JP2009521926A - プロテアーゼ阻害 - Google Patents

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Abstract

プロテアーゼを阻害する操作された配列を含むタンパク質（２つ以上の操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを有するタンパク質など）およびそのようなタンパク質の使用が開示される。本発明はまた、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、癌および慢性閉塞性肺障害からなる群から選択される障害の原因となる過剰な活性を有する、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含み２つ以上のプロテアーゼを阻害する、単離されたタンパク質に関する。

Description

（発明の背景）
背景
多くの疾患の病態の局面は、プロテアーゼの過剰な活性を含む。そのようなプロテアーゼ活性を低下させる医薬品を使用して、疾患状態を回復させることができる。
要旨
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、強いプロテアーゼインヒビターである。Ｋｕｎｉｔｚドメインの例としては、ヒト血漿カリクレイン、ヒトプラスミン、ヒトヘプシン（ｈｅｐｓｉｎ）、ヒトマトリプターゼ（ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ）、ヒトエンドセリアーゼ（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｓｅ）１（ｈＥＴ−１）、ヒトエンドセリアーゼ２（ｈＥＴ−２）およびヒト好中球エラスターゼ（ヒト白血球エラスターゼとしても知られる）を阻害する、天然に存在しないＫｕｎｉｔｚドメインが挙げられる。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、操作されることにより、ほとんどのセリンプロテアーゼに対して非常に高い親和性および特異性を有することができる。
時折、単一の疾患状態において、有害な活性を有する２つ以上のプロテアーゼが存在する。様々な患者において、所与の症状は、２つの異なるプロテアーゼの異常な活性から生じ得る（患者ごとに関与するプロテアーゼが異なる）。これらのような場合において、２つ以上のプロテアーゼを阻害する単一の活性な薬理学的物質を得ることが有用であり得る。しばしば、特異性の低いインヒビター（例えば、低分子インヒビター）が、意図した標的以外のプロテアーゼを阻害することによって重大な副作用を引き起こす。複数のドメイン（各々が、異なるプロテアーゼに対して高い親和性および特異性を有する）を含む分子を使用して、標的以外のプロテアーゼとインヒビターとの交差反応に起因する副作用を引き起こすことなく、様々な標的プロテアーゼを阻害することができる。これにより、複数または様々な調節不全のプロテアーゼを有する患者を処置するための単一の薬剤の開発が可能になる。
１つの局面において、本開示は、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含む単離されたタンパク質を特徴とし、ここで、そのタンパク質は、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する。例えば、そのタンパク質は、２つ以上のヒトプロテアーゼを（各々が１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭ未満のＫｉで）阻害する。
１つの実施形態において、本発明のタンパク質は、２つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その各々が、同じプロテアーゼを阻害し、本タンパク質は、分子量が大きいために単一のＫｕｎｉｔｚドメインよりも血清残存時間が長い。本タンパク質は、グリコシル化されていてもよいし、されていなくてもよい。
１つの実施形態において、本タンパク質は、操作されたプロテアーゼ阻害性配列として２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する単一の操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
そのプロテアーゼ阻害性配列は、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン、ペプチド（例えば、２４アミノ酸長未満の環状ペプチドまたは鎖状ペプチド）および抗原結合フラグメントの可変ドメインであり得る。例えば、そのプロテアーゼ阻害性配列は、軽鎖可変ドメインとともに、ヒトプロテアーゼと結合して、阻害する重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含み得る。
１つの実施形態において、本タンパク質は、操作されたプロテアーゼ阻害性配列として少なくとも２、３、４、５、６、７または８個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。例えば、本タンパク質は、２、３、４、５または６個のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。いくつかの場合において、Ｋｕｎｉｔｚドメインの少なくとも１つは、天然に存在するヒトＫｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＴＦＰＩまたは本明細書中で述べる他のヒトタンパク質）のフレームワークを含むが、プロテアーゼ結合ループ中の１残基以上において天然に存在するヒトＫｕｎｉｔｚドメインと異なる。
１つの実施形態において、本タンパク質は、少なくとも１５キロダルトンの分子量および／またはマウスにおいて少なくとも３０分というβ相半減期を有する。例えば、１つ以上のＰＥＧ部分を含むようにそのタンパク質を改変することによってか、または、そのタンパク質をヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのキャリアに共有結合することによって、タンパク質の分子量および／またはβ相半減期を増大させてもよい。そのような共有結合は、タンパク質の生成後にそのタンパク質とキャリアとの共有結合性の架橋によってか、または、キャリアを有する融合タンパク質としてのタンパク質の発現によって達成され得る。
１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインの少なくとも１つは、２つだけのジスルフィド結合を含む。例えば、本タンパク質は、ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）におけるアミノ酸１４位および３８位に相当する位置にシステインを含まない。
代表的なタンパク質は：
・関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、癌および慢性閉塞性肺障害の原因となる過剰な活性を有する２つ以上のプロテアーゼ；
・好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧの２つ以上（例えば、すべて）；
・ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧおよびトリプターゼの２つ以上（例えば、すべて）；
・ヒト血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼ；
・ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）、ヒトカリクレイン８（ｈＫ８）およびヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）の２つ以上（例えば、すべて）；
・ｈＫ６およびヒト好中球エラスターゼ；
・ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト血漿カリクレイン
・ヒトプラスミン、ヒトヘプシン、ヒトマトリプターゼ、ヒトエンドセリアーゼ１およびヒトエンドセリアーゼ２の２つ以上
を阻害し得る。
例えば、本タンパク質は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、好中球エラスターゼに特異的であり、第２のＫｕｎｉｔｚドメインは、プロテイナーゼ３に特異的である。第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、第２のＫｕｎｉｔｚドメインのＮ末端またはＣ末端であり得る。
ＤＸ−８８は、ヒト血漿カリクレイン（ｈｐＫａｌ１）のＫｕｎｉｔｚドメインインヒビターであり、ＤＸ−８９０は、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）のＫｕｎｉｔｚドメインインヒビターである。１つの実施形態において、本タンパク質は、（ｉ）ＤＸ−８８、ＤＸ−８８と少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８または９９％同一のドメインまたはＤＸ−８８のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも７０、８０、８５、９０、９５または１００％を含むＫｕｎｉｔｚドメインならびに（ｉｉ）ＤＸ−８９０、ＤＸ−８９０と少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８または９９％同一のドメインまたはＤＸ−８９０のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも７０、８０、８５、９０、９５または１００％を含むＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
１つの実施形態において、本タンパク質は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その少なくとも２つは、同一であるか、または少なくとも９０または９５％同一である。１つの例において、本タンパク質は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その各々は、ＤＸ−８８、ＤＸ−８８と少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８または９９％同一のドメインまたはＤＸ−８８のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも７０、８０、８５、９０、９５または１００％を含むＫｕｎｉｔｚドメインである。別の例において、本タンパク質は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その各々は、ＤＸ−８９０と少なくとも８５、９０、９２、９５、９６、９７、９８もしくは９９％同一のドメインでまたはＤＸ−８９０のプロテアーゼ結合ループにおけるアミノ酸残基の少なくとも７０、８０、８５、９０、９５もしくは１００％を含むＫｕｎｉｔｚドメインである。
１つの実施形態において、本タンパク質は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、そのＫｕｎｉｔｚドメインは、互いに異なる。
１つの実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、リンカー（例えば、可撓性親水性リンカー）によって接続されている。例えば、そのリンカーは、３５、２２、１５、１３、１１または９アミノ酸長未満である。そのリンカーは、少なくとも２、３または４グリシン残基を含み得る。１つの実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、血清アルブミン部分によって分断されている。別の実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、血清アルブミン部分によって分断されていない。１つの実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、Ｔ細胞エピトープを含んでいないリンカーによって接続されている。例えば、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、中型から大型の疎水性残基および荷電残基を有しないリンカーによって接続されている。そのリンカーは、グリコシル化部位を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、そのリンカーは、３個未満もしくは２個未満のグリコシル化部位を有するか、または１個未満のグリコシル化部位を有する、すなわち、グリコシル化部位を有しない。そのリンカーは、Ｎ結合型グリコシル化部位を欠きうる。
１つの実施形態において、本タンパク質は、好中球ディフェンシンの存在下でヒトプロテアーゼを阻害する。本タンパク質は、内在性プロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼ、例えば、ＭＴ６−ＭＭＰ（ロイコリジン（Ｌｅｕｋｏｌｙｓｉｎ））による分解に耐性であり得る。例えば、本タンパク質は、ＭＭＰ−８またはＭＭＰ−１２によって認識される切断部位を含まない。１つの実施形態において、本タンパク質は、第ＶＩＩａ因子と第Ｘａ因子の両方を阻害しない。本タンパク質は、ヒトビクニンと少なくとも２つのアミノ酸が異なり得る。
別の局面において、本開示は、被験体を処置する方法を特徴とする。この方法は、本明細書中に記載されるタンパク質、例えば、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質（このタンパク質は、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する）を被験体に投与する工程を含む。例えば、被験体は、少なくとも２つの異なるプロテアーゼのプロテアーゼ活性を低下させる必要がある被験体である。被験体は、第１および第２のヒトプロテアーゼが原因となる障害を有し得、そして、投与されるタンパク質は、その第１および第２のヒトプロテアーゼを阻害する。例えば、そのタンパク質は、第１のヒトプロテアーゼを特異的に阻害するＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを特異的に阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
別の局面において、本開示は、（ｉ）ヒトセリンプロテアーゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインおよび（ｉｉ）ヒトプロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼの結合性および阻害に寄与するポリペプチド配列を含む単離されたタンパク質を特徴とする。１つの例において、そのタンパク質は、１本のポリペプチド鎖からなる。別の例において、そのタンパク質は、少なくとも２本のポリペプチド鎖を含む。１つの実施形態において、一方のポリペプチド鎖は、抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインを含み、他方のポリペプチド鎖は、抗原結合フラグメントの軽鎖可変ドメインを含み、その抗原結合は、ヒトプロテアーゼ、例えば、メタロプロテアーゼに結合して阻害する。
１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインと同じポリペプチド鎖の構成要素である。別の実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、抗原結合フラグメントの軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド鎖の構成要素である。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、抗体の定常ドメインもしくはその抗原結合フラグメントのＣ末端側または可変ドメインのＮ末端側であり得る。別の実施形態において、１つのＫｕｎｉｔｚドメインは、可変抗体ドメインのＮ末端側であり、第２のＫｕｎｉｔｚドメインは、同じ鎖の最後の定常ドメインのＮ末端側である。その２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、同じ阻害活性を有していてもよいし、異なる阻害活性を有していてもよい。
別の局面において、本開示は、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質を提供する方法を特徴とする。その方法は：第１のヒトプロテアーゼを阻害する第１のＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを阻害する第２のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列を提供する工程；複数のＫｕｎｉｔｚドメインを含むレシピエントタンパク質のアミノ酸配列を提供する工程；およびそのレシピエントタンパク質の改変アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを調製する工程を含み、ここで、そのレシピエントタンパク質は、（ａ）レシピエントタンパク質中のＫｕｎｉｔｚドメインの１つのアミノ酸が、第１のＫｕｎｉｔｚドメインの結合性または特異性に寄与するアミノ酸残基と置換され、そして（ｂ）レシピエントタンパク質中のＫｕｎｉｔｚドメインの別のアミノ酸が、第２のＫｕｎｉｔｚドメインの結合性または特異性に寄与するアミノ酸残基で置換されるように改変されている。
別の局面において、本開示は、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質を提供する方法を特徴とする。その方法は：第１のヒトプロテアーゼを阻害する第１のＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを阻害する第２のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列を提供する工程；ならびに第１および第２のＫｕｎｉｔｚドメインをコードする配列がインフレームである、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する工程を含む。それらのドメインは、リンカー配列をコードする配列によって分断され得る。ある特定の実施形態において、（ａ）リンカーは、中型または大型の疎水性残基も荷電残基も含まないか、または（ｂ）ＭＨＣ Ｉエピトープは、第１および第２のＫｕｎｉｔｚドメインならびにリンカー由来のアミノ酸によって形成されない。１つの実施形態において、第１および第２のヒトプロテアーゼは、単一のヒト疾患の原因となる。
これらの方法は、細胞、例えば、トランスジェニック動物における細胞（例えば、哺乳動物細胞）または培養宿主細胞において、調製されたポリヌクレオチドを発現する工程をさらに含み得る。その方法は、薬学的組成物として、調製されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を製剤化する工程をさらに含み得る。
別の局面において、本発明は、関節リウマチを処置する方法を特徴とする。この方法は：関節リウマチを有するかまたは有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ヒト血漿カリクレインとヒト組織カリクレインの両方を阻害する。
別の局面において、本開示は、肺の炎症を処置する方法を特徴とする。この方法は：肺の炎症を有するか、または有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧおよびトリプターゼの２つ以上を阻害する。
別の局面において、本開示は、多発性硬化症を処置する方法を特徴とする。この方法は：多発性硬化症を有するかまたは有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）、ヒトカリクレイン８（ｈＫ８）およびヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）の２つ以上を阻害する。
別の局面において、本開示は、脊髄（ｓｐｉｎａｌ ｃｈｏｒｄ）損傷を処置する方法を特徴とする。この方法は：脊髄損傷を有するかまたは有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ｈＫ６とヒト好中球エラスターゼの両方を阻害する。
別の局面において、本開示は、慢性閉塞性肺障害を処置する方法を特徴とする。この方法は：慢性閉塞性肺障害を有するかまたは有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ヒト好中球エラスターゼ、ＰＲ３およびカテプシンＧの２つ以上を阻害する。
別の局面において、本開示は、炎症性腸疾患（例えば、クローン病または潰瘍性大腸炎）を処置する方法を特徴とする。この方法は：クローン病を有するかまたは有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含む。いくつかの実施形態において、そのタンパク質は、ヒト組織カリクレイン（ｈＫ１）およびヒト血漿カリクレインを阻害する。
別の局面において、本開示は、ヒトプロテアーゼを阻害する操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を特徴とし、ここで、そのＫｕｎｉｔｚドメインは、天然に存在するほとんどのＫｕｎｉｔｚドメインに見られる１４−３８ジスルフィドを有しない。いくつかの実施形態において、そのプロテアーゼは、血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼ、プラスミンまたは本明細書中に記載される他のプロテアーゼからなる群から選択される。１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインの結合ループは、ＤＸ−８８、ＤＸ−８９０もしくはＤＸ−１０００の結合ループと同一であるか、または少なくとも８０、８５、９０もしくは９５％同一である。１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、ＤＸ−８８、ＤＸ−８９０またはＤＸ−１０００と少なくとも８５、９０、９５または１００％同一であるが、ＢＰＴＩのシステイン１４およびシステイン３８に相当する位置にシステインを含まない。
別の局面において、本開示は、ポリヌクレオチドのライブラリーを特徴とする。そのライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含み、その各々は、ＢＰＴＩの１４位および３８位に相当する位置にシステインを有しないＫｕｎｉｔｚドメインをコードする配列を含む。Ｋｕｎｉｔｚドメインの第１および／または第２の結合ループにおける１つ以上の残基が、複数のポリヌクレオチド間で異なるように、複数のポリヌクレオチドが異なる。１つの実施形態において、１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、３９および４０位（ＢＰＴＩの配列に関してナンバリング）をコードするコドンが異なる。
別の局面において、本発明は、８０、８５、９０、９５、９８％以下が異なる少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを特徴とする。Ｋｕｎｉｔｚドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメイン間で同一の１つ以上の残基に相当する位置において異なるコドンを使用する。１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列は、同一である。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列は同一であるが、同一のＫｕｎｉｔｚドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、少なくとも１０または２０コドン異なる。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインをコードする核酸配列は、９０、８０、７０、６０または５０％未満が同一である。
複数のＫｕｎｉｔｚドメイン、例えば、少なくとも２、３、４、５または６個のＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質を操作することが可能である。各Ｋｕｎｉｔｚドメインは、１つ以上のセリンプロテアーゼに対して高い親和性および特異性を有するように操作され、得られたタンパク質は、親和性および特異性が高い１個から数個のプロテアーゼを阻害し得る。さらに、操作されたタンパク質のサイズは、血清中での寿命を増大させる（例えば、そのタンパク質の分子量を増加させるようにＫｕｎｉｔｚドメインの外側にアミノ酸残基を含めることによって）サイズであり得る。任意の方法を使用して、複数のＫｕｎｉｔｚドメインを有するタンパク質を操作することができる。例としては、様々なドメインの融合および多様なＫｕｎｉｔｚドメインのライブラリーからの１つ以上のドメインの選択が挙げられる。
本発明の１つの局面において、１４−３８ジスルフィドを有しないＫｕｎｉｔｚドメインのライブラリーが構築され、高親和性インヒビターが選択される。例えば、そのライブラリーは、Ｋｕｎｉｔｚドメインの第１および／または第２の結合ループ中の１つ以上の位置においてバリエーションを含む。例えば、ＢＰＴＩの配列に関する１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、３８、３９および４０位が異なる。他の局面において、本発明は、遺伝的不安定性を回避するために、普遍なアミノ酸配列またはほぼ普遍なアミノ酸配列をコードする遺伝的多様性の構築、例えば、タンパク質の様々なセグメントをコードする核酸配列間の組換えを含む。
本明細書中で引用されるすべての特許、特許出願および他の参考文献は、それらの全体が参考として援用される。
詳細な説明
多くの障害が、複数のプロテアーゼと関連しており（Ｃｈｕｒｇ ａｎｄ Ｗｒｉｇｈｔ，２００５，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｕｌｍ Ｍｅｄ，１１：１５３−９）、ゆえに、少なくとも２つのヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質は、そのような障害を処置（例えば、改善および／または予防）するために有用な薬理学的物質であり得る。そのようなタンパク質は、１つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインまたはプロテアーゼを阻害する他の配列を含み得る。
これらの障害のいくつかは、異なるセリンプロテアーゼの過剰なプロテアーゼ活性と関連する。このような場合において、セリンプロテアーゼの任意の対の触媒部位は、単一のＫｕｎｉｔｚドメインが、有用な親和性を有する両方のプロテアーゼと結合することができない程度に異なり得る。従って、２つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを含む組成物が、本明細書中に提供され、その組成物は、共有結合によって結合した少なくとも２つの異なる操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン（または異なる特異性を有するＫｕｎｉｔｚドメイン）を含む。それらのＫｕｎｉｔｚドメインは、代表的にはペプチド結合によって結合している（が、そのＫｕｎｉｔｚドメインは、一方のＫｕｎｉｔｚドメインのカルボキシ末端が、他方のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ末端にペプチド結合を介して直接結合しているという意味では、ペプチド結合によって直接結合している必要はないことが理解されるべきである）；１つ以上のアミノ酸のリンカーは、Ｋｕｎｉｔｚドメインを分断し得る）。ペプチドリンカーは、任意の所望の長さであり得るが、いくつかの実施形態では、リンカーは、限られたサイズ、例えば、３５、２２、１５、１３、１１または９アミノ酸長未満である。リンカーは、少なくとも２、３または４個のグリシン残基を含み得る。
１つの実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、血清アルブミン部分によって分断されていない。１つの実施形態において、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、Ｔ細胞エピトープを含まないリンカーによって接続されている。例えば、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインは、中型から大型の疎水性残基および荷電残基を有しないリンカーによって接続されている。リンカーは、グリコシル化部位を含んでいてもよいし、含んでいなくてもよい。例えば、リンカーは、３個未満もしくは２個未満のグリコシル化部位を有するか、または１個未満のグリコシル化部位を有する、すなわち、グリコシル化部位を有しない。リンカーは、Ｎ結合型グリコシル化部位を欠きうる。
いくつかの実施形態において、複数の異なる操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを含んでいるタンパク質は、操作されたＫｕｎｉｔｚドメインの結合決定基を、複数のＫｕｎｉｔｚドメインを天然に含むレシピエントタンパク質に移すことによって（例えば、少なくとも２つの操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン（または異なる特異性を有するＫｕｎｉｔｚドメイン）を含むタンパク質を生成するために、操作された配列を参照することにより天然に存在する配列を改変することによって）生成される。
２つ以上のセリンプロテアーゼが、類似する場合、一方は、標的セリンプロテアーゼのすべてを阻害する、例えば、１０ｎＭ未満のＫｉで標的プロテアーゼの各々を阻害するＫｕｎｉｔｚドメインについて選択することができる。本明細書中で使用されるとき、トリプシン−ＢＰＴＩ複合体中のＢＰＴＩに隣接するトリプシン残基に相当する約２０残基が、８０％同一である場合、２つのセリンプロテアーゼは、「類似する」。理解されるように、２つ以上の標的セリンプロテアーゼを阻害する単一のＫｕｎｉｔｚドメインを得る見込みは、標的プロテアーゼ間の同一性が増大するにつれて高くなる。いくつかの実施形態において、２つ以上のプロテアーゼに対する特異性を有するＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質は、各標的プロテアーゼに対して１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭ未満のＫＩを有する。
さらに、いくつかの実施形態において、タンパク質は、抗体（または抗原結合フラグメントもしくはその誘導体（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ））に結合したＫｕｎｉｔｚドメインまたはセリンプロテアーゼと結合して阻害する非Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチドを含む。
いくつかの障害は、セリンプロテアーゼだけでなく、他のタイプのプロテアーゼ（例えば、メタロプロテアーゼ（例えば、マトリクスメタロプロテアーゼすなわちＭＭＰ）またはシステインプロテアーゼ）とも関与する。従って、本発明はまた、メタロプロテアーゼもしくはシステインプロテアーゼを阻害する少なくとも１つのペプチドまたはタンパク質に結合した少なくとも１つのＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質も提供する。メタロプロテアーゼを阻害する代表的なタンパク質は、メタロプロテアーゼと結合して阻害する抗体および抗原結合フラグメントまたはそれらの誘導体（例えば、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ）、特に、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのメンバーと結合して阻害するものである。システインプロテアーゼを阻害する代表的なタンパク質は、システインプロテアーゼと結合して阻害する抗体および抗原結合フラグメントまたはそれらの誘導体（Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖ）、特に、カテプシンファミリーのメンバー（例えば、カテプシンＬおよび／またはカテプシンＷ）と結合して阻害するものである。
単一または複数のＫｕｎｉｔｚドメイン含有配列および抗体（または抗原結合フラグメントまたはそれらの誘導体）間の融合は、任意の構造、例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン含有配列と：ａ）抗原結合フラグメントもしくは完全長抗体の軽鎖のＮ末端、ｂ）抗原結合フラグメントもしくは完全長抗体の軽鎖のＣ末端、ｃ）抗原結合フラグメントもしくは完全長抗体の重鎖のＮ末端、またはｄ）抗原結合フラグメントもしくは完全長抗体の重鎖のＣ末端との融合であり得る。抗体は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、Ｆｖとして配列され得る。例えば、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを含むタンパク質を使用することで十分であり得る。
阻害するペプチドはまた、本発明のタンパク質に組み込まれ得る。そのような阻害性ペプチドは、１つのＫｕｎｉｔｚドメインまたは複数のＫｕｎｉｔｚドメインおよび確実に血液中で長く残存する抗体もしくはアルブミン成分のいずれかを含むタンパク質に融合され得る。メタロプロテイナーゼを阻害するペプチドは、１つ以上の治療的なＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質のいずれかの末端に融合され得る。別の代表的な構造は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン間への阻害性ペプチドの挿入である（例えば、そのペプチドを使用して、ヒトＴＦＰＩの操作されたバージョンでＫｕｎｉｔｚドメイン間のリンカーを置き換え得るか、またはそのペプチドを、２つの別個のＫｕｎｉｔｚドメインを接続するリンカーとして使用し得る）。
プロテアーゼと結合する抗体および／またはペプチドは、標的プロテアーゼを用いた抗体ライブラリーまたはペプチドライブラリーのセレクションによって同定され得る（例えば、Ｕ．Ｓ．２００５／０１８０９７７およびＨｕａｎｇら、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００３，２７８：１５５３２−４０）。そのようなセレクションは、代表的には、同様に標的プロテアーゼを阻害するそれらのライブラリーメンバーを同定するスクリーニング工程と組み合わされる。そのような方法は、当業者によって理解されているような、本明細書中に開示されるセレクションおよびスクリーニング方法と類似する。
「操作された」タンパク質配列（例えば、操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン）とは、本明細書中で言及されるとき、天然に存在しない配列を有するタンパク質のことである。いくつかの実施形態において、操作されたＫｕｎｉｔｚドメインは、天然に存在するＫｕｎｉｔｚドメインと少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸異なる。
配列の比較および２つの配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０）、特に、ＴａｔｕｓｏｖａおよびＭａｄｄｅｎによって報告され（１９９９，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０）、米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）によって提供されている（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉにおいてウェブを介して入手可能）ようなＢＬＡＳＴ２配列を使用して行われ得る。２つのヌクレオチド配列を比較するためのパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＮ）は、マッチに対するリワード（Ｒｅｗａｒｄ）：１；ミスマッチに対するペナルティ：−２；オープンギャップペナルティ：５；ギャップ伸長ペナルティ：２；ギャップｘ＿ドロップオフ：５０；期待値（ｅｘｐｅｃｔ）：１０．０；ワードサイズ：１１である。２つのアミノ酸配列を比較するためのパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）は、行列：ＢＬＯＳＵＭ６２；オープンギャップペナルティ：１１；ギャップ伸長ペナルティ：１；ギャップｘ＿ドロップオフ：５０；期待値：１０．０；およびワードサイズ３である。
本明細書中で使用されるとき、「低ストリンジェンシー」、「中ストリンジェンシー」、「高ストリンジェンシー」または「非常に高いストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションという言及は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明するものである。ハイブリダイゼーション反応を行うための指針は、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見られ得る。水溶系および非水溶系の方法は、上記参考文献に記載されており、そのいずれかを使用し得る。本明細書中で言及される特定のハイブリダイゼーション条件は、以下のとおりである：（ａ）約４５℃における６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の後、少なくとも５０℃（洗浄温度は、低ストリンジェンシー条件では５５℃に上げることができる）における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の洗浄という低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；（ｂ）約４５℃における６×ＳＳＣの後、６０℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄という中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；（ｃ）約４５℃での６×ＳＳＣの後、６５℃における０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄という高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件；そして（ｄ）６５℃における０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳの後、６５℃における０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄という非常に高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件。
Ｋｕｎｉｔｚドメイン
「Ｋｕｎｉｔｚドメイン」は、少なくとも５１アミノ酸を有し、かつ、少なくとも２つ、おそらく３つのジスルフィドを含むポリペプチドドメインである。このドメインは、第１と第６のシステイン、第３と第４のシステイン、および必要に応じて第２と第４が、ジスルフィド結合を形成する（例えば、５８アミノ酸を有するＫｕｎｉｔｚドメインでは、システインは、以下に提供されるＢＰＴＩ配列の番号に従ってアミノ酸５、１４、３０、３８、５１および５５に相当する位置に存在し得、ジスルフィドは、５位と５５位、１４位と３８位および３０位と５１位におけるシステイン間で形成し得る）か、または、２つのジスルフィドが存在する場合、それらは、５と５５の間および３０と５１の間に形成し得るように折りたたまれている。それぞれのシステイン間の間隔は、本明細書中に提供されるＢＰＴＩ配列の番号に従って（表７）、５と５５、１４と３８および３０と５１に相当する位置間の間隔の７、５、４、３、２または１アミノ酸以内であり得る。ＢＰＴＩ配列は、任意の総称的なＫｕｎｉｔｚドメインにおける特定の位置をいうための基準として使用され得る。目的のＫｕｎｉｔｚドメインとＢＰＴＩとの比較は、アラインメントされたシステインの数が最大になる、最も適合するアラインメントを同定することによって行われ得る。
ＢＰＴＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインの３次元構造（高解像度において）は、公知である。ＢＰＴＩのＸ線構造の１つは、「６ＰＴＩ」としてＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋに寄託されている。いくつかのＢＰＴＩホモログの３次元構造（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔら（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，３（７）：５９１−５９８；Ｈｙｎｅｓら（１９９０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９：１００１８−１００２２）も同様に公知である。少なくとも７０個の天然のＫｕｎｉｔｚドメイン配列が公知である。公知のヒトホモログとしては、ＴＦＰＩの３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｗｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１３）：６００１−６００４；Ｇｉｒａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ，３３８：５１８−２０；Ｎｏｖｏｔｎｙら（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（３１）：１８８３２−１８８３７；これらの参考文献のいくつかにおいて、ＴＦＰＩは、ＬＡＣＩ（リポタンパク質関連凝固インヒビター）またはＥＰＩ（外因性経路インヒビター）として同定されている）、インター−α−トリプシンインヒビターの２つのＫｕｎｉｔｚドメイン、ＡＰＰ−Ｉ（Ｋｉｄｏら（１９８８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３（３４）：１８１０４−１８１０７）、コラーゲン由来のＫｕｎｉｔｚドメインおよびＴＦＰＩ−２の３つのＫｕｎｉｔｚドメイン（Ｓｐｒｅｃｈｅｒら（１９９４）ＰＮＡＳ ＵＳＡ，９１：３３５３−３３５７）が挙げられる。ＴＦＰＩは、３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む３９ｋＤａ（表１におけるアミノ酸配列）の分子量を有するヒト血清糖タンパク質である。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、主に２つのループ領域（「結合ループ」）におけるアミノ酸を用いて標的プロテアーゼと相互作用する。第１のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸１１−２１に相当すると思われる残基間である。第２のループ領域は、ＢＰＴＩのアミノ酸３１−４２に相当すると思われる残基間である。Ｋｕｎｉｔｚドメインの代表的なライブラリーは、第１および／または第２のループ領域における１つ以上のアミノ酸位置が異なる。特に有用な異なる位置としては：ＢＰＴＩの配列における１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９位が挙げられる。これらの位置の少なくともいくつかは、標的プロテアーゼと密接に隣接していると予想される。
Ｋｕｎｉｔｚドメインの「フレームワーク領域」は、Ｋｕｎｉｔｚドメインの一部であるが、特に第１および第２の結合ループ領域中の残基（例えば、ＢＰＴＩの１１−２１およびＢＰＴＩの３１−４２のアミノ酸に相当すると思われる残基）を除外した残基と定義される。フレームワーク領域は、ヒトＫｕｎｉｔｚドメイン、例えば、ＴＦＰＩドメイン１由来であり得る。代表的なフレームワークは、少なくとも１、２または３個のリシンを含み得る。１つの実施形態において、リシンは、ＬＡＣＩのフレームワークに見られる位置に相当する位置またはそのような位置から少なくとも３、２または１アミノ酸以内の位置に存在する。
逆に、これらの特定の位置に無いか、またはループ領域内でない残基は、これらのアミノ酸の位置よりも広い範囲のアミノ酸置換（例えば、保存的および／または非保存的置換）を許容し得る。
ＢＰＴＩは、５８アミノ酸を有し、システイン残基を５、１４、３０、３８、５１および５５位に有する原型のＫｕｎｉｔｚドメインである。これらは、５：５５、１４：３８および３０：５１にジスルフィドを形成する。
ほとんどすべてのＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、フェニルアラニン残基は、３３および４５位に存在する。ほとんどすべてのＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、グリシン残基は、１２および３７位に存在する。９位と１０位の間（９ａと呼ばれる）にエキストラ残基（ｅｘｔｒａ ｒｅｓｉｄｕｅ）が存在する可能性がある。９ａが存在する場合、１２は、グリシンである必要はない。いくつかの天然のＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、２６位の後に３残基以下の挿入が観察される；これらの挿入された残基は、２６ａ、２６ｂおよび２６ｃとナンバリングされ得る。いくつかの天然のＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、４２位の後に３残基以下の挿入が観察される（４２ａ、４２ｂおよび４２ｃとナンバリング）。命名されたもの以外のシステイン残基が観察され（例えば、ブンガロトキシンにおいて見られるような）、Ｋｕｎｉｔｚドメインと他のタンパク質とのジスルフィド結合がもたらされ得る。
ほとんどのＫｕｎｉｔｚドメインは、５８アミノ酸を有し、５、１４、３０、３８、５１および５５位においてＣｙｓを有する。これらのドメインは、本明細書中で「基準のＫｕｎｉｔｚドメイン」と呼ばれる。すべての基準のＫｕｎｉｔｚドメインは、本質的に同一の主鎖３Ｄ構造を有する。ＴＦＰＩの第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、基準のＫｕｎｉｔｚドメインである。本発明者らは、ＴＦＰＩ−Ｋ１ Ｋｕｎｉｔｚドメインのファージディスプレイライブラリーを構築した（例えば、Ｕ．Ｓ．６，３３３，４０２を参照のこと）。さらに、特定の標的プロテアーゼへの結合について、ＴＦＰＩ−Ｋ１フレームワークを有するＫｕｎｉｔｚドメインを選択することが可能である。次いで、残基１３、１５−２１、３４、３９−４０を、レシピエントＫｕｎｉｔｚドメインが、特定の標的プロテアーゼに対する親和性を得るように他の任意の基準のＫｕｎｉｔｚドメインに移すことができる。
非基準のＫｕｎｉｔｚドメインの１つのクラスは、９ａ位にエキストラアミノ酸を有するものである。このクラスのＫｕｎｉｔｚドメインにおいて、残基１２は、グリシンである必要はなく、その領域の３Ｄ構造は、基準のＫｕｎｉｔｚドメインの３Ｄ構造と異なる。ＴＦＰＩ−２では、第２のＫｕｎｉｔｚドメインは、この非基準の特徴を有する。ＴＦＰＩ−２ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２を再操作するために、好ましい実施形態は、ＴＦＰＩ−２Ｋｕｎｉｔｚドメイン２のライブラリーを構築し、所望の結合特性を選択することである。あるいは、残基８−１２および３９−４３を基準に変更し得る。すなわち、本発明者らは、Ｓ９ａを削除し、Ｄ１２をＧに変更し得る。本発明者らは、結合に必要なアミノ酸を１３および３９に置き、４０−４５をＧＮＡＮＮＦに変更する。なぜなら、これらが、これらの位置に最も共通したアミノ酸であるからである。
Ｋｕｎｉｔｚドメインが、セリンプロテアーゼに結合するとき、Ｋｕｎｉｔｚドメインの少数のアミノ酸だけが、セリンプロテアーゼと接触する。正確な数は、セリンプロテアーゼおよびＫｕｎｉｔｚドメインに依存するが、通常、１２〜２０である。ＢＰＴＩおよびトリプシンの場合において、ＢＰＴＩの１３残基（Ｔ１１、Ｇ１２、Ｐ１３、Ｃ１４、Ｋ１５、Ａ１６、Ｒ１７、Ｉ１８、Ｉ１９、Ｇ３６、Ｇ３７、Ｃ３８およびＲ３９）は、トリプシン中の原子の４Å以内に位置する少なくとも１つの原子を有する。残基１２、１４、１６、３７および３８は、基準のＫｕｎｉｔｚドメインにおいて高度に保存されている。ＢＰＴＩでは、残基３４は、トリプシンの原子の５Å以内に存在するバリンである。この位置における荷電側鎖（またはその欠如）および／またはかさ高い側鎖は、結合に影響し得るので、３４における大型の残基または荷電残基の置換は、結合性に影響し得る。
ＢＰＴＩにおける原子の４Å以内に存在するトリプシンの約２０残基が存在する（キモトリプシノゲンのナンバリングを使用して）：Ｙ３９、Ｈ４０、Ｆ４１、Ｃ４２、Ｈ５７、Ｎ９７、Ｌ９９、Ｙ１５１、Ｄ１８９、Ｓ１９０、Ｃ１９１、Ｑ１９２、Ｇ１９３、Ｄ１９４、Ｓ１９５、Ｓ２１４、Ｗ２１５、Ｇ２１６、Ｇ２１９およびＧ２２６。これらの位置のうち、Ｃ４２、Ｈ５７、Ｇ１９３、Ｄ１９４、Ｓ１９５、Ｓ２１４は、トリプシンに相同なセリンプロテアーゼの間で完全に保存されている。３９、４１、９７、９９、１５１および１９２位は、非常に可変性である。４０位は、ヒスチジンであることが多いが、かなり可変性を示す。１８９位は、Ｄであることが最も多いが、Ｓ、Ｇ、ＡおよびＴも既知のセリンプロテアーゼにおいて存在する。１９０位は、Ｓであることが最も多いが、Ｇ、Ｖ、Ｔ、Ａ、ＩおよびＰも観察されている。１９１位は、Ｃであることが最も多いが、ＦおよびＹも観察されている。２１５位は、Ｗであることが最も多いが、Ｆ、Ｙ、Ｇ、Ｎ、ＳおよびＫも観察されている。２１６位は、Ｇであることが最も多いが、Ｖ、ＳおよびＫも観察されている。２１９位は、Ｇであることが最も多いが、Ｓ、Ｔ、Ｅ、Ｐ、Ｄ、ＮおよびＴも観察されており、残基の欠失もある。２２６位は、Ｇであることが最も多いが、Ｔ、Ｄ、Ｓ、ＥおよびＡも観察されている。これらの残基は、基質に接触するので、特定のセリンプロテアーゼの基質特異性に最も直接関与する残基である。他のプロテアーゼについては、Ｋｕｎｉｔｚドメインに接触し得るアミノ酸の数は、２０より大きいか、または２０未満であり得る。
ＢＰＴＩおよび他のＫｕｎｉｔｚドメインは、プロテアーゼ触媒部位において結合するが、切断および放出に抵抗することによってセリンプロテアーゼを阻害する。Ｋｕｎｉｔｚドメインがセリンプロテアーゼを阻害するためには、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、触媒部位に密接に適合しなければならない。いくつかの場合において、Ｋｕｎｉｔｚドメインの残基１５と残基１６の間の結合は切断されるが、その切断されたＫｕｎｉｔｚドメインは、プロテアーゼから放れない。
ＢＰＴＩは、特に特異的ではなく、種々のセリンプロテアーゼを阻害し、親和性は、１０ｎＭより良好である。例えば、様々なプロテアーゼに対するその親和性は：（ヒト尿カリクレイン（４ｎＭ）、ブタの膵臓カリクレイン（０．５５ｎＭ）、ヒトプラスミン（０．８９ｎＭ）、活性化タンパク質Ｃ（１μＭ）（Ｔａｂｙら、１９９０，Ｔｈｒｏｍｂ Ｒｅｓ，５９：２７−３５）トロンビン（３０μＭ）（Ｐｉｎｔｉｇｎｙ ａｎｄ Ｄａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔ，１９９２，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０７：８９−９５）およびウシトリプシン（０．０６ｐＭ））である。
他のＫｕｎｉｔｚドメインは、非常に特異的であり得る。例えば、ＤＸ−８８は、ヒト血漿カリクレインをＫＤ約３０ｐＭで阻害するが、（ヒト尿カリクレイン（＞１００μＭ）、ブタ膵臓カリクレイン（２７μＭ）、ヒトＣ１ｒ活性化（＞２０μＭ）、Ｃ１ｓ活性化（＞２０μＭ）、ヒトプラスミン（１３７ｎＭ）、ヒト好中球エラスターゼ（＞２０μＭ）、ヒト血漿第ＸＩＩａ因子（＞２０μＭ）、ヒト血漿第ＸＩａ因子（１０ｎＭ）、ヒトトロンビン（＞２０μＭ）、ヒトトリプシン（＞２０μＭ）およびヒトキモトリプシン（＞２０μＭ））に対する親和性は、少なくとも２５０，０００倍低い。ＤＸ−８８のアミノ酸配列を表５に示し、ＤＸ−８８をコードするＤＮＡを表６に示す。表８は、制限酵素認識部位を含むＤＸ−８８遺伝子を示している。
操作されたＫｕｎｉｔｚドメインは、米国特許第６，３３３，４０２号、同第５，６６３，１４３号、同第６，９５３，６７４号（各々が、参考として援用される）にさらに開示されている。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、より大きなタンパク質内に位置し得、例えば、ＫｕｎｉｔｚドメインのＮ末端および／またはＣ末端に配列が存在し得る。
ＴＦＰＩ：組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ；ＬＡＣＩとも呼ばれる）の配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ＮＭ＿００６２８７）を表３に示す。第Ｘａ因子へのＴＦＰＩの結合動態は、１９９３年に公開された（Ｈｕａｎｇら、１９９３，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２６８：２６９５０−５）。ＴＦＰＩタンパク質の配列は、Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ（ゼブラフィッシュ）、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ（イヌ）、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ（アカゲザル）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ（ウサギ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー）、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ（マウス）、Ｇａｌｌｕｓ ｇａｌｌｕｓ（ニワトリ）およびＨｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ（ヒト）において公知である。ＴＦＰＩは、３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む。第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、第ＶＩＩａ因子／組織因子複合体における第ＶＩＩａ因子に結合して阻害し、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２は、第Ｘａ因子に結合して阻害し、そして、Ｋｕｎｉｔｚドメイン−３は、細胞への結合に関与する（Ｐｉｒｏ ａｎｄ Ｂｒｏｚｅ，２００４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：３５６７−７２）。Ｋｕｎｉｔｚドメイン−３による細胞への結合は、Ｐ１アルギニンをロイシンに変更することによって低下し得る（Ｐｉｒｏ ａｎｄ Ｂｒｏｚｅ，２００４，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：３５６７−７２）。
ヒトＴＦＰＩを改変することにより、少なくとも２つの異なるヒトプロテアーゼ（例えば、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子以外のプロテアーゼ）を阻害し、複数のＫｕｎｉｔｚドメインを有する操作されたタンパク質が提供され得る。本発明の改変タンパク質の多くは、ヒトＴＦＰＩと非常に類似している。ＴＦＰＩまたはそのＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質は、細胞表面へのポリペプチドの結合が抗原性を増大し得るとき、細胞に結合しないように変更され得る（Ｌｅｏｎｅｔｔｉら、１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６０：３８２０−７）。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３を保持しながらＣ末端のペプチドＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭを削除するヒトＴＦＰＩの改変により、細胞への結合性および他のその結果生じる細胞シグナル伝達事象が低下する。好ましい実施形態において、治療的タンパク質は、任意の遺伝子の発現に対する効果を有さず、細胞に結合しない。
Ｍｉｎｅら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２）４１：７８−８５．）は、ＴＦＰＩの第３のＫｕＤｏｍにおける３つのリシン残基（表１におけるＫ２４１、Ｋ２６０およびＫ２６８に相当する）が、ヘパリンと結合し得、細胞への結合を促進し得る正に帯電したクラスターを形成することを報告した。本発明の１つの実施形態において、Ｋ２４１、Ｋ２６０およびＫ２６８の１つ以上は、正に帯電していないアミノ酸に変更される。２９位において、Ｋが、最も共通したＡＡタイプであり、Ｑが、２番目に共通しているので、Ｋ２４１Ｑが、ＴＦＰＩのＫｕＤｏｍ３において正電荷を除去するための好ましい変異である。４８位において、Ｅが、最も共通したＡＡタイプである。ゆえに、Ｋ２６０Ｅが、ＴＦＰＩのＫｕＤｏｍ３において正電荷を除去するための好ましい変異である。５６位において、Ｇは、最も共通したＡＡタイプである。ゆえに、Ｋ２６８Ｇが、ＴＦＰＩのＫｕＤｏｍ３において正電荷を除去するための好ましい変異である。３つのリシンの少なくとも１つの除去によって、グリコサミノグリカンに結合するＴＦＰＩ変異体の可能性が低下する。
ＴＦＰＩは、メタロプロテイナーゼ、例えば、ＭＭＰ−８によって特定の部位（Ｓ１７４の後およびＫ２０の後）で切断される。Ｐ１８、Ｌ１９およびＬ２１は、表４２において基質３と一致する。１つの実施形態において、使用されるタンパク質は、ＴＦＰＩに基づくが、ＭＭＰ切断を妨害するリンカー配列に改変を含む。例えば、ＭＭＰによる切断部位は、そのような切断を回避するために変更される。ある特定の場合において、Ｓ１７４およびＫ２０は、例えば、アラニンに変更される。別の実施形態において、その部位は、そのまま放置される。最も多い場合では、操作されたＫｕｎｉｔｚドメインは、それらの標的に対して非常に高い親和性を有するので、ＭＭＰ消化に対する感度を低下または排除するようにＴＦＰＩベースのタンパク質を操作することが、必要でない場合もある。
ＴＦＰＩ自体は、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子に対して特に高い親和性を有しない。Ｐｅｔｅｒｓｅｎら（Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、１９９６，Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２３５：３１０−６）は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１が、第ＶＩＩａ因子／ＴＦとＫＤ＝２５０ｎＭで結合し、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２が、第Ｘａ因子とＫＤ＝９０ｎＭで結合することを報告している。ＴＦＰＩに基づいて操作されたＫｕｎｉｔｚドメインタンパク質は、それらの標的に対して非常に高い親和性を有する（例えば、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインは、第Ｘａ因子および第ＶＩＩａ因子に対する親和性を１０ｎＭ以下または１ｎＭ以下のＫＤに増加するように操作され得る）。基本的なＣ末端セグメント（リンカー４）はまた、第Ｘａ因子との結合に関連する（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍら、２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ，３６７：４５１−８）。例えば、本明細書中に記載されるタンパク質は、第ＶＩＩａ因子および第Ｘａ因子の一方または両方に対して１０ｎＭまたは１００ｎＭより大きいＫＤを有する。
ＴＦＰＩ−２：ＴＦＰＩ−２のアミノ酸配列を表１１に示す。第２のＫｕｎｉｔｚドメインは、残基９ａならびに残基４２ａおよび４２ｂを有し、基準ではないことに注意されたい。リンカーは、ＴＦＰＩにおけるものよりも短い。Ｃ末端リンカーは、かなり基本的であるが、リンカー１、２および３は、ＴＦＰＩにおいて対応するリンカーよりもかなり短い。ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメインが実施例２、３および５においてリモデリングされるのと同じ方法で、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン３をリモデリングすることによって多機能プロテアーゼインヒビターとなるように操作され得る。Ｋｕｎｉｔｚドメイン２は、基準とならざるをえないか、または、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２誘導体のライブラリーを作製し、所望の結合特性を有するメンバーを選択し、そして、必要であればＫｕｎｉｔｚドメイン２をリモデリングし得る。ＴＦＰＩ−２は、ＴＦＰＩと同様に、細胞表面に結合する。ＴＦＰＩ−２の好ましい誘導体は、細胞に結合しなくなるように改変され、そして、遺伝子発現に影響するものである。
表１２は、Ｍ１３由来のファージ上のＭ１３ ＩＩＩの断端上でのＴＦＰＩ−２ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の提示を引き起こし得るＤＮＡ配列を示す。親ファージベクターの配列を表１３に示す。表１２のディスプレイカセットに結合した制限酵素認識部位を表１３において太字で示す。ＴＦＰＩ−２ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２ライブラリーを作製するために、ＰｓｔＩとＢｓｐＥＩの間のＤＮＡを表１２に示される多様性で合成する。表１４は、この合成に使用され得るオリゴヌクレオチド（ＯＮ）を示す。ＯＮ１Ｕ９６およびＯＮ７１Ｌ９７は、強調された３’末端において相補的である。ＯＮ１Ｕ２１Ｔ２およびＯＮ１４７Ｌ２１は、この長いオリゴヌクレオチドの５’末端と同一であり、これを使用して、この長いオリゴヌクレオチドのＰＣＲ増幅を開始することができる。最終生成物の末端の近くにＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩ部位が存在する。二本鎖ＤＮＡは、ＰｓｔＩおよびＢｓｐＥＩで切断され、同様に切断されたベクターにライゲーションされる。このライブラリーの理論的多様性は、６．７×１０１４アミノ酸配列である。実際のライブラリーは、少なくとも１０９、１０１０または１０１１個の形質転換体を含み得る。表１２に示される混合物を合成するためにコドンベースの突然変異誘発を使用し得る。
肝細胞成長因子アクチベーターインヒビター−１および−２：複数のＫｕｎｉｔｚドメインを含む哺乳動物のタンパク質のさらなる例は：肝細胞成長因子アクチベーターインヒビター−１（ＨＡＩ−１）および肝細胞成長因子アクチベーターインヒビター−２（ＨＡＩ−２）である。各々は、２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
ＨＡＩ−１およびＨＡＩ−２は、細胞結合型タンパク質である。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインおよび介在配列のみを含むタンパク質の形態を生成することによって、細胞と関連しない誘導体が調製され得る。細胞の結合に関与するＨＡＩ−１およびＨＡＩ−２の領域は、例えば、欠失によって不活性化され得る。
ビクニン：表３９は、ＵＳ６，５８３，１０８（‘１０８号特許）において報告されている「ヒト（ｈｕｍｉｎ）ビクニン」に対する４つのアミノ酸配列を示す。‘１０８号の配列番号は、第２のＫｕｎｉｔｚドメインに続くシグナル配列およびアミノ酸配列において相違を有する「配列番号２」、「配列番号４５」および「配列番号４７」として示される。表３８は、種々のセリンプロテアーゼに対するビクニンの２つのＫｕｎｉｔｚドメインについての‘１０８号特許からの親和性データを示す。
プロテアーゼ標的
プロテアーゼは、炎症および組織損傷をはじめとした、多岐にわたる生物学的プロセスに関与する。好中球などの炎症細胞によって産生されるセリンプロテアーゼは、肺気腫などの様々な障害に関係している。同様に、様々な複数のプロテアーゼは、単一の障害の原因となり得る。
特定のプロテアーゼの例としては、以下が挙げられる。好中球エラスターゼは、細胞外マトリックス成分および病原体に対して活性を有する多形核白血球によって産生されるセリンプロテアーゼである。肺気腫は、肺の機能に重大な障害をもたらす肺胞の破壊を特徴とする。ヒト好中球エラスターゼは、約２３８アミノ酸残基からなり、２つのアスパラギンに結合した炭水化物側鎖を含み、４つのジスルフィド結合によって連結されている（ＧｅｎｅＢａｎｋ Ｅｎｔｒｙ Ｐ０８２４６）。ヒト好中球エラスターゼは、通常、プロ酵素として発生中の好中球において合成されるが、原始的な顆粒中に活性型で（通常、炎症部位における顆粒から放出されたときに完全な酵素活性を有する状態で）保存される（Ｇｕｌｌｂｅｒｇ Ｕら、Ｅｕｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９９７；５８：１３７−１５３；Ｂｏｒｒｅｇａａｒｄ Ｎ，Ｃｏｗｌａｎｄ ＪＢ．Ｂｌｏｏｄ．１９９７；８９：３５０３−３５２１）。
他の代表的なプロテアーゼ標的としては：プラスミン、組織カリクレイン、血漿カリクレイン、第ＶＩＩａ因子、第ＸＩａ因子、トロンビン、ウロキナーゼ、トリプシン１、トリプシン２、膵臓キモトリプシン、膵臓エラスターゼ、トリプターゼおよび第ＩＩａ因子が挙げられる。関連するプロテアーゼのクラスとしては：血液凝固に関連するプロテアーゼ、繊維素溶解に関連するプロテアーゼ、補体に関連するプロテアーゼ、細胞外マトリックス成分を消化するプロテアーゼ、基底膜を消化するプロテアーゼおよび内皮細胞に関連するプロテアーゼが挙げられる。例えば、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。１つ以上のプロテアーゼを阻害する本明細書中に記載されるタンパク質は、これらのクラスの中の１つ以上のプロテアーゼを阻害するように操作され得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインおよび他のプロテアーゼインヒビターの同定
種々の方法を使用して、プロテアーゼ、例えば、ヒトプロテアーゼに結合し、そして／またはそれを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを同定することができる。これらの方法を使用して、複数のプロテアーゼ（例えば、複数のヒトプロテアーゼ）を阻害するタンパク質の構成要素として使用され得る天然のＫｕｎｉｔｚドメインおよび天然に存在しないＫｕｎｉｔｚドメインを同定することができる。例えば、既知のプロテアーゼインヒビターまたはプロテアーゼ耐性タンパク質を変更することによってか、ランダム化されたペプチドもしくはタンパク質のライブラリーを使用することによってか、または、例えば、ＵＳ２００４−００７１７０５（¶１０２〜１１２を含む）に記載されているような抗体のライブラリーを使用することによって、他のプロテアーゼインヒビターも同様に同定することができる。当業者に理解されるように、本明細書中のプロテアーゼのインヒビターを同定する方法の説明は、大部分は、Ｋｕｎｉｔｚドメインに対するものであり、その方法は、ペプチドベースまたは抗体ベースのプロテアーゼインヒビターの同定用に適合され得る。
例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、複数のライブラリーメンバーの各々が、変更されたＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質のライブラリーから同定され得る。様々なアミノ酸が、そのドメインにおいて変更され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９；Ｕ．Ｓ．５，６６３，１４３およびＵ．Ｓ．６，３３３，４０２を参照のこと。例えば、ＤＮＡ突然変異誘発、ＤＮＡシャフリング、オリゴヌクレオチドの化学合成（例えば、サブユニットとしてコドンを使用して）および天然遺伝子のクローニングを使用して、Ｋｕｎｉｔｚドメインが変更され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９およびＵ．Ｓ．２００３−０１２９６５９を参照のこと。
Ｋｕｎｉｔｚドメインのライブラリーは、本明細書中に記載されるＫｕｎｉｔｚドメイン（例えば、本明細書中に記載されるフレームワーク、例えば、改変されたフレームワーク領域または天然に存在するフレームワーク領域を有するＫｕｎｉｔｚドメイン）の１つ以上の結合ループアミノ酸残基を変更することによって作製され得る。１つの実施形態において、変更された残基は、複数のアミノ酸間で異なっている。
ライブラリーは、タンパク質を生成するために使用される発現ライブラリーであり得る。そのタンパク質を、例えば、タンパク質アレイを使用して整列させることができる。Ｕ．Ｓ．５，１４３，８５４；Ｄｅ Ｗｉｌｄｔら（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇら（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ ａｎｄ Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／９８５３４、ＷＯ０１／８３８２７、ＷＯ０２／１２８９３、ＷＯ００／６３７０１、ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３。
Ｋｕｎｉｔｚドメインはまた、例えば、ファージディスプレイなどのファージライブラリー、酵母ディスプレイライブラリー、リボソームディスプレイまたは核酸−タンパク質融合ライブラリーの形態で複製可能な遺伝的パッケージ上に提示され得る。例えば、Ｕ．Ｓ．５，２２３，４０９；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９：１３７３−１３７７；ＷＯ０３／０２９４５６；およびＵ．Ｓ．６，２０７，４４６を参照のこと。そのようなライブラリーの結合メンバーを、セレクションによって得ることができ、そして、ハイスループット様式でスクリーニングすることができる。例えば、Ｕ．Ｓ．２００３−０１２９６５９を参照のこと。
ディスプレイライブラリーからのセレクション
この項では、プロテアーゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを同定するためのディスプレイライブラリーのメンバーを選択する代表的な方法を説明する。本明細書中に開示される方法はまた、改変され得、そして、他のタイプのライブラリー、例えば、発現ライブラリーまたはタンパク質アレイなどと組み合わせて使用され得る。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、ファージ上、特に、繊維状ファージ（例えば、Ｍ１３）上に提示され得る。好ましい実施形態において、ライブラリーは、セリンプロテアーゼと接触する可能性があり、結合性に影響し得るＫｕｎｉｔｚドメインの位置において種々のアミノ酸タイプを有するメンバーを含む。固定化されているか、または固定化可能なセリンプロテアーゼ（例えば、結合対の一方のメンバー（例えば、アビジンまたはストレプトアビジン）での改変によって）を標的として使用して、目的のセリンプロテアーゼに対して高親和性を有するライブラリーのメンバーを選択することができる。
代表的なディスプレイライブラリーのセレクションにおいて、ファージライブラリーを、プロテアーゼ（例えば、変異体または化学的に不活性化されたタンパク質）またはそのフラグメントの活性型または不活性型であり得る標的プロテアーゼと接触させ、そしてそれと結合させ得る。セレクションプロセスにおいて、結合したものと結合していないものとの分離を容易にするために、プロテアーゼを固体支持体上に固定化するのが都合よいことが多いが、まず溶液中で標的プロテアーゼと結合させ、次いで、支持体に標的プロテアーゼを結合することによって、結合したものを結合していないものから分離することも可能である。例として、プロテアーゼの存在下でインキュベートするとき、標的プロテアーゼと相互作用するＫｕｎｉｔｚドメインを提示するファージは、固体支持体上に固定化された標的プロテアーゼと複合体を形成するのに対し、結合していないファージは、溶液中に残り、緩衝液で洗浄される。次いで、結合したファージは、多くの手段（例えば、緩衝液を比較的高い酸性または塩基性のｐＨ（例えば、ｐＨ２またはｐＨ１０）に変化すること、緩衝液のイオン強度を変化すること、変性剤を加えること、競合相手を加えること、感染することができる宿主細胞を加えること（Ｈｏｇａｎら（２００５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ３８（４）：５３６，５３８．）または他の公知の手段）によってプロテアーゼから遊離され得る。
例えば、プロテアーゼ結合ペプチドを同定するために、プロテアーゼを固体表面（例えば、マルチウェルアッセイプレート中のウェルのプラスチック表面）に吸着させ得る。続いて、ファージディスプレイライブラリーのアリコートを、固定化されたプロテアーゼおよびファージの構造を維持する適切な条件下（例えば、ｐＨ６〜７）でウェルに加える。固定化されたプロテアーゼに結合するポリペプチドを提示するファージがそのプロテアーゼに結合し、ウェル内に保持される。結合していないファージは、除去され得る（例えば、緩衝液による洗浄によって）。ファージライブラリーと固定化されたプロテアーゼとの結合の間に、ブロッキング剤または競合剤を含めることも可能である。
次いで、比較的強い酸ｐＨ（例えば、ｐＨ２）またはアルカリｐＨ（例えば、ｐＨ８〜９）を有する緩衝液で洗浄することによって、固定化されたプロテアーゼに結合したファージを溶出し得る。次いで、プロテアーゼから溶出され、回収されたファージの溶液を中和し、そして、所望であれば、プロテアーゼ結合ペプチドを提示するファージの濃縮混合ライブラリー集団としてプールしてもよい。あるいは、各ライブラリー由来の溶出されたファージを、プロテアーゼ結合物のライブラリー特異的な濃縮集団として別個に維持してもよい。次いで、さらなるセレクションの回のため、および／または、ファージ上に提示されたペプチドの解析のため、および／または、提示された結合ペプチドをコードするＤＮＡを配列決定するために、プロテアーゼ結合ペプチドを提示するファージの濃縮集団を標準的な方法によって生育させてもよい。
次いで、回収されたファージを、細菌細胞の感染によって増幅させてもよく、スクリーニングプロセスを、プロテアーゼに結合しなかったものが少なく、そしてプロテアーゼに結合したものが濃縮されている新しいファージのプールにおいて繰り返してもよい。数回、結合ファージを回収することが、このプロセスを完了するのに十分であり得る。数回（例えば、２または３回）のセレクションの後、結合プール中の選別されたファージクローン由来の結合部分をコードする遺伝子配列が、従来の方法によって決定されることにより、ファージと標的との結合親和性をもたらすペプチド配列が明らかになる。各回のセレクションの後に回収されたファージの数の増加および密接に関連した配列の回収から、スクリーニングが、所望の特徴を有するライブラリーの配列に収束していることが示唆される。
結合ポリペプチドのセットが同定された後、その配列情報を使用して、第２のライブラリーが設計され得る。例えば、第２のライブラリーは、最初のライブラリーよりも詳細に、より小さい配列空間のセグメントを探索することができる。いくつかの実施形態において、第２のライブラリーは、さらなる所望の特性、例えば、ヒトタンパク質に対して高い同一パーセンテージを有する配列を有するメンバーに偏ったタンパク質を含む。
セレクションの反復。ディスプレイライブラリー技術は、反復様式で使用され得る。第１のディスプレイライブラリーは、標的プロテアーゼに結合する１つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを同定するために使用される。次いで、これらの同定されたＫｕｎｉｔｚドメインを、突然変異誘発法を用いて改変することにより、第２のディスプレイライブラリーを形成する。次いで、より親和性の高いタンパク質を、例えば、より高ストリンジェンシーまたはより競合的な結合条件および洗浄条件を使用することによって第２のライブラリーから選択する。
いくつかの実施において、突然変異誘発を結合界面であることが知られている領域またはその可能性がある領域に標的化する。Ｋｕｎｉｔｚドメインについて、結合界面付近の多くの位置が知られている。そのような位置としては、例えば、ＢＰＴＩの配列における１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４、３８および３９位が挙げられる。いくつかの代表的な突然変異誘発技術としては：混合ヌクレオチドを用いたＤＮＡの合成、エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇら（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ １：１１−１５）、組換え、ランダム切断を用いたＤＮＡシャフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３８９−３９１；「核酸シャフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴＴＭ（Ｃｏｃｏら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位定方向突然変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １０：６４８７−６５０４）、カセット突然変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの組み込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ １３：３２４５）が挙げられる。合成において使用されるヌクレオチドの混合物は、例えば、様々なコドンの最初の２位を任意の塩基とし、最後の塩基をＧまたはＴとし、そして、すべての２０アミノ酸タイプを出現させることが可能なＮＮＫであり得る。あるいは、いくつかのアミノ酸タイプおよびおそらく終止コドンを除外した様々なコドンが使用され得る。ＮＮＫにより、３２個のコドンが得られ、そのうちの１つが、ストップコドンであるＴＡＧである。ＮＮＫはまた、Ｓｅｒ、ＬｅｕおよびＡｒｇの各々に対して３つのコドン；Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、ＴｈｒおよびＧｌｙの各々に対して２つのコドンをもたらす；他の１２個のアミノ酸タイプは、単一のコドンを有する。様々なコドンＮＮＴは、１５個のアミノ酸タイプをもたらし、ストップコドンをもたらさない。ＮＮＧは、１３個のアミノ酸タイプおよび１つのストップコドンをもたらす。
突然変異誘発は、より限定された様式または標的化された様式でも行われ得る。例えば、目的の位置における親アミノ酸がＳｅｒである場合、第１の塩基における（．８５Ｔ、．０５Ｃ、．０５Ａ、．０５Ｇ）、第２の塩基において（．８５Ｃ、．０５Ｔ、．０５Ａ、０．５Ｇ）および第３の塩基において（．８５Ｔ、．０５Ｃ、．０５Ａ、．０５Ｇ）を有するコドン混合物を使用し得る。このＤＮＡ分子のほとんどは、ＳｅｒをコードするＴＣＴを有するが、他のものは、１、２または３塩基異なるコドンを有し、それにより、多様なアミノ酸タイプがもたらされる。
セレクションの反復の１つの例において、本明細書中に記載される方法は、まず、少なくとも最小の結合特異性で、例えば、１００ｎＭ、１０ｎＭまたは１ｎＭ未満という、結合に対する平衡解離定数で、標的プロテアーゼと結合するディスプレイライブラリーからＫｕｎｉｔｚドメインを同定するために使用される。最初に同定された、Ｋｕｎｉｔｚドメインをコードする核酸配列は、例えば、最初のタンパク質のＫｕｎｉｔｚドメインよりも増強された特性（例えば、結合親和性、動態または安定性）を有する第２のＫｕｎｉｔｚドメインを同定するためのバリエーションの導入用の鋳型核酸として使用される。
特異性についてのセレクションまたはスクリーニング。本明細書中に記載されるディスプレイライブラリーセレクションおよびスクリーニング法としては、非標的分子、例えば、標的プロテアーゼ以外のプロテアーゼに結合するディスプレイライブラリーメンバーを排除していくセレクションプロセスまたはスクリーニングプロセスが挙げられ得る。１つの実施形態において、その非標的分子は、不可逆的に結合したインヒビター、例えば、共結合したインヒビターによる処理によって不活性化されているプロテアーゼである。
１つの実施において、いわゆる「ネガティブセレクション」工程または「枯渇」を使用して、標的と、関連するが異なるかまたは関係のない非標的分子とを区別する。ディスプレイライブラリーまたはそのプールを非標的プロテアーゼと接触させる。非標的プロテアーゼに結合しないサンプルのメンバーを回収し、標的分子への結合についての次のセレクションまたはなおも続くネガティブセレクションに対して使用する。ネガティブセレクション工程は、標的プロテアーゼに結合するライブラリーメンバーを選別する前または後であり得る。
別の実施においては、スクリーニング工程を使用する。ディスプレイライブラリーメンバーが、標的分子への結合について単離された後、単離されたライブラリーメンバーの各々は、それが非標的プロテアーゼに結合する能力について試験される。例えば、ハイスループットＥＬＩＳＡスクリーニングを使用して、このデータを得ることができる。このＥＬＩＳＡスクリーニングはまた、標的への各ライブラリーメンバーの結合についての定量的データを得るために使用され得る。非標的および標的への結合データを比較する（例えば、コンピュータおよびソフトウェアを使用して）ことにより、標的プロテアーゼに特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。
複数の特異性を有する単一のＫｕｎｉｔｚドメイン
２つ以上の特異性を有する単一のＫｕｎｉｔｚドメインは、標的セリンプロテアーゼを使用したライブラリーの交互セレクションによって得られる。Ｋｕｎｉｔｚドメインのライブラリーのメンバーを、まず、第１の標的セリンプロテアーゼへの結合について選別し、第１の標的に結合するそれらのライブラリーメンバーを第２の標的セリンプロテアーゼに対してセレクションおよびスクリーニングする。この交互に行うセレクションおよびスクリーニングを、所望する程度の数の標的セリンプロテアーゼに対して行い得る。さらに、その後、標的プロテアーゼのすべてに結合するライブラリーメンバーを所望の結合についてスクリーニングするセレクションを繰り返してもよい。通常、２〜４回の反復セレクションを行う。
例えば、交互セレクションを使用して、ヒトカリクレイン１（ｈ．Ｋ１、組織カリクレインとしても知られる）とマウスカリクレイン１（ｍ．Ｋ１）の両方を阻害する単一のＫｕｎｉｔｚドメインを得ることができる。上に記載したように、ライブラリーを、一方の標的（例えば、ｈＫ１）に対してまず選別し、次いで、第１のセレクションにおいて同定されたＫｕｎｉｔｚドメインを次いで、他方の標的（例えば、ｍＫ１）に対して選別し得る。その特徴が、疾患動物モデルにおいて評価され得るので、ヒトセリンプロテアーゼおよび別の哺乳動物種（例えば、マウス）由来の対応物を阻害するＫｕｎｉｔｚドメインが、有用である。
別の例において、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）とヒト組織カリクレインの両方を阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを、２つの標的を用いた交互セレクションによって選別する。そのようなインヒビターは、ヒト血漿カリクレインとヒト組織カリクレインの両方が、過剰に活性である関節炎などの疾患において有利であり得る。１つの実施形態において、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、ヒトビクニン（例えば、米国特許第６，５８３，１０８号に記載されているように）と少なくとも２、３、５または１０アミノ酸異なる。
特異性決定基の転移
２つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを有する天然タンパク質を改変することにより、２つの異なるヒトプロテアーゼ、例えば、血漿カリクレイン（ｐＫａｌ）およびヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）をそれぞれ阻害する少なくとも２つの操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを有するタンパク質を提供することができる。例えば、ＤＸ−８８のプロテアーゼ結合ループ由来の残基を、レシピエントタンパク質の一方のＫｕｎｉｔｚドメインに転移し、そして、ＤＸ−８９０のプロテアーゼ結合ループ由来の残基をもう一方のＫｕｎｉｔｚドメインに転移することができる。得られたタンパク質は、血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼを阻害する。
１つの実施形態において、結合性および／または特異性に寄与する残基を、既存のタンパク質、例えば、血清タンパク質などの天然に存在するタンパク質のＫｕｎｉｔｚドメインに置換する。いくつかの血清タンパク質は、２または３個のＫｕｎｉｔｚドメインを含んでいる。これらのＫｕｎｉｔｚドメインの各々は、１つの標的を阻害するように操作され得る。例えば、ヒト組織の細胞外のコンパートメントは、組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ、リポタンパク質関連凝固インヒビター（ＬＡＣＩ）としても知られる）、組織因子経路インヒビター−２（ＴＦＰＩ−２）、肝細胞成長因子アクチベーターインヒビター−１（ＨＡＩ−１）、肝細胞成長因子アクチベーターインヒビター−２（ＨＡＩ−２、胎盤ビクニンとしても知られる）およびビクニン（インター−アルファトリプシンインヒビターとしても知られる）を含む。１つのストラテジーは、マルチＫｕｎｉｔｚドメインヒトタンパク質の１つを鋳型として使用し、そして、必要とされる親和性および特異性をもたらす残基のみを変化させることである。
親和性および特異性をもたらす残基は、いくつかの残基の置換によって、１つのＫｕｎｉｔｚドメインから所望の特性を保持する別のＫｕｎｉｔｚドメインに転移され得る。例えば、ＤＸ−８８は、ＴＦＰＩのＫｕｎｉｔｚドメイン１に基づくものであり、ファージディスプレイライブラリーからのセレクションに基づいて変更されたＫｕｎｉｔｚドメイン内の５アミノ酸を有する。ＤＸ−８８は、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）の３０ｐＭインヒビターであるが、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１は、ｈ．ｐＫａｌに対してほとんど親和性を有しない。表７は、いくつかのＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列、いくつかの野生型のアミノ酸配列、ファージライブラリーから選別されるいくつかアミノ酸配列、いくつかの設計されたアミノ酸配列およびいくつかの設計され、構築され、そして試験されたアミノ酸配列を示している。ＢＰＴＩ、ＴＦＰＩ−Ｋ１、ＴＦＰＩ−Ｋ２およびＴＦＰＩ−Ｋ３は、天然に存在するＫｕｎｉｔｚドメインである。ＤＸ−８８およびＤＸ−１０００は、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１誘導体のライブラリーから選別されたものであり、それぞれヒト血漿カリクレインおよびヒトプラスミンを阻害する。ＴＦ８９０は、ＤＸ−８９０との比較によって設計され、高い親和性でヒト好中球エラスターゼを阻害するはずである。ＴＦＰＩ−Ｋ２＿８８は、ヒト血漿カリクレインを阻害するはずであるＴＦＰＩ−Ｋ２の改変物である。ＴＦＰＩ−Ｋ３＿８８は、ヒト血漿カリクレインを阻害するはずであるＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン３の誘導体である。ＩＴＩ−Ｋ２は、ビクニンの第２のＫｕｎｉｔｚドメインである。ＤＸ−８９０は、ヒト好中球エラスターゼへの結合性についてＢＰＴＩ誘導体のライブラリーから選別されるインヒビターに基づいて設計されたヒト好中球エラスターゼの強力なインヒビターである。ＴＦＰＩ−Ｋ２＿８９０は、ヒト好中球エラスターゼを阻害するように設計されたＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の誘導体である。ＴＦＰＩ−Ｋ３＿８９０は、ヒト好中球エラスターゼを阻害するように設計されたＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン３の誘導体である。
（＊）新しい操作されたＫｕｎｉｔｚドメイン配列は、ディスプレイライブラリー技術を使用して選別され得る。「基礎」配列または「骨格」配列は、任意のＫｕｎｉｔｚドメイン含有タンパク質であり得るが、ある特定の実施形態では、その「基礎」配列は、２つ以上のＫｕｎｉｔｚドメイン（例えば、ＴＦＰＩ、例えば、ＴＦＰＩ Ｋ１）を含む天然に存在するタンパク質由来である。目的の任意のセリンプロテアーゼが、標的として使用され得、それらのセリンプロテアーゼとしては、好中球エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ）、プロテイナーゼ３（例えば、ヒトプロテイナーゼ３）、カテプシンＧ（例えば、ヒトカテプシンＧ）、トリプターゼ（例えば、ヒトトリプターゼ）、血漿カリクレイン（例えば、ヒト血漿カリクレイン）、好中球エラスターゼ（例えば、ヒト好中球エラスターゼ）、カリクレイン６（例えば、ヒトカリクレイン６）、カリクレイン８（例えば、ヒトカリクレイン８）、カリクレイン１０（例えば、ヒトカリクレイン１０）、組織カリクレイン（例えば、ヒト組織カリクレイン）、プラスミン（例えば、ヒトプラスミン）、ヘプシン（例えば、ヒトヘプシン）、マトリプターゼ（例えば、ヒトマトリプターゼ）、エンドセリアーゼ１（例えば、ヒトエンドセリアーゼ１）およびエンドセリアーゼ２（例えば、ヒトエンドセリアーゼ２）が挙げられる。
いくつかの実施形態において、レシピエントＫｕｎｉｔｚドメインは、１３、１５、１６、１７、１８、１９、３１、３２、３４および３９位の残基（ＢＰＴＩの配列に関してナンバリング）が、もとのＫｕｎｉｔｚドメインにおける残基と同じであるように改変される。あるいは、残基１１、１３、１５−１９、３１、３２、３４、３９および４０が変更され得る。別の実施形態において、１１−１９、３１、３２、３４および３８−４０が変更され得る；この場合において、１４−３８ジスルフィドを、他のアミノ酸タイプに変更することができる。他の実施形態において、レシピエントＫｕｎｉｔｚドメインは、第１および第２の結合ループにおける残基が、もとのＫｕｎｉｔｚドメインにおける残基と同じであるように改変される。
ポリペプチドの改変および変更
同様の特性または改善もしくは変更された特性を有する有用な変異体を得るために、Ｋｕｎｉｔｚドメインまたは本明細書中に記載されるタンパク質を変更することもできる。代表的には、多くの変異体が、可能性がある。例えば、本明細書中に記載される結合アッセイ（例えば、蛍光偏光測定法（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ））を使用して、変異体を調製し、次いで、試験することができる。
変異体の１つのタイプは、Ｋｕｎｉｔｚドメインまたは本明細書中に記載される他のタンパク質の切断型である。この例では、変異体は、Ｎ末端またはＣ末端からドメインの１つ以上のアミノ酸残基を除去することによって調製される。いくつかの場合において、そのような一連の変異体を調製し、試験する。その一連の変異体の試験からの情報を使用して、プロテアーゼ結合性および／または血清中での安定性に不可欠なドメインの領域を決定する。一連の内部欠失物または内部挿入物を、同様に構築し、試験することができる。Ｋｕｎｉｔｚドメインについて、例えば、最初のシステインであるＣ５のＮ末端側の１〜５残基または１〜３残基および最後のシステインであるＣ５５のＣ末端側の１〜５残基または１〜３残基を除去することができ、ここで、そのシステインの各々は、ＢＰＴＩにおいてそれぞれナンバリングされたシステインに相当する。
変異体の別のタイプは、置換型である。１つの例において、Ｋｕｎｉｔｚドメインをアラニンスキャニングに供することにより、結合活性およびまたは安定性に寄与する残基を同定する。別の例において、１つ以上の位置における置換のライブラリーを構築する。このライブラリーは、偏っていなくてもよいし、特に複数の位置を変更する場合、もとの残基に偏っていてもよい。いくつかの場合において、置換は、すべて保存的置換である。
別の例において、各リシンをアルギニンに置換し、結合親和性を測定する。それにより、リシンを有さず、かつ、選択された結合特性を保持している結合タンパク質が得られ得る。ポリペプチド鎖においてリシン残基を有しないタンパク質は、ペグ化に対してただ１つの部位のみ（アミノ末端）を提供するので、ペグ化のときに、より相同な産物がもたらされる。
変異体の別のタイプとしては、１つ以上の天然に存在しないアミノ酸が挙げられる。そのような変異体ドメインは、化学合成または改変によって生成され得る。１つ以上の位置を天然に存在しないアミノ酸で置換することができる。いくつかの場合において、置換されたアミノ酸は、もとの天然に存在する残基（例えば、脂肪族、荷電、塩基性、酸性、芳香族、親水性）またはもとの残基の同配体に化学的に関連し得る。
非ペプチド結合および他の化学修飾を含めることも可能である。例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインの一部もしくは全部または他のタンパク質をペプチド模倣物、例えば、ペプトイドとして合成してもよい（例えば、Ｓｉｍｏｎら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：９３６７−７１およびＨｏｒｗｅｌｌ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１３２−４を参照のこと）。
タンパク質生成
ポリペプチドの組換え産生。標準的な組換え核酸方法を使用して、本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、１つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質）を発現することができる。一般に、そのタンパク質をコードする核酸配列は、核酸発現ベクターにクローニングされる。そのタンパク質が十分に小さい場合、例えば、そのタンパク質が、６０アミノ酸未満のペプチドである場合、そのタンパク質は、自動化された有機合成方法によって合成され得る。
タンパク質発現用の発現ベクターは、タンパク質をコードするセグメントおよび制御配列、例えば、コーディングセグメントに作動可能にライゲーションされたプロモーターを含み得る。適当なベクターおよびプロモーターは、当業者に公知であり、本発明の組換え構築物を生成するために市販されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載されている技術を参照のこと。
Ｎ結合型グリコシル化のための部位を含まないタンパク質の発現を、細菌、酵母または哺乳動物細胞において行うことができる。Ｎ結合型グリコシル化のための部位を有するタンパク質は、非グリコシル化バージョンを得るために細菌において発現され得るか、または、グリコシル化が望まれる場合は、酵母もしくは哺乳動物細胞において発現され得る。ヒトにおいて使用するために、グリコシル化バージョンは、好ましくはＣＨＯまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの哺乳動物細胞において生成される。
Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇおよび他のテキストは、組換え（および非組換え）タンパク質を精製するための多くの一般的な方法を提供する。
ペプチドの合成生成。ポリペプチドは、合成手段によって生成することもできる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５：２１４９を参照のこと。例えば、合成ペプチドまたはペプチド模倣物の分子量は、約２５０〜約８，００００ダルトンであり得る。例えば、ペプチドの有効な分子量を増加させる部分に付着することによって、ペプチドを改変することができる。例えば、親水性ポリマー（例えば、ペプチドの親和性および／または活性を増大させる）を用いてペプチドをオリゴマー化、二量体化および／または誘導体化する場合、その分子量は、より大きくなり得、約５００〜約５０，０００ダルトンの範囲内であり得る。
ペグ化および他の改変
単一のＫｕｎｉｔｚドメインは、低分子量を有し、少なくともいくつかの場合において、腎臓によって迅速に濾過される。分子量が増大すると、血清残存も増大し得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質の分子量を増加させるために、種々の部分をそのタンパク質に共有結合的に付着することができる。１つの実施形態において、その部分は、ポリマー、例えば、水溶性および／または実質的に非抗原性のポリマー（例えば、ホモポリマーまたは非生物学的ポリマー）である。実質的に非抗原性のポリマーとしては、例えば、ポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドが挙げられる。その部分は、循環中、例えば、血液、血清、リンパまたは他の組織中におけるＫｕｎｉｔｚドメインの安定性および／または保持を、例えば、少なくとも１．５、２、５、１０、５０、７５または１００倍増強し得る。１つまたは複数の部分を、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質に付着することができる。例えば、上記ポリマーの少なくとも３つの部分にタンパク質を付着する。１つの実施形態において、特に、プロテアーゼ結合ループ中にリシンが存在しない場合、そのタンパク質の各リシンは、ポリマーの部分に付着され得る。
適当なポリマーは、実質的に重量が異なり得る。例えば、約２００ダルトン〜約４０ｋＤａ、例えば、１〜２０ｋＤａ、４〜１２ｋＤａまたは３〜８ｋＤａの範囲、例えば、約４、５、６または７ｋＤａの平均分子量を有するポリマーを使用することができる。１つの実施形態において、化合物に関連するポリマーの個別の部分の平均分子量は、２０、１８、１７、１５、１２、１０、８または７ｋＤａ未満である。最終分子量はまた、結合体の所望の有効なサイズ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状または分枝状などの構造）および誘導体化の程度に依存し得る。
代表的なポリマーの非限定的なリストとしては、ポリアルキレンオキシドホモポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体およびそのブロック共重合体（但し、ブロック共重合体の水溶性が維持される場合））が挙げられる。ポリマーは、親水性ポリビニルポリマー、例えば、ポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンであり得る。さらなる有用なポリマーとしては、ポリオキシアルキレン（例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ））；ポリ乳酸；ポリグリコール酸；ポリメタクリレート；カルボマー；サッカライドモノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースならびにノイラミン酸を含む分枝状または非分枝状の多糖（ホモ多糖およびヘテロ多糖（例えば、ラクトース、セルロース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストランスルフェート、デキストラン、デキストリン、グリコーゲンまたは酸ムコ多糖、例えば、ヒアルロン酸の多糖サブユニット）を含む）；糖アルコールのポリマー（例えば、ポリソルビトールおよびポリマンニトール）；ヘパリンまたはヘパロン（ｈｅｐａｒｏｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態において、ポリマーは、種々の異なる共重合体ブロックを含む。
２つ以上のポリマー部分をタンパク質に付着させるさらなる代表的な方法は、ＵＳ２００５−００８９５１５に記載されている。
タンパク質の分子量を増加させる別の方法は、タンパク質の多量体を作製すること（例えば、少なくとも２コピーのタンパク質を融合するように（代表的にはタンデムに融合するが、頭部と頭部との融合もまたあり得る）タンパク質を作製すること）による方法である。多量体は、化学的架橋または多量体をコードする構築物の発現によって生成され得る。ＤＮＡの長い反復配列は、不安定であり得るので、様々なコピーのタンパク質をコードするポリヌクレオチドが様々な配列を有することが、好ましい。
結合相互作用の特徴付け
タンパク質（例えば、１つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質）の結合特性を、様々なアッセイ様式を使用して容易に評価することができる。例えば、結合特性は、標的プロテアーゼおよび非標的プロテアーゼを阻害する能力の定量的な測定によってアッセイされ得る。あるいは、例えば、タンパク質の結合特性は、特定の標的プロテアーゼに対するそのタンパク質の解離定数（ＫＤ）または結合定数（Ｋａ）を決定する簡便かつ正確な方法を提供する蛍光偏光測定法（Ｂｅｎｔｌｅｙら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０（１２）：７２５０−５６；Ｓｈｉｍａｄａら（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９７（６）：１６３７−４４；Ｔｅｒｐｅｔｓｃｈｎｉｇら（１９９５）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２２７（１）：１４０−７；Ｄｕｒｋｏｐら（２００２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．３７２（５−６）：６８８−９４）によって溶液中で測定され得る。１つのそのような手順において、評価されるタンパク質をフルオレセインで標識する。フルオレセイン標識されたタンパク質を、マルチウェルアッセイプレートのウェル内で、様々な濃度の特定の標的プロテアーゼまたは非標的プロテアーゼと混合する。蛍光偏光測定法の測定は、蛍光偏光プレートリーダーを使用して行われる。
結合相互作用もまた、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して解析することができる。例えば、評価されるタンパク質を、標的プロテアーゼ、例えば、限られた量の標的プロテアーゼでコーティングされている底面を有するマイクロタイタープレートに接触させる。その分子をプレートに接触させる。そのプレートを緩衝液で洗浄することにより、非特異的に結合した分子を除去する。次いで、そのタンパク質を認識する抗体を用いて、プレートに結合したタンパク質の量を、プレートを探索することによって測定する。例えば、そのタンパク質は、エピトープタグを含み得る。その抗体は、適切な基質が提供されるとき、比色定量用の産物を生成する酵素（例えば、アルカリホスファターゼ）に連結され得る。ディスプレイライブラリーメンバーが、試験されるタンパク質を含む場合において、その抗体は、すべてのディスプレイライブラリーメンバーの中で定常性の領域（例えば、ファージディスプレイライブラリーメンバーにおいては、主要なファージコートタンパク質）を認識することができる。
タンパク質と特定の標的プロテアーゼとの結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して解析することができる。例えば、サンプル中に存在するディスプレイライブラリーメンバーを配列決定し、必要に応じて、例えばＥＬＩＳＡによって確認した後に、提示されたタンパク質を多量に生成することができ、また、標的の結合性についてＳＰＲを使用してアッセイすることができる。ＳＰＲまたはリアルタイム生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）は、相互作用物のいずれをも標識することなく、生体分子特異的な相互作用をリアルタイムで検出する（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。ＢＩＡチップの結合表面における質量の変化（結合事象を示唆する）により、表面に近い光の屈折率の変化が生じる（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学現象）。屈折度の変化により、生物学的分子間のリアルタイム反応の指標として測定される検出可能なシグナルが生成される。ＳＰＲを使用するための方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｌａｓｍｏｎｓ Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．ａｎｄ Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５に記載されている。
ＳＰＲからの情報を用いて、タンパク質（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質）の標的プロテアーゼに対する結合性についての平衡解離定数（ＫＤ）および動態学的パラメータ（ｋｏｎおよびｋｏｆｆを含む）の正確かつ定量的な基準がもたらされ得る。そのようなデータを使用して、様々なタンパク質を比較することができる。ＳＰＲからの情報を用いて、構造活性関係（ＳＡＲ）を明らかにすることもできる。例えば、タンパク質が、単一の親抗体または既知の親抗体のセットのすべての変異型変異体である場合、特定の結合パラメータ、例えば、高い親和性および遅いｋｏｆｆと相関する、所定の位置における変異体アミノ酸を同定することができる。
結合親和性を測定するためのさらなる方法としては、核磁気共鳴（ＮＭＲ）および結合滴定（ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）（例えば、蛍光エネルギー転移を用いた）が挙げられる。
結合特性を研究するための他の溶液測定としては、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）、ＮＭＲ、Ｘ線結晶構造解析、分子モデリングおよび遊離分子に対する結合分子の測定が挙げられる。遊離分子に対する結合分子の測定は、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．，Ｂｏｉｓｅ，ＩＤ製のＫｉｎＥｘＡ装置を用いて行うことができる。
プロテアーゼ阻害の特徴づけ
本明細書中に記載されるタンパク質が標的プロテアーゼならびに非標的プロテアーゼを阻害する能力を特徴付けることは、有用であり得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、標的プロテアーゼ阻害の強さおよび選択性について選択され得る。１つの例において、プロテアーゼがその基質と反応できるアッセイ条件下において、標的プロテアーゼと基質とを結合させる。このアッセイは、試験タンパク質の非存在下および漸増濃度の試験タンパク質の存在下で行われる。プロテアーゼ活性が５０％阻害される試験タンパク質の濃度は、その試験タンパク質に対するＩＣ５０値（阻害性濃度）またはＥＣ５０（有効濃度）値である。より低いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有するタンパク質は、より高いＩＣ５０またはＥＣ５０値を有するタンパク質よりも強力な標的プロテアーゼのインヒビターであると考えられる。この局面によれば、好ましいタンパク質は、プロテアーゼ活性の阻害についてインビトロアッセイにおいて測定されるとき、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭまたは０．１ｎＭ以下のＩＣ５０値を有する。
試験タンパク質は、様々なプロテアーゼに対する選択性についても評価され得る。試験タンパク質は、プロテアーゼおよび他の酵素のパネルに対する作用強度についてアッセイされ、ＩＣ５０値は、各々について測定される。標的プロテアーゼに対して低いＩＣ５０値を示し、かつ、試験パネル（例えば、トリプシン、プラスミン、キモトリプシン）の中の他のプロテアーゼに対してより高いＩＣ５０値を示すタンパク質は、標的プロテアーゼに対して選択的であると考えられる。一般に、タンパク質は、そのＩＣ５０値が、酵素のパネルにおいて測定されたＩＣ５０値のうち２番目に小さいＩＣ５０値より少なくとも１桁小さい場合に、選択的であると見なされる。
インビボまたは本明細書中に記載される化合物が投与された被験体のサンプル（例えば、肺洗浄液または血清）において、Ｋｕｎｉｔｚドメイン活性を評価することもできる。
薬学的組成物および処置
例えば、本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、少なくとも２つのヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質）を含む薬学的に許容可能な組成物もまた特徴付ける。１つの実施形態において、このタンパク質は、１つ以上のＫｕｎｉｔｚドメインを含む。
例えば、このタンパク質は、複数の標的プロテアーゼを阻害する。薬学的組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含み得る。
代表的なキャリアとしては、生理的に適合する任意およびすべての溶媒、分散媒、被覆剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤ならびに吸収遅延剤などが挙げられる。好ましくは、キャリアは、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮への投与（例えば、注射または注入による）に適したものである。投与経路に応じて、活性な化合物は、酸の作用および化合物を不活性化し得る他の天然の条件から化合物を保護する材料でコーティングされ得る。
薬学的組成物は、薬学的に許容可能な塩、例えば、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、望ましくない任意の毒物学的作用をもたらさない塩を含み得る（例えば、Ｂｅｒｇｅ、Ｓ．Ｍ．，ら（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照のこと）。そのような塩の例としては、酸付加塩および塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、無毒性の無機酸（例えば、塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸など）から得られる塩ならびに無毒性の有機酸（例えば、脂肪族モノカルボン酸および脂肪族ジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族のスルホン酸など）から得られる塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アルカリ土類金属（例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど）ならびに無毒性の有機アミン（例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカインなど）から得られる塩が挙げられる。
薬学的組成物は、種々の形態であり得る。これらとしては、例えば、液体、半固体および固体の投与形態（例えば、液体の溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、リポソームならびに坐剤が挙げられる。好ましい形態は、意図される投与様式および治療的適用に依存する。代表的な組成物は、注射可能または注入可能な溶液（例えば、ヒトへの抗体の投与に使用される組成物と同様）の形態である。通常の投与様式は、非経口（例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管的、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、髄腔内、硬膜外および胸骨内の注射および注入）である。１つの実施形態において、化合物は、静脈内への注入または注射によって投与される。別の実施形態において、化合物は、筋肉内または皮下への注射によって投与される。薬学的組成物は、代表的には、滅菌されていなければならないし、製造および貯蔵の条件下において安定でなければならない。
本組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高い薬物濃度に適した他の秩序構造物として製剤化され得る。滅菌された注射可能な溶液は、上で列挙された成分の１つまたは組み合わせとともに適切な溶媒中に必要な量で活性化合物を組み込むことによって調製され得、必要であれば、その後、フィルター滅菌される。一般に、分散液は、基礎となる分散媒を含む滅菌されたビヒクルおよび上で列挙された材料のうち他の必要な成分中に活性化合物を組み込むことによって調製される。滅菌された注射可能な溶液を調製するための滅菌された散剤の場合、調製の好ましい方法は、予めフィルター滅菌されたその溶液から活性成分および任意のさらなる所望の成分の粉末を得る、真空乾燥および凍結乾燥である。例えば、レシチンなどのコーティングを使用することによって、分散液の場合は必要な粒径を維持することによって、そして、界面活性剤を使用することによって、溶液の適正な流動性が維持され得る。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に含めることによって、注射可能な組成物の長時間にわたる吸収がもたらされ得る。
本明細書中に記載されるタンパク質は、当該分野で公知の種々の方法によって投与され得る。多くの適用に対して、投与の経路／様式は、静脈内への注射または注入である。例えば、治療的な適用に対して、化合物は、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量に達するように３０、２０、１０、５または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内注入によって投与され得る。あるいは、用量は、１００μｇ／Ｋｇ、５００μｇ／Ｋｇ、１ｍｇ／Ｋｇ、５ｍｇ／Ｋｇ、１０ｍｇ／Ｋｇまたは２０ｍｇ／Ｋｇであり得る。投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なる。
ある特定の実施形態において、本タンパク質は、迅速な放出を防ぐキャリア、例えば、植込錠およびマイクロカプセル化送達系をはじめとした放出制御製剤とともに調製される。生分解性で生体適合性のポリマー（例えば、エチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸）が使用され得る。そのような製剤を調製するための多くの方法が特許されており、一般に知られている。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照のこと。薬学的な製剤化は、十分に確立された技術であり、Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２０００）（ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２）；Ａｎｓｅｌら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，７ｔｈ Ｅｄ．．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９９９）（ＩＳＢＮ：０６８３３０５７２７）；およびＫｉｂｂｅ（ｅｄ．），Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，３ｒｄ ｅｄ．（２０００）（ＩＳＢＮ：０９１７３３０９６Ｘ）にさらに記載されている。
本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、少なくとも２つのヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質）および使用（例えば、処置、予防的または診断的な使用）のための指示書を備えたキットもまた、本発明の範囲内である。１つの実施形態において、キットは、（ａ）化合物、例えば、化合物を含んでいる組成物、および、必要に応じて（ｂ）情報を提供する物質を備える。その情報提供物質は、本明細書中に記載される方法に関する説明、指示、市場もしくは他の物質および／または本明細書中に記載される方法のために化合物を使用することであり得る。
１つの実施形態において、上記情報提供物質は、適当な様式、例えば、適当な用量、投与形態または投与様式（例えば、本明細書中に記載される用量、投与形態または投与様式）で化合物を投与するための指示を含み得る。別の実施形態において、上記情報提供物質は、適当な被験体、例えば、ヒト、例えば、過剰なエラスターゼ活性を特徴とする障害を有するか、またはその危険性のあるヒトを同定するための指示を含み得る。上記情報提供物質は、化合物の生成、化合物の分子量、濃度、使用期限の日付、バッチまたは製造地情報などについての情報を含み得る。キットの情報提供物質は、上記形態に限られない。多くの場合において、上記情報提供物質、例えば、指示書は、印刷物、例えば、印刷された文章、図および／または写真、例えば、ラベルまたは印刷されたシートとして提供される。しかしながら、上記情報提供物質は、他の様式（例えば、点字、コンピュータ解読可能物質、ビデオ記録物または音声記録物）でも提供され得る。別の実施形態において、本キットの情報提供物質は、リンク情報または連絡先、例えば、キットのユーザーが化合物および／または本明細書中に記載される方法におけるその使用に関する確かな情報を得ることができる実際の住所、電子メールアドレス、ハイパーリンク、ウェブサイトまたは電話番号である。当然ながら、情報提供物質は、任意の組み合わせの様式でも提供され得る。
キットの組成物は、化合物に加えて、他の成分（例えば、溶媒もしくは緩衝液、安定剤または保存剤）および／または本明細書中に記載される状態または障害を処置するための第２の薬剤を含み得る。あるいは、その他の成分は、キット内に含められ得るが、化合物とは異なる組成物または容器内に含められ得る。そのような実施形態において、キットは、化合物と他の成分を混合するためまたは他の成分とともに化合物を使用するための指示書を備え得る。
キットは、化合物を含んでいる組成物用の１つ以上の容器を備え得る。いくつかの実施形態において、キットは、組成物用の別個の容器、分割物またはコンパートメントおよび情報提供物質を含む。例えば、組成物は、ビン、バイアルまたは注射器内に含められ得、上記情報提供物質は、プラスチックスリーブまたは小包内に含められ得る。他の実施形態では、キットの別個のエレメントは、単一の分割されていない容器内に含まれる。例えば、組成物は、ラベルの形態で情報提供物質が付着したビン、バイアルまたは注射器内に入っている。いくつかの実施形態において、キットは、複数の個別の容器（例えば、そのパック）（各々が、化合物の１つ以上の単位投与形態（例えば、本明細書中に記載される投与形態）を含む）を備える。例えば、キットは、複数の注射器、アンプル、箔小包またはブリスター包装（この各々が、化合物の単一の単位用量を含む）を備える。キットの容器は、気密性で、防水性で（例えば、水分または蒸発の変化に不透性）、そして／または遮光性であり得る。
本明細書中に記載されるタンパク質（例えば、少なくとも２つのヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質）は、単独か、または、第２の薬剤と組み合わせて、被験体、例えば、患者、例えば、障害（例えば、本明細書中に記載される障害）、障害の症状または障害に対する素因を有する患者に、その障害、障害の症状または障害に対する素因を治療、治癒、軽減、緩和、変化、矯正、回復、改善するか、またはそれらに影響するという目的で、投与され得る。処置はまた、ある状態の発生を遅延させ得る、例えば、その発生を防ぎ得るか、またはその悪化を防ぎ得る。
治療有効量、代表的には、被験体を処置する際、例えば、被験体における障害の少なくとも１つの症状を治癒、軽減、緩和または改善する際に、そのような処置がなされないときに予想される程度よりも大きい程度で、被験体に単回または複数回投与されるときの有効な化合物の量が、投与され得る。組成物の治療有効量は、因子（例えば、疾患の状態、個体の年齢、性別および体重ならびにその化合物が個体において所望の応答を誘発する能力）に応じて変化し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が、組成物の任意の有毒または不利益な効果よりも勝る量である。治療的に有効な用量は、好ましくは、処置されていない被験体と比較して、好ましくは測定可能なパラメータを調節する。化合物が測定可能なパラメータを阻害する能力は、ヒト障害における有効性を予測する動物モデル系において評価され得る。
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的な応答）をもたらすために調整され得る。例えば、単回のボーラスを投与してもよいし、時間をかけていくつかに分割した量を投与してもよいし、治療的な状況の緊急事態によって示唆されるときは、その用量を比例的に減少または増加させてもよい。投与の簡便性および用量の均一性のために投薬単位形態で非経口組成物を製剤化することは、特に有利である。本明細書中で使用されるとき、投薬単位形態とは、処置される被験体に対して統一された用量として適した物理的に分離した単位のことをいう；各単位は、必要な薬学的キャリアと併せて所望の治療効果をもたらすように計算され、予め決められた量の活性化合物を含む。
本明細書中に記載される化合物の治療的有効量または予防的有効量に対する例示的な、非限定的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／Ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／Ｋｇである。化合物は、約１〜５０ｍｇ／ｍ２または約５〜２０ｍｇ／ｍ２の用量を達成するために２０、１０、５または１ｍｇ／分未満の速度で非経口（例えば、静脈内または皮下）注入によって投与され得る。用量値は、軽減されるべき状態のタイプおよび重症度にあわせて変化し得ることに注意されたい。任意の特定の被験体に対する特定の投与レジメンが、個体の要望および組成物を投与しているかまたは投与の監督をしている者（例えば、監督医師）の専門的な判断に応じて、時間をかけて調節されるべきであることおよび本明細書中で示される用量範囲は、単なる例示であることがさらに理解される。
治療的用途
本発明のタンパク質は、２つ以上のプロテアーゼによって媒介される障害を処置または予防するための治療において使用され得る。同様に、本発明のタンパク質は、２つ以上のプロテアーゼによって媒介される障害を処置するための薬物を製造するために使用され得る。
関節リウマチ（ＲＡ）：ヒト血漿カリクレイン、ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト好中球エラスターゼはすべて、ＲＡに関与している（Ｖｏｌｐｅ−Ｊｕｎｉｏｒら、１９９６，Ｉｎｆｌａｍｍ Ｒｅｓ，４５：１９８−２０２；Ｃａｓｓｉｍら、２００２，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ，９４：１−３４；Ｃｏｌｍａｎ，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４３：１０３−８；Ｄｅｌａ Ｃａｄｅｎａら、１９９５，Ｆａｓｅｂ Ｊ，９：４４６−５２；Ｒａｈｍａｎら、１９９５，Ａｎｎ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ，５４：３４５−５０；Ｔｒｅｍｂｌａｙら、２００３，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ，４：５５６−６５）。従って、ヒト血漿カリクレイン、ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト好中球エラスターゼの群からの少なくとも２つのプロテアーゼを阻害するタンパク質の有効量を、ＲＡを有する（または有すると疑われる）被験体に投与することによって関節リウマチを処置する方法（例えば、総Ｓｈａｒｐスコア、Ｓｈａｒｐ浸潤スコアまたはＨＡＱ障害指標を安定化または改善する方法）が、提供される。
ＭＭＰ１、２、３、９および１３もまた、ＲＡに関与している（Ｂｕｒｒａｇｅら（２００６）Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．１１：５２９−４３）。従って、（ａ）ヒト血漿カリクレイン、ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト好中球エラスターゼの群からの少なくとも２つのプロテアーゼ、（ｂ）ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３の群からの少なくとも１つのプロテアーゼを阻害するタンパク質の有効量を投与することによって、ＲＡを処置する方法（例えば、総Ｓｈａｒｐスコア、Ｓｈａｒｐ浸潤スコアまたはＨＡＱ障害指標を安定化または改善する方法）がまた提供される。
ＲＡは、種々の臨床的基準によって評価され得る。いくつかの代表的な兆候としては、総Ｓｈａｒｐスコア（ＴＳＳ）、Ｓｈａｒｐ浸潤スコアおよびＨＡＱ障害指標が挙げられる。本発明のタンパク質は、ＲＡを処置するため、例えば、これらの臨床的基準の１つ以上に基づく評価を改善するために投与される。
肺障害：肺の炎症性障害は、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧ、トリプターゼ、ＭＭＰ−１２およびＭＭＰ−９をはじめとした多くの様々なプロテアーゼが関与する。従って、本発明は、炎症を伴う肺障害を有する（または有すると疑われる）被験体に、これらのプロテアーゼの２つ以上（またはすべて）の活性を阻害するタンパク質の有効量を投与することによって、炎症を伴う肺障害を処置および／または予防するための方法（例えば、ＰＦＴスコアを改善もしくは安定化する方法、または、ＰＦＴスコアの悪化を遅延、予防もしくは低下させる方法、あるいは、ＣＯＰＤ患者に対して、破壊指標スコアを少なくとも１０、２０、３０もしくは４０％低下させることによるか、または、年齢および性別が同じ正常な集団に対する正常な破壊指標スコアの少なくとも５０、４０、３０または２０％以内に低下させることによる方法）を提供する。炎症を伴う代表的な肺障害としては、喘息、気腫、嚢胞性線維症および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）（特に、ＣＯＰＤの急性増悪）が挙げられる。特に、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧおよびＭＭＰ−１２は、ＣＯＰＤと関連するので、ＣＯＰＤを処置するためのタンパク質は、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧの群からの少なくとも２つのプロテアーゼを阻害し、いくつかの実施形態では、ＭＭＰ−９および／またはＭＭＰ−１２をさらに阻害する。
種々の臨床的基準は、肺疾患およびその処置の有効性を評価するために利用可能である。肺機能検査（ＰＦＴ）（例えば、１秒量（ＦＥＶ４）、６秒量（ＦＥＶ６）、努力肺活量（ＦＶＣ）、最大呼気流量、パーセンテージとして表されるＦＥＶ１とＦＶＣとの比（ＦＥＶ１／ＦＶＣ）、ＦＶＣの中間（２５〜７５％）の部分の間の平均努力呼気流量より低い努力呼気流量（ＦＥＦ２５−７５）および薄面コンピュータ断層撮影（ｔｈｉｎ ｓｅｃｔｉｏｎ ｃｏｍｐｕｔｅｄ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ））が、肺疾患および処置の有効性を評価するために使用され得る。肺胞中隔の損傷および気腫の基準である「破壊指標」は、ＣＯＰＤならびに本明細書中のタンパク質および方法の治療効果をモニターする際に特に有用であり得る。例えば、Ａｍ Ｒｅｖ Ｒｅｓｐｉｒ Ｄｉｓ １９９１ Ｊｕｌ；１４４（１）：１５６−５９を参照のこと。
多発性硬化症：多発性硬化症（ＭＳ）は、ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）、ヒトカリクレイン８（ｈＫ８）およびヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）と関与し得る。従って、本発明は、これらのプロテアーゼの２つ以上（例えば、３つすべて）を阻害するタンパク質の有効量を、ＭＳを有する（または有すると疑われる）被験体に投与することによって多発性硬化症を処置する方法（例えば、ＥＤＳＳスコアを低下または安定化する方法、悪化の強度または頻度を低下させる方法、あるいは硬化性の病変のサイズ、数を低下させる方法または硬化性の病変のサイズもしくは数の増大速度を低下させる方法）を提供する。ＭＳを有する患者は、臨床的に明確なＭＳの診断を確立する際の、医学的分野において認知されている基準（例えば、ＭＳの診断に関するワークショップによって定義された基準）によって同定され得る（Ｐｏｓｅｒら、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１３：２２７，１９８３）。
多発性硬化症の処置の有効性は、当該分野で認知されている任意の方法または基準を使用して調べられ得る。共通して使用される３つの基準は：ＥＤＳＳ（総合障害度評価尺度（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｔｕｓ ｓｃａｌｅ），Ｋｕｒｔｚｋｅ，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ３３：１４４４，１９８３）、悪化の発生またはＭＲＩ（磁気共鳴画像）である。
脊髄損傷：脊髄損傷は、ｈＫ６、ヒト好中球エラスターゼおよび他のセリンプロテアーゼによって悪化し得る。従って、本発明は、少なくとも２つのセリンプロテアーゼｈＫ６およびヒト好中球エラスターゼを阻害するタンパク質の有効量を、脊髄損傷を有する被験体に投与することによって脊髄損傷を処置する方法（例えば、全般的または細密な運動技能を改善すること、患者が行い得る日常生活動作（ＡＤＬ）を増加させること、反射応答の改善または複雑な移動運動行動の改善）を提供する。
行動の評価は、しばしば、運動障害の正確な性質を定義することができないか、または、脊髄損傷後の運動行動の回復を評価することができない。全般的な運動行動の評価に加えて、脊髄損傷後の機能の回復の評価の隠れた欠陥を評価するために、移動運動用の複雑な検査を使用することが適切である。Ｓｕｒｅｓｈらは、ボンネットモンキー（Ｍａｃａｃａ ｒａｄｉａｔａ）において機能の回復を評価するために、反射応答および複雑な移動運動について感度の高い定量的検査を複合行動スコア（ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｓｃｏｒｅ）（ＣＢＳ）として設計した（Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ．（２０００）１７８（２）：１３６−５２）。これらの測定は、非侵襲性であるので、ヒト患者における使用に適応され得る。
炎症性腸疾患：炎症性腸疾患（ＩＢＤ）としては、２つの特徴的な障害であるクローン病および潰瘍性大腸炎（ＵＣ）が挙げられる。潰瘍性大腸炎は、大腸において発生するが、クローン病は、消化管全体ならびに小腸および大腸が関与し得る。ほとんどの患者について、ＩＢＤは、数ヶ月から数年にわたって継続する、断続的な直腸からの出血、痙攣性の腹痛、体重減少および下痢をはじめとした症状を伴う慢性的な状態である。ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）、ヒト血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼは、クローン病と潰瘍性大腸炎の両方に関与している（Ｃｏｌｍａｎ，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，４３：１０３−８；Ｄｅｖａｎｉら（２００５）Ｄｉｇ．Ｌｉｖｅｒ Ｄｉｓ．３７（９）：６６５−７３；Ｋｕｎｏら（２００２）Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３７（Ｓｕｐｐｌ １４）：２２−３２；Ｓｔａｄｎｉｃｋｉら、（１９９７）Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．４２（１１）：２３５６−６６）。従って、本発明はまた、ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）、ヒト血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼの少なくとも２つ（または３つすべて）を阻害するタンパク質の有効量を、被験体に投与することによって、クローン病および／または潰瘍性大腸炎を処置および／または予防する方法（例えば、直腸からの出血、腹部の疼痛／痙攣、体重減少もしくは下痢を減少または排除する方法、ヘマトクリットを改善する方法／貧血の改善を排除する方法あるいはＵＣ患者における潰瘍性大腸炎スコアについての臨床活性指標を改善する方法）も提供する。被験体は、ＩＢＤを有するか、ＩＢＤを有すると疑われるか、またはＩＢＤを発症する危険性がある。
ＩＢＤの症状の多く（例えば、直腸からの出血、腹部の疼痛／痙攣、下痢、体重減少、ヘマトクリット／貧血）は、標準的な方法を使用して定量化され得る。さらに、臨床指標（例えば、潰瘍性大腸炎についての臨床活性指標）を使用して、ＩＢＤをモニターし得る。（例えば、Ｗａｌｍｓｌｅｙら Ｇｕｔ．１９９８ Ｊｕｌ；４３（１）：２９−３２およびＪｏｗｅｔｔら（２００３）Ｓｃａｎｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３８（２）：１６４−７１もまた参照のこと）。
膵炎 急性膵炎は、膵臓チモーゲンの急激な膵臓内での活性化によって、（放置される場合）膵臓が本質的に自己分解されることを特徴とする。関与する主な酵素は、ヒトトリプシン１および２、ヒト膵臓キモトリプシンならびにヒト膵臓エラスターゼである。従って、本発明は、プロテアーゼであるヒトトリプシン１、ヒトトリプシン２、ヒト膵臓キモトリプシンおよびヒト膵臓エラスターゼの少なくとも２つを阻害するタンパク質を、急性膵炎を有する（または有すると疑われる）被験体に投与することによって、急性膵炎を処置するための方法（例えば、Ｒａｎｓｏｎスコア、急性生理異常・慢性度による重症度評価（Ａｃｕｔｅ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃｈｒｏｎｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ）（ＡＰＡＣＨＥ ＩＩ）スコアまたはＢａｌｔｈａｚａｒコンピュータ断層像重症度指標（ＣＴＳＩ）を安定化または改善する方法）を提供する。
癌 多くのセリンプロテアーゼは、癌および腫瘍形成経路に関与する。ヘプシンおよびマトリプターゼは、肝細胞成長因子の活性化に関与する。肝細胞成長因子（ＨＧＦ）は、多くの腫瘍に対する成長因子であり、その放出を阻止することが、必要な成長因子を腫瘍細胞から奪うことになる。さらに、マトリプターゼはまた、プロｕＰＡをｕＰＡ（プラスミノゲンからのプラスミンの生成に関与する酵素）に切断し得る。プラスミンは、様々なマトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化に関与する。プラスミノゲンから活性なプラスミンに変換されるとき、プラスミンは、種々の上皮癌細胞の表面と結合した状態で残存する。ＭＭＰ活性は、癌細胞を１カ所の部位から離れさせるか、または新しい部位に浸潤させる種々のマトリックスタンパク質を切断する際に重要である。さらに、マトリプターゼはまた、プロｕＰＡをｕＰＡ（プラスミノゲンからのプラスミンの生成に関与する酵素）に切断し得る。エンドセリアーゼ１および２はまた、癌に関与している。
従って、本開示は、癌に関与する少なくとも２つのプロテアーゼ、例えば、ヒトプラスミン、ヒトヘプシン、ヒトマトリプターゼ、ヒトエンドセリアーゼ１およびヒトエンドセリアーゼ２の群からの少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する本発明の操作されたマルチＫｕｎｉｔｚドメインタンパク質の有効量を投与することによって、癌（例えば、乳癌（Ｈｅｒ２＋、Ｈｅｒ２−、ＥＲ＋、ＥＲ−、Ｈｅｒ２＋／ＥＲ＋、Ｈｅｒ２＋／ＥＲ−、Ｈｅｒ２−／ＥＲ＋およびＨｅｒ２−／ＥＲ−乳癌を含む）、頭頸部癌、口腔癌、喉頭癌、軟骨肉腫、卵巣癌、精巣癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、グリア芽細胞腫、グリオーマ））を処置する方法（例えば、腫瘍成長を遅延、排除または逆転させる方法、転移の数もしくはサイズを予防または減少させる方法、腫瘍細胞の侵襲性を低下または排除する方法、腫瘍進行の間隔を延長する方法あるいは無病生存時間を延長する方法）を提供する。
開示される方法は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍およびそれらの転移の予防および処置に有用である。固形腫瘍としては、様々な器官系（例えば、肺、乳房、リンパ系、消化器系（例えば、結腸）および尿生殖器管（例えば、腎臓、尿路上皮または精巣の腫瘍）、咽頭、前立腺および卵巣）の悪性腫瘍（例えば、肉腫、腺癌および癌腫）が挙げられる。代表的な腺癌としては、直腸結腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌および小腸の癌が挙げられる。さらなる代表的な固形腫瘍としては：線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫（ｓｙｎｏｖｉｏｍａ）、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、消化器系癌、結腸癌、膵癌、乳癌、生殖器泌尿器系癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。上述の癌の転移もまた、本明細書中に記載される方法に従って処置または予防され得る。
実施例１−真核細胞におけるＴＦＰＩの発現
表１は、ＬＡＣＩ（組織因子経路インヒビター（ＴＦＰＩ）としても知られる）のアミノ酸配列を示している。表２は、ＬＡＣＩ内の様々なＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列を示している。「｜」の印が付けられた位置（１１、１３、１５−１９、３４、３９−４０）は、ドメインのプロテアーゼ特異性を変化させるために変更され得る残基の例である。「＾」の印が付けられた位置（２１および３２）もまた、変更され得る。
「＄」の印が付けられた位置は、Ｋｕｎｉｔｚドメインの構造に寄与し得る。いくつかの実施において、これらの位置は、変異体において維持されている。他の実施において、それらは多様であるが、限られた程度で多様であり、例えば、保存的置換を可能にする程度で多様である。
ＬＡＣＩは、３つの可能性のあるＮ結合型グリコシル化（Ｎｘ（Ｓ／Ｔ））部位を含む。表１において、Ａｓｎ（Ｎ）残基は、太字で示され、下線が引かれている。Ｋｕｎｉｔｚドメイン２において、Ｎ２５（ドメインの初めからのナンバリング）は、潜在的なグリコシル化部位である。この位置は、セリンプロテアーゼと接触する残基から遠く、この部位でのグリコシル化は、プロテアーゼの結合性または阻害を干渉する可能性は低い。リンカー３における第２のＡｓｎのグリコシル化もまた、活性に影響する可能性は低い。Ｋｕｎｉｔｚドメイン３における第３の潜在的部位は、結合部位から遠く、この部位におけるグリコシル化は、プロテアーゼへの結合性またはプロテアーゼの阻害を妨害しないだろう。
表３は、ＴＦＰＩをコードするｃＤＮＡを示している。推定シグナル配列をコードするＤＮＡは、塩基１３３〜塩基２１６（下線部）である。表３２は、ウサギＴＦＰＩについてのｃＤＮＡを示している。そこでは、より短いシグナル配列が同定される。成熟タンパク質は、塩基２１７〜１０４４によってコードされる。表４は、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現され得るＴＦＰＩの改変配列を有するベクターであるｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ１の注釈つきのＤＮＡ配列を示している。改変により、制限酵素認識部位がもたらされ、ＴＦＰＩの部分が容易に変更され得る。他のベクターおよび他のシグナル配列が、使用され得る。ＤＮＡ配列を改変することにより、多くの制限酵素認識部位が導入され、その結果、ＴＦＰＩの部分が、容易に除去または改変され得る。変更された塩基は、大文字、太字または下線として示される。表４の各行において、感嘆符（！）に続く各性質が解説である。同様の形式のこの表および他の表における裸のＤＮＡ配列は、感嘆符およびその行においてそれに続くすべての性質を低下させることによって回復され得る。
表４中のＤＮＡ配列は、ヒトＴＦＰＩ ｃＤＮＡおよび表１５中のオリゴヌクレオチドを使用して構築され得る。第１のｃＤＮＡは、鋳型として使用され、ＯＮＭａｔｕｒｅＴおよびＯＮ１０１９Ｌ２７は、８２９塩基セグメントのコード領域を増幅するために使用される。このＤＮＡは、プライマー１：（ＯＮＳｆｉＴ、ＯＮＳａｃＨｉｎＬ）、２：（ＯＮＳａｃＨｉｎＵ、ＯＮＭｌｕＩＬ）、３：（ＯＮＭｌｕＩＵ、ＯＮＢＢＢＬ）、４：（ＯＮＢＢＢＵ、ＯＮＸｈｏＢａｍＬ）、５：（ＯＮＸｈｏＢａｍＵ、ＯＮＢｓｍＢＩＬ）、６：（ＯＮＢｓｍＢＩＵ、ＯＮＡｐａＳａｌＬ）、７：（ＯＮＡｐａＳａｌＵ、ＯＮＳａｃ２Ｌ）、８：（ＯＮＳａｃ２Ｕ、ＯＮＢｓｐＥ２Ｌ）、９：（ＯＮＢｓｐＥ２Ｕ、ＯＮＢｓｓＨ２Ｌ）および１０：（ＯＮＢｓｓＨ２Ｕ、ＯＮｆｉｎａｌＬ）を使用する１０回のＰＣＲ反応のための鋳型として使用され得る。この１０個の産物（異なる１つの産物と重複した２０以上の塩基を有する）を混合し、そして、プライマーＯＮＳｆｉＴおよびＯＮｆｉｎａｌＬで増幅されることにより、８７４塩基の産物が生成される。この核酸をＳｆｉＩおよびＸｂａＩで切断し、同様に切断された発現ベクターにライゲーションする。
実施例２：ｈ．ｐＫａｌおよびヒト好中球エラスターゼを阻害するＴＦＰＩ誘導体
ヒト好中球エラスターゼおよびヒト血漿カリクレインは、両方とも、冠状動脈バイパス手術（ＣＢＰＳ）に関連する炎症性応答に関与し得る。従って、ヒト好中球エラスターゼとヒト血漿カリクレインの両方を阻害するタンパク質は、患者を処置するために使用されるとき、例えば、冠状動脈バイパス手術の前、手術中、手術後に、有益な相乗効果を有し得る。
非常に強力で、かつ、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）およびヒト好中球エラスターゼの各々に特異的なインヒビターは、表９に示される遺伝子によってコードされる。変更されたアミノ酸は、太字で示され、変異した塩基は、太字かつ大文字で示される。制限酵素認識部位は、太字で示される。真核細胞において機能的な他の任意のシグナル配列が使用され得る。このタンパク質は、ＴＦ８８８９０と名付けられる。この遺伝子は、表４に示される全長ＴＦＰＩに対して使用されたベクターと同じベクターまたは任意の適当な発現ベクターにおいて発現され得る。発現ベクターを、ＳｆｉＩおよびＸｂａＩで切断し、その消化されたベクターＤＮＡに、表９に示されるＤＮＡをライゲーションする。表１０は、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１およびＫｕｎｉｔｚドメイン２に変化をもたらすために使用され得るオリゴヌクレオチドを示している。その手順は、以下のとおりである。
ＯＮ１Ｕ２３およびＯＮ７１８Ｌ２１を用いたｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ１のＰＣＲにより、Ｓ１７４までの成熟配列を含む５２２塩基の産物ＰＮＫ１が得られる。ＰＮＫ１を鋳型として使用し、ＯＮ１Ｕ２３およびＯＮＫ１Ｂｏｔにより、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基１３〜２０周辺に変更を含む１４１塩基の産物ＰＮＫ２が得られる。Ｋｕｎｉｔｚドメイン１内において、変更は、Ｋ１５Ｒ、Ｒ１７Ａ、Ｉ１８Ｈ、Ｉ１９ＰおよびＦ２１Ｗである。ＯＮＫ１ＴおよびＯＮＫ２Ｂ１を用いたＰＮＫ１のＰＣＲにより、第１の産物と５７塩基重複する２６５塩基の産物ＰＮＫ３が得られる。このＰＣＲによって、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２に変更：Ｉ１３Ｐ、Ｒ１５Ｉ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ｆ、Ｉ１８Ｆ、Ｔ１９ＰおよびＹ２１Ｗが導入される。ＯＮＫ２Ｔ１およびＯＮＫ２Ｂ２を用いたＰＮＫ１のＰＣＲにより、ＰＮＫ３と５１塩基の重複およびＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン２における変更を含む長さ１０４のＰＮＫ４が得られる。これにより、Ｒ３２Ｌ、Ｋ３４ＰおよびＬ３９Ｑの変更が導入される。ＯＮＫ２Ｔ２およびＯＮ７１８Ｌ２１を用いたＰＮＫ１のＰＣＲにより、長さ１６５のＰＮＫ５が得られる。ＰＮＫ２、ＰＮＫ３、ＰＮＫ４およびＰＮＫ５を混合し、ＯＮＳｆｉＴｏｐおよびＢｏｔＡｍｐを使用して、５７３塩基のフラグメントを増幅する。最終ＰＣＲ産物をＳｆｉＩおよびＸｂａＩで切断し、同様に切断された発現ベクターにライゲーションする。この新しいベクターをｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ２と呼ぶ。
ｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ２によってコードされる分子であるＴＦ８８８９０は、以下の特徴を有すると予想される。第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒト血漿カリクレインを阻害し、第２のＫｕｎｉｔｚドメインは、ヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を阻害する。この成熟タンパク質は、１７４アミノ酸であるはずであり、Ｎ１１７およびＮ１６７においてグリコシル化され得る。Ｎ１１７は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２における２６位である。この部位は、タンパク質においてプロテアーゼ結合部位と異なる側に位置するので、プロテアーゼとの結合性を干渉しないと予想される。Ｎ１６７は、リンカー３中に存在し、ｈＮＥの阻害を干渉しないと予想される。このタンパク質は、Ｓ１７４で終結する。ＭＭＰ−８およびＭＭＰ１２は、野生型ＴＦＰＩをこの部位で切断する。従って、この配列で終結しているタンパク質は、野生型ＴＦＰＩのＭＭＰ−８またはＭＭＰ１２の切断から生じたものであるので、そのようなペプチドの存在は、免疫応答を引き起こす可能性が低い。ＴＦ８８８９０の予想される分子量は、１９ＫＤａ＋糖鎖である。細胞表面結合と関与するＴＦＰＩの領域が存在しないので、ＴＦ８８８９０は、ＴＦＰＩとは異なり細胞表面と結合しないと予想される。ＴＦ８８８９０の分子量は、約１４ＫＤａであり、血清中での滞留時間は短いだろう。短い滞留時間は、冠状動脈バイパス手術を受ける患者を処置するためには有用であり得る。しかしながら、長い滞留時間は、例えば、１つ以上のポリマー部分（例えば、ＰＥＧ部分）を付着することによって、操作され得る。
ＴＦ８８８９０に対する代替の構造を、以下の表２０〜２５に示す。さらなる代替の構造は、塩基５０８〜５７９が欠失した表９に示される配列を使用したものである。この構築物は、ＴＦ８８８９０Ｓであり、２つの潜在的なグリコシル化のＮ結合型部位を有する１５０アミノ酸を含み得る。ＴＦ８８８９０Ｓは、ヒト血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼを阻害し得る。これらの表中の配列は、代表的な成熟アミノ酸配列である。これらの配列を含むタンパク質を分泌によって生成するために、真核細胞（例えば、哺乳動物（例えば、ＣＨＯまたはＨＥＫ２９３Ｔ）細胞もしくは酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ））または細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはＣａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ）における発現に適したシグナル配列が付加され得る。
３個以上のグリコシル化部位を含まないように、例えば、このタンパク質が、Ｎ結合型グリコシル化部位を有しないように、このタンパク質は、消化され得る。
Ｋｕｎｉｔｚドメインは、リンカー、例えば、親水性で可撓性のリンカー（例えば、リンカー：ＧＧＳＧＧＳＳＳＳＳＧ）と接続され得る。Ｔ細胞エピトープを有しないリンカーが、特に有用である。ＭＨＣ分子に対するすべてのリガンドは、（ａ）中型から大型の疎水性アミノ酸（ＶＩＬＭＦＷＹ）または（ｂ）荷電アミノ酸（ＥＤＲＫＨ）から選択される少なくとも１または２個のアミノ酸タイプを含む。従って、これらのアミノ酸のいずれかを含まないリンカー（例えば、１２アミノ酸のリンカー）は、隣接するＫｕｎｉｔｚドメイン由来の残基の近位から生じ得るエピトープを含むＭＨＣ−Ｉネオ−エピトープの生成を回避する。２つ以上のリンカーを使用する場合（例えば、少なくとも３つのＫｕｎｉｔｚドメインを有するタンパク質に対して）、Ｋｕｎｉｔｚドメイン間のリンカーは、異なり得る。
例えば、ＴＦ８８８９０−２は、ＴＦ８８８９０の構造の代替物であり、表２０に示される。ＴＦ８８８９０−２は、２コピーのＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を含み、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）のインヒビターにするために第１リンカーが改変され、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターにするために第２リンカーが改変されている。
成熟ＴＦ８８８９０−３のアミノ酸配列を表２１に示す。ＴＦ８８８９０−３は、３コピーのＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を含み、ヒト血漿カリクレインのインヒビターにするために第１および第３リンカーが改変され、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターにするために第２リンカーが改変されている。ＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の例は、いかなるＴ細胞エピトープももたらさないと予想される、親水性で可撓性のリンカー（ＧＧＳＧＧＳＳＳＳＳＧ）によって接続されている。第１または第３のＫｕｎｉｔｚドメインは、異なるプロテアーゼを阻害するように改変され得、それにより、３重特異性のインヒビターがもたらされる。高い分子量は、血清中での滞留時間を延ばすと予想される。
成熟ＴＦ８８８９０−４のアミノ酸配列を表２２に示す。ＴＦ８８８９０−４は、４コピーのＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を含み、ｈ．ｐＫａｌのインヒビターにするために第１および第３のリンカーが改変され、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターにするために第２および第３のリンカーが改変されている。ＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の例は、いかなるＴ細胞エピトープももたらさないと予想される、親水性で可撓性のリンカー（ＧＧＳＧＧＳＳＳＳＳＧ）によって接続されている。このリンカーは、すべて同じである必要はない。４つすべてのＫｕｎｉｔｚドメインが、異なるプロテアーゼに特異的であり得る。
成熟ＴＦ８８８９０−５のアミノ酸配列を表２３に示す。ＴＦ８８８９０−５は、４コピーのＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を含み、ｈ．ｐＫａｌのインヒビターにするために第１および第３のリンカーが改変され、ヒト好中球エラスターゼのインヒビターにするために第２および第３のリンカーを改変している。ＴＦＰＩ−Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の例は、いかなるＴ細胞エピトープももたらさないと予想される、親水性で可撓性のリンカー（ＧＧＳＧＮＧＳＳＳＳＧＧＳＧＳＧ）によって接続されている。示されるリンカーの各々が、Ｎ結合型グリコシル化部位（ＮＧＳ）を含む。真核細胞において産生される場合、ＴＦ８８８９０−５は、３つの部位において、溶解性および血清滞留時間を増大させるはずである糖鎖を有するはずである。それらのリンカーは、同じである必要はない。４つすべてのＫｕｎｉｔｚドメインが、異なるプロテアーゼに特異的であり得る。
実施例３：ＴＦＰＩに基づくヒトプラスミンｈ．ｐＫａｌおよびヒト好中球エラスターゼのインヒビター
表１６は、ヒトＴＦＰＩ由来のタンパク質でＰｌａＫａｌＥｌ０１と命名されるアミノ酸配列を示している。配列ＫＧＧＬＩＫＴＫＲＫＲＫＫＱＲＶＫＩＡＹＥＥＩＦＶＫＮＭは、野生型ＴＦＰＩのＣ末端由来であり；この配列は、細胞との結合性およびＴＦＰＩが遺伝子発現に対して有する効果に関与する。この配列の除去およびＫｕｎｉｔｚドメイン３における変更によって、細胞と結合せず、かつ、細胞の遺伝子発現を調節しないタンパク質がもたらされる。Ｋｕｎｉｔｚドメイン１において、本発明者らは、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の残基１５をＬｙｓからＡｒｇに変更した。残基１７において、本発明者らは、ＩｌｅをＡｒｇに変更した。残基１８において、ＭｅｔをＰｈｅに変更する。残基１９において、本発明者らは、ＬｙｓをＡｓｐに変更する。残基２１において、本発明者らは、ＰｈｅをＴｒｐに変更する。これらの変更により、ヒトプラスミンの強力なインヒビターであるＤＸ−１０００と同一のＫｕｎｉｔｚドメインがもたらされる。
Ｋｕｎｉｔｚドメイン２では、本発明者らは、以下の変更を行う（すべてがＫｕｎｉｔｚドメイン内の位置で示される）：Ｉ１３Ｐ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ａ、Ｉ１８Ｈ、Ｔ１９Ｐ、Ｙ２１Ｗ、Ｋ３４ＩおよびＬ３８Ｅ。これらの変更により、ヒト血漿カリクレインと接触するＫｕｎｉｔｚドメインの一部においてＤＸ−８８に非常に類似したＫｕｎｉｔｚドメインがもたらされる。このドメインは、ヒト血漿カリクレインの強力で特異的なインヒビターである可能性が非常に高い。
Ｋｕｎｉｔｚドメイン３では、本発明者らは、以下の変更を行う：Ｌ１３Ｐ、Ｒ１５Ｉ、Ｎ１７Ｆ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｐ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３６Ｇ、Ｇ３９Ｑ。これにより、Ｋｕｎｉｔｚドメインは、非常に特異的なヒト好中球エラスターゼのインヒビターであるＤＸ−８９０に非常に類似する。ＰｉｒｏおよびＢｒｏｚｅによって報告されたように（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ２００４，１１０：３５６７−７２．）、非常に基礎的なＣ末端テイルを除去することにより、細胞への結合性が大きく低下する。ＰｉｒｏおよびＢｒｏｚｅはまた、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３のＲ１５をＬｅｕに変更することにより、細胞との結合性が大きく低下すると報告した。
ＰｌａＫａｌＥｌ０１をコードする遺伝子は、以下のとおり構築され得る。表１７に示されるオリゴヌクレオチドを、ヒトＴＦＰＩのｃＤＮＡ（表３に示される）とともにプライマーとして使用する。まず、オリゴヌクレオチドＧｅｔ＿ＴＦＰＩ＿ｔｏｐおよびＯＮ９３７Ｌ２４を使用してコドン１〜コドン２７６のコード配列を増幅し、それにより、３’末端のコドンが切断される。この８２８塩基の産物をＰＫＥ＿Ｐ１と呼び、それを６回のＰＣＲ反応：ａ）Ｇｅｔ＿ＴＦＰＩ＿ｔｏｐおよびＭｕｔＫ１：３１０Ｌ４３でＰＫＥ＿Ｐ２（２２０塩基）を生成し、ｂ）ＭｕｔＫ１：３１０Ｕ４３およびＭｕｔＫ２：５１７Ｌ５６でＰＫＥ＿Ｐ３（２６３塩基）を生成し、ｃ）ＭｕｔＫ２：５１７Ｕ５６およびＭｕｔＫ２：５７７Ｌ４７でＰＫＥ＿Ｐ４（１０７塩基）を生成し、ｄ）ＭｕｔＫ２：５７７Ｕ４７およびＭｕｔＫ３：７９２Ｌ５５でＰＫＥ＿Ｐ５（２７０塩基）を生成し、ｅ）ＭｕｔＫ３：７９２Ｕ５５およびＭｕｔＫ３：８６７Ｌ３１でＰＫＥ＿Ｐ６（１０６塩基）を生成し、そしてｆ）ＭｕｔＫ３：８６７Ｕ３１およびＯＮＬｏｗＣａｐＰＫＥでＰＫＥ＿Ｐ７（１１４塩基）を生成するＰＣＲ反応のために鋳型として使用する。ＰＫＥ＿Ｐ２からＰＫＥ＿Ｐ７を混合し、プライマーＯＮＬｏｗＣａｐＰＫＥおよびＯＮＮｃｏＩを用いてＰＣＲ増幅することにより、末端にＮｃｏＩおよびＸｂａＩ部位を有する８６１塩基の産物が得られた。このフラグメントをＳｆｉＩおよびＸｂａＩで切断し、そして、真核細胞における発現のために、表９に示されるような発現カセットを有する、同様に切断された発現ベクター（例えば、ｐＦｃＦｕｓｅ）にライゲーションする。
実施例４：ＭＭＰによる切断に耐性であるＰｌａＫａｌＥｌ０１の改変
ＭＭＰ−８に対する既知の基質を表４２に示す。Ｐ３におけるＰ、Ｐ１におけるＧおよびＰ１’におけるＩまたはＬに対する優先傾向に注意するべきである。ＭＭＰ−１２に対する既知の基質を表４３に示す。
表４２：ＭＭＰ−８の基質（ＭＥＲＯＰＳ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｒｏｐｓ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／）に拠る）
Figure 2009521926
 表４３：ＭＭＰ−１２に対するいくつかの既知基質の切断
Figure 2009521926
 基質
１：アルファ１−プロテイナーゼインヒビター（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）
２：アルファ１−プロテイナーゼインヒビター
３：アルファ１−プロテイナーゼインヒビター
４：インスリンＢ鎖（酸化型）
５：インスリンＢ鎖（酸化型）
すべてに対する参考文献：Ｓｈａｐｉｒｏ，Ｓ．Ｄ．，Ｈａｒｔｚｅｌｌ，Ｗ．Ｏ．＆ Ｓｅｎｉｏｒ，Ｒ．Ｍ．Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｅｌａｓｔａｓｅ．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ Ｅｎｚｙｍｅｓ，２ ｅｄｎ（Ｂａｒｒｅｔｔ，Ａ．Ｊ．，Ｒａｗｌｉｎｇｓ，Ｎ．Ｄ．＆ ＷｏｅｓｓｎｅｒＪ．Ｆ．ｅｄｓ），ｐ．５４０−５４４，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｌｏｎｄｏｎ（２００４）。
表３０は、ＰｌａＫａｌＥｌ０２のアミノ酸配列を示している。このタンパク質は、コドン４９が、ＬｅｕをコードするコドンからＰｒｏをコードするに変更されており、コドン１１２が、ＩｌｅをコードするコドンからＰｒｏをコードするコドンに変更されており、そしてコドン２０３が、ＴｈｒをコードするコドンからＰｒｏをコードするコドンに変更されており、それによって、ＭＭＰ−８またはＭＭＰ−１２による切断が妨害されるという点でＰｌａＫａｌＥｌ０１と異なる。多くのプロテアーゼは、Ｐｒｏの前で切断することが困難であり、ＭＭＰ−８またはＭＭＰ−１２の既知基質のいずれもが、Ｐ１’位にＰｒｏを有する。
実施例５：半減期、メタロプロテイナーゼおよびシステインプロテアーゼ
タンパク質（例としては、タンパク質ＰｌａＫａｌＥｌ０１）の半減期は、１）ペグ化、２）Ｆｃのアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおけるＦｃ（例えば、ＩｇＧのＦｃドメイン）との融合（例えば、ＰｌａＫａｌＥｌ０１：：ＦｃまたはＦｃ：：ＰｌａＫａｌＥｌ０１）、３）アミノ末端またはカルボキシ末端におけるヒト血清アルブミン（またはそのフラグメント）との融合（例えば、ＰｌａＫａｌＥｌ０１：：ｈＳＡまたはｈＳＡ：：ＰｌａＫａｌＥｌ０１、または４）分子量が、許容できる半減期となるのに十分大きくなるまでタンパク質の多量体を形成することをはじめとした方法によって延長され得る。
表１８は、ＰｌａＫａｌＥｌ：：ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧ：：ｈＳＡ融合タンパク質のアミノ酸配列を示している。この分子は大きいが、その半減期は、ＩｇＧまたはｈＳＡと同程度の数週間であり得る。
ＰｌａＫａｌＥｌ０１二量体を表１９に示す。リンカー５の後ろに、公知の抗原性配列を回避する１３アミノ酸のグリシンリッチ親水性リンカーが挿入される。この後ろに、成熟ＰｌａＫａｌＥｌ０１配列のもう１つのコピーが続く。得られたタンパク質は、５０９成熟アミノ酸配列のＰＫＥＰＫＥ０２を有する。分子量が高いことから、この分子にＰｌａＫａｌＥｌ０１よりも一層長い半減期をもたらすと予想される。ＰＫＥＰＫＥ０２および関連タンパク質は、６０ｋＤａを超える分子量を有すると予想され、数日という半減期を有し得る。
ＰＫＥＰＫＥ０２は、ヒトプラスミン、ｈ．ｐＫａｌおよびヒト好中球エラスターゼの各々に対して２つの阻害性部位を有する。このタンパク質のＫｕｎｉｔｚドメインを、さらに操作することにより、６つ以下の異なるセリンプロテアーゼを特異的に阻害するタンパク質が生成され得る。さらに、このタンパク質は、ａ）他のセリンプロテアーゼ、ｂ）メタロプロテイナーゼ、またはｃ）システインプロテイナーゼを阻害する１つ以上の短いペプチド配列との融合によって改変され得る。
哺乳動物細胞または酵母における発現、例えば、分泌型発現に適したベクター中の機能的なシグナル配列の後ろに、ＰＫＥＰＫＥ０２をコードする遺伝子を挿入する。例えば、ＰＫＥＰＫＥ０２をコードするＤＮＡ配列は、表９に示されるものと類似の発現カセットを有する発現ベクターのＳｆｉＩ部位とＸｂａＩ部位の間に挿入される。表９に示されるようなシグナル配列を使用し、その後ろに、表９におけるような１つまたは２つの終止コドンを有するアミノ酸配列を続けることも可能である。
表３１は、ヒト好中球エラスターゼを阻害するために設計された６つのＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質であるＥｌｓｉｘの配列を示している。この配列は、ＴＦＰＩの二量体由来である。変異は、太字で示されている。Ｋｕｎｉｔｚドメイン１において、変異は、Ｋ１５Ｉ、Ｉ１７Ｆ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９ＰおよびＥ３９Ｑである。Ｋｕｎｉｔｚドメイン２において、変異は、Ｉ１３Ｐ、Ｒ１５Ｉ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ｆ、Ｉ１８Ｆ、Ｔ１９ＰおよびＬ３９Ｑである。Ｋｕｎｉｔｚドメイン３において、変異は、Ｌ１３Ｐ、Ｒ１５Ｉ、Ｎ１７Ｆ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｐ、Ｓ３６ＧおよびＧ３９Ｑである。Ｋｕｎｉｔｚドメイン４は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の繰り返しである；Ｋｕｎｉｔｚドメイン５は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２の繰り返しであり、Ｋｕｎｉｔｚドメイン６は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３の繰り返しである。２つの半分の部分を接続するリンカーは、ＧｌｙおよびＳｅｒから構成される。ｎとして示される６つのグリコシル化可能部位が存在する（Ｋｕｎｉｔｚドメイン２のＮ２５における部位、リンカー２におけるＮ１７における部位、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３におけるＮ４４における部位および改変ＴＦＰＩの第２のコピーにおける３つより多い部位）。
表２４は、ＴＦ８９０−６の成熟アミノ酸配列を示している。この分子は、各々がヒト好中球エラスターゼを阻害するように設計された６つの同一のＫｕｎｉｔｚドメインを有する。ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１は、変異Ｋ１５Ｉ、Ｉ１７Ｆ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９ＰおよびＥ３９Ｑによって改変されている。このアミノ酸配列をコードする２個以上のＥ２４ ＤＮＡ配列が存在する。好ましくは、Ｋｕｎｉｔｚドメインの各例は、遺伝的不安定性の可能性を回避するために異なるものであり得る。リンカーは、各々１２アミノ酸長であり、グリシンおよびセリンから構成される。この長さは、次のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ末端のアミノ酸と組み合わせた１つのＫｕｎｉｔｚドメインのカルボキシ末端のアミノ酸が、ＭＨＣ−Ｉに対するエピトープを形成しない程度の長さである。全体的にグリシンおよびセリンから構成されるペプチドは、ＭＨＣ−Ｉエピトープと密接に結合しない可能性がある。
分泌による発現のために、シグナル配列をコードする配列を、ＴＦ８９０−６をコードするＤＮＡの前に付加し得る。分泌による真核生物での発現のために、真核生物のシグナル配列を付加すること、および、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓまたは哺乳動物細胞においてタンパク質を発現することが可能である。ＴＦ８９０−６が、４０８アミノ酸を含むので、その分子量は、約４４．８ＫＤａであり、この分子量は、より少ないＫｕｎｉｔｚドメインを有するタンパク質と比べて、このタンパク質の血清滞留時間を延長し得る。
表２５は、５４８アミノ酸を含み、およその分子量が６０．３ＫＤａであり得るＴＦ８９０−８のアミノ酸配列を示している。ＴＦ８９０−８は、同一のアミノ酸配列の８つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む。このリンカーは、グリシンおよびセリンから作製されており、すべてが、１２アミノ酸長である。この分子は、ヒト好中球エラスターゼに対して一重特異的であるが、ＤＸ−８９０（分子量が約７ＫＤａである単一のＫｕｎｉｔｚドメイン）よりも長い半減期を有し得る。
同一のＤＮＡの複数のリピートを有することを回避するために、（ＴＦ８９０−リンカー）ｎ（ｎは、１〜１０であり得る）に対する遺伝子を以下のとおり操作することができる。表２８は、短いリンカー、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１の改変バージョン（１−５８番）および多くのリンカー（文字ａ−ｌ）をコードするＤＮＡを示している。これらの配列は、制限酵素消化を促進する配列を含むプライマーアニーリング配列と隣接している。表２８の最後に、ｄｓＤＮＡを生成するためにＰＣＲで使用され得るオリゴヌクレオチドがある。ＯＮＵＰＴＦ８９０およびＯＮＬＰＴＦ８９０は、上鎖（ｕｐｐｅｒ ｓｔｒａｎｄ）ＰＣＲプライマーおよび下鎖（ｌｏｗｅｒ ｓｔｒａｎｄ）ＰＣＲプライマーである。ＯＮＵＡＴＦ８９０およびＯＮＵＣＴＦ８９０は、トップ鎖（ｔｏｐ ｓｔｒａｎｄ）であり、ＯＮＬＢＴＦ８９０は、下鎖である。ＣＣの後ろで各鎖を切断するＢｓｕ３６ＩでｄｓＤＮＡを切断する。従って、重複は、上鎖における５’−ＴＣＡ−３’および下鎖における５’−ＴＧＡ−３’である。これは、ライゲーションによってトップ鎖が連結されることを意味する。本発明者らが、パリンドロームオーバーハングを生成する酵素を使用する場合、トップ鎖とボトム鎖（ｂｏｔｔｏｍ ｓｔｒａｎｄ）とがランダムに接続され得る。切断後、長い挿入断片は、複数の挿入断片の挿入に好ましい条件下で、適合するＢｓｕ３６Ｉ部位を有するベクターにライゲーションされる。Ｂｓｕ３６Ｉ挿入部位の外側のプライミング部位を使用して、本発明者らは、単離物をスクリーニングすることにより、３、４、５、６、７または８つの挿入断片を有するものを見つけ出す。そのベクターは、真核細胞、好ましくは、哺乳動物細胞において発現できるように設計され得る。表２８に示されるように、残基Ｓ３−Ｆ２０、Ｉ２５−Ｒ４７およびＣ５１−Ｘ＿ｈに対するコドンは、コードされたＫｕｎｉｔｚドメインアミノ酸配列を維持する様式で変更されるが、ＤＮＡの多様性を最大にする。リンカー中の残基は、ＧまたはＳのいずれかであり得る。従って、単位鎖は、正確に同一の短いセグメントを有する。
実施例６：Ｋｕｎｉｔｚドメインの安定化
ジスルフィド結合を有するＫｕｎｉｔｚドメインは、高濃度かつ３７℃における長期間の貯蔵においてオリゴマー化できる。オリゴマー化は、モノマー間でのジスルフィド交換から生じ得る。Ｃ１４−Ｃ３８ジスルフィドは、基準のＫｕｎｉｔｚドメインの表面上に露出しており、他のＫｕｎｉｔｚドメイン上のシステインと交換することにより、分子間結合が形成され得る。従って、標的プロテアーゼを阻害するが、オリゴマーを形成する可能性が低いＫｕｎｉｔｚドメインは、Ｃ１４−Ｃ３８ジスルフィドの除去によって設計され得る。特に、これらの位置におけるシステイン残基は、システイン以外のアミノ酸（例えば、アラニン、グリシンまたはセリン）に変異され得る。１つの実施形態において、それらの変異は、Ｃ１４ＧまたはＣ３８Ｖである。そのような変異Ｋｕｎｉｔｚドメインは、融解に関して安定性が低いことがあるが、多量体化に関しては安定性が高いことがある。
ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１は、変異Ｋ１５Ｉ、Ｉ１７Ｆ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９ＰおよびＥ３９Ｑによって、ヒト好中球エラスターゼの強力なインヒビターに操作され得る。１４−３８ジスルフィドを排除するために、Ｈａｇｉｈａｒａら（Ｈａｇｉｈａｒａら、２００２，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７：５１０４３−８）によって見出されたように変異Ｃ１４ＧおよびＣ３８Ｖが作製され得る。これにより、ヒト好中球エラスターゼへの結合性を低下させ得る。表２６は、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に対するディスプレイカセットを示しており、ここで、ヒト好中球エラスターゼに対する親和性をもたらすために、変異Ｋ１５Ｉ、Ｉ１７Ｆ、Ｍ１８ＦおよびＫ１９Ｐが作製される。さらに、１２、１３、１４、３８および３９位は、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸であり得る。これにより、２，４７６，０９９という多様性がもたらされる。ＮＨＫは、アミノ酸ＦＬＳＹ＜終止＞ＰＨＱＩＭＴＮＫＶＡＤＥをコードするのに対し、ＢＧＧは、アミノ酸ＷＲＧをコードすることに注意されたい。これらのコドンの両方を使用することによって、本発明者らは、Ｃｙｓ以外のすべてのアミノ酸を許容する。ＯＮＴＡＡＡｘＣは、ＮｃｏＩ制限酵素認識部位ならびにコドン１２、１３および１４においてＮＨＫを含むＴ２７までのコドンを有する。ＯＮＴＡＡＢｘＣは、１２および１３がＮＨＫであること、ならびに、１４がＢＧＧであることを除いて同じ範囲を網羅する。ＯＮＴＡＢＡｘＣは、１３にＢＧＧならびに１２および１４にＮＨＫを有する。ＯＮＴＡＢＢｘＣは、１３と１４の両方にＢＧＧおよび１２にＮＨＫを有する。ＯＮＴＢＡＡｘＣ、ＯＮＴＢＡＢｘＣ、ＯＮＴＢＢＡｘＣおよびＯＮＴＢＢＢｘＣはすべて、最初の４つのオリゴヌクレオチドと同じパターンで、１２にＢＧＧ、１３および１４にＮＨＫまたはＢＧＧを有する。従って、１２、１３および１４は、Ｃ以外の任意のＡＡであり得る。ＯＮＬｏＡＡｘＣは、コドンＲ２０〜Ｅ４９（ＸｂａＩ部位である）＋ｓｃａｂ ＤＮＡを網羅する。ＯＮＬｏＡＡｘＣが、下鎖であるので、ＮＨＫおよびＢＧＧの逆相補、すなわちＭＤＮおよびｃｃＶを有する。表２７は、このストラテジーを実施し得るオリゴヌクレオチドを示している。８つの長いオリゴヌクレオチドを混合し、短いオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して、ＮｃｏＩからＸｂａＩまでのＤＮＡを生成する。そのＰＣＲ産物をＮｃｏＩおよびＸｂａＩで切断し、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１またはＮｃｏＩおよびＸｂａＩ部位を有するその誘導体を含んでいるＤＹ３Ｐ８２のバージョンにライゲーションする。表２９は、Ｍ１３ ＩＩＩの断端上にＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を提示するファージベクターであるＤＹ３Ｐ８２ＴＦＰＩ１の注釈つきの配列を含む。ＤＹ３Ｐ８２ＴＦＰＩ１は、野生型Ｍ１３ ｉｉｉ遺伝子および、ａ）ディスプレイの発現が、グルコースによって抑制され得、ＩＰＴＧによって誘導され得るように、そしてｂ）ほとんどのファージが、１つ以下のＫｕｎｉｔｚドメイン：：ＩＩＩ断端タンパク質を提示するようにＰＬａｃによって調節されるディスプレイ遺伝子を有する。これにより、非常に好ましい結合物と単なる適切な結合物とを区別することが可能になる。本発明者らは、ヒト好中球エラスターゼに対する結合物をファージのライブラリーから選択する。ＤＸ−８９０が、ＫＤ約３ｐＭでヒト好中球エラスターゼと結合するので、非常にストリンジェントな洗浄を使用する。さらに、ＤＸ−８９０を溶出剤として使用してもよい。
１４−３８ジスルフィドを有さず、標的プロテアーゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを選択することができると予想される。一旦、高親和性の結合およびヒト好中球エラスターゼの阻害をもたらすアミノ酸配列が決定されると、実施例５に示されたような多量体のライブラリーを構築することができる。このアプローチは、任意のＫｕｎｉｔｚドメインならびに任意の標的プロテアーゼおよび複数の標的プロテアーゼに適用され得る。例えば、ヒト血漿カリクレインが標的である場合、１２、１３、１４、３８および３９位においてＤＸ−８８の配列を変化させることができ、様々なアミノ酸からＣｙｓのみが排除される。
実施例７：ＰＫおよび免疫原性研究のためのウサギＴＦＰＩの誘導体
表３２は、ウサギＴＦＰＩのアミノ酸配列を示している。表３３は、ウサギＴＦＰＩのｃＤＮＡを示している。表３４は、ウサギＴＦＰＩの操作された誘導体であるＲａＴＦＰＫＥ０１を示している。Ｋｕｎｉｔｚドメイン１において、変異は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１に対してヒトプラスミン阻害活性をもたらすように設計された、Ｙ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｋ１９ＤおよびＦ２１Ｗである。Ｋｕｎｉｔｚドメイン２において、変異は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン２に対してｈ．ｐＫａ１の阻害をもたらすように設計された、Ｉ１３Ｐ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ａ、Ｉ１８Ｈ、Ｔ１９ＰおよびＬ３９Ｅである。Ｋｕｎｉｔｚドメイン３において、変異は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン３に対してヒト好中球エラスターゼ阻害をもたらすように設計された、Ｌ１３Ｐ、Ｑ１５Ｉ、Ｎ１７Ｆ、Ｅ１８Ｆ、Ｉ１９Ｐ、Ｓ３６ＧおよびＧ３９Ｑである。Ｃ末端の基礎的なペプチドを切断する。このタンパク質は、ＰｌａＫａｌＥｌ０１と同じ様式でＣＨＯ細胞において産生され得る。このタンパク質は、約３０ＫＤａ＋糖鎖という分子量を有するはずである。６つのＮｘ（Ｓ／Ｔ）部位が存在し得るが、１つは、ＮＰＴであり、グリコシル化される可能性が低い。本発明者らは、第３のＫｕｎｉｔｚドメインを変化させ、リシンリッチのＣ末端ペプチドを除去したので、ＲａＴＦＰＫＥ０１は、妥当な半減期を有するはずであり、細胞に結合しないはずである。
表３６は、ＲａＴＦＰＫＥ０１をコードする遺伝子を示している。この配列は、ａ）シグナル配列、ｂ）ウサギＴＦＰＩ由来の第１のリンカー、ｃ）下線が引かれたシステインコドンおよび大文字の太字で示された変異を有するＫｕｎｉｔｚドメイン１、ｄ）第２のリンカー、ｅ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン２、ｆ）第３のリンカー、ｇ）Ｋｕｎｉｔｚドメイン３、およびｇ）最後のリンカーを示すように配置されている。表３７は、ウサギＴＦＰＩ ｃＤＮＡ由来の表３６の遺伝子を構築するために使用され得るオリゴヌクレオチドを示している。まず、ウサギＴＦＰＩ ｃＤＮＡならびにＯＮｒＳｆｉおよびＴｒｕｎｃＬｏを使用して、７７６塩基の産物ＰｒＴＦ１を生成する。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＳｆｉおよびＯＮｒＫ１Ｂｏｔとともに鋳型として使用することにより、１６２塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ２が生成される。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＫ１ＴｏｐおよびＯＮｒＫ２Ｂｏｔ１とともに鋳型として使用することにより、２３９塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ３が生成される。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＫ２Ｔｏ１およびＯＮｒＫ２Ｂ２とともに鋳型として使用することにより、１０３塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ４が生成される。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＫ２Ｔ２およびＯＮｒＫ３Ｂ１とともに鋳型として使用することにより、２３６塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ５が生成される。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＫ３Ｔ１およびＯＮｒＫ３Ｂ２とともに鋳型として使用することにより、９９塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ６が生成される。ＰｒＴＦ１は、ＯＮｒＫ３Ｔ２およびＯＮｒＸｂａＩＬとともに鋳型として使用することにより、１１７塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ７が生成される。ＰｒＴＦ２〜７を混合し、ＯＮｒＳｆｉおよびＯＮｒＸｂａＩＬをプライマーとして使用することにより、７９０塩基のオリゴヌクレオチドであるＰｒＴＦ８が生成され、それをＳｆｉＩおよびＸｂａＩで切断し、同様に切断された発現ベクターにライゲーションする。
表４０は、ウサギＴＦＰＩの誘導体である成熟ＲａＴＦＰＫＥ０４のアミノ酸配列を示している。ＲａＴＦＰＫＥ０４は、ＲａＴＦＰＫＥ０１の変異のすべてを有し、Ｋｕｎｉｔｚドメインの各々においてＣ１４ＧおよびＣ３８Ｖを有する。この目的は、ＲａＴＦＰＫＥ０１よりも凝集する可能性の低いタンパク質を作製することである。
表３５は、２コピーの成熟ＲａＴＦＰＫＥ０１をリンカー＝ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧＳＧＳＳＧと接続することにより形成される５０９ＡＡタンパク質であるＲａＴＦＰＫＥ０２のアミノ酸配列を示している。この成熟タンパク質は、約５６Ｋｄａ＋糖鎖という分子量を有するはずである。ＲａＴＦＰＫＥ０２は、ウサギにおいて長い半減期（ｈａｌｆ−ｌｉｋｅ）を有するはずであり、免疫原性を有しないはずである。表４１は、成熟ＲａＴＦＰＫＥ０５のアミノ酸配列を示している。ＲａＴＦＰＫＥ０５は、ＲａＴＦＰＫＥ０２と類似しているが、各Ｋｕｎｉｔｚドメインにおいて、Ｃ１４は、Ｇに変更され、Ｃ３８は、Ｖに変更されている。ＲａＴＦＰＫＥ０５は、ＲａＴＦＰＫＥ０２よりも凝集する可能性が低い。
実施例８：ｈＮＥ、ｈＰｒ３およびｈＧａｔＧに対するインヒビター
好中球は、活性化されたとき、３つのセリンプロテアーゼ：好中球エラスターゼ（ｈＮＥ，白血球エラスターゼとしても知られる）、プロテイナーゼ３（Ｐｒ３）およびカテプシンＧ（ＣａｔＧ）を放出する。過剰な好中球の活性化によって引き起こされる損傷を阻止するために、これらのプロテアーゼの２つ以上、例えば、各々親和性および特異性が高い３つすべてのプロテアーゼを阻害する薬剤を使用することができる。ヒト好中球エラスターゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインが知られている。ＣａｔＧのインヒビターは、Ｋｕｎｉｔｚドメインのライブラリーからのセレクションによって得ることができる（米国特許第５，５７１，６９８号）。ＰＲ３に対するインヒビターは、同様の様式でＫｕｎｉｔｚドメインライブラリーから得ることができた。
１つの実施形態において、次いで、Ｐｒ３阻害活性をもたらすアミノ酸残基（ｒｅｓｉｄｅｓ）は、別のＫｕｎｉｔｚドメイン、例えば、マルチドメインタンパク質（例えば、３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質）のＫｕｎｉｔｚドメインに転移され得る。ＣａｔＧ阻害活性をもたらすアミノ酸残基は、同様に、そのタンパク質の別のＫｕｎｉｔｚドメインに転移され得る。ｈＮＥ阻害活性をもたらすアミノ酸残基は、第３のドメインに転移され得る。
別の実施形態において、好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧを阻害するＫｕｎｉｔｚドメインは、例えば、様々なＫｕｎｉｔｚドメインを含む融合タンパク質を形成することによって互いに物理的に会合する。
いくつかの実施形態において、操作されたタンパク質は、細胞に結合せず、また、以下の特性：（ａ）好中球ディフェンシンの存在下で機能する能力、（ｂ）ＭＴ６−ＭＭＰ（ロイコリジン）による分解に耐える能力、（ｃ）陰イオン性表面に結合したプロテアーゼを阻害する能力、（ｄ）好中球からのＩＬ−８の産生ならびに単球からのＴＮＦαおよびＩＬ−１βの産生を減少させる能力の１つ以上（例えば、以下の２、３または４つ）を有し得る。
実施例９：動物における薬物動態
以下の方法を使用して、動物、例えば、マウスおよびウサギにおけるタンパク質（例えば、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質）の薬物動態（ＰＫ）を評価することができる。
試験されるタンパク質を、ヨードジェン（ｉｏｄｏｇｅｎ）法（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してヨウ素（１２５Ｉ）で標識する。反応チューブを反応緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．４Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．５）ですすぐ。そのチューブを空にし、次いで、０．１ｍｌの反応緩衝液および１２μＬの無担体ヨウ素−１２６，約１．６ｍＣｉを加える。６分後、活性化ヨウ素を、試験されるタンパク質を含むチューブに移す。９分後、反応を２５μＬの飽和チロシン溶液で終結させる。反応物を、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ中の５ｍｌのＤ−塩ポリアクリルアミド６０００カラムによって生成することができる。ＨＳＡを使用して、ゲルへの固着を最小限にすることができる。
十分な数のマウス（約３６匹）を入手する。各動物の体重を記録する。マウスの場合、それらの動物の尾静脈に約５μｇの試験タンパク質を注射する。注射の約０、７、１５、３０および９０分、４時間、８時間、１６時間および２４時間後に、１匹につき１時点（１時点あたり４匹）でサンプルを回収する。サンプル（約０．５ｍｌ）を抗凝血剤（０．０２ｍｌのＥＤＴＡ）中に回収する。細胞を遠心分離し、血漿／血清と分離する。放射線計測およびインライン放射線検出によるＨＰＬＣにおけるＳＥＣペプチドカラムによって、サンプルを解析することができる。
ウサギの場合、材料を耳静脈に注射する。注射の０、７、１５、３０、９０分、４、８、１６、２４、４８、７２、９６、１２０および１４４時間後に、サンプルを回収し得る。マウスの場合と同様に、サンプルを回収および解析し得る。
データを、インビボクリアランスの「速い」、「遅い」および「最も遅い」期を説明する二指数関数的崩壊曲線（方程式１）または三指数関数的崩壊曲線（方程式２）に当てはめることができる：
Figure 2009521926
 ここで：
ｙ＝その時点（＝投与後のｔ）における血漿中に残存する標識の量
Ａ＝「速い」クリアランス期における総標識
Ｂ＝「遅い」クリアランス期における総標識
Ｃ＝「最も遅い」クリアランス期における総標識
α＝「速い」クリアランス期の崩壊定数
β＝「遅い」クリアランス期の崩壊定数
γ＝「最も遅い」クリアランス期の崩壊定数
ｔ＝投与後の時間
以下のように、α、βおよびγ期の崩壊定数をそれぞれの期に対する半減期に変換することができる：
α期半減期＝０．６９（１／α）
β期半減期＝０．６９（１／β）
γ期半減期＝０．６９（１／γ）
二指数関数的な方程式を使用してデータを当てはめる場合において、αおよびβ期を通じてのインビボ循環からクリアランスされる総標識のパーセンテージは、以下のとおり算出される：
％α期＝［Ａ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
％β期＝［Ｂ／（Ａ＋Ｂ）］×１００
三指数関数的な方程式を使用してデータを当てはめる場合において、αおよびβ期を通じてのインビボ循環からクリアランスされる総標識のパーセンテージは、以下のとおり算出される：
％α期＝［Ａ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）］×１００
％β期＝［Ｂ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）］×１００
％γ期＝［Ｃ／（Ａ＋Ｂ＋Ｃ）］×１００
実施例１０：正に帯電したＣ末端領域を除いたＴＩＦＰをコードする遺伝子
表５０は、ＣＨＯ細胞における発現に最適化され、ｈＴＦＰＩｍＣ１をコードする遺伝子を示している。ｈＴＦＰＩｍＣ１は：ａ）シグナル配列、ｂ）シグナルペプチダーゼによる切断によってもたらされる短いリンカー、ｃ）コードされるマルチＫｕＤｏｍタンパク質の精製を容易にする６−ｈｉｓタグ、ｄ）トロンビン切断部位、ｅ）ＴＦＰＩ２−２７０に対応するコドンを含む。この遺伝子は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において発現され得る。コドン２７１〜３０４は、排除されている。残基２７１〜３０４は、ＴＦＰＩが、細胞表面に結合すること、内部移行することおよび遺伝子発現を変化させることに関与する。これらの効果は、治療的なプロテアーゼインヒビターにおいて不要である。ｈＴＦＰＩｍＣ１は、Ｈｉｓ６タグを介して銅キレート樹脂上で精製され得る。このＨｉｓタグは、Ｒ３８の後ろで切断するはずのトロンビンによる処理によって除去可能である。
表５３は、真核細胞において発現できるように、表５０の遺伝子を含むベクターのＤＮＡを示している。表５６は、ｈＴＦＰＩｍＣ１のアミノ酸配列を示している。Ｎ結合型グリコシル化が予想されるＡｓｎ残基は、上に「＊」を伴う太字のＮで示される。
ｈＴＦＰＩｍＣ１は、表５３に示されるベクターで形質転換されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現した。そのタンパク質をアフィニティークロマトグラフィで精製し、そして、サンプルをゲルクロマトグラフィで解析し、見かけの分子量が約４２．５ｋＤａであると示された。
ｈＴＦＰＩｍＣ１の細胞表面との結合をフローサイトメトリーによって試験したところ、検出可能な（バックグラウンドよりも高い）細胞表面との結合は示されなかった。
実施例１１：改変ＴＦＰＩ，ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］
表５１は、ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］に対する注釈つきの遺伝子を示している。ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］は、ヒトプラスミン（ｈＰｌａ）を阻害するように改変されたＴＦＰＩの第１のＫｕＤｏｍ、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）を阻害するように改変された第２のＫｕＤｏｍおよびヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を阻害するように改変された第３のＫｕＤｏｍを有する。これらの特異性を達成するために、以下の変異を作製した。第１のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、抗プラスミン活性をもたたらす変異Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９ＤおよびＦ２１Ｗを作製した。第２のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、抗血漿カリクレイン活性をもたたらす変異Ｉ１３Ｐ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ａ、Ｉ１８Ｈ、Ｔ１９Ｐ、Ｙ２１Ｗ、Ｋ３４ＩおよびＬ３９Ｅを作製した。第３のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、抗ヒト好中球エラスターゼ活性をもたたらす変異Ｌ１３Ｐ、Ｒ１５Ｉ、Ｎ１７Ｆ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｐ、Ｋ３４Ｐ、Ｓ３６ＧおよびＧ３９Ｑを作製した。表５４は、ＣＨＯ細胞などの真核細胞において、表５１に示される遺伝子の発現を可能にするベクターのＤＮＡ配列を示している。表５７は、注釈つきのｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］のアミノ酸配列を示している。ＫｕＤｏｍの各々に対して、野生型ＡＡを実際のＡＡ配列の下に示す。このタンパク質が、切断型であり、また、第３のＫｕＤｏｍが、改変されているので、細胞表面に結合しないと予想される（上記の実施例１０を参照のこと）。ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］は、ヒトプラスミン（ｈ．Ｐｌａ）、ヒト血漿カリクレイン（ｈ．ｐＫａｌ）およびヒト好中球エラスターゼ（ｈＮＥ）を強く阻害すると予想される。
実施例１２：Ｐｌａ３０１Ｂ，ヒトプラスミンの３重インヒビター
表５２は、ヒトＴＦＰＩ由来であり、３つのＫｕＤｏｍ（各々が、ｈ．Ｐｌａを阻害するように設計されている）を有するタンパク質であるＰｌａ３０１Ｂをコードする遺伝子を示している。表５５は、真核細胞におけるＰｌａ３０１Ｂの発現を可能にするベクターの配列を示している。表５８は、Ｐｌａ３０１Ｂのアミノ酸配列を示している。Ｐｌａ３０１Ｂに対して抗ｈ．Ｐｌａ活性をもたらすために、本発明者らは、以下の変異を作製した。第１のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、変異Ｋ１５Ｒ、Ｉ１７Ｒ、Ｍ１８Ｆ、Ｋ１９Ｄ、Ｆ２１Ｗを作製した。第２のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、変異Ｉ１３Ｐ、Ｇ１６Ａ、Ｙ１７Ｒ、Ｉ１８Ｆ、Ｔ１９Ｄ、Ｙ２１ＷおよびＫ３４Ｉを作製した。第３のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、変異Ｌ１３Ｐ、Ｎ１７Ｒ、Ｅ１８Ｆ、Ｎ１９Ｄ、Ｆ２１Ｗ、Ｋ３４Ｉ、Ｓ３６ＧおよびＧ３９Ｅを作製した。各ＫｕＤｏｍは、ｈ．Ｐｌａの強力なインヒビターであるはずである。
ヒトプラスミンは、ウロキナーゼタイププラスミノゲンアクチベーター（ｕＰＡ）によって活性化されることが知られている。ｕＰＡは、ウロキナーゼタイププラスミノゲンアクチベーターレセプター（ｕＰＡ−Ｒ）によって細胞表面に結合していることが多い。ｕＰＡ−ｕＰＡ−Ｒ複合体によって活性化されるｈ．Ｐｌａは、プラスミンレセプター（Ｐｌａ−Ｒ）に結合することが多い。
Ｐｌａ３０１Ｂは、表５５に示されるベクターを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞において発現した。このタンパク質をプラスミン阻害についてアッセイし、そして、活性であることが見出された。
実施例１３：プラスミン、マトリプターゼおよびヘプシンを阻害するマルチプルＫｕＤｏｍインヒビター
ＨＡＩ−１は、Ｋｕｎｉｔｚドメイン１を介して（Ｋｉｒｃｈｈｏｆｅｒら、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２００５ ５７９（９）：１９４５−５０）マトリプターゼを阻害する（Ｈｅｒｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２００５ ３９０（Ｐｔ１）：１２５−３６．）（ＨＡＩ−１Ｂの第１のＫｕｎｉｔｚドメインは、ＨＡＩ−１の第１のＫｕｎｉｔｚドメインと同一である）。ＨＡＩ−２のドメイン１は、ヘプシンを阻害する（Ｐａｒｒ ａｎｄ Ｊｉａｎｇ，Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００６ Ｓｅｐ １；１１９（５）：１１７６−８３）。表６１は、プラスミン、マトリプターゼおよびヘプシンを阻害するように設計されているタンパク質であるＰｌａＭａｔＨｅｐのアミノ酸配列を示している。ＴＦＰＩの第１のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、Ｋ１５をＲに、Ｉ１７をＲに、Ｍ１８をＦに、Ｋ１９をＤに、そしてＦ２１をＷに変異させた。これは、表７に示されるＤＸ−１０００（プラスミンの強力なインヒビター）に相当する。第２のＫｕＤｏｍにおいて、本発明者らは、Ｉ１３をＲに、Ｙ１７をＳに、Ｉ１８をＦに、Ｔ１９をＰに、Ｙ２１をＷに、Ｅ３１をＫに、Ｒ３２をＳに、そしてＫ３４をＶに変異させた。変異したドメインを、ＴＦＰＩ−Ｋ２ｍａｔｒとして表７に示し、野生型ＡＡを小文字、変異を大文字で示す。これらの変化によって、マトリプターゼの強力なインヒビターであるＰｌａＭａｔＨｅｐの第２のドメインが作製されるはずである。ＴＦＰＩの第３のドメインにおいて、本発明者らは、Ｒ１１をＶに、Ｌ１３をＲに、Ｎ１７をＳに、Ｅ１８をＭに、Ｎ１９をＰに、Ｆ２１をＷに、Ｋ３４をＶに、Ｓ３６をＧに、Ｅ４２をＳに、そしてＫ４８をＥにする変異を作製した。Ｋ４８Ｅ変異は、グリコアミノグリカン（ｇｌｙｃｏａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ）と結合する機会を減少させる。これらの変化をＴＦＰＩ−Ｋ３ｈｅｐとして表７に示し、これらの変化により、ヘプシンの強力なインヒビターであるＰｌａＭａｔＨｅｐの第３のドメインが作製されるはずである。表６１に示されるタンパク質を発現する遺伝子は、本明細書中に示される他のＴＦＰＩ誘導体の遺伝子から容易に構築される。
表
表１：ヒトＬＡＣＩ（ＴＦＰＩ）
Figure 2009521926
 表２：ヒトＬＡＣＩ（ＴＦＰＩ）におけるＫｕＤｏｍのＡＡ配列
Figure 2009521926
 表３：ヒトＬＡＣＩ（ＴＦＰＩ）のｃＤＮＡ
Figure 2009521926
 表４：ｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ１の注釈つきのＤＮＡ配列
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５：ヒト血漿カリクレインのインヒビターであるＤＸ−８８のＡＡ配列
Figure 2009521926
 表６：ＤＸ−８８をコードするＤＮＡ
Figure 2009521926
 表７：様々なＢＰＴＩ関連ＫｕＤｏｍの比較
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表８：ＤＸ：８８遺伝子
Figure 2009521926
 表９：ｐＦＴＦＰＩ＿Ｖ２における発現用のＴＦ８８８９０をコードする遺伝子
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表１０：成熟ＴＦＰＩ（１−１７４）のＫｕＤｏｍ１およびＫｕＤｏｍ２のリモデリングに対するＯＮ
（すべてのＯＮは、５’から３’に記載される）
変異は、小文字の太字で示される。制限酵素認識部位は、大文字の太字である。
Figure 2009521926
 表１１：ＴＦＰＩ−２
Figure 2009521926
 表１２：ＴＦＰＩ２ ＫｕＤｏｍ２のライブラリー
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表１３：ＴＦＰＩ２ ＫｕＤｏｍ２を提示するディスプレイファージのＤＮＡ
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表１４：ＴＦＰＩ２ ＫｕＤｏｍ２のライブラリーを作製するためのＯＮ
Figure 2009521926
 表１５：表４に示される改変ｔｆｐｉ遺伝子を構築するためのＯＮ
Figure 2009521926
 プライマーは、Ｕ／Ｌ欄に示されるとおりの上鎖（Ｕ）または下鎖（Ｌ）である。「Ｌｅｎ」は、鋳型としてヒトｔｆｐｉ ｃＤＮＡおよびプライマーのＵ−Ｌ対とともに得られる産物の長さを示す。
大文字の塩基は、公開されているｃＤＮＡ配列から逸脱したものを示す。制限部位を太字で示す。２つの制限酵素認識部位が重複している場合、一方に下線を引いた。
表１６：改変ヒトＴＦＰＩ＝ＰｌａＫａｌＥｌ０１
Figure 2009521926
 グリコシル化可能部位を「ｎ」として示す。
表１７：ＰｌａＫａｌＥｌ０１をコードする遺伝子を構築するためのＯＮ
Figure 2009521926
 表１８：ＰｌａＫａｌＥ１０１：：（ＧＧＳ）４ＧＧ：：ｈＳＡ
Figure 2009521926
 グリコシル化可能部位を「ｎ」として示す。
表１９：改変ヒトＴＦＰＩ二量体＝ＰＫＥＰＫＥ０２
Figure 2009521926
 グリコシル化可能部位を「ｎ」として示す。
表２０ ＴＦ８８８９０−２
Figure 2009521926
 表２１ ＴＦ８８８９０−３
Figure 2009521926
 表２２ ＴＦ８８８９０−４
Figure 2009521926
 表２３ ＴＦ８８８９０−５
Figure 2009521926
 表２４ ＴＦ８９０−６
Figure 2009521926
 表２５ ＴＦ８９０−８
Figure 2009521926
 表２６：１４−３８ジスルフィドの除去のためのライブラリー
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表２７：１４−３８ジスルフィドを欠損したＫｕＤｏｍライブラリーを構築するためのオリゴヌクレオチド
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表２８：定常ＡＡ配列以外の遺伝的多様性のためのライブラリー
リンカーを有するＤＸ−８９０様ＴＦＰＩ Ｋ１ドメインをコードする遺伝子
ヌルライブラリー−ＤＮＡレベルでの多様性，すべてが同じＡＡ配列をコードする
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表２９：ＴＦＰＩ ＫｕＤｏｍ１および誘導体を提示するファージベクター
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表３０：改変ヒトＴＦＰＩ＝ＰｌａＫａｌＥ１０２
Figure 2009521926
 野生型からの変異を太字の大文字で示す。
グリコシル化可能部位を「ｎ」として示す。
表３１：改変ヒトＴＦＰＩ二量体＝ＥＬｓｉｘ
Figure 2009521926
 野生型からの変異を太字の大文字で示す。
グリコシル化可能部位を「ｎ」として示す。
表３２：ウサギＴＦＰＩのＡＡ配列
Figure 2009521926
 表３３：ウサギＴＦＰＩのｃＤＮＡ配列
Figure 2009521926
 表３４：ウサギＴＦＰＩの誘導体であるＲａＴＦＰＫＥ０１のＡＡ配列
Figure 2009521926
 表３５：ウサギＴＦＰＩの誘導体であるＲａＴＦＰＫＥ０２のＡＡ配列
Figure 2009521926
 Ｎは、グリコシル化され得る。
表３６：ｒａｔｆｐｋｅ０１のＤＮＡ
Figure 2009521926
 表３７：ウサギｔｆｐｉからｒａｔｆｐｋｅ０１を作製するためのオリゴヌクレオチド
すべてのオリゴヌクレオチドが、５’→３’である
Figure 2009521926
 表３８：米国特許第６，５８３，１０８号の表４Ｂ
リフォールディングされたビクニン（７−６４）による様々なプロテアーゼの阻害に対するＫｉ値
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表３９：米国特許第６，５８３，１０８号からのビクニンのＡＡ配列
Figure 2009521926
 表４０：ウサギＴＦＰＩの誘導体であるＲａＴＦＰＫＥ０４のＡＡ配列
Figure 2009521926
 Ｎは、グリコシル化され得る。
表４１：ウサギＴＦＰＩの誘導体であるＲａＴＦＰＫＥ０５のＡＡ配列
Figure 2009521926
 表４４：ＤＸ−８９０のアミノ酸配列
Figure 2009521926
 表４５：ＤＸ−１０００のアミノ酸配列
Figure 2009521926
 表５０：Ｃ末端領域を除いた、最適化されたタグ化野生型ＴＦＰＩであるｈＴＦＰＩｍＣ１
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５１：プラスミン、ｐＫａｌおよびｈＮｅを阻害するＴＦＰＩである、ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５２：ＰＬＡ３０１Ｂ
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５３：Ｃ末端領域を除いた、最適化されたタグ化野生型ＴＦＰＩをコードするベクター
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５４：プラスミン、ｐＫａｌおよびｈＮｅを阻害するＴＦＰＩに対するベクター
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５５：ＤＸＭＭＭを含むベクター
Figure 2009521926
Figure 2009521926
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Figure 2009521926
 表５６：ｈＴＦＰＩｍＣ１のＡＡ配列
Figure 2009521926
 表５７：ｈＴＦＰＩ［ＰｐＫｈＮＥ］のＡＡ配列
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表５８：ＰＬＡ３０１Ｂのアミノ酸配列
Figure 2009521926
 表６０：１９個のヒトＫｕＤｏｍを含む１０３個のＫｕＤｏｍにおけるＡＡタイプの分布
Figure 2009521926
Figure 2009521926
Figure 2009521926
 表６１：プラスミン、マトリプターゼおよびヘプシンを阻害する改変ヒトＴＦＰＩであるＰｌａＭａｔＨｅｐ
Figure 2009521926
 他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。

Claims (84)

  1. １つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含み、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する、単離されたタンパク質。
  2. 各々が１０ｎＭ未満のＫｉで前記２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  3. 各々が１ｎＭ未満のＫｉで前記２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  4. 前記操作されたプロテアーゼ阻害性配列として、２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する単一の操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  5. 前記単一の操作されたＫｕｎｉｔｚドメインが、各々が１０ｎＭ未満のＫｉで２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害する、請求項４に記載のタンパク質。
  6. 前記操作されたプロテアーゼ阻害性配列として少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  7. ３つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項６に記載のタンパク質。
  8. ４つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項６に記載のタンパク質。
  9. ５つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項６に記載のタンパク質。
  10. 少なくとも６つのＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項６に記載のタンパク質。
  11. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインの少なくとも１つが、天然に存在するヒトＫｕｎｉｔｚドメインのフレームワークを含むが、プロテアーゼ結合ループ中の少なくとも１つの残基において該天然に存在するヒトＫｕｎｉｔｚドメインと異なる、請求項６に記載のタンパク質。
  12. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインの少なくとも１つが、ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインのフレームワークを含むが、プロテアーゼ結合ループ中の少なくとも１つの残基において該ＴＦＰＩ Ｋｕｎｉｔｚドメインと異なる、請求項１１に記載のタンパク質。
  13. 少なくとも１５キロダルトンの分子量を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  14. 少なくとも３０分というβ相半減期を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  15. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインの少なくとも１つが、ジスルフィド結合を２つだけ含む、請求項１に記載のタンパク質。
  16. ２つ以上のＰＥＧ部分で改変されている、請求項１に記載のタンパク質。
  17. 好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧからなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  18. 好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３およびカテプシンＧを阻害する、請求項１７に記載のタンパク質。
  19. 関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病、癌および慢性閉塞性肺障害からなる群から選択される障害の原因となる過剰な活性を有する２つ以上のプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  20. 前記タンパク質が、少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメイン、好中球エラスターゼに特異的な第１のＫｕｎｉｔｚドメインおよびプロテイナーゼ３に特異的な第２のＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項１７に記載のタンパク質。
  21. 前記第１のＫｕｎｉｔｚドメインが、前記第２のＫｕｎｉｔｚドメインのＣ末端側である、請求項２０に記載のタンパク質。
  22. ヒト血漿カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  23. ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧおよびトリプターゼの２つ以上を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  24. ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）、ヒトカリクレイン８（ｈＫ８）およびヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）の２つ以上を阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  25. ｈＫ６およびヒト好中球エラスターゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  26. ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト血漿カリクレインを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  27. プラスミン、ヘプシン、マトリプターゼ、エンドセリアーゼ１およびエンドセリアーゼ２からなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  28. 前記タンパク質が、１０ｎＭ未満のＫｉで各々のプロテアーゼを阻害する、請求項１７、１８または２２〜２７に記載のタンパク質。
  29. （ｉ）ＤＸ−８８またはＤＸ−８８のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも９０％を含むＫｕｎｉｔｚドメイン、および（ｉｉ）ＤＸ−８９０またはＤＸ−８９０のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも９０％を含むＫｕｎｉｔｚドメインを含む、請求項１に記載のタンパク質。
  30. 少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その各々が、ＤＸ−８８またはＤＸ−８８のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも９０％を含むＫｕｎｉｔｚドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
  31. 少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含み、その各々が、ＤＸ−８９０またはＤＸ−８９０のプロテアーゼ結合ループ中のアミノ酸残基の少なくとも９０％を含むＫｕｎｉｔｚドメインである、請求項１に記載のタンパク質。
  32. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、互いに異なる、請求項６に記載のタンパク質。
  33. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、可撓性親水性リンカーによって接続されている、請求項６に記載のタンパク質。
  34. 前記リンカーが、１５アミノ酸長未満であり、少なくとも２つのグリシン残基を含む、請求項３３に記載のタンパク質。
  35. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、血清アルブミン部分によって分断されていない、請求項６に記載のタンパク質。
  36. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、Ｔ細胞エピトープを含まないリンカーによって接続されている、請求項６に記載のタンパク質。
  37. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、中型から大型の疎水性残基および荷電残基を有しないリンカーによって接続されている、請求項６に記載のタンパク質。
  38. 前記少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインが、グリコシル化部位を含むリンカーによって接続されている、請求項６に記載のタンパク質。
  39. ３個未満のグリコシル化部位を有する、請求項１に記載のタンパク質。
  40. グリコシル化部位を有しない、請求項１に記載のタンパク質。
  41. Ｎ結合型グリコシル化部位を有しない、請求項１に記載のタンパク質。
  42. 好中球ディフェンシンの存在下で前記ヒトプロテアーゼを阻害する、請求項１に記載のタンパク質。
  43. ＭＴ６−ＭＭＰ（ロイコリジン）による分解に耐性である、請求項１に記載のタンパク質。
  44. ＭＭＰ−８またはＭＭＰ−１２によって認識される切断部位を含まない、請求項１に記載のタンパク質。
  45. 前記プロテアーゼ阻害性配列が、ヒトプロテアーゼに結合して阻害する２０アミノ酸未満のペプチドのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  46. 前記プロテアーゼ阻害性配列が、軽鎖可変ドメインとともにヒトプロテアーゼに結合して阻害する重鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
  47. 第ＶＩＩａ因子と第Ｘａ因子の両方を阻害しない、請求項１に記載のタンパク質。
  48. ビクニンと少なくとも２つのアミノ酸が異なる、請求項１に記載のタンパク質。
  49. 被験体を処置する方法であって、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のタンパク質を該被験体に投与する工程を含む方法であり、ここで、該被験体は、少なくとも２つの異なるプロテアーゼによって引き起こされるプロテアーゼ活性を低下させる必要がある、方法。
  50. 第１および第２のヒトプロテアーゼが原因となるヒト障害を処置する方法であって、複数のＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質の有効量を被験体に投与する工程を含む方法であり、該複数のＫｕｎｉｔｚドメインは、第１のヒトプロテアーゼを特異的に阻害するＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを特異的に阻害するＫｕｎｉｔｚドメインを含む、方法。
  51. （ｉ）ヒトセリンプロテアーゼを阻害するＫｕｎｉｔｚドメイン、および（ｉｉ）メタロプロテアーゼの結合性および阻害に寄与するポリペプチド配列を含む、単離されたタンパク質。
  52. １本のポリペプチド鎖からなる、請求項５１に記載のタンパク質。
  53. メタロプロテアーゼの結合性および阻害に寄与する前記ポリペプチド配列が、メタロプロテアーゼと結合して阻害する抗原結合フラグメントの可変ドメインを含む、請求項５１に記載のタンパク質。
  54. 少なくとも２本のポリペプチド鎖を含み、一方のポリペプチド鎖は、前記抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインを含み、他方のポリペプチド鎖は、該抗原結合フラグメントの軽鎖可変ドメインを含む、請求項５３に記載のタンパク質。
  55. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、前記抗原結合フラグメントの重鎖可変ドメインと同じポリペプチド鎖の構成要素である、請求項５４に記載のタンパク質。
  56. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、前記抗原結合フラグメントの軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド鎖の構成要素である、請求項５４に記載のタンパク質。
  57. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、前記抗原結合フラグメントの定常ドメインのＣ末端側である、請求項５３に記載のタンパク質。
  58. ２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質を提供する方法であって：
    第１のヒトプロテアーゼを阻害する第１のＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを阻害する第２のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列を提供する工程；
    複数のＫｕｎｉｔｚドメインを含むレシピエントタンパク質のアミノ酸配列を提供する工程；および
    該レシピエントタンパク質の改変アミノ酸配列をコードする核酸を調製する工程であって、ここで、該レシピエントタンパク質は、（ａ）該レシピエントタンパク質中の該Ｋｕｎｉｔｚドメインの１つのアミノ酸が、該第１のＫｕｎｉｔｚドメインの結合性または特異性に寄与するアミノ酸残基と置換され、そして（ｂ）該レシピエントタンパク質中の該Ｋｕｎｉｔｚドメインの別のアミノ酸が、該第２のＫｕｎｉｔｚドメインの結合性または特異性に寄与するアミノ酸残基と置換されるように改変されている、工程
    を含む、方法。
  59. ２つ以上のヒトプロテアーゼを阻害するタンパク質を提供する方法であって：
    第１のヒトプロテアーゼを阻害する第１のＫｕｎｉｔｚドメインおよび第２のヒトプロテアーゼを阻害する第２のＫｕｎｉｔｚドメインのアミノ酸配列を提供する工程；ならびに
    該第１および第２のＫｕｎｉｔｚドメインをコードする配列がインフレームであり、かつリンカー配列をコードする配列によって分断されているポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを調製する工程であって、ここで、（ａ）該リンカーは、中型または大型の疎水性残基も荷電残基も含まないか、または（ｂ）ＭＨＣ Ｉエピトープは、該第１および第２のＫｕｎｉｔｚドメイン由来の該第１および第２のＫｕｎｉｔｚドメインならびに該リンカー由来のアミノ酸によって形成されない工程、
    を含む、方法。
  60. 前記第１および第２のヒトプロテアーゼが、単一のヒト疾患の原因となる、請求項５８または５９に記載の方法。
  61. 前記調製された核酸を細胞中で発現させる工程をさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
  62. 薬学的組成物として、前記調製された核酸によってコードされるタンパク質を製剤化する工程をさらに含む、請求項５８または５９に記載の方法。
  63. 関節リウマチを処置する方法であって、該方法は：関節リウマチを有するかまたは関節リウマチを有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該タンパク質は、ヒト血漿カリクレイン、ヒト組織カリクレインおよびヒト好中球エラスターゼからなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する、方法。
  64. 前記タンパク質が、マトリクスメタロプロテアーゼ−（ＭＭＰ−）１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−１３からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼをさらに阻害する、請求項６３に記載の方法。
  65. 肺の炎症性障害を処置する方法であって、該方法は：肺の炎症性障害を有するかまたは肺の炎症性障害を有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該タンパク質は、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３、カテプシンＧおよびトリプターゼからなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する、方法。
  66. 前記タンパク質は、マトリクスメタロプロテアーゼ−（ＭＭＰ−）９およびＭＭＰ−１２からなる群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼをさらに阻害する、請求項６５に記載の方法。
  67. 前記肺の炎症性障害が、慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）であり、前記少なくとも２つのプロテアーゼは、ヒト好中球エラスターゼ、プロテイナーゼ３（ＰＲ３）およびカテプシンＧからなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
  68. 多発性硬化症を処置する方法であって、該方法は：多発性硬化症を有するかまたは多発性硬化症を有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該タンパク質は、ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）、ヒトカリクレイン８（ｈＫ８）およびヒトカリクレイン１０（ｈＫ１０）からなる群から選択される少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する、方法。
  69. 脊髄損傷を処置する方法であって、該方法は：脊髄損傷を有するかまたは脊髄損傷を有すると疑われる被験体に、１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該タンパク質は、ヒトカリクレイン６（ｈＫ６）とヒト好中球エラスターゼの両方を阻害する、方法。
  70. 炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を処置する方法であって、該方法は：炎症性腸疾患を有するかまたは炎症性腸疾患を有すると疑われる被験体に、少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該２つのプロテアーゼは、血漿カリクレイン、ヒト組織カリクレイン（ｈ．Ｋ１）およびヒト好中球エラスターゼからなる群から選択される、方法。
  71. 前記ＩＢＤが、クローン病である、請求項７０に記載の方法。
  72. 前記タンパク質が、マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）をさらに阻害する、請求項７０に記載の方法。
  73. 前記タンパク質が、マトリクスメタロプロテアーゼ９（ＭＭＰ−９）をさらに阻害する、請求項７１に記載の方法。
  74. 急性膵炎を処置する方法であって、該方法は：急性膵炎を有するかまたは急性膵炎を有すると疑われる被験体に、少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、ここで、該２つのプロテアーゼは、ヒトトリプシン１、ヒトトリプシン２、ヒト膵臓キモトリプシンおよびヒト膵臓エラスターゼからなる群から選択される、方法。
  75. 癌を処置する方法であって、該方法は：
    癌を有するかまたは癌を有すると疑われる被験体に、少なくとも２つのプロテアーゼを阻害する１つ以上の操作されたプロテアーゼ阻害性配列を含むタンパク質の有効量を投与する工程を含み、該２つのプロテアーゼは、ヒトプラスミン、ヒトヘプシン、ヒトマトリプターゼ、ヒトエンドセリアーゼ１およびヒトエンドセリアーゼ２からなる群から選択される、方法。
  76. 前記２つのプロテアーゼが、ヒトプラスミン、ヒトヘプシンおよびヒトマトリプターゼからなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
  77. 血漿カリクレイン、ヒト好中球エラスターゼおよびプラスミンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼを阻害する操作されたＫｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質であって、ここで、該Ｋｕｎｉｔｚドメインは、１４−３８ジスルフィドを有しない、タンパク質。
  78. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインの結合ループが、ＤＸ−８８、ＤＸ−８９０またはＤＸ−１０００の結合ループと同一である、請求項７７に記載のタンパク質。
  79. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、ＤＸ−８８、ＤＸ−８９０またはＤＸ−１０００と少なくとも９５％同一であるが、システイン１４およびシステイン３８に相当する位置においてシステインを含まない、請求項７７に記載のタンパク質。
  80. 複数のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドのライブラリーであって、該ポリヌクレオチドの各々は、１４位および３８位に相当する位置においてシステインを有しないＫｕｎｉｔｚドメインをコードする配列を含み、該Ｋｕｎｉｔｚドメインの第１および／または第２の結合ループ中の１つ以上の残基が、該複数のポリヌクレオチド間で異なるように、該複数のポリヌクレオチドが異なる、ライブラリー。
  81. ウシ膵臓トリプシンインヒビター（ＢＰＴＩ）の配列に関して１３位、１６位、１７位、１８位、１９位、３１位、３２位、３４位および３９位をコードするコドンが異なる、請求項８０に記載のライブラリー。
  82. ９５％以下が異なる少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメインを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、該Ｋｕｎｉｔｚドメインをコードする該配列は、該少なくとも２つのＫｕｎｉｔｚドメイン間で同一である１つ以上の残基に相当する位置において異なるコドンを使用する、ポリヌクレオチド。
  83. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、同一である、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
  84. 前記Ｋｕｎｉｔｚドメインが、同一であるが、該同一のＫｕｎｉｔｚドメインをコードする配列が、少なくとも１０コドンにおいて異なる、請求項８２に記載のポリヌクレオチド。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020091296A (ja) * 2013-10-21 2020-06-11 ダイアックス コーポレーション 自己免疫疾患の診断と治療
US11156612B2 (en) 2013-01-20 2021-10-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of determining levels of cleaved and/or intact kininogen
US11372002B2 (en) 2013-10-21 2022-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Assays for determining plasma kallikrein system biomarkers

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6057287A (en) 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US20050222023A1 (en) * 2002-02-07 2005-10-06 Hans-Peter Hauser Albumin-fused kunitz domain peptides
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
AU2003243394B2 (en) 2002-06-07 2008-06-12 Takeda Pharmaceutical Company Limited Prevention and reduction of blood loss
EP2386310B1 (en) 2002-08-28 2018-11-07 Dyax Corp. Methods for preserving organs and tissues
WO2005021557A2 (en) * 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
WO2006108826A1 (en) * 2005-04-15 2006-10-19 Novo Nordisk A/S Basic protein purification tags from thermophilic bacteria
EP2076527B1 (en) * 2006-10-13 2014-12-10 Novo Nordisk Health Care AG Processing enzymes fused to basic protein tags
AU2008289005A1 (en) * 2007-08-21 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
AU2008288772A1 (en) * 2007-08-23 2009-02-26 Genzyme Corporation Treatment with kallikrein inhibitors
EP2350305A4 (en) * 2008-10-22 2013-03-06 Dyax Corp COMBINATION TREATMENTS WITH PROTEASE BINDING PROTEINS FOR INFLAMMATORY DISEASES
US8637454B2 (en) 2009-01-06 2014-01-28 Dyax Corp. Treatment of mucositis with kallikrein inhibitors
EP2405925B1 (en) * 2009-03-10 2015-01-14 Med Discovery Sa Kallikrein inhibitors for the treatment of neutropenia
GB0916578D0 (en) * 2009-09-22 2009-10-28 Malmsten Nils M Polypeptides and uses thereof
LT3459564T (lt) 2010-01-06 2022-03-10 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plazmos kalikreiną surišantys baltymai
US9597379B1 (en) * 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
KR102320178B1 (ko) 2011-01-06 2021-11-02 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 혈장 칼리크레인 결합 단백질
WO2013059439A2 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Dyax Corp. Combination therapy comprising an mmp-14 binding protein
ES2886531T3 (es) 2013-01-07 2021-12-20 Omniox Inc Formas poliméricas de proteínas H-NOX
CR20160444A (es) 2014-02-24 2017-04-21 Takeda Gmbh Proteínas de fusión uti
EP3122782A4 (en) 2014-03-27 2017-09-13 Dyax Corp. Compositions and methods for treatment of diabetic macular edema
IL258637B2 (en) 2015-10-19 2024-10-01 Dyax Corp An immunoassay for the detection of high molecular weight cleaved kininogen
AU2016366557B2 (en) 2015-12-11 2024-01-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Plasma kallikrein inhibitors and uses thereof for treating hereditary angioedema attack
JP6467073B2 (ja) * 2018-01-04 2019-02-06 オムニオクス， インコーポレイテッド Ｈ−ｎｏｘタンパク質の重合体形態
AU2019234670B2 (en) * 2018-03-13 2023-11-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited Substituted imidazopyridines as inhibitors of plasma kallikrein and uses thereof
AU2020329191A1 (en) * 2019-08-12 2022-03-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Macrophage stimulating 1 receptor (MST1R) variants and uses thereof
FI4031547T3 (fi) 2019-09-18 2024-09-16 Takeda Pharmaceutical Company Ltd Plasman kallikreiinin estäjiä ja niiden käyttötapoja
JP2022549601A (ja) 2019-09-18 2022-11-28 武田薬品工業株式会社 ヘテロアリール血漿カリクレインインヒビター

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10503375A (ja) * 1994-08-05 1998-03-31 カイロン コーポレイション 組織因子活性インヒビターｔｆｐｉおよびｔｆｐｉ−２のキメラタンパク質および変異体
JP2001521367A (ja) * 1996-03-11 2001-11-06 バイエル コーポレイション ヒト ビクニン

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0332640A1 (en) 1986-11-17 1989-09-20 California Biotechnology, Inc. Recombinant alzheimer's amyloid protein
US4966852A (en) 1987-07-23 1990-10-30 Monsanto Company DNA clone of human tissue factor inhibitor
US5106833A (en) 1987-07-23 1992-04-21 Washington University Coagulation inhibitors
IL87172A (en) 1987-07-23 1994-12-29 Univ Washington A method of inhibiting the isolation of a purer tissue factor
IL87171A (en) 1987-11-23 1995-08-31 Monsanto Co ANDC of human tissue factor inhibitor
US7078383B2 (en) 1988-09-02 2006-07-18 Dyax Corp. ITI-D1 Kunitz domain mutants as HNE inhibitors
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
DK408089D0 (da) 1989-08-18 1989-08-18 Novo Nordisk As Proteiner
US5378614A (en) 1989-08-18 1995-01-03 Novo Nordisk A/S Vector and method for making tissue factor pathway inhibitor (TFPI) analogues in yeast
IL104327A0 (en) 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Variant of human kunitz-type protease inhibitor
IL104314A0 (en) 1992-01-07 1993-05-13 Novo Nordisk As Human kunitz-type protease inhibitor and variants thereof,their production and pharmaceutical compositions containing them
US5212091A (en) 1992-03-02 1993-05-18 Monsanto Company Method of producing tissue factor pathway inhibitor
US6063764A (en) 1992-06-01 2000-05-16 Washington University & Chiron Corp. Method for using lipoprotein associated coagulation inhibitor to treat sepsis
US5455338A (en) 1993-11-05 1995-10-03 Zymogenetics, Inc. DNA encoding novel human kunitz-type inhibitors and methods relating thereto
PT737207E (pt) 1994-01-11 2005-02-28 Dyax Corp Inibidores de plasmina humana derivados de dominios kunitz
ES2227545T3 (es) * 1994-01-11 2005-04-01 Dyax Corporation Proteinas y sus analogos del "dominio de kunitz" inhibidores de calicreina.
US6057287A (en) * 1994-01-11 2000-05-02 Dyax Corp. Kallikrein-binding "Kunitz domain" proteins and analogues thereof
US5795954A (en) 1994-03-04 1998-08-18 Genentech, Inc. Factor VIIa inhibitors from Kunitz domain proteins
US6008196A (en) 1994-06-02 1999-12-28 Hoechst Marion Roussel, Inc. Perfluoroalkyl ketone inhibitors of elastase and processes for making the same
JP3779728B2 (ja) 1994-08-05 2006-05-31 カイロン コーポレイション 組織因子活性インヒビターの産生
US5648331A (en) 1994-08-26 1997-07-15 G.D. Searle & Co. Method of inhibiting tissue ischemia and reperfusion injury
US5914316A (en) 1994-12-16 1999-06-22 Washington University Method of inhibiting intimal hyperplasia
ZA963619B (en) * 1995-05-08 1996-11-22 Scios Inc Protease inhibitor peptides
US5780265A (en) * 1995-06-05 1998-07-14 Genentech, Inc. Kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US5786328A (en) 1995-06-05 1998-07-28 Genentech, Inc. Use of kunitz type plasma kallikrein inhibitors
US6242414B1 (en) 1995-06-07 2001-06-05 Chiron Corporation Regulation of cytokine synthesis and release
US5736364A (en) 1995-12-04 1998-04-07 Genentech, Inc. Factor viia inhibitors
AU6042298A (en) 1997-01-31 1998-08-25 Human Genome Sciences, Inc. Tissue factor pathway inhibitor-3
US6180607B1 (en) 1999-08-05 2001-01-30 Christopher Davies Protein having proteinase inhibitor activity
US6544760B2 (en) 1999-12-22 2003-04-08 Zymogenetics, Inc. Kunitz domain polypeptide Zkun11
US20020102703A1 (en) 1999-12-29 2002-08-01 Sheppard Paul O. Kunitz domain polypeptide zkun10
WO2001068707A1 (en) 2000-03-13 2001-09-20 Eli Lilly And Company Human hepatocyte growth factor activator inhibitor homologue
US20040152633A1 (en) * 2001-05-31 2004-08-05 Jorgensen Marianne Ulrich Kunitz-type sequences and polypeptides
AU2002353018A1 (en) 2001-12-03 2003-06-17 Dyax Corporation Library screening
JP2005516607A (ja) * 2002-02-07 2005-06-09 デルタ バイオテクノロジー リミテッド Ｈｉｖ阻害タンパク質
US7153829B2 (en) 2002-06-07 2006-12-26 Dyax Corp. Kallikrein-inhibitor therapies
US6989369B2 (en) 2003-02-07 2006-01-24 Dyax Corp. Kunitz domain peptides
US7273610B2 (en) 2003-08-14 2007-09-25 Dyax Corp. Endotheliase-2 ligands
US20070020252A1 (en) 2003-08-29 2007-01-25 Ladner Robert C Modified protease inhibitors
WO2005021557A2 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Dyax Corp. Poly-pegylated protease inhibitors
WO2005041631A2 (en) * 2003-10-21 2005-05-12 Dyax Corp. Endotheliase-1 ligands
US7235530B2 (en) 2004-09-27 2007-06-26 Dyax Corporation Kallikrein inhibitors and anti-thrombolytic agents and uses thereof
US20060111296A1 (en) 2004-11-22 2006-05-25 Dyax Corp. Plasmin-inhibitory therapies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH10503375A (ja) * 1994-08-05 1998-03-31 カイロン コーポレイション 組織因子活性インヒビターｔｆｐｉおよびｔｆｐｉ−２のキメラタンパク質および変異体
JP2001521367A (ja) * 1996-03-11 2001-11-06 バイエル コーポレイション ヒト ビクニン

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012015867; Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ． ２７２（１８）, 1997, １２２０９-１２２１４ *

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11156612B2 (en) 2013-01-20 2021-10-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods of determining levels of cleaved and/or intact kininogen
JP2020091296A (ja) * 2013-10-21 2020-06-11 ダイアックス コーポレーション 自己免疫疾患の診断と治療
KR20210107182A (ko) * 2013-10-21 2021-08-31 다이액스 코포레이션 자가면역 질환의 진단 및 치료
US11372002B2 (en) 2013-10-21 2022-06-28 Takeda Pharmaceutical Company Limited Assays for determining plasma kallikrein system biomarkers
JP7157089B2 (ja) 2013-10-21 2022-10-19 武田薬品工業株式会社 自己免疫疾患の診断と治療
KR102485948B1 (ko) 2013-10-21 2023-01-06 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 자가면역 질환의 진단 및 치료
KR20230010003A (ko) * 2013-10-21 2023-01-17 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 자가면역 질환의 진단 및 치료
KR102665705B1 (ko) 2013-10-21 2024-05-14 다케다 파머수티컬 컴패니 리미티드 자가면역 질환의 진단 및 치료
US12061206B2 (en) 2013-10-21 2024-08-13 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diagnosis and treatment of autoimmune diseases
JP7541560B2 (ja) 2013-10-21 2024-08-28 武田薬品工業株式会社 自己免疫疾患の診断と治療

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