JP2009523191A - ポリアルキレンオキシド・カルボン酸の高効率製法 - Google Patents

Abstract

ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルの新規調製方法を提供する。新規の方法は、出発物質であるポリアルキレンオキシドへの逆反応を妨げる、穏やかな条件を用いる。さらに、ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルを適切な酸と反応させて、ポリアルキレンオキシド酸を生成する。

Description

本発明は、純度が高められた、活性化ポリアルキレンオキシドの酸およびエステルの、改良された、さらに効率の良い製法に関する。

水溶性のポリアルキレンオキシド（「ＰＡＯ」）と、タンパク質およびポリペプチドなどの治療成分(therapeutic moiety)との共役(conjugation)が知られている。例えば、参照することにより本願に援用される、特許文献１を参照。特許文献１は、ＰＥＧで修飾された生理活性ポリペプチドが、in vivoで長期間に亘り循環し、低減された免疫原性および抗原性を有することを開示している。

ＰＡＯを他の化合物と共役させるには、まず、ポリマーのヒドロキシル末端基を反応性の官能基に転換しなければならない。この方法は、しばしば「活性化」と称され、その生成物は活性化ポリアルキレンオキシドまたは活性化ＰＡＯと呼ばれる。

研究は、その大半が、タンパク質、酵素およびポリペプチドのε−アミノ基へのＰＡＯ類の共有結合を対象としている。リジンアミノ基へのＰＡＯ類の共有結合は、非特許文献１によって開示されるサクシノイル−Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステル、および、アズラクトン、アリールイミダート(aryl imidate)、環状イミドチオン(imide thione)などの連結基によって得られる。例えば、特許文献２〜４参照。前述の特許文献の各内容は、ここに参照することにより本願に援用される。ＰＡＯ類はまた、ポリマーを活性化炭水化物基(carbohydrate groups)に結合させるため、ヒドラジン基で活性化されている。

さらには、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）などのＰＡＯ類の末端ヒドロキシル基のカルボン酸への転換についても、報告されている。ＰＥＧ−酸は少なくとも２つの点で有用である。第一に、カルボン酸誘導体は、利用可能なヒドロキシルまたはアミノ部分を介して求核体と直接共役させるのに使用できる。第二に、ＰＥＧカルボン酸は、他の種類の活性化ポリマーを形成するための中間体として使用することができる。例えば、ｍＰＥＧカルボン酸は、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、およびジイソプロピルカルボジイミドなどの縮合剤を介してスクシンイミジルエステル誘導体に転換することができる。他の活性化されたＰＡＯ類は、活性化エステルをヒドラジンと反応させてＰＡＯ−ヒドラジド誘導体を生成することにより、調製することができる。

ここに参照することにより援用される、共有されている特許文献５は、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸の調製における、過去の多くの困難を解決した。特許文献５は、ＰＡＯ（すなわち、ＰＡＯ−ＯＨ）を塩基の存在下でハロ酢酸ｔ−アルキルと反応させて、ＰＡＯのｔ−アルキルエステルを形成し、次に、ＰＡＯのｔ-アルキルエステルを酸と反応させて所望のポリアルキレンオキシド・カルボン酸を形成することによる、ＰＡＯカルボン酸の調製方法を教示した。

特許文献５の方法が開発されて以来、さらなる改良の必要性が生じた。例えば、ＮＭＲ機器の改良に伴い、ＰＥＧ−酸には、まだ、〜５％のＰＥＧ−ＯＨの不純物が含まれていることが明らかとなった。さらには、元々のＰＥＧ−ＯＨの混入の程度は、ポリマーの分子量と共に、および二置換性および分岐鎖ＰＥＧポリマーの使用と共に、増加することが判明した。さらには、本方法には、少なくとも１８時間の反応時間、ならびに、反応溶媒の還流および回転式の蒸発が必要であることが、特許文献５によって教示された。
米国特許第４，１７９，３３７号明細書 米国特許第５，２９８，６４３号明細書 米国特許第５，３２１，０９５号明細書 米国特許第５，３４９，００１号明細書 米国特許第５，６０５，９７６号明細書 Abuchowski et al., Cancer Biochem. Biophys., 7, 175-86 (1984)

少なくとも前述の理由から、当技術分野では、さらに速く、したがって、さらに経済的な、ＰＡＯカルボン酸を調製する方法、および、ＰＡＯ−ＯＨの混入が検出されない、はるかに高い純度のＰＡＯ酸および中間体の製造方法が、長年に亘り必要とされている。本発明は、これらの必要性に取り組むものである。

ある態様では、本発明は、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸およびそれに関連する中間体を高純度で調製する方法を含む。本方法は、まず、ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルを調製し、次に、そのカルボン酸誘導体に転換することを含む。ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルは、
（ａ）ポリアルキレンオキシドを、第１溶媒系中で約１０分〜約６０分間、塩基と反応させ、
（ｂ）工程（ａ）の生成物を第２溶媒系中で約３０分未満の間、ハロ酢酸ｔ−アルキルと反応させる、
各工程によって調製される。工程（ａ）および（ｂ）の反応は、約１０℃〜約３５℃で行なわれる。

次に、得られたポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルを、酸と反応させることによって、ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルを対応するカルボン酸に転換し、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸を形成する。この方法は、有利に、高収率、高純度の物質を提供する。

本発明のこの態様における、ポリアルキレンオキシドとしては、ポリエチレングリコールおよびω−メトキシ−ポリエチレングリコールが好ましい。ハロ酢酸ｔ−アルキルとしては、ブロモ酢酸またはクロロ酢酸ｔ−ブチル、およびハロ酢酸の他のｔ−アルコールエステルが好ましい。本方法に使用される塩基としては、例えば、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウムなどが好ましい。本方法は、ｔ−ブタノールなどのアルコール中、またはトルエンなどの他の不活性溶媒中で、金属ｔ−ブトキシドを使用して行なうことができる。

本発明の方法は、ポリアルキレンオキシドとハロ酢酸ｔ−アルキルをおよそ等モル比で用いて行なってもよい。しかしながら、ハロ酢酸ｔ−アルキルが、ポリアルキレンオキシドよりも大きいモル量で存在することが好ましい。

本発明のさらなる態様では、ＰＥＧ−ヒドラジン、ＰＥＧ−アミド、および、スクシンイミジル、メチルおよびエチルエステルを含むＰＥＧ−エステルなど、αおよび／またはω−置換されたポリアルキレンオキシドを高純度で調製する方法が提供される。これらの態様には、上述のポリアルキレンオキシド・カルボン酸を所望のｔ−置換ポリマーに転換することが含まれる。

さらに本発明の別の態様では、ポリアルキレンオキシド−生物活性求核体複合体(nucleophile conjugates)の調製方法が開示される。本発明のこの態様では、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸を生物活性な求核体と反応させて、ポリマーと生物活性な求核体との間にエステル結合を形成する。例えば、本発明のこの態様では、タキソール２’ＰＥＧモノエステルおよび２０−カンプトテシンＰＥＧ−エステルまたはビス−活性化ＰＥＧを使用したジエステルを調製することができる。

本発明のもっとも大きな利点の１つは、得られるポリアルキレンオキシド・カルボン酸が、最近になって見出された技法で作られたものと比べても、高純度で調製されることである。したがって、生成物に混入される物質、すなわち、ｍ−ＰＥＧ−ＯＨなどの出発物質は、はっきりと感知できる量では含まれない。言い換えれば、それらは、約２％未満の量で含まれることが好ましく、約１％未満がさらに好ましく、約０．５％未満がもっとも好ましい。結果として、出発物質のアルコールから所望のカルボン酸誘導体を分離する必要がない。さらには、面倒なイオン交換または逆相ＨＰＬＣ技法を必要とせずに、所望のカルボン酸誘導体を提供できる。

本発明は、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸およびポリアルキレンオキシドのハロ酢酸ｔ−アルキルなどの合成中間体の、改良された調製方法を提供する。概して、ＰＡＯカルボン酸は、ＰＡＯ（すなわち、ＰＡＯ−ＯＨ）を適切な塩基の存在下で、適切なハロ酢酸ｔ−アルキルと反応させ、ＰＡＯのｔ−アルキルエステルを形成し、次に、ＰＡＯｔ−アルキルエステルを酸と反応させてＰＡＯカルボン酸を得ることにより、調製される。従来の方法は、反応を還流下で行ない、続いて回転乾燥して生成物を溶媒系から分離した。これらの工程段階の両方で、ＰＡＯｔ−アルキルエステルの一部が出発物質、すなわち、ＰＡＯ−アルコールに戻ってしまうことが判明している。この逆反応は、高分子量のＰＥＧ不純物および異なる結合を有するＰＥＧ−薬物複合体など、望ましくない不純物の原因となり、また、結果的に、より遅く、効率の悪い反応過程となる。

したがって、従来のＰＡＯエステルおよび酸の調製方法とは対照的に、意外にも、塩基の存在下、最も低い実施温度範囲、かつ塩基の最も低い有効濃度で、反応を行なう場合に、改善されることが見出された。反応温度の下限値は、選択される溶媒系における反応物質および生成物の沈殿開始点によって規定される。本発明について、さらに詳細に以下に述べる。

１．ポリマー置換基およびポリアルキレンオキシド
本発明に係るカルボン酸誘導体は、室温で水溶性のポリエチレングリコールなどのポリ（アルキレンオキシド）（ＰＡＯ類）から調製されることが好ましい。この群には、メトキシポリ（エチレングリコール）（ｍＰＥＧ−ＯＨ）などのω−置換されたポリアルキレンオキシド誘導体が含まれる。他の適切なアルキル置換ＰＡＯ誘導体としては、片末端(mono-terminal)Ｃ₁−Ｃ₄基を含むものが挙げられる。ある実施の形態では、モノメチルＰＥＧホモポリマーなどの直鎖非抗原性ポリマーが好ましい。他の実施の形態では、ポリマーと結合する物質または薬剤の性質に応じて、分岐鎖ポリマーまたは「Ｕ−ＰＥＧｓ」を用いるのが好ましい。他のポリ（エチレングリコール）ホモポリマー、他のアルキル−ポリ（エチレンオキシド）ブロック共重合体、およびポリ（アルキレンオキシド）の共重合体またはブロック共重合体など、別のポリアルキレンオキシドも有用である。本発明のポリマーは、約２００〜約１００，０００の分子量を有し、約２，０００〜約８０，０００が好ましい。しかしながら、約４，０００〜約５０，０００の分子量がもっとも好ましい。

説明の目的であって、限定はしないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）残基は、

のうちの１つであって構わない。

ポリマーの重合度は、ポリマー鎖の繰り返しの数を表し、ポリマーの分子量によって決まる。実質的に非抗原性のポリマーであるＰＡＯ類およびＰＥＧ類は、重量平均分子量によって実質的に異なるが、本発明のほとんどの態様では、Ｒ₁は約２００〜約１００，０００の重量平均分子量を有することが好ましい。実質的に非抗原性のポリマーは約２，０００〜約４８，０００の重量平均分子量を有することがさらに好ましい。

ＰＥＧは、「スターＰＥＧ(star-PEG)」または、参照することによりその開示が本願に援用される、日油株式会社の薬物送達システムカタログ２００５に記載されるようなマルチアームＰＥＧであってもよい。具体的には、ＰＥＧは、化学式：

であって差し支えなく、
ここで、
ｊは約１０〜約３４０の整数であって、約１２，０００〜約４０，０００の総分子量を有し、その残基の末端部分の少なくとも１〜最大３までが、メチルまたは他の低級アルキルでキャップされている、ポリマーを提供することが好ましい。ＣＯＯＨ誘導体に転換する前のこのような化合物としては：

が挙げられる。

さらに本発明の範囲内であることが意図されるものとしては、参照することによりその各開示が本願に援用される、本願と同一の譲受人に譲渡された米国特許第５，６０５，９７６号、同第５，６４３，５７５号、同第５，９１９，４５５号、および同第６，１１３，９０６号の各明細書に記載されている分岐鎖ポリマー残基を含む、末端ＣＯＯＨを有する他のＰＥＧ系化合物の構造が挙げられる。構造式Ｉに対応する、一部の特定のポリマーの典型的なリストとして：

が挙げられ、ここで、
Ｌ₁、Ｌ₂およびＬ₃は、独立して、選択される二官能性のリンカーであり、Ｌ₂は、あるいは、ジアミノアルキルまたはリジン残基などの分岐した連結基であってもよい。例えば、前述の米国特許第６，１１３，９０６号明細書を参照のこと；および、
ｚは、１〜約１２０の整数である。

二官能性の連結基は、当業者に既知である。したがって、Ｌ_1-3の部分は、独立して、以下の限定されない化合物などの二官能性の連結基の中の１つを選択することができる：

ここで、
Ｒ_9-13は、独立して、Ｃ_1-6アルキルなどと同一の群から選択され、ＨまたはＣＨ₃であることが好ましく、
Ｒ₁₄は、Ｒ_9-13ならびにＮＯ₂、Ｃ_1-6ハロアルキルおよびハロゲンを定義する、同一の群から選択され、
ｑ、ｔおよびｙは、それぞれ独立して、１〜約１２の自然数から選択される。

本発明の方法は、デキストランなどの別のポリマー物質、または、デキストラン、ポリビニルアルコール、炭水化物系ポリマー、ヒドロキシプロピル−メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、ポリアルキレンオキシド、および／またはそれらのコポリマーなどの官能化された、または活性化された、モノ−またはビス−カルボン酸になることのできる、他の類似した非免疫原性のポリマーを使用して行なうこともできる。参照することによりその内容を本願に援用する、本願と同一譲受人に譲渡された米国特許第６，１５３，６５５号明細書を参照のこと。前記リストは、単なる例証であって本願に使用する適切な非抗原性のポリマーの種類を限定することは意図されていない。

２．ｔ−アルキルエステル誘導体の合成
ポリアルキレンオキシド・カルボン酸を調製するための本発明の方法は、まず、
（ａ）ポリアルキレンオキシドを、第１溶媒系中で約１０分〜約６０分間、さらに好ましくは、約２０分〜約４０分間、塩基と反応させ、
（ｂ）工程（ａ）の生成物を、第２溶媒系中で、約３０分未満の間、例えば、約１分〜約３０分、さらに好ましくは約１分〜約１５分間、ハロ酢酸ｔ−アルキルと反応させて、ＰＡＯのｔ−アルキルエステルを提供する、
各工程によって、ＰＡＯのｔ−アルキルエステル誘導体を調製することが含まれる。

溶媒系は、工程（ａ）から工程（ｂ）まで、同一であることが好ましく、その際、温度は、約１０℃〜約３５℃が好ましく、約２０℃〜約３１℃がさらに好ましい。したがって、第１および第２溶媒系は、通常、同一である。ＰＡＯｔ−アルキルエステルの逆反応を最小限にするため、溶媒系でＰＡＯを十分に希釈することが必要である。溶媒系に対するＰＡＯの比は、約１０〜２５ｍｌまたはそれ以上の溶媒系に対して、約１ｇのＰＡＯであることが好ましい。溶媒系に対するＰＡＯの比は、約１５ｍｌの溶媒系に対して、約１ｇのＰＡＯであることがさらに好ましい。

反応生成物であるＰＡＯｔ−アルキルエステルを、例えば、反応生成物が比較的不溶性の場合に混和性の溶媒を溶媒系に加える、および／または、溶媒系の温度を低下させるなどの、任意の適切な当技術分野で既知の方法によって、溶媒系から沈殿させる。沈殿を回収し、適切な非可溶化溶媒で１回以上洗浄し、例えば再結晶化などによってさらに精製する。

溶媒系は、溶液に反応物質および反応生成物を移動させるために選択される、任意の適切な当技術分野で既知の溶媒または溶媒の混合物であって差し支えない。特定の実施の形態では、溶媒系は、低温で反応物質および反応生成物が沈殿するのを妨げるように選択される。以下に示すように、溶媒系は、例えば１００％トルエンなど、トルエンを含み、沈殿剤はエチルエーテルである。別の実施の形態では、溶媒系は、随意的に、９９％〜５％の濃度のトルエンを、ジクロロメタンおよび／または塩化エチレンなどの１種類以上の追加の適合した溶媒と混合して含む。

塩基は、カリウムｔ−ブトキシド、ナトリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム、ナトリウム・アミド、水素化ナトリウム、およびそれらの組合せからなる群より選択される。適切なハロ酢酸ｔ−アルキルは、構造式：

であって、
ここでＸは塩素、臭素、またはヨウ素であり、
Ｒ_1-3は、独立して、Ｃ_1-8アルキル、置換アルキルまたは分岐鎖アルキル、例えばフェニルまたは置換フェニルなどのアリールから選択される。

好ましいハロ酢酸ｔ−ブチルとしては、ブロモ酢酸ｔ−ブチル、クロロ酢酸ｔ−ブチル、およびヨード酢酸ｔ−ブチルが挙げられる。これらの酢酸ｔ−ブチルは、例えば、シグマ・ケミカル社(Sigma Chemical Co.)（米国、ミズーリ州、セントルイス所在）などから市販されている。あるいは、トリチルまたは置換アリールエステルを使用することもできる。

３．カルボン酸誘導体の合成
次に、ＰＡＯカルボン酸を製造するために、得られたＰＡＯｔ−アルキルエステルを、適切な酸の存在下、適切な溶媒系中で反応させ、ＰＡＯカルボン酸を形成する。酸性か反応の溶媒系として、以下にジクロロメタンが例示されているが、クロロホルム、またはジクロロエタンなど、他の適切な当技術分野で既知の溶媒も、随意的に用いられる。酸は、所望のＰＡＯカルボン酸を生成するのに有効な、任意の当技術分野で既知の酸であり、例えば、トリフルオロ酢酸、硫酸、リン酸、および塩酸が挙げられる。トリフルオロ酢酸が例示されており、本発明の一部の態様では好ましい。

本発明のＰＡＯカルボン酸の調製の第１の工程は、中間体である、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸のｔ−ブチルエステルを形成することを含む。この中間体は、塩基の存在下、上述のように、ＰＡＯをハロ酢酸ｔ−ブチルと反応させることにより、形成される。塩基は、カリウムｔ−ブトキシドが好ましいが、代わりにブチルリチウム、ナトリウム・アミド、または水素化ナトリウムなどを用いることもできる。これらの塩基は、固体として、本明細書に記載される方法に使用することができ、ｔ−ブタノール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ヘキサンなどの適切な溶媒に溶解させることがさらに好ましい。

中間体を形成するため、ポリアルキレンオキシドを、およそ１：１〜約１：１０のモル比になる量で、ハロ酢酸ｔ−ブチルと反応させる。しかしながら、ハロ酢酸ｔ−ブチルは、約１：８のモル比で存在することが好ましい。さらには、塩基のポリアルキレンオキシドに対するモル比は、約１：１〜約１：２の範囲である。

一旦、ｔ−ブチルエステル中間体が形成されると、ポリアルキレンオキシドのカルボン酸誘導体を容易に、９２％を超える純度で、好ましくは９７％を超える、さらに好ましくは９９％を超える、もっとも好ましくは９９．５％を超える純度で、提供することができる。したがって、混入物質、特に、例えばｍＰＥＧ−ＯＨまたはＰＥＧジオールなどの出発物質に関しては、微量しか含まれない。モノまたはビス−ポリエチレングリコールカルボン酸が好まれる、発明の好ましい態様では、最終物質に含まれる出発物質の混入量は、¹³Ｃ ＮＭＲによる測定で１％未満である。

本発明のこの態様では、ＰＡＯの末端置換されたカルボン酸を提供するため、ｔ−ブチルエステル中間体を、少なくとも当量のトリフルオロ酢酸などの酸と反応させる。あるいは、希塩酸、すなわち、約１Ｎの塩酸、硫酸、リン酸などが使用できる。過剰量によって、技術者は、ｔ−ブチルエステル中間体を所望のカルボン酸誘導体に転換し、ＰＥＧまたは関連する出発ポリマー物質の緩衝能力を妨げることができる。酸との反応の際の温度は、塩基との反応のように重要ではなく、一般に、例えば約１８℃〜約３０℃の周囲温度で行なわれる。

所望のモノ−またはビス−カルボン酸誘導体は、中間体の最終的な酸誘導体への転換が確実となるのに十分な時間の経過後、すなわち、約２〜３時間後に得られる。しかしながら、反応時間は、特定の反応物質および反応条件に応じて、多少変化するであろう。中間体を最終的な所望のカルボン酸に転換した後、溶媒、すなわち、例えばジクロロメタンを、ロータリーエバポレーションなどの当業者に既知の技法を用いて蒸留することにより留去する。得られた残渣をジクロロメタン／エチルエーテル、２−プロパノール、ジメチルホルムアミド／２−プロパノール、トルエン／エチルエーテル、またはトルエン／ヘキサンで再結晶化し、最終生成物を得る。

本明細書に記載の方法は、所望のカルボン酸を、極めて高純度、すなわち、好ましくは９９％を超える純度で提供することから、新規方法の完了後に、従来法によるさらなる生成は必要ではなく、よって、医薬品グレードのポリマーが必要とされる場合に、技術者に時間、労働および物質の大幅な節約を提供する。

４．追加のαおよび／またはω末端部分
本発明のさらなる態様では、モノまたはビスカルボン酸誘導体は、他の活性化ポリアルキレンオキシドの形成に使用することができる。例えば、末端カルボン酸基は、以下の基に転換されうる：
Ｉ．ａ）スクシンイミジチル、
ｂ）カルボニルイミダゾール、
ｃ）アズラクトン、
ｄ）環状イミドチオン、
ｅ）イソシアネートまたはイソチオシアネート、または
ｆ）アルデヒド
などのアミノ基と反応する能力のある官能基、
ＩＩ．カルボン酸基、および、ヒドラジンまたは、例えばアシルヒドラジド、カルバゼート(carbazates)、セミカルバゼート、チオカルバゼートなどのヒドラジド官能基などの反応性カルボニル基と反応する能力のある官能基。
必要以上の実験をすることなく、当業者に既知の技法を使用して、ＰＥＧ−ＣＯＯＨのさまざまな他の離脱基への転換を行なうことができる。転換反応は、関連文献にも報告されている。

末端の活性化基に、ポリアルキレンオキシドに近接するスペーサー部分を含めることもできる。スペーサー部分は、１８個までの炭素原子、または追加のポリマー鎖を含むアルキル、アルコキシ、ヘテロアルキルであって差し支えない。標準的な合成技法を用いてスペーサー部分を付加することができる。

５．カルボン酸誘導体の転換
ポリマーカルボン酸誘導体は、さらなるポリアルキレンオキシド誘導体を形成するのに使用可能な高純度の中間体としての働きをすることもできる。例えば、高純度のアミド、ヒドラジド、他のエステルなどは、標準的な技法を用いて、適切な試薬（アミド、ヒドラジンなど）と共に濃縮することによって、ＰＡＯカルボン酸活性化Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミドエステルから形成することができる。

あるいは、塩基の存在下、カルボン酸をジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはジイソプロピルカルボジイミドと反応させることにより、カルボン酸誘導体をスクシンイミジルエステルへと転換させることができる。

これらの後続転換反応は、実質的には、当業者に周知の標準的な技法である。本発明のこの特徴の重要な側面は、例えばＰＥＧ−カルボン酸などの中間体が、実質的に純粋（９９＋％）であり、したがって、実質的に純粋な最終製品を技術者に保証する、という事実である。

６．共役に適した生物活性物質
カルボン酸誘導体と共役する求核体は、「生物活性な」といわれる。しかしながら、この用語は、生理学的または薬学的活性に限定されない。例えば、酵素を含むものなど、一部の求核体の複合体(nucleophile conjugates)は、有機溶媒中で反応を触媒することができる。同様に、一部の本発明のポリマー複合体は、実験室診断としても有用である。すべての複合体の重要な特徴は、非修飾の生物活性物質と関連する活性の少なくとも一部が維持されることである。

本発明のある態様によれば、２つの置換基の間にエステル結合を形成させるのに十分な条件下で、高純度のＰＥＧ−ＣＯＯＨなどのポリマーのカルボン酸誘導体と、生物活性を失わずに置換反応を受けることができる、利用可能なヒドロキシル部分を有する求核体とを反応させる。特定の抱合反応に関するいかなる事項にも拘束されないが、本発明のプロドラッグは、一般的に、
１）本明細書で調製されるＰＥＧ−酸またはＰＥＧ−二酸などの活性化ポリマー、および加水分解可能な連結を形成可能な位置を有する生物活性物質を提供し、
２）０℃〜２２℃までの温度（室温）で、例えば、シグマ・ケミカル社などの商業的供給源から入手できる、または既知の技法を用いて合成される、１，３−ジイソプロピル−カルボジイミド（ＤＩＰＣ）、１，（３−ジメチルアミノプロピル）３−エチルカルボジイミド（ＥＤＣ）、任意の適切なジアルキルカルボジイミド、向山試薬（例えば、２−ハロ−１−アルキル−ピリジニウムハライド）、またはププロピルホスホン酸環状無水物（ＰＰＡＣＡ）などのカップリング剤、および、ジメチルアミノピリジン（好ましい）、ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、トリエチルアミンなどの塩基の存在下、ジクロロメタン、クロロホルム、トルエンまたはＤＭＦなどの不活性溶媒中で２つの置換基を反応させる、
各工程によって調製される。

本願で調製されるポリマーに抱合されうる化合物の例示的なリストを以下に示す：

および、本明細書に記載される活性化ポリマーと共役するＯＨ基を有する、当業者に既知のあらゆる小分子。共役に利用可能な２つ以上のＯＨが存在する場合は、当技術分野で認められる保護または脱保護の方法を用いて、適切に保護された化合物が必要とされるであろう。

本発明のさらなる態様では、カルボン酸がスクシンイミジルエステルなどの別の末端官能基に転換される場合、活性化ポリマーと所望の求核体との共役は、利用可能なアミノ基を含む生物活性な求核体とポリマーを反応させることによって達成される。例えば、参照することにより本願に援用される、米国特許第５，１２２，６１４号明細書を参照のこと。同様に、前記セクション３に記述されるような他の連結基を使用する場合は、所望の活性化ポリマーを、所望の標的連結基、すなわち、ＮＨ₂、ＣＯＯＨなどを含んでいる生物活性物質と反応させることによって、ＰＡＯ−複合体を調製することができる。当然ながら、これらの抱合反応を完了するのに用いられる条件は、複合体の最適な生物活性を維持するように選択されるということが理解されよう。

複合体は、生物活性があり、多くの治療用途を有する。所望の生物活性物質を含むポリマー複合体を有効量で投与することにより、生物活性物質を含む治療を必要とする哺乳類を治療することができる。例えば、酵素補充療法または血液因子を必要とする哺乳類に所望の物質を含む所定のポリマー複合体を与えることができる。このような複合体の用量は、所望の治療結果を実現するのに十分な量であり、臨床経験に基づいて当業者には明白であろう。

本発明の対象である生物活性な求核体としては、限定はしないが、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、酵素、例えば医薬品などの天然または合成による有機分子などが挙げられる。

対象とする酵素としては、炭水化物特異的酵素(Carbohydrate-specific enzymes)、タンパク質分解酵素、酸化還元酵素、転移酵素、加水分解酵素、リアーゼ、異性化酵素、およびリガーゼが挙げられる。特定の酵素に限定されるわけではないが、対象とする酵素の例として、アスパラギナーゼ、アルギナーゼ、アルギニンデアミナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、スーパーオキシド・ジスムターゼ、エンドトキシナーゼ、カタラーゼ、キモトリプシン、リパーゼ、ウリカーゼ、アデノシンジホスファターゼ、チロシナーゼおよびビリルビンオキシダーゼが挙げられる。対象とする炭水化物特異性酵素には、グルコースオキシダーゼ、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルコウロニダーゼ等が含まれる。対象とする炭水化物特異的酵素としては、ブドウ糖酸化酵素、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルコセレブロシダーゼ、グルクロニダーゼなどが挙げられる。

対象とするタンパク質、ポリペプチドおよびペプチドとしては、ヘモグロビン；第VII因子、第VIII因子、および第IX因子を含む血液因子などの血清タンパク質；免疫グロブリン；インターロイキン、α−、β−およびγ−インターフェロンなどのサイトカイン；顆粒球コロニー刺激因子を含むコロニー刺激因子；血小板由来成長因子；および、ホスホリパーゼ活性化タンパク質（ＰＬＡＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。生物学的又は治療的に対象とされる他のタンパク質としては、インスリン、レクチンおよびリシンなどの植物タンパク質、腫瘍壊死因子、成長因子、組織成長因子、ＴＧＦα又はＴＧＦβおよび上皮細胞成長因子、ホルモン、ソマトメジン、エリスロポイエチン、色素性ホルモン、視床下部放出因子、抗利尿ホルモン、プロラクチン、絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、および同種のものが挙げられる。対象とされる免疫グロブリンとして、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびそれらの断片が挙げられる。

インターロイキン、インターフェロンおよびコロニー刺激因子などの一部のタンパク質は、通常、組換え法を用いる結果として、非グリコシル化型でも存在する。これら非グリコシル化型もまた、本発明の生物活性な求核体の１つである。

本発明の生物活性な求核体には、in vivo 生物活性を示すポリペプチドの任意の部分も含まれる。これには、アミノ酸配列、アンチセンス部分およびそれに類したもの、抗体断片、単鎖抗原結合タンパク質（例えば、参照することによりその開示が本願に援用される、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照のこと）、抗体又は断片の融合体を含む結合分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、触媒抗体、ヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドが含まれる。

タンパク質又はその部分は、組織培養、動物供給源からの抽出、又は組換えＤＮＡ法などの当業者に既知の技法を用いることにより調製又は単離することができる。タンパク質、ポリペプチド、アミノ酸配列などのトランスジェニック供給源もまた、意図されている。かかる物質は、トランスジェニック動物、即ちマウス、ブタ、ウシ等から得られ、それらタンパク質は乳汁、血液又は組織内に発現される。トランスジェニック昆虫およびバキュロ・ウイルス発現系もまた、供給源として意図されている。更に、突然変異ＴＮＦおよび突然変異インターフェロンなどのタンパク質の突然変異型も、本発明の範囲内にある。

対象とされる他のタンパク質は、ブタクサ、抗原Ｅ、ミツバチ毒、ダニ・アレルゲン、および同種のものなどのアレルゲンタンパク質である。

有用な生物活性な求核体は、タンパク質およびペプチドに限られない。実質的にあらゆる生物活性化合物が本発明の範囲内に含まれる。医薬化学製品、即ち抗腫瘍薬、心・血管作動薬、抗新生物薬、抗感染薬、抗不安薬、胃腸薬、中枢神経系作用薬、鎮痛薬、排卵誘発剤又は避妊薬、抗炎症薬、ステロイド薬、抗ウレセミック薬 (anti-urecemic agent)、血管拡張薬、血管収縮薬および同種のものなどの化学療法薬分子が挙げられる。本発明の好ましい態様では、カルボン酸誘導体をポリマーと化学療法薬部分の間にエステル結合をもたらす条件下で反応させる。特に好ましい生物活性な求核体としては、タキソール、タキサン (taxanes) 、タキソテール、カンプトテシン、ポドフィロトキシン、ヘモグロビン、グルコセレブロシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルギナーゼ、アスパラギナーゼ、アルギニンデアミナーゼおよびスーパーオキシド・ジスムターゼが挙げられる。

前述の事項は、本発明のポリマーとの結合に適した生物活性な求核体を説明するものである。当然ながら、具体的に言及してはいないが適切な求核基を有する生物活性な物質もまた意図されており、それらは本発明の範囲内にある。

以下の非限定的実施例は、本発明の特定の態様を説明するものである。全ての部およびパーセンテージは特に断らない限り重量基準であり、すべての温度は摂氏で示している。

実施例１
ｍ−ＰＥＧ ^30K エステル３
図１を参照すると、６００ｍｌのトルエン中の３１ｇ（１．０３ｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ^30K−ＯＨ（化合物１）溶液を共沸して、１３０ｍｌの蒸留液を留出させた。次いで、その反応混合物を３０℃まで冷却してから、ｔ−ブタノール中のカリウムｔ−ブトキシドの１．０ｍｏｌ溶液２．１ｍｌ（２．０７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた混合液を室温で１時間攪拌してから、５．９ｇ（０．０３０ｍｏｌ）のブロモ酢酸ｔ−ブチルを加えた。得られた混合液を３０℃で１０〜６０分間攪拌し（化合物２の生成）、続いて、１．６ｇ（８．３ｍｏｌ）のブロモ酢酸ｔ−ブチルを加えた。得られた濁った反応混合液を３０℃で１時間攪拌した。生成物（化合物３）を、エーテルを用いて反応混合液から沈殿させ、濾過して回収し、さらなるエーテルで洗浄した。この粗生成物を１２％ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶して２７．８ｇ（収率９０％）を得た。この生成物は、¹³Ｃ ＮＭＲにより純度９９％強と確認され、６０．５ｐｐｍに見られるＰＥＧ−ＯＨのピークは存在しなかった。図１を参照のこと。
¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃)δ169.07, 81.01, 71.54- 68.62(PEG), 58.65, 27.82。

実施例２
ｍ−ＰＥＧ ^30K 酸４
９０ｍｌのジクロロメタン中の８．７ｇ（０．１３ｍｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ^30Kエステル（化合物３）および４５ｍｌのＴＦＡの溶液を室温で３時間攪拌し、次いで、溶媒をロータリー・エバポレーターで一部留去してから、生成物をエーテルで沈殿させた。その固形物を濾過して回収し、１２％ＤＭＦ／ＩＰＡから再結晶し、乾燥して８．２ｇ（収率９４％）の生成物を得た（化合物４）。この生成物は¹³Ｃ ＮＭＲにより純度９９％強と確認された。
¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃)δ170.90, 71.54-68.18(PEG), 58.65。

実施例３
タキソール２’ｍ−ＰＥＧ ^30K モノエステルの調製
実施例２からのｍＰＥＧ３０，０００酸（３７５０ｍｇ、０．１２５ｍｍｏｌ、化合物４）を共沸し、次いで、室温で２０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解させた。上記溶液を、０℃で、１，３−ジイソプロピル−カルボジイミド（２６ｍｌ、０．１７ｍｍｏｌ）、４−ジメチルアミノピリジン（３２ｍｇ、０．２６ｍｍｏｌ）およびタキソール（１４６ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）で処理した。３０分後にその反応混合液を室温まで温め、１６時間、その温度を保った。次いで、反応混合液を０．１ＮのＨＣｌで洗浄し、乾燥し、蒸発させて白色の固形物を得た。これを２−プロパノールから結晶化して３０００ｍｇの純粋な生成物５を得た（収率８０％）。

比較実施例４
合成の一部を変更し、ｍＰＥＧ^30Kエステルを調製する実施例１の操作に従った。化合物２が形成され、１．６ｇ（８．３ｍｍｏｌ）のブロモ酢酸ｔ−ブチルを加えた後、得られた濁った混合液６を還流加熱してから、熱源を外し、室温で１８時間攪拌した（化合物７の生成）。これを、３０℃で１時間攪拌して得られた濁った混合液と比較する。この生成物は、ピークを測定するのに使用する装置の感度が非常に良くなり、ＰＥＧ−ＯＨの６１．１８ｐｐｍの有意なピークが発見されたことにより、これまで考えられていた純度９９％強ではなく、むしろわずか純度６０％であることが¹³Ｃ ＮＭＲで確認された。図２を参照。未知のピークとして２００．２６に不純物が認められた。
¹³C NMR (75.4mHz, CDCl₃)δ200.26, 169.00, 80.95, 74.00-68.00 (PEG), 63.00, 未知の不純物, 61.18 (出発物質−PEG-OH), 58.60, 27.77。

実施例５
ｍ−ＰＥＧ ^30K ＲＮＬ８ａアルデヒド９

９０ｍｌの無水ジクロロメタン中の１０．０ｇ（０．３３ｍｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ^30K酸８、０．１５ｇ（１．０ｍｍｏｌ）の３，５−ジメチル−４−ヒドロキシベンズアルデヒド、および０．１５ｇ（１．２４ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰの溶液を表欲で０℃まで冷却し、０．１９ｇ（１．０ｍｍｏｌ）のＥＤＣ塩酸塩を加えた。この混合液を一晩、室温に置いた。この時点で、溶媒をロータリー・ エバポレーター(rotovap)で一部留去し、エーテルで生成物を沈殿させ、回収し、エーテルで洗浄した。この粗生成物を１２％ＤＭＦ／ＩＰＡで再結晶化し、９．４ｇ（収率９４％）を得た。
¹³C NMR (75.4 MHz5 CDCl₃) δ190.80, 167.26, 152.01, 133.74, 131.02, 129.74, 71.57- 67.83(PEG), 58.68, 16.19。

実施例６
ｍ−ＰＥＧ ^30K ＲＮＬ８ａアルコール１０
６３ｍｌの無水メタノール中の４．８ｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ^30KＲＮＬ８ａアルデヒド９を１５℃まで冷却し、０．０１ｇ（０．２５ｍｍｏｌ）の水素化ホウ素ナトリウムを加えた。この混合液を２時間、１５〜２０℃で攪拌し、１Ｎ ＨＣｌでｐＨ６．５に合わせた。ロータリー・エバポレーターでメタノールを留去し、残渣に水を加えた。０．５Ｎ ＨＣｌでｐＨを２．０まで下げ、ジクロロメタンで水から生成物を抽出した。この抽出液を無水硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過した後、溶媒をロータリー・ エバポレーターで一部留去した。エチルエーテルで生成物を沈殿させ、濾過回収し、エチルエーテルで洗浄して４．６ｇ（収率９６％）の生成物を得た。
¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) δ 167.76, 146.25, 138.68, 129.42, 126.67, 71.55- 67.87 (PEG), 63.86, 58.65, 16.11。

実施例７
ｍ−ＰＥＧ ^30K ＲＮＬ８ａリンカー１１
１８ｍｌのジクロロメタンおよび１．８ｍｌのＤＭＦの混合液中の１．８ｇ（０．０６ｍｍｏｌ）のｍ−ＰＥＧ^30KＲＮＬ８ａアルコール１０の溶液を０℃まで冷却し、０．１３ｇ（０．４８ｍｍｏｌ）のＤＳＣおよび０．３３ｇ（０．４３ｍｍｏｌ）のピリジンを加えた。この混合液を一晩、室温に置いた。この時点で、溶媒をロータリー・ エバポレーターで一部留去し、生成物をエーテルで沈殿させ、回収し、エーテルで洗浄した。この粗生成物を１２％ＤＭＦ／ＩＰＡで再結晶化し、１．６ｇ（収率８８％）を得た。
¹³C NMR (75.4 MHz, CDCl₃) S 168.14, 167.59, 151.03, 147.76, 130.53, 130.27, 128.50, 72.97-67.83(PEG), 58.67, 25.17, 16.11。

この最終生成物は、結合に利用できるアミンまたはヒドロキシル基を有する、さまざまな、生物活性のあるポリペプチド、酵素、タンパク質、小分子などとの結合に使用することができる。これらの抱合反応の方法については、例えば、参照することによりその各内容が本願に援用される、本願と同一の譲受人に譲渡された米国特許第６，１８０，０９５号明細書、またはGreenwaldらのJ. Med. Chem. 1999 Vol. 42, No. 18, 3657- 3667に記載されている。

実施例１に対応するＮＭＲスペクトル。 比較実施例４に対応するＮＭＲスペクトル。

Claims (23)

1. （ａ）第１溶媒系中で、約１０分〜約６０分間、ポリアルキレンオキシドを塩基と反応させ、
   （ｂ）第２溶媒系中で、約３０分未満の間、工程（ａ）の生成物をハロ酢酸ｔ−アルキルと反応させる、
   各工程を有してなり、
   工程（ａ）および（ｂ）の反応が約１０℃〜約３５℃の温度で行なわれることを特徴とする、
   ポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルの調製方法。
2. 請求項１のポリアルキレンオキシドのｔ−アルキルエステルを酸と反応させてポリアルキレンオキシド・カルボン酸を形成する工程を含む、ポリアルキレンオキシド・カルボン酸の調製方法。
3. 前記ポリアルキレンオキシドがポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項１記載の方法。
4. 得られた前記ポリアルキレンオキシドｔ−アルキルエステルを前記第２溶媒系から分離する工程をさらに含むことを特徴とする請求項１記載の方法。
5. 前記ポリエチレングリコールがω−メトキシポリエチレングリコールであることを特徴とする請求項３記載の方法。
6. 前記ハロ酢酸ｔ−アルキルが、構造式：
   

   

   を含むことを特徴とする請求項１記載の方法であって、
   ここで、
   Ｘは塩素、臭素、またはヨウ素であり、
   Ｒ_1-3は、独立して、Ｃ_1-8アルキル、Ｃ_1-8置換アルキル、またはＣ_1-8分岐鎖アルキルおよびアリールからなる群より選択される。
7. 前記ハロ酢酸ｔ−アルキルがハロ酢酸ｔ−ブチルであることを特徴とする請求項６記載の方法。
8. 前記ハロ酢酸ｔ−ブチルが、ブロモ酢酸ｔ−ブチルまたはクロロ酢酸ｔ−ブチルであることを特徴とする請求項７記載の方法。
9. 前記ポリアルキレンオキシドの前記塩基に対するモル比が１：１〜約１：２であることを特徴とする請求項１記載の方法。
10. 前記塩基が、カリウムｔ−ブトキシド、ブチルリチウム、ナトリウム・アミド、水素化ナトリウム、およびこれらの組合せからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の方法。
11. 前記塩基がカリウムｔ−ブトキシドであることを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 前記酸が、トリフルオロ酢酸、硫酸、リン酸および塩酸からなる群より選択されることを特徴とする請求項２記載の方法。
13. 前記酸がトリフルオロ酢酸であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 前記工程（ａ）の反応が、約２０分〜４０分間行なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
15. 前記溶媒系がトルエンを含み、前記工程（ａ）および（ｂ）の反応が約２５〜約３１℃で行なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
16. 前記溶媒系がトルエンおよびジクロロメタンを含み、前記工程（ａ）および（ｂ）の反応が約２０〜約３１℃で行なわれることを特徴とする請求項１記載の方法。
17. 前記反応が約１８〜約３０℃で行なわれることを特徴とする請求項２記載の方法。
18. 溶媒系に対するポリアルキレンオキシドの比が、約１５〜約２５ｍｌの溶媒系に対して１ｇのポリアルキレンオキシドであることを特徴とする請求項１記載の方法。
19. 前記ポリアルキレンオキシドが、約２００〜約１００，０００の分子量を有することを特徴とする請求項１記載の方法。
20. 前記ポリアルキレンオキシドが約２，０００〜約８０，０００の分子量を有することを特徴とする請求項１９記載の方法。
21. 前記ポリアルキレンオキシドが約４，０００〜約５０，０００の分子量を有することを特徴とする請求項１９記載の方法。
22. 生成した前記ポリアルキレンオキシド・カルボン酸の純度が¹³Ｃ ＮＭＲの測定で９９％を超えることを特徴とする請求項２記載の方法。
23. 前記ポリアルキレンオキシドが直鎖または分岐鎖のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の方法。

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