JP2009145058A - 核酸マイクロアレイ及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 検査対象となる核酸試料とはハイブリダイゼーションしない核酸プローブが固定された核酸マイクロアレイに対し、当該核酸プローブの相補配列とターゲット核酸の相補配列とを有する核酸プローブをハイブリダイゼーションすることによって、簡便に所望の核酸プローブを固定化した核酸マイクロアレイを製造できる。
【選択図】 図1
Description
(1) 核酸マイクロアレイに固定されている核酸プローブに対して、検査対象となる核酸試料をハイブリダイズさせ、
配列特異的に形成したハイブリッドを、例えばハイブリダイズした核酸試料に施した蛍光物質等により検出する、
ことで、複数の核酸プローブに対応する核酸試料中のターゲット核酸を、一度に定量的又は定性的に調べることができる。
上記無機能プローブを固定化した核酸マイクロアレイに対し、無機能プローブに相補な塩基配列とターゲット核酸の相補配列を有する核酸プローブ(以下、間接プローブと称す)をハイブリダイゼーションすることにより、所望の位置に所望の機能プローブを固定化した核酸マイクロアレイを製造することができる。
無機能プローブの相補配列部分のTmが、ターゲット核酸の相補配列部分のTmに比較して著しく高い場合は、ターゲット核酸の相補配列部分のTmを元にハイブリダイゼーション条件を決めると、無機能プローブの相補配列部分は、ミスマッチを許容したハイブリダイゼーションとなる可能性がある。また、逆に、無機能プローブのTmに合わせてハイブリダイゼーション条件を決めると、ターゲット核酸の相補配列部分にとっては極めてストリンジェンシーの高いハイブリダイゼーション条件となり、ハイブリダイゼーションがおこりにくくなる可能性が高い。
無機能プローブが搭載された核酸マイクロアレイの作製
1.プローブ配列の設計
MICROSOFT社のソフトウェアー「EXCEL」のRNDBETWEEN関数を使用し、1から4までの整数をランダムに30個発生させ、それをつなげて1から4までの数値のみから構成される30桁の数値とした。
まず、プローブとなるオリゴヌクレオチドをDNA自動合成装置により合成した。合成の際、最終段階で、アミノリンクTM(PEバイオシステムズ社製)を該オリゴヌクレオチドに反応させ、次いで脱保護操作を行うことにより、各オリゴヌクレオチドの末端にアミノヘキシル基が導入された5’-O-アミノヘキシルオリゴヌクレオチドを調製した。次いで、それらオリゴヌクレオチドに、無水メタクリル酸を反応させ、5’末端ビニル化オリゴヌクレオチドを調製した。
図1に示す配列固定器具を利用して中空繊維束を製造した。なお、図1中のx、y、zは直交の3次元軸であり、x軸は繊維の長手方向と一致する。
次に、核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液をデシケーター内に設置した。デシケーター内を減圧状態にしたのち、中空繊維束の繊維束が固定されていない一方の端部をこの溶液中に浸漬した。デシケーター内に窒素ガスを封入し、中空繊維の中空部に核酸プローブを含むゲル前駆体重合性溶液を導入した。次いで、容器内を70℃とし、3時間かけて重合反応を行った。
Mouse Universal Reference Total RNA(Clontech製)1μgから、MessageAmpII-Biotin Enhancedキット(Ambion製)を用い、キットに添付のプロトコールに従って、ビオチン標識された相補鎖RNAを合成、精製した。
ビオチン標識された相補鎖RNA各5μgをプラスチックチューブに入れ、液量が18μlとなるように、蒸留水を添加した。RNA Fragmentation Reagent(Ambion社製)を用いて以下の通りに断片化を行った。
上記で得られた検体液を、70℃で2分間熱変性した後、速やかにウェルプレートにアプライした。ウェルプレートにアプライされた検体液に対し、上記で作成した中空繊維束薄片を接触させることによりハイブリダイゼーションを行った。
1.間接プローブ合成と間接チップの作製
実施例1で作製した無機能型核酸マイクロアレイに対してハイブリさせ、新たに機能型核酸マイクロアレイを作製する目的で、間接プローブを27種類作製した。間接プローブは、その3’側が無機能プローブの相補鎖により構成され、5’側が、マウスのいくつかのmRNAをターゲットとするキャプチャープローブ配列として構成される。配列長が60merとなるように、上述の方法で間接プローブを合成した。ただし、末端修飾は行わなかった。なお、間接プローブの5‘側30塩基の配列は、機能プローブ(配列番号28番から54番)の何れか1つの配列と同一であり、3’側30塩基の配列は、無機能プローブ(配列番号1番から27番)の何れかひとつの配列と相補となっている。
これらは全て100pmol/ulの濃度で調製し、27種類それぞれを、2ulずつ混合し、各間接プローブがそれぞれ200pmolずつ入った混合液54ulを得た。この溶液に対し、146ulの滅菌水を混合し、各間接プローブがそれぞれ200pmolずつ入った混合液200ulを得た。この混合液15ulに対し、滅菌水を105ul、20×SSCバッファー(Ambion製)を15ul、2% SDS溶液15ulを混合し、合計150ulの間接プローブ混合溶液を得た。
マウス脳及び骨格筋より抽出された市販のTotal RNA(Ambion社製)各1マイクログラムから、MessageAmpII-Biotin Enhancedキット(Ambion社製)を用い、キットに添付のプロトコールに従って、ビオチン標識された相補鎖RNAを合成、精製した。
21・・・・多孔板
31・・・・中空繊維
41・・・・板状物
Claims (6)
- 機能プローブと同数またはそれ以上の無機能プローブが固定されている核酸マイクロアレイ。
- 請求項1のアレイの無機能プローブと間接プローブがハイブリットを形成している、核酸マイクロアレイ。
- 核酸マイクロアレイが、繊維型マイクロアレイである請求項1又は2記載のアレイ。
- 機能プローブと同数またはそれ以上の無機能プローブを固定することを特徴とする核酸マイクロアレイの製造方法。
- 請求項4において、その後に無機能プローブに間接プローブをハイブリダイズさせる工程を有する核酸マイクロアレイの製造方法。
- 核酸マイクロアレイが繊維型マイクロアレイである請求項4又は5記載の製造方法。
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