クラマス湖産藻類は、ベータカロテン中に発現された、高含量のカロテンを有する。さらに、それは、ビタミンAの前駆体および非前駆体のいずれでもある、広範なカロテンを含む。非前駆体のうち、クラマス湖産藻類は、特に顕著なカンタキサンチン含量を有する。
カンタキサンチン=327mg/Kg
基本抽出物 ベータカロテンとしての総カロテン=420mg/Kg
カンタキサンチン=41mg/Kg
抽出物B ベータカロテンとしての総カロテン=2400mg/Kg
上記の数字は、長年にわたる異なる生成物バッチに対する異なる試験の平均である。基本抽出物中のカロテン濃度は、依然として顕著であるとはいえ、明らかに低下している。とりわけ、藻類およびその抽出物中のカロテンは、通常の野菜において、部分的に吸収を阻害する、いかなるセルロース膜も他の因子も有さない、天然の食物源に由来するので、ヒト(our organism)により高度に吸収される。血漿レチノールは、ビタミンAの活性形態であり、重要な抗酸化特性を有し、眼から肝臓、口から神経系に至る、ヒトの各種の系を保護しうることが示されている(18)。
CuCl2による酸化的損傷に由来するTBARS形成の基本抽出物の阻害
AFA PCの標準的な含量を有する、抽出物の抗酸化力は、精製済みPCそのものの抗酸化力のほか、PCの活性補欠分子族である、精製済み発色団フィコシアノビリン(PCB)の抗酸化力ともまた比較されている。CuCl2による血漿の酸化により生じるマロニルジアルデヒド(MDA)の形成に関する試験は、抽出物が、全抽出物中における他の活性抗酸化分子の存在に起因して、純PCおよびその発色団PCBよりもさらに高い抗酸化力を有することを示し、一方、PCおよびPCBが、100nMの濃度におけるMDA形成阻害度30〜40%による、同様の抗酸化能を有するのに対し、100nMの同様のPC濃度を有する、基本抽出物は、最大89%までの阻害度を生じることを示す(図20)。
AFA抽出物をヒト血漿試料と共にプレインキュベートし、これに続いて100μMで酸化作用物質CuCl2による同じ試料のインキュベーションを行ったところ、245nmにおける分光光度計により初期副生成物(early by-products)である共役ジエンの産生によって測定されるように、リポタンパク質の酸化が、用量依存的に強く減少した。ジエンの形成がその抽出物により阻害される、最初の遅延段階(a first lag-phase)の後にさらに進行する酸化、その漸進的な減少は、抽出物中わずか150nMのPC濃度によりほぼ完全な阻害レベルに達する(図22)。
ORAC試験により抽出物の抗酸化能を評価するために、本発明者らは、PCおよびPCBについてORACを調べるのに用いたのと同じ手法を用いた。AFA抽出物の水溶性および脂溶性成分をともに調べるため、本発明者らは、まず、以下の通りに、2つの水溶性および脂溶性抽出物を調製した。
・ 10mgの抽出物を1mlの蒸留水中に量り取り、ポッター型ホモジナイザーにより1分間ホモジナイズする。
・ 前出の抽出から得られたペレットを、1mlのアセトン中に再懸濁させる。
健常対象におけるMDA、GSHおよびレチノールの血漿レベルに対する、AFA藻類およびAFA抽出物をともなう補給(the supplementation)の効果
以下の試験は、主にAFA藻類およびAFA藻類抽出物に基づく処方により行った。それはまた、アシドフィルス菌およびタンパク質分解酵素などの消化管因子をも含んでいたが、抗酸化活性は、主に藻類因子に帰属させるべきである。
b)脂質過酸化の最も重要なマーカーの1つである、血漿MDAレベル中の目覚しい減少(−35.5%)がみられる。この結果は、上記に示したin vitroでの非常に目覚しい結果を、in vivoにおいて強く確認する;
c)本生成物が与える全般的な抗酸化保護はまた、身体が、内因性GSHの顕著な増加(+16.8%)を生じるのに役立った。
高圧酸素療法は、減圧に由来する病気(illnesses)、一酸化炭素中毒、ガス塞栓症、および組織感染症などの、様々な病態の治療に使用され成功している。高圧酸素への曝露は、実際、血中に溶解する酸素の有益な増加を生じる。しかし、有益な作用と共に、十分な抗酸化防護により保護しないならば、細胞および組織を損傷しうる循環ROS(活性酸素種)も増加しうる(34)。このために、高圧療法を受ける患者は、一般に、抗酸化ビタミンを補給される。
in vitro試験
シクロオキシゲナーゼ(COX)酵素は、プロスタグランジン(PG)、トロンボキサン、およびプロスタサイクリンなどのエイコサノイドの合成における第1段階を触媒する。この酵素には、2つの異なるアイソフォームが存在する。COX−1が、ホメオシタシスの通常の調節に関与するのに対し、COX−2は、PG産生の原因であり、それが次々に急性炎症を促進する。
本試験において、本発明者らは、0.25μモル/kgのカプサイシン(チリペッパーの活性本質)または2nモル/kgのサブスタンスP(炎症性神経性応答の原因である受容体と共に作用する)による、炎症促進刺激(pro-inflammatory stimulus)を受けたアルビノの雄スイスマウスにおける、PCを含む藻類抽出物(AFA抽出物)の抗炎症特性を詳しく調べた。組織炎症レベルは、組織における血漿タンパク質の流出の結果として、炎症部位内に蓄積した着色剤エバンスブルーの分光光度法での吸収量により測定した。図30に示す通り、カプサイシン(0.25μモル/kg)またはSP(2nモル/kg)の静脈内注射は、炎症刺激を受けなかった対照マウスにおいて観察される場合と比べて、試験組織内における血漿流出の増加を誘発する。AFA抽出物(1600mg/kgまたは800mg/kg)によるマウスの前処置は、血漿流出を顕著に阻害し、対照群と同等な値にまで引き下げる。
文献では、微細藻類スピルリナに由来する純PCが、アポトーシス機構を介して、白血病細胞株(39)などの腫瘍細胞株およびマクロファージ細胞株(40)の、増殖を阻害する顕著な特性をin vitroにおいて有することが報告されている。
クラマス湖産藻類AFAおよびその抽出物中のフィコシアニンおよび他の相乗作用分子の抗酸化および抗炎症特性を踏まえると、栄養学的および薬理学的目的のための経口投与のほか、皮膚治療の使用および美容目的ともに、皮膚への局所用としても用いることができる、ということは明白である。
予備試験として、本発明者らは、クラマス湖産AFA藻類を毒性学的に調べ、その皮膚使用が、毒性または炎症反応をもたらさないことを確立した。試験は、イタリア、フェラーラ大学の「美容センター(Centro di Cosmetologia)」において実施した。「密封貼付試験」は、無傷のヒト皮膚に対して単回投与で貼付したときの美容生成物の刺激作用を評価するために実施した。試験は、試験実施に対して書面により同意した、男女の健常志願者対象20例を対象に実施した。以下の対象は、試験から除外した。
・皮膚炎に罹患するすべての対象、
・アレルギー性皮膚反応の既往を有するすべての対象、
・抗炎症薬治療(ステロイドまたは非ステロイド)下にあるすべての対象。
紅斑:0−なし 1−軽度 2−はっきりと見える 3−中等度 4−重篤(serious)
浮腫:0−なし 1−軽度 2−はっきりと見える 3−中等度 4−重度(strong)
紅斑および浮腫スコアの総計を「刺激指数」と定義する。15分および24時間での刺激指数を最終報告書に報告する。20回の試験の平均刺激指数を計算する。次いで、生成物を以下のパラメータに従って分類した。
指数 分類
<0.5 刺激なし
0.5〜2.0 軽度の刺激
2.0〜5.0 中等度の刺激
5.0〜8.0 高度の刺激
上述の手法およびパラメータに従う、クラマス湖産藻類AFAに対する試験結果は、
「志願者対象20例の健康な皮膚に対して、密封条件下で、蒸留水により希釈して(1:10)貼付された、試験生成物は、
フィンチャンバー除去後の15分において0.25(zero. twenty five)
フィンチャンバー除去後の24時間において0.15(zero. fifteen)
の平均刺激指数を示した。
有効性研究
美容および皮膚成分としての藻類の非刺激性および無毒性を確認した時点で、本発明者らは、8%のクラマス湖産藻類基本抽出物を含むクリームの調製を開始し、皮膚の柔軟性、水分補給、およびしわなどの美容パラメータに関するその有効性を調べた。試験は、30〜65歳の個体15例を対象に無作為に実施した。彼らは、特定の皮膚(dermatological or skin)問題で選ばれたのでなく、実際、しわの量などのパラメータについては、大半の参加者が、深いしわを有さなかったことにより、統計学的に非有意の結果がもたらされた。にもかかわらず、しわが実際に存在する場合、しわの軽減に関する結果は極めて明瞭であった。本研究は、統計学的な有意性の欠如に対して、一部のパラメータに関して最終的なものではないが、AFA抽出物の皮膚および美容特性を強く確認する予備報告ではあり、したがって、これが、特定の皮膚(dermatological and skin)問題により明確に方向づけられたさらなる研究の正当性を保証する。本発明者らは、本明細書に、本研究の手法および主要な結果を示す。
a)AFA抽出物を含む植物乳液
b)基本植物乳液
と呼ぼう。
・皮膚症なし、
・進行中の薬剤治療なし、
・通常の日常的行為を変更しないと誓約、
・既往症にアトピー症なし。
・顔の左側面(SX):基本植物乳液。
・皮膚の弾力性
・湿潤指数
・皮膚の形状測定
であった。
・生成物塗布の15日後(T15)および30日後(T30)
皮膚の弾力性
皮膚の弾力性は、CUTOMETER(登録商標)SEM 575(COURAGE + KHAZAKA electronic GmbH製)により測定した。弾力性の測定は、1が可能な弾力性の最大値を表す、0〜1のスケールにより行った。
皮膚の湿潤性の測定は、国際的に認知されたCORNEOMETER(登録商標)に基づく。通常の室内条件(20℃および40〜60%の空気湿度)における試験部位の、健康皮膚は、>50の湿潤指数を有するべきである。35〜50の範囲の湿潤指数が、乾燥した皮膚を表すのに対し、35より劣る場合は極めて乾燥した皮膚を表す。これらの値は、結果の解釈に対するただの指標である。
in vivoにおける皮膚表面解析用のVISIOSCAN VC98を用いて、しわの軽減を検査する(図33)。パラメータは、
・SEr:粗さ
・SEsc:鱗状態(scaliness)
・SEsm:滑らかさ、しわの幅および形態に比例する
・Sew:しわ、 しわの数および幅に比例する
・量:しわの深さに比例し、より深いしわは、量パラメータがより大きい
である。
上記の結論に関しては、皮膚の形状測定については、統計学的に有意な結果がみられなかった。しかし、これは、生成物の無効性(failure)に起因したのでなく、参加者の大半が、時点0において、彼らの皮膚が既に最適な状態に近かったことを踏まえると、いかなる本格的な改善(serious improvement)も、不可能とさせるような、初期状態を有していたという事実に起因した。これが、本研究の弱点であった。しかしながら、実際に改善を要する皮膚状態(皮膚病変の状態には該当しない)を有する参加者を選択し、適宜結果を解釈したところ、本発明者らは以下の結果を得た。
参加者15例のうち、12例のみが、最適より少ない弾力性状態を有した。実際、弾力性指数を0〜1(1が可能な最大値)としたところ、本発明者らは、参加者中に0.57〜0.98の範囲の値を得た。この範囲に基づき、本発明者らは、3つのふさわしい区分を確立した。
0.75〜0.9=中等度の弾力性状態
<0.75=低度の弾力性状態
30日間の処置期間を考慮に入れると、図34のグラフは、より低いレベルからより高いレベルへの参加者の移行として、改善のレベルを報告する。
通常の室内条件(20℃および40〜60%の空気湿度)における試験部位の、健康皮膚は、>50の湿潤指数を有するべきである。35〜50の範囲の湿潤指数が、中程度に乾燥した皮膚を表すのに対し、<35の値は極めて乾燥した皮膚を表す。これらの値を本発明者らの解釈基準として採用すると、図35のグラフは、30日の期間において認められた改善を、より低いレベルからより高いレベルへの参加者の移行として報告する。
皮膚の形状測定に関しては、ゼロに近いT0値または初期を有する、参加者が多すぎるため、試験パラメータの一部が使用できなかった。すなわち、Serまたは皮膚の粗さパラメータに注目したところ、本発明者らは、参加者15例のうち12例が、0.0または皮膚の粗さ全くなしの初期値を有し、パラメータSEscまたは皮膚の鱗状態に関しては、参加者15例のうち10例が、0.0または鱗状態全くなしの値を有することを見た。したがって、本発明者らは、Sew、またはしわの数および幅、ならびにしわの深さについて測定したしわの量を指す、VOLの、2つのパラメータに評価を限定した。ここでも、Sewでは参加者7例のみ、VOLでは9例のみが是正を要する初期値を有し、残りはゼロに近い値を有したので、本発明者らは、統計学的な有意性に到達できなかった。にもかかわらず、図36が示す通り、わずかながら値を変化させた参加者は、顕著な改善を有した。
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Claims (14)
- 以下のステップ:
a)採取直後のAFA藻類を冷凍し解凍するか、または、出発物質が乾燥AFA藻類粉末である場合は、水で希釈したAFA粉末を超音波で分解して、細胞を破砕する;
b)ステップa)の生成物を遠心分離し、沈殿物から上清を分離する;
c)水溶性成分を含む上清を回収する、
により得られる、クラマス湖産微細藻類(アファニゾメノン・フロスアクアエ(Aphanizomenon Flos Aquae Aquae Ralfs ex Born.& Flah.Var.flos aquae))の水性抽出物。 - d)請求項1に記載の抽出物を、カットオフ分子量30kDaの膜を用いるサイズ除外限外濾過にかける;
e)残留物を回収する、
により水溶性成分を濃縮する、クラマス湖産微細藻類の抽出物。 - 以下のステップ:
f)請求項1に記載のステップb)において得られる乾燥させた沈殿物を純エタノールに懸濁し、ホモジナイズし、そして暗所、室温において24時間定常攪拌下にホモジネートを保持する;
g)結果として得られる懸濁液を、4℃、3000rpmで5分間(5’)、遠心分離する;
h)上清を回収する;
i)場合によって、ステップf)からh)に従い、ペレットを第2のエタノール抽出にかける;
l)場合によって、上清を乾燥させ、脂溶性濃縮物を得る、
により得られる親油性成分が富化された分画を添加した、請求項1から2に記載のクラマス湖産微細藻類の抽出物。 - フィコシアニン/フィコエリスロシアニン複合体(C−PC/PEC)、フィコビオロビリン(PVB)、AFAフィトクロム、マイコスポリン様アミノ酸のポルフィラ334およびシノリンからなる群から選択される、請求項1から3に記載のクラマス湖産AFA微細藻類抽出物の単離された生理活性成分。
- 請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載の単離成分、またはその混合物を含む物質(matter)の組成物。
- クロロフィル、ベータカロテン、プロビタミンAカロテノイド、キサントフィル類カロテン、カンタキサンチン、ビタミンまたはミネラルをさらに含む、請求項5に記載の組成物。
- 栄養、美容、または薬剤の使用に適した、請求項5から6に記載の組成物。
- 対象における細胞または組織に対する酸化的損傷を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載のその単離成分の使用。
- 対象における炎症を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載のその単離成分の使用。
- 対象における腫瘍細胞増殖を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載のその単離成分の使用。
- 対象における皮膚病変(affections)を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載のその単離成分の使用。
- 対象における眼病変(pathologies)を予防、制御または治療するための組成物の調製のための、請求項1から3に記載のクラマス湖産藻類抽出物または請求項4に記載のその単離成分の使用。
- 前記組成物が、洗眼液の形態である、請求項12に記載の使用。
- 前記対象が、ヒト対象である、請求項8から13に記載の使用。
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