JP2009062308A - リポソーム安定剤及びこれを含むリポソーム並びに食品 - Google Patents

Abstract

【課題】コレステロールあるいはコレステロール誘導体に代わるリポソーム安定剤、該安定剤を含むリポソーム、及び該リポソームを含む食品を提供する。
【解決手段】植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを有効成分とするリポソーム安定剤または、リポソームに該植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを含有したリポソーム、さらに該リポソームと植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンとを含有する食品である。植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンをリポソームに含有することでコレステロールと同程度のリポソームの安定性を図れる。
【選択図】なし

Description

本発明は、リポソーム安定剤、該安定剤を含むリポソーム並びに該リポソームを含む食品に関する。

リポソームは、細胞膜などの生体膜に模して人工的に作られた脂質二重層の構造を持つ小胞体である。脂質二重層を形成する脂質は、極性脂質と呼ばれる親水性と疎水性の両方の性質を兼ね備えた両親媒性という性質をもっており、リン脂質がその代表例である。
両親媒性の分子は、水中でエネルギー的に最も安定する構造として、外側に親水基を配向し、内側に疎水基を水から隔離されるように配向して極性脂質の二重層からなる膜を形成する。極性脂質の二重層の側端においては、疎水基が水に触れることがない立体構造が形成される。すなわち、側端に疎水基が露出しないよう球状の小胞が形成される。この小胞はリポソームと呼ばれ、小胞の芯部には水層が閉じ込められる。
リポソームは脂質二重層の間や小胞内部に種々の物質を含有および／または内包することができることから、マイクロカプセルとしての応用が試みられている。例えば、遺伝子治療の際の遺伝子導入用キャリア、赤血球を内包した酸素運搬体、水溶性・脂溶性の薬物を含むドラッグ・キャリアなどに応用が図られている。

しかしながら、リポソームをマイクロカプセルとして用いる場合、小胞形状や脂質二重層の構造を安定的に保つことができず、小胞に内包された物質が層の外側に拡散してしまうという問題点が指摘されている。このような問題を解決するため、コレステロールや特許文献１に開示されるグリセリン誘導体がリポソームの脂質二重層の安定剤として知られている。

特開平１−９９３１号公報 Ｍａｒｉｎｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ（２００２）１４０：７６３−７７１

一般的には、コレステロールがリポソームの安定剤として使用されている。コレステロールをリポソームに添加することにより、リポソームの安定性は向上する。しかし、コレステロールの添加は、リポソームの人体への投与あるいは摂取による血中総コレステロール量への悪影響が懸念される。
また、有用成分を含有するリポソームを疾病予防訴求型食品へ適用する場合、コレステロールを添加したリポソームは、商品の健康上のイメージを損ない、商品価値を低下させることにもつながりかねない。

本発明者らは、コレステロールあるいはコレステロール誘導体に代わるリポソーム安定剤について種々研究したところ、植物由来のステロールエステルとホスファチジルセリンがコレステロールと同等以上のリポソームの安定化効果を持っていることを発出し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、コレステロールに代わる、健康素材由来のリポソーム安定剤を提供することを目的とする。

すなわち、本発明は、（１）植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを有効成分とすることを特徴とするリポソーム安定剤、（２）植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを含有することを特徴とするリポソーム、さらに（３）リポソームと植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを含有することを特徴とする食品である。
植物ステロールは、ステロール骨格を有する点でコレステロールと構造上類似する化合物であるが、コレステロールのようにリポソームの安定化効果を奏しない。植物ステロールの脂肪酸エステル化合物となることで初めてリポソームの安定化効果を奏する。

以上述べたように、植物ステロールエステルおよびホスファチジルセリンは、コレステロールと同様、リポソームに含有されることで、リポソーム粒子の分散安定化効果を発揮する。
また、健康素材として注目される植物ステロールをリポソームの安定剤として用いることができるので、動物性脂質であるコレステロールに代わり、例えば、食品への機能性物質添加に関し、機能性物質と組み合わせた疾病予防訴求型食品として、新たな展開を図ることが可能になる。
さらに、例えばオメガ−３高度不飽和リン脂質のような健康素材のリン脂質と組み合わせ、リポソームの膜構成素材に付加価値をつけた商品化を展開することが可能になる。

植物ステロールエステルまたはホスファチジルセリンは、リポソームの安定剤として作用する。すなわち、植物ステロールエステルまたはホスファチジルセリンは、リポソームに含有されてリポソーム粒子の分散安定化効果を発揮する。リポソーム中で植物ステロールエステルまたはホスファチジルセリンは、リポソームの脂質二重層の間に保持されて存在するものと考えられる。ここで、植物ステロールエステルとは、植物に由来するステロールのエステル化合物であって、β−シトステロール、カンペステロール、スティグマステロール、ブラシカステロール等のエステルあるいはそれらの混合物を含むものである。
植物ステロールエステルは、次式１に示すステロール骨格のＡ環の３位のヒドロキシ基が脂肪酸のカルボキシル基とエステル結合を形成している。

植物ステロールエステルは、穀類、野菜等の植物油中に植物ステロールの脂肪酸エステルとして含まれており、単独、あるいは混合物で用いることができる。植物ステロールにエステル結合する脂肪酸は、飽和あるいは不飽和の鎖状炭化水素であり炭素数１２以上の高級脂肪酸が望ましい。これらの脂肪酸には例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレイン酸等が挙げられる。

植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリン（ＰＳと略記することもある）は、リポソームに含有され、好ましくはリポソームの脂質二重層の間に保持されて、リポソームの安定剤として作用する。

植物ステロールエステルの量は、リポソームを構成するリン脂質に対して１〜７０モル％量、好ましくは１〜５０モル％量を脂質二重層に挟着することが望ましい。この範囲では植物ステロールエステルの量が多いほど、リポソームの安定性は高まるが、この範囲を超えると、逆に安定性が低下する。

ホスファチジルセリンは、全リン脂質として１〜７０モル％添加が望ましい。添加量が多いほどリポソームの安定性は高まるが、多すぎるとリポソーム膜の性質が変化してしまう恐れがある。ホスファチジルセリンは、ホスファチジルコリン（ＰＣと略記することもある）のコリン基をホスファチジル基転移反応でセリンに置換することで容易に得ることができる。

なお、植物ステロールエステルとホスファチジルセリンは、それぞれ単独でも、一緒に用いられてもよい。植物ステロールエステルとホスファチジルセリンの併用は、リポソームの安定化効果をさらに強化するので望ましい。

リポソームを構成するリン脂質は、レシチンのようなグリセロリン脂質、スフィンゴリリピドホスホグリセライドのようなスフィンゴリン脂質があげられ、天然由来のリン脂質が好ましい。天然由来のリン脂質には例えば、卵黄、大豆、穀類、ゴマ、コーン、レバー、魚介類由来のリン脂質がある。なかでも、魚介類由来のリン脂質はリン酸にＥＰＡおよび／またはＤＨＡのようなオメガ−３高度不飽和脂肪酸がエステル結合しているリン脂質なので特に好ましい。

図１にイカ、ホタテ、魚卵等、魚介類、海藻類等からのリン脂質抽出フローを示す。
まず、第１工程において、魚介類の部位の組織中に含まれる中性油分を水不溶相として分離する。具体的には、原料と水との混合物を所定温度で沸騰させて、所定時間加熱する。以下、この第１工程を蒸煮工程と呼ぶ。原料は、魚介類の水産加工の工程から産出される副生品として、従来は有効に利用されることなく廃棄されている魚介類の部位を用いるのが好適である。
原料に魚介類の廃棄する部位（以下、魚介類の部位と呼ぶ）を用いた場合の蒸煮工程では、魚介類の部位に対して０．５〜５重量倍の水を加えて、９５〜１００℃に加熱して行なうことができる。蒸煮が長時間に過ぎると最終目的製品であるリン脂質が分解する場合があるので好ましくない。

第２工程は、第１工程の後で、固形物と液相に分離する工程である。この工程は、遠心分離及び／又はろ過による固液分離工程で可能であり、遠心分離工程を好適に用いることができる。具体的には、第１工程終了後に遠心分離器にかけ、所定の回転数で所定時間遠心分離を行なうことにより、固形物と液相を得る。この際の遠心力としては、１０００〜３０００Ｇ程度であればよい。液相は、廃棄物として回収する。なお、遠心分離工程で得た固形物は水分を含んでいるので、水分を減少させるために、さらに、減圧乾燥を行なって固形物の含水量を下げることが好ましい。この場合、常圧乾燥によると高温のために目的とするリン脂質が分解するおそれがあるので、減圧乾燥が望ましい。

第３工程は、第２工程で得た固形物の有機溶剤抽出工程である。この工程では、固形物に有機溶剤を添加して有機溶剤抽出を行ない、残渣固形物と有機溶剤抽出液とを得る。この有機溶剤抽出工程は、例えば撹拌器つき防爆仕様タンクに入れて行なうことができる。この場合、固形物に、固形物と同じ重量の有機溶剤を加えて行なうことができ、この工程を繰り返し行なうこともできる。さらに、有機溶剤抽出工程は、円筒カラム形状の抽出装置で連続式に抽出することもできる。ここで、有機溶剤は、次の工程であるカラムクロマト操作条件を考慮して選択され、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、アセトン、クロロホルム、塩化メチレン、ヘキサン及びそれらの含水物を用いることができる。また、有機溶剤は含水アセトンとすることもできる。この場合、含水アセトンは、水分を１０〜３０重量％とすることが好ましい。ただし、食品用途であることを考慮すると、エタノールが最も好ましい。エタノールは、仮に微量が人体中に取り込まれても無害であり、効率よく抽出できる。
この抽出工程では、第２工程で得た固形物２内に含まれ有機溶剤に溶解しない成分が、残渣固形物に濃縮される。このため、固形物内に含まれるカドミウムなどの有害な重金属を、残渣固形物に含ませて回収することができる。

第４工程は、有機溶剤抽出液に含まれる有機溶剤を蒸留除去する工程である。蒸留除去した有機溶剤は回収する。この場合、残存する抽出液中の有機溶剤が１０〜５０重量％の範囲内となるようにする。有機溶剤が１０重量％より少ないと流動性を失い、５０重量％を超えるとその量が多くなり過ぎて、ともに次の工程への仕込みに不適当である。

第５工程は、第４工程で得た抽出液の精製工程である。精製工程としてはカラムクロマト法が好適である。この抽出液をクロマトカラム上部に仕込んだ後、有機溶剤を展開剤として流下し、不適切な画分を除去して好適な画分を回収する。有機溶剤としてはエタノールが好適であり、初期に流出する濃黒褐色の画分を除去して、淡色になる画分を目的物として回収する。クロマトカラムとしては、例えば、シリカゲル又はアルミナゲルからなる充填剤を充填した円筒管を用いることが好適である。さらに、上記材料の混合粒子や多孔質樹脂粒子を用いてもよい。
なお、別法として、有機溶剤としてエタノール単体ではなく、アセトン及びエタノールを展開剤として用いてもよい。この場合、クロマトカラムに、最初にアセトンを流通させると、アセトンに溶解する、例えばトリグリセライドなどの有用リン脂質組成物以外の不要成分が流出するので、これを除去した。
次に、クロマトカラム内の充填剤に吸着した目的成分をエタノールで流出させて回収する。

第６工程は、クロマトカラムからの流出液相である精製液に含まれている有機溶剤を蒸留除去する工程であり、濃縮液相として有用リン脂質組成物が得られる。この有用リン脂質組成物の収率は、原料に対して１〜３％程度である。

リポソームに含有する機能性物質も特に限定されるものではなく、各種の薬効をもつ物質をリポソームに内包することができる。機能性食品向けには、例えばコエンザイムＱ１０、アガリクス、ルテイン、アスタキサンチンやブルーベリーエキスを挙げることができる。

一般に、リポソームの脂質二重層は、適当な容器の内壁に脂質二重層の膜を形成して作られる。本発明のリポソームは、リン脂質と植物ステロールエステルを有機溶媒に溶解させ、有機溶媒を除去して容器の内壁に脂質二重層の膜を形成する。
次いで、この容器に機能性物質や薬効成分を溶解させた水溶液を加えて攪拌する。この攪拌により、脂質二重膜が容器内壁から剥がされ、小胞体、すなわちリポソームが形成される。小胞体が形成されるときに、同時に機能性物質や薬効成分を含んだ水溶液が小胞に内包される。
このようにして得られる本発明のリポソームは、水溶液中でも粒度分布を安定的に維持することができる。このように長時間にわたって、リポソームが水溶液中で分散維持できるため、マイクロカプセルとしての活用の幅が広がり、食品、特に飲料への応用が可能となる。

イカミール由来ホスファチジルコリン（ＰＣ）と海草由来ジガラクトシルジアシルグリセロール（ＤＧＤＧと記載することもある）と植物ステロールエステルとを３：１：４の割合（重量比）でクロロホルムに溶解させた後、ナス型フラスコ中でクロロホルムを留去して、内壁に薄膜を形成させた。
ここで、海草由来ジガラクトシルジアシルグリセロールは、難吸収性の物質の吸収率を高める糖脂質であり、さらにホスファチジルセリン（ＰＳ）等のリン脂質を安定させる物質を含まないので、調整したリポソーム液の安定性は脆弱化されている状態にある。ＤＧＤＧは、海藻や微細藻のような水生植物である褐藻ネジモクを細切した後、エタノール等の有機溶剤で抽出処理を行い、エーテル−水で水溶性物質を除去した後、脂質分をさらにシリカゲルカラムクロマトで精製分離して得た（非特許文献１を参照）。
また、使用した植物ステロールエステルの植物ステロールの組成は、カンペステロール２４．７％、スティグマステロール２５．０％、β−シトステロール４１．７％であった。次いで、脂質の１００倍容量の水を加えてボルテックミキサーで薄膜が完全に剥離するまで攪拌してリポソーム分散液を調整した。
一方、ステロールエステルの効果を比較するため、植物ステロールエステルを含まないリポソーム分散液（比較例１）を調整した。
得られたそれぞれのリポソーム分散液を、４００ｎｍのフィルターによって整粒して、リポソーム分散液の粒度分布を測定（レーザー光散乱粒径分布計；島津製作所ＳＡＬＤ−２００Ｖ、波長６７０ｎｍ）してリポソームの安定性を評価した。
結果を図２に示す。

図２は、植物ステロールエステル添加後（０日目）、８日目のリポソーム粒径の変化を示したもので、横軸にリポソームの粒径（ｎｍ）、縦軸に分布の頻度（％）を表わしている。なお、図中で用いた「比較例１」とは、植物ステロールエステルを含まないリポソーム分散液である。
植物ステロールエステルを含有しないリポソームは８日後には、０日目と同じ粒径のリポソームを維持できなく、分布状況が変化しているのに対し、植物ステロールエステルを含有したリポソームは８日目でもほぼ同じ分布状況を示し、リポソームが安定して存在していることがわかる。

ＰＣとＰＳと植物ステロールエステル、およびＰＣとＰＳとコレステロール（比較例２）を８：２：５のモル比に配合し、実施例１と同様にしてリポソーム膜を形成させた。
次いで、１ｎｍカルセインを含む５ｍＭトリス塩酸緩衝液（３００ｍＭスクロースを含有、ｐＨ７．４）を加え、リポソームを形成した。３℃窒素置換で遮光保存した後、励起波長４９０ｎＭ、蛍光波長５２０ｎｍで蛍光強度を測定して保持効率を調べた。
結果を図３に示す。図３は、縦軸にカルセイン漏出量（％）、横軸に経過日数を表わしている。リン脂質のみで、安定剤無添加のときのリポソームの安定効果が一番低く、植物ステロールエステルは、コレステロールと遜色ないリポソームの安定効果を有していることがわかる。

イカミール由来ホスファチジルコリンとホスファチジルセリンのみをモル比１：１で含むリポソーム分散液（ＰＣ、ＰＳのみ）、イカミール由来ホスファチジルコリンとイカミール由来ホスファチジルセリンと植物ステロールとを１：１：１の割合（重量比）で含むリポソーム分散液（比較例３）、植物ステロールに代えてコレステロールを用いたリポソーム分散液（比較例４）を実施例１と同様に調整した。
それぞれのリポソーム分散液を４００ｎｍのフィルターによって整粒し、リポソーム分散液の粒度分布を測定して（レーザー光散乱粒径分布計；島津製作所ＳＡＬＤ−２００Ｖ、波長６７０ｎｍ）リポソームの安定性を評価した。
結果を図４に示す。図４は、粒子径（ｎｍ）を横軸に、分布の頻度（％）を縦軸に表わす。ＰＳのみの添加でもコレステロールと同等の粒度頻度を持ち、ＰＳがリポソーム安定効果を有していることがわかる。また、この結果からも、植物ステロールはリポソームの安定効果を有しないことがわかる。

イカミール由来ホスファチジルコリン（ＰＣ）とホスファチジルセリン（ＰＳ）をモル比８：２、９：１、９．５：０．５および１０：０で含む、４種類のＰＳ濃度を添加したリポソーム分散液を実施例１と同様に調整した。
得られた４種類のＰＳ濃度を添加したリポソーム分散液を整粒し、１４日後に粒度分布をレーザー光散乱粒径分布計（島津製作所ＳＡＬＤ−２００Ｖ、波長６７０ｎｍ）で測定した。
結果を図５に示す。図５は、粒子径（ｎｍ）を横軸に、分布の頻度（％）を縦軸に表わす。ＰＳ添加量が増えるに従って、安定性が高くなることがわかる。一方、ＰＳ無添加のリポソームの粒度分布は、分布の形が崩れ、安定性が悪いことがわかる。

魚介類からのリン脂質抽出フロー図である。 植物ステロールによるリポソーム粒径の変化を示す図である。 植物ステロールエステルとコレステロールのリポソーム安定効果を示す図であ る。 コレステロール、植物ステロールと、植物ステロールエステル、ホスファチジルセリンとのリポソーム粒子形成能を比較した図である。 ホスファチジルセリンによるリポソーム粒径の変化を示す図である。

Claims (8)

1. 植物ステロールエステルまたはホスファチジルセリンを有効成分とすることを特徴とする、リポソーム安定剤。
2. リポソームに植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンが含有されていることを特徴とする、リポソーム。
3. リポソームに植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンと、機能性物質とを含有することを特徴とする、リポソーム。
4. 前記リポソームの構成脂質がオメガ−３高度不飽和リン脂質である、請求項２または請求項３に記載のリポソーム。
5. 植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンを含有したリポソームを含むことを特徴とする、食品。
6. 前記リポソームの構成脂質がオメガ−３高度不飽和リン脂質である、請求項５または６記載の食品。
7. 植物ステロールエステルおよび／またはホスファチジルセリンと、機能性物質とを含有するリポソームを含むことを特徴とする、食品。
8. 前記リポソームの構成脂質がオメガ−３高度不飽和リン脂質である、請求項６または７記載の食品。

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