JP2009522024A5

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Publication number: JP2009522024A5
Application number: JP2008548849A
Authority: JP
Filing date: 2006-12-28
Publication date: 2010-05-20
Anticipated expiration: 2026-12-28

Description

〔図面の簡単な説明〕
図１は、内皮細胞の増殖におけるhUTCロット番号120304、MSC、および、線維芽細胞の効果を示す。共培養培地（ヘイフリック培地８０％＋EGM-2MV培地２０％、もしくは、ヘイフリック培地５０％＋EGM-2MV培地５０％）中、２４ウェル組織培養皿の底の上に、内皮細胞を５，０００細胞／ｃｍ２（１０，０００細胞／ウェル）の密度で接種し、トランスウェルインサート(transwell insert)の内側に、hUTCロット番号120304、MSC、もしくは、線維芽細胞を５，０００細胞／ｃｍ２（１，６５０細胞／インサート）で接種した。共培養７日後、細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。また、EGM-2MV培地中に、内皮細胞を陽性対照として維持した。Ａ：HUVEC、Ｂ：HCAEC、Ｃ：HIAEC。

図２は、内皮細胞の増殖におけるhUTCロット番号120304および中和抗体の効果を示す。共培養培地（ヘイフリック培地５０％＋EGM-2MV培地５０％）中、２４ウェル組織培養皿の底の上に、HUVECもしくはHCAECを５，０００細胞／ｃｍ２（１０，０００細胞／ウェル）の密度で接種し、トランスウェルインサートの内側に、hUTCロット番号120304を、５，０００細胞／ｃｍ２（１，６５０細胞／インサート）で接種した。また、この時、FGF（７μｇ／ｍＬ）、HGF（１μｇ／ｍＬ）、もしくは、VEGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を加えた。共培養７日後、細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。また、EGM-2MV培地中に、内皮細胞を陽性対照として維持した。成長因子単独で処理した細胞、ならびに、成長因子と中和抗体で処理した細胞について示す。Ａ：HUVEC、Ｂ：HCAEC。

図３は、HUVECの増殖におけるhUTCロット番号120304細胞可溶化物および中和抗体の効果を示す。EGM-2MV培地中、２４ウェル組織培養皿の底の上に、HUVECを５，０００細胞／ｃｍ２（１０，０００細胞／ウェル）の密度で、８時間、接種した。その後、０．５％FBSを含み成長因子を含まないEGM-2MV培地０．５ｍＬ中で、一晩インキュベーションすることによって、細胞を血清枯渇した。その後に、FBS、新たに準備したhUTCロット番号120304細胞可溶化物、FGF（７μｇ／ｍＬ）もしくはHGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を加えた。培養４日後、細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。明灰色の棒：培地対照、中間の灰色の棒：タンパク質６２．５μｇを含む可溶化物とともにインキュベーションしたHUVEC、暗灰色の棒：タンパク質１２５μｇを含む可溶化物とともにインキュベーションしたHUVEC。

図４は、内皮細胞の遊走におけるhUTCおよびMSCの効果を示す。共培養培地（ヘイフリック培地５０％＋EGM-2MV培地５０％）中、トランスウェルインサートの内側に、HUVECもしくはHCAECを５，０００細胞／ｃｍ２（２３，０００細胞／インサート）の密度で接種し、６ウェル組織培養皿の底の上に、hUTCロット番号120304もしくはMSCを５，０００細胞／ｃｍ２（４８，０００細胞／ウェル）の密度で接種した。共培養７日後、トランスウェルインサートの下側にある細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。また、EGM-2MV培地中に、内皮細胞を対照として維持した。Ａ：HUVEC、Ｂ：HCAEC。

図５は、内皮細胞の遊走におけるhUTCロット番号120304 および中和抗体の効果を示す。共培養培地（ヘイフリック培地５０％＋EGM-2MV培地５０％）中、トランスウェルインサートの内側に、HUVECもしくはHCVECを５，０００細胞／ｃｍ２（２３，０００細胞／インサート）の密度で接種し、６ウェル組織培養皿の底の上に、hUTCロット番号120304を５，０００細胞／ｃｍ２（４８，０００細胞／ウェル）の密度で接種した。この時、FGF（７μｇ／ｍＬ）、もしくは、HGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を加えた。共培養７日後、トランスウェルインサートの下側にある細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。また、EGM-2MV培地中に、内皮細胞を対照として維持した。Ａ：HUVEC、Ｂ：HCAEC。

PPDCとともに投与してもよい他の成分の例は、限定されないが、数例挙げると、以下のものを含む。
（１）他の血管形成因子、血管形成薬、筋再生性もしくは筋保護性の因子もしくは薬剤
（２）選択された細胞外マトリックス成分（例えば、本分野で既知の１つ以上の型のコラーゲン、および／もしくは、成長因子）、血小板豊富な血漿、ならびに、薬剤（あるいは、PPDCが、成長因子を発現し産生するように、遺伝子操作されてもよい）
（３）抗アポトーシス薬［例えば、エリスロポエチン（EPO）、EPOミメティボディ、トロンボポエチン、インスリン様成長因子（IGF）１（IGF-I）、IGF-II、肝細胞成長因子、カスパーゼ阻害剤］
（４）抗炎症化合物［例えば、p38 MAPキナーゼ阻害剤、TGF-beta阻害剤、スタチン、IL-6とIL-1の阻害剤、ペミロラスト、トラニラスト、レミケード（REMICADE）（Centocor, Inc., Malvern, PA）、シロリムス、および、非ステロイド抗炎症薬（NSAIDS）（例えば、テポサリン、トルメチン、スプラフェン）
（５）免疫抑制薬もしくは免疫調節薬（例えば、カルシニューリン阻害剤、mTOR阻害剤、抗増殖薬、副腎皮質ステロイド、様々な抗体）
（６）抗酸化剤（例えば、プロブコール、ビタミンＣ・Ｅ、コエンザイムＱ１０、グルタチオン、Ｌ−システイン、Ｎ−アセチルシステイン）
（７）局所麻酔薬

分娩後由来細胞、もしくは、組成物、ならびに／または、分娩後由来細胞を含むマトリックスを、マイクロカテーテル、カテーテル法(intracatheterization)、ミニポンプを経由して部位に送達してもよい。媒体賦形剤もしくはキャリアは、患者、特に、細胞分化が誘導されるべき部位に局所的に、投与するために製薬上許容できることが既知である任意のものでありうる。例としては、液体培地、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）、滅菌生理食塩水、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、リーボビッツ培地（L15；Invitrogen, Carlsbad, CA）、滅菌ブドウ糖液、および、任意の生理学上許容できる液体を含む。

≪方法および材料≫
細胞培養
＜分娩後由来細胞＞
ヒト臍帯および胎盤を受領し、細胞を以前に説明したように単離した（実施例１）。細胞をゼラチンコート組織培養プラスチックフラスコ上の成長培地［ダルベッコ変法必須培地（DMEM；Invitrogen, Carlsbad, CA）、１５％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan UT）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン（Invitrogen）１００μｇ／ｍＬ、０．００１％（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール（Sigma, St. Louis, MO）］の中で培養した。培養物を５％ＣＯ_２とともに３７℃でインキュベーションした。実験に使用した細胞は、４代継代〜１２代継代の間のものであった。

その後、内皮細胞培養物を、内皮細胞反応の陽性対照とするために、１０ｎｍｏｌヒトbFGF（Peprotech, Rocky Hill, NJ）、もしくは、１０ｎｍｏｌヒトVEGF（Peprotech, Rocky Hill, NJ）のいずれかで処理した。分娩後由来細胞を接種したトランスウェルインサートを、インサートチャンバー中に２％FBSを含む成長培地の入った適切なウェルに加えた。培養物を、５％ＣＯ２とともに３７℃で、約２４時間インキュベーションした。ウェルプレートをインキュベータから取り除き、内皮細胞培養物像をOlympus（登録商標）倒立顕微鏡（Olympus, Melville, NY）で収集した。

表２−１は、成長培地中に分娩後由来細胞によって放出された既知の血管形成因子の濃度を示している。上記で説明したように、分娩後由来細胞をインサート上に接種した。細胞を、３７℃、大気酸素中、インサート上で、４８時間培養し、その後、２％FBS培地に切り換え、３７℃、２４時間に戻した。培地を取り除き、即座に凍結し、−８０℃で保存し、サーチライト多重ELISA解析（SEARCHLIGHT multiplex ELISA assay)（Pierce Chemical Company, Rockford, IL）によって分析した。示した結果は、２回の測定の平均である。結果は、分娩後由来細胞が、検出できる濃度の血小板由来成長因子-bb(platelet-derived growth factor-bb)（PDGF-bb）、もしくは、ヘパリン結合表皮成長因子(heparin-binding epidermal growth factor)（HBEGF）を放出しないことを示す。細胞は、測定可能な量の、メタロプロテアーゼ組織阻害因子１(tissue inhibitor of metalloprotease-1)（TIMP-1）、アンジオポエチン２(angiopoietin 2)（ANG2）、トロンボポエチン(thrombopoietin)（TPO）、ケラチノサイト成長因子(keratinocyte growth factor)（KGF）、肝細胞成長因子(hepatocyte growth factor)（HGF）、線維芽細胞成長因子(fibroblast growth factor)（FGF）、血管内皮成長因子(vascular endothelial growth factor)（VEGF）を放出する。

分娩後由来細胞を、大気酸素中、２％FBSを含む培地中で、２４時間培養した。培地を取り除き、サーチライト多重ELISA解析（SEARCHLIGHT multiplex ELISA assay)（Pierce）によって解析した。結果は、２回の分析の平均である。値は、培養培地ｍＬ当たりのｐｇで報告された培地中の濃度である。Plac：胎盤由来細胞、Umb cord：臍帯由来細胞。

表２−２は、分娩後由来細胞によって放出された既知の血管形成因子の濃度を示している。上記で説明したように、分娩後由来細胞をインサート上に接種した。細胞を、５％酸素、成長培地中、インサート上で、４８時間培養し、その後、２％FBS培地に切り換え、５％Ｏ_２インキュベーション、２４時間に戻した。培地を取り除き、即座に凍結し、−８０℃で保存し、サーチライト多重ELISA解析（SEARCHLIGHT multiplex ELISA assay)（Pierce Chemical Company, Rockford, IL）によって分析した。示した結果は、２回の測定の平均である。結果は、分娩後由来細胞が、検出できる濃度の血小板由来成長因子-bb（PDGF-bb）、もしくは、ヘパリン結合表皮成長因子（HBEGF）を放出しないことを示す。細胞は、測定可能な量の、メタロプロテアーゼ組織阻害因子１（TIMP-1）、アンジオポエチン２（ANG2）、トロンボポエチン（TPO）、ケラチノサイト成長因子（KGF）、肝細胞成長因子（HGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血管内皮成長因子（VEGF）を放出する。

分娩後由来細胞を、５％酸素中、２％FBSを含む培地中で、２４時間培養した。培地を取り除き、サーチライト多重ELISA解析（SEARCHLIGHT multiplex ELISA assay)（Pierce）によって解析した。結果は、２回の分析の平均である。値は、培養培地ｍＬ当たりのｐｇで報告された培地中の濃度である。Plac：胎盤由来細胞、Umb cord：臍帯由来細胞。

所定の継代の間、細胞を、一度リン酸緩衝生理食塩水（PBS；Invitrogen；カタログ番号14190）で洗浄し、トリプシン処理（０．２５％トリプシン−EDTA；Invitrogen；カタログ番号25200-056）によって引き離した。細胞をGUAVA（登録商標）装置（Guava Technologies, Hayward, CA）を用いてカウントし、５，０００細胞／ｃｍ２の密度で接種した。細胞を定期的に３〜４日ごとに継代した。

細胞可溶化物を準備するために、細胞ペレットを含むチューブを、液体窒素(liquid nitrogen)（LN2）中に６０秒間浸し、その後、即座に３７℃の水浴に、６０秒間、もしくは、解凍されるまでであるが３分未満、浸した。このステップを３回くり返した。このステップの後、凍結解凍サンプルを１３，０００ｒｃｆ、４℃で、１０分間遠心分離し、その後、氷上に置いた。上澄みを注意深く取り除き、新しい滅菌シリコン化１．５ｍＬチューブに移した。遠心分離ステップを３回繰り返し、結果的に生じた上澄みを集めた。タンパク質濃度を、QUICK START（商標） Bradfordタンパク質解析キット（Bio-rad；カタログ番号500-0201）を用いて、HUVECの増殖に係る細胞可溶化物の効果を研究するために決定した。

＜細胞増殖の測定＞
細胞を採取し、指定された培地処方に直接、５，０００細胞／ｃｍ２の濃度で播いた。共培養実験のために、２４ウェルトランスウェル（Corning；カタログ番号3413）を、ウェルの底の上に播いた内皮細胞（１０，０００細胞／ウェル）とともに用い、hUTC、MSC、もしくは、線維芽細胞を、トランスウェルインサート（１，６５０細胞／トランスウェルインサート）の内側に播いた。指定された期間で、hUTC、MSC、もしくは、線維芽細胞を含むインサートを取り除き廃棄した。各ウェルに９０μＬのトリプシンを加えることによって、内皮細胞を採取した。ピペッティングで上下することによって、細胞を引き離し、その後、９６ウェルプレートに移した。培地９０μＬを加えることによって、トリプシンを抑制した。染色溶液２０μＬ（培地１８μＬ＋GUAVA VIACOUNT（登録商標） Flex試薬１μＬ＋DMSO１μＬ）を加えることによって、細胞を染色し、GUAVA（登録商標）装置（Guava Technologies, Hayward, CA）を用いて定量した。

HUVECの増殖におけるhUTCロット番号120304細胞可溶化物の効果を研究するために、HUVECを、EGM-2MV培地の入った２４ウェル組織培養皿上に１０，０００細胞／ウェルの密度で、８時間、接種した。その後、０．５％FBSを含み成長因子を含まないEGM-2MV培地０．５ｍＬ中で、一晩インキュベーションすることで、細胞を血清枯渇した。その後、FBS、新たに準備したタンパク質を含むhUTCロット番号120304細胞可溶化物６２．５μｇもしくは１２５μｇ、および、FGF（７μｇ／ｍＬ）もしくはHGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を加えた。培養４日後、細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。

内皮細胞増殖におけるhUTC介在性増加の潜在的なメカニズムの研究のために、FGF（７μｇ／ｍＬ）、HGF（１μｇ／ｍＬ）、VEGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を、HUVECおよびHCAECと、hUTCとの共培養中に含めた。細胞を最初に播いた時に、抗体を細胞培養培地に加えた。共培養７日後、細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。

＜細胞遊走の検査＞
細胞遊走を測定するために、６ウェルトランスウェル（Corning；カタログ番号3428）設定を用いた。指定された培地処方に直接、５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、細胞を接種した。トランスウェルインサートの内側に、内皮細胞を接種し（２３，０００細胞／トランスウェルインサート）、ウェルの底に、hUTCロット番号120304もしくはMSCを播いた（４８，０００細胞／ウェル）。共培養７日後に、トランスウェルの下側の細胞数をカウントすることによって、遊走を検査した。簡単に言うと、トランスウェルを、清潔なウェルへ移し、PBSで洗浄した。ウェルの底にトリプシンを加えることによって、ウェルの下側の細胞を採取した。完全成長培地を加えることによって、トリプシンを抑制し、遠心分離によって、細胞を収集した。その後、細胞を培地２５μＬで再懸濁し、このうちの２０μＬを、GUAVA（登録商標）装置を用いて細胞カウントを達成するために用いた。

内皮細胞遊走におけるhUTC介在性増加の潜在的なメカニズムの研究のために、FGF（７μｇ／ｍＬ）、HGF（１μｇ／ｍＬ）に対する中和抗体を、HUVECおよびHCAECと、hUTCロット番号120304との共培養中に入れた。細胞を最初に播いた時に、細胞培養培地中に抗体を加えた。共培養７日後、トランスウェルインサートの下側にある細胞を採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。

≪結果≫
＜内皮細胞の増殖におけるhUTCの効果＞
内皮細胞の増殖におけるhUTCの効果を研究するために、共培養システムを利用した。このことは、２４ウェル組織培養皿の底に播いた内皮細胞、および、トランスウェルインサートの内側に播いたhUTCのトランスウェル設定を用いて実施された。これらの実験では、２つの異なる培地処方（材料と方法で詳説された培地組成物）、すなわち、ヘイフリック培地８０％＋EGM-2MV培地２０％（H80）、もしくは、ヘイフリック培地５０％＋EGM-2MV培地５０％（H50）を用いた。共培養６日または７日後、トランスウェルインサートを取り除き、内皮細胞をトリプシン処理によって採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。

＜HUVECの増殖におけるhUTCロット番号120304細胞可溶化物の効果＞
また、本研究は、HUVECの増殖における細胞可溶化物の効果を決定するために実行された。EGM-2MV培地の入った２４ウェルプレート上に、５，０００細胞／ｃｍ２の密度で、HUVECを接種した。その後、０．５％ウシ胎仔血清（FBS）を含み成長因子を含まないEGM-2MV培地０．５ｍＬ中で、一晩インキュベーションすることによって、細胞を血清枯渇した。インキュベーション後、新たに準備されたhUTCロット番号120304細胞可溶化物を様々な濃度で加えた。いくつかの例では、FGF、HGF、中和抗体もまた含まれる。培養４日後、HUVECを採取し、GUAVA（登録商標）装置を用いてカウントした。