CN115245486A - 一种植物甾醇月桂酸酯辅酶q10复合脂质体的制备工艺 - Google Patents
一种植物甾醇月桂酸酯辅酶q10复合脂质体的制备工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，包括以下步骤：步骤S1：磷酸盐缓冲溶液的配置；步骤S2：辅酶Q10标准曲线的绘制；步骤S3：通过高效液相法测定辅酶Q10的包封率及保留率；步骤S4：复合脂质体的制备；步骤S5：复合脂质体的表征包括包封率的测定和粒径、多相分散系数、电位的测定；步骤S6：复合脂质体的制备条件优化以及影响因素的考察；步骤S7：响应面法优化实验；步骤S8：根据模型回归方程可知复合脂质体制备的优化工艺条件：步骤S9：制备验证：本发明，制备得到的复合脂质体呈现球形，表面光滑，没有明显的凹陷；复合脂质体具有均匀的结构分布以及良好的表面质量，并具有良好的包封率。
Description
技术领域
本发明涉及复合脂质体制备工艺技术领域，尤其涉及一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺。
背景技术
植物甾醇月桂酸酯是典型的脂溶性物质，天然存在于母乳、椰子油之中，具有显著的降血液中胆固醇的功能；辅酶Q10又被称为泛醌，分子式C59H90O4，是一种重要的脂溶性抗氧化物质。随着科学技术的不断发展，对辅酶Q10的研究不断深入，发现该物质在众多领域内都有药用价值，。由辅酶Q10的结构式可知，辅酶Q10分子结构中含有不饱和键，因此很不稳定，容易被空气中的氧气氧化，见光也极不稳定，易溶于正己烷、氯仿等弱极性的有机溶剂中，水溶性差。脂质体作为极具潜力的药物载体，脂质体作为药物的载体已经取得了很多进展，尤其是在抗癌药物的应用上，能提高其治疗活性。由于脂质体具有很好的靶向性和缓释性，用脂质体包埋药物可以在一定的程度上增加药物的含量，而且毒副作用也很小，可以精准的作用于靶点；利用脂质体对辅酶Q10包埋，能有效改善Co Q10的稳定性、水分散性，提高生物利用率
现有技术制备得到的脂质体，脂质体的结构分散不均匀，而且脂质体的表面质量较差，从而影响包封率，因此，设计一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺是很有必要的。
发明内容
本发明解决的问题在于提供一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，通过用高效液相法对辅酶Q10的含量测定，通过浓度与峰面积之间的关系确立了辅酶Q10标准曲线和对应的关系式；通过对植物甾醇月桂酸酯、辅酶Q10的量、吐温的量三个单因素实验，建立了三因素三水平的响应面设计优化方案，确立了植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺条件，其次对稳定性进行测试，盐溶液的稳定性、酸碱溶液的稳定性、植物甾醇月桂酸酯的量，吐温的量，辅酶Q10的量制备得到的复合脂质体呈现球形，表面光滑，没有明显的凹陷；复合脂质体具有均匀的结构分布以及良好的表面质量，并具有良好的包封率。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，包括以下步骤：
步骤S1：磷酸盐缓冲溶液的配置；
用电子天平精确称取4.7991g磷酸氢二钠、1.0297g的磷酸二氢钠，8.500g的NaCl置于1L的烧杯用超纯水溶解，用1mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH,定容至1L，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
步骤S2：辅酶Q10标准曲线的绘制；
用电子天平准确称取0.0030g的辅酶Q10的标准品，用无水乙醇超声溶解，并定容于25mL容量瓶中；分别移取10mL、5mL、4mL、2mL、1mL、0.5mL的辅酶Q10标准溶液，用无水乙醇定容于10mL的容量瓶中，得到浓度为120μg/mL、60μg/mL、24μg/mL、12μg/mL、6μg/mL的辅酶Q10溶液，采用高效液相色谱测量峰面积，根据不同浓度辅酶Q10溶液的峰面积绘制峰面积与浓度关系的标准工作曲线；
步骤S3：通过高效液相法测定辅酶Q10的包封率及保留率；
高效液相色谱条件：C18柱，3.9nm×150nm的不锈钢色谱柱，直径为4μm；流动相为甲醇：正己烷＝4：1；柱温30℃；流速为0.8ml/min；检测波长275nm；进样量10μL，
包埋辅酶Q10量＝辅酶Q10总含量-游离辅酶Q10的量；
步骤S4：复合脂质体的制备；
利用电子天平准确称取40mg吐温-80、80mg大豆磷脂、2mg月桂酸酯、8mg辅酶Q10于100mL圆底烧瓶，加入10mL有机溶剂溶解，放置30分钟以上后进行减压旋转蒸发，除去有机溶剂，旋蒸过程中控制真空泵压力，0.02MPa条件下10min，0.04MPa条件下10min，0.05MPa条件下10min，压力保持30min,在瓶壁上形成均匀的薄膜，加入10mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，再次控制压力为0.02MPa旋蒸10min，把薄膜完全洗脱下来，用超声乳化分散器在冰水浴环境下探针式超声8min，超声功率：200w；频率：1s开/1s关，得到澄清透亮的溶液，置于冰箱冷藏备用；
步骤S5：复合脂质体的表征包括包封率的测定和粒径、多相分散系数、电位的测定；
步骤S6：复合脂质体的制备条件优化以及影响因素的考察：影响单因素的实验包括植物甾醇月桂酸酯的量、辅酶Q10的量、吐温-80的量、缓冲溶液的pH；
步骤S7：响应面法优化实验：结合单因素试验，以辅酶Q10的包封率为重要参考指标，设计三因素三水平共十七组实验，植物甾醇月桂酸酯的量为因素A，辅酶Q10的量为因素B，吐温-80的量为因素C，采用正交设计优选植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备条件处方，通过响应面实验设计方案及结果，并进行多元回归方程拟合和方差分析，得到自变量的二次多项回归方程：
Y＝93.7-1.12A-3.19B+5.54C+1.65AB+0.9AC+1.83BC-3.84A2-1.11B2-3.91C2
响应面实验模型方差分析结果得出，回归模型极显著，P<0.0001；模型R2＝0.9819，表明实际结果与预测值一致，模型调整的相关系数R2＝0.9586，表明该模型中响应值的变化为95.86％由所选的自变量决定，进一步说明该模型能够准确预测出响应值与自变量之间的关系；P失拟项＝0.0526，不显著，表明模型误差较小，可用于预测实验结果；综上所述，该模型拟合程度良好，可以用于植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺优化；
一次项B、C，二次项A2、C2对于复合脂质体辅酶Q10包埋率的影响为极显著，P<0.01，一次项A；交互项AB、BC影响显著，p<0.05；
步骤S8：根据模型回归方程可知复合脂质体制备的优化工艺条件：月桂酸酯2mg，辅酶Q10为8mg，吐温-80为39mg，大豆磷脂80mg，PBS缓冲溶液的体积为10mL，水浴温度为50℃，理论的包封率为95.9％；
步骤S9：制备验证。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S4中，有机溶剂选用氯仿：甲醇＝2：1的比例配制。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S5中，
包封率的测定包括：吸取1mL制备好的脂质体于试管中，加入3mL的正己烷，用Vortex-1漩涡振荡机振荡3min，然后放入离心机中离心，设置参数3000r/min，温度4-6℃，离心时间5min，离心完之后吸取上层清液于50mL烧瓶中，重复上述步骤两次，将两次吸取的上层清液合并在一起，用旋转蒸发仪旋干，然后用无水乙醇冲洗下来，定容于5mL棕色容量瓶中，之后用1mL的注射器吸取定容完的液体，用0.22μm的滤头过滤于棕色液相小瓶待测；
粒径、多相分散系数、电位的测定包括：
平均粒径的测定：运用激光纳米粒度仪检测脂质体的平均粒径及多相分散系数；设置参数为温度25℃，平衡稳定时间20s，运行次数14次,间隔时间1s，稳定时间2s；将脂质体样品用超纯水稀释100倍；每个样品重复测定3次取平均值；脂质体的粒径越小，可利用度越高，PDI即多项分散系数，数值越大表示脂质体分散越不均匀，一般选择PDI小于0.3；
电位的测定：运用激光纳米粒度仪测定脂质体的电位，温度设置为25℃，平衡稳定时间为120s，最大运行20s，稳定时间2s；脂质体样品用超纯水稀释100倍后进行测定，分别测量3次取平均值；Zeta电位的绝对值越大，粒子之间的排斥力越大，表示脂质体越稳定；
透射电子显微镜表征方法：将上述制备的脂质体用超纯水稀释至一定浓度，采用负染法对脂质体样品进行微观形貌观测。用注射器将稀释的脂质体滴至铜网上，铜网的孔径选用300目规格，放置10min后，用滤纸小心吸去铜网上多余的液体，滴加适量的2％磷钨酸进行负染8min，然后用滤纸吸去多余的磷钨酸，用透射电子显微镜进行观察。
作为本发明进一步的方案：所述步骤S6中，复合脂质体的影响单因素的考察：
植物甾醇月桂酸酯的量：在制备脂质体过程中，改变植物甾醇月桂酸酯的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的植物甾醇月桂酸酯，分别为1mg、2mg、3mg、4mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg；
辅酶Q10的量：在制备脂质体过程中，改变辅酶Q10的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的辅酶Q10，分别为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg；
吐温-80的量：在制备脂质体过程中，改变吐温-80的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的吐温-80，分别为0mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg，大豆磷脂酰胆碱为80mg，辅酶Q10为10mg；
缓冲溶液的pH：制备脂质体过程中，只改变PBS即缓冲溶液的pH值，保持其他因素不变，配置缓冲溶液的pH分别为7.0、7.2,、7.4、7.6、7.8，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg，月桂酸酯2mg；
采用Box-Behnken实验设计，优化上述对包埋率影响显著的因素，通过二次多项式回归拟合，结合方差分析及各因素相互交互作用，确定植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10脂质体的最佳制备工艺条件；
得出辅酶Q10含量与峰面积之间的关系式：
y＝11687x+2640.9
其中，y表示峰面积，x表示辅酶Q10的浓度，得出辅酶Q10浓度在6-120μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系；
当植物甾醇月桂酸酯的量1-3mg时，复合脂质体粒径为70nm左右；4mg时，脂质体粒径明显增加至103.99nm；植物甾醇月桂酸酯的量为1-2mg时，PDI值没有明显变化；而在3-4mg时，PDI值明显增大，但均小于0.3；植物甾醇月桂酸酯的加入对Zeta值的影响没有显著规律；随着植物甾醇月桂酸酯含量的增加，月桂酸酯的含量为1mg、2mg时，辅酶Q10包封率为93％以上；含量为3mg、4mg时，包封率为90％以下；因此，植物甾醇月桂酸酯的加入量为1-2mg时辅酶Q10包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当辅酶Q10的量在5-10mg时复合脂质体的粒径为70nm左右，PDI值变化不大；当量为15mg、20mg、25mg时，粒径明显增大为120nm以上，PDI值也增加至0.4以上,辅酶Q10的加入量对zeta值的影响较小，无明显规律；辅酶Q10的量为5-10mg时，包封率在92％以上；辅酶Q10的含量在5mg-25mg时，包封率逐渐降低，均在84％以下；因此，辅酶Q10的加入量为5-10mg时包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当吐温-80的量为0-10mg时，复合脂质体的粒径为245.8nm和101.59nm，PDI值也在0.4左右；当吐温-80的量为20-50mg时，粒径在60-80nm范围内，PDI值在0.232-0.281之间，均小于0.3，复合脂质体的分散度较高，吐温-80的量对电位的变化没有明显规律；当吐温-80的量为0mg时，辅酶Q10的包封率低于40％，随着吐温的含量从10mg逐渐增加到了40mg时，辅酶Q10的包封率达到峰值，当吐温含量再增加时，包封率又出现了下降的趋势；
当PBS的pH值为7.0时，复合脂质体的粒径为81.25nm；当PBS的pH值为7.2-8.0时，复合脂质体的粒径接近70nm，PDI值无明显变化，pH值的变化对于复合脂质体的电位影响没有显著规律；当pH值为7.4时，复合脂质体对辅酶Q10的包封率达到94％以上，复合脂质体分散比较均匀；当pH值为7.0、7.2、7.6、7.8时，辅酶Q10的包封率均在90％以上，没有较大波动，表明PBS的pH值在比较小的范围内波动时，对包封率的变化的影响比较小。
本发明的有益效果是：该植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，通过用高效液相法对辅酶Q10的含量测定，通过浓度与峰面积之间的关系确立了辅酶Q10标准曲线和对应的关系式；通过对植物甾醇月桂酸酯、辅酶Q10的量、吐温的量三个单因素实验，建立了三因素三水平的响应面设计优化方案，确立了植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺条件，其次对稳定性进行测试，盐溶液的稳定性、酸碱溶液的稳定性、植物甾醇月桂酸酯的量，吐温的量，辅酶Q10的量制备得到的复合脂质体呈现球形，表面光滑，没有明显的凹陷；复合脂质体具有均匀的结构分布以及良好的表面质量，并具有良好的包封率。
附图说明
图1为本发明的辅酶Q10标准工作曲线示意图；
图2为本发明的植物甾醇月桂酸酯量与包封率关系图；
图3为本发明的辅酶Q10量与包封率之间的关系图；
图4为本发明的吐温-80含量与包封率之间的关系图；
图5为本发明的PBS不同pH值与包封率之间的关系图；
图6为本发明的响应面实验设计方案及结果；
图7为本发明的回归模型二次方差分析表；
图8为本发明的辅酶Q10和月桂酸酯交互等高线和响应面示意图；
图9为本发明的吐温-80和月桂酸酯交互等高线和响应面示意图；
图10为本发明的辅酶Q10和吐温-80交互等高线和响应面示意图；
图11为本发明制备得到的月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体透射电镜图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下面给出具体实施例。
参见图1-11，一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，包括以下步骤：
步骤S1：磷酸盐缓冲溶液的配置；
用电子天平精确称取4.7991g磷酸氢二钠、1.0297g的磷酸二氢钠，8.500g的NaCl置于1L的烧杯用超纯水溶解，用1mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH,定容至1L，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
步骤S2：辅酶Q10标准曲线的绘制；
用电子天平准确称取0.0030g的辅酶Q10的标准品，用无水乙醇超声溶解，并定容于25mL容量瓶中；分别移取10mL、5mL、4mL、2mL、1mL、0.5mL的辅酶Q10标准溶液，用无水乙醇定容于10mL的容量瓶中，得到浓度为120μg/mL、60μg/mL、24μg/mL、12μg/mL、6μg/mL的辅酶Q10溶液，采用高效液相色谱测量峰面积，根据不同浓度辅酶Q10溶液的峰面积绘制峰面积与浓度关系的标准工作曲线；
步骤S3：通过高效液相法测定辅酶Q10的包封率及保留率；
高效液相色谱条件：C18柱，3.9nm×150nm的不锈钢色谱柱，直径为4μm；流动相为甲醇：正己烷＝4：1；柱温30℃；流速为0.8ml/min；检测波长275nm；进样量10μL，
包埋辅酶Q10量＝辅酶Q10总含量-游离辅酶Q10的量；
步骤S4：复合脂质体的制备；
利用电子天平准确称取40mg吐温-80、80mg大豆磷脂、2mg月桂酸酯、8mg辅酶Q10于100mL圆底烧瓶，加入10mL有机溶剂溶解，有机溶剂选用氯仿：甲醇＝2：1的比例配制；放置30分钟以上后进行减压旋转蒸发，除去有机溶剂，旋蒸过程中控制真空泵压力，0.02MPa条件下10min，0.04MPa条件下10min，0.05MPa条件下10min，压力保持30min,在瓶壁上形成均匀的薄膜，加入10mLpH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，再次控制压力为0.02MPa旋蒸10min，把薄膜完全洗脱下来，用超声乳化分散器在冰水浴环境下探针式超声8min，超声功率：200w；频率：1s开/1s关，得到澄清透亮的溶液，置于冰箱冷藏备用；
步骤S5：复合脂质体的表征包括包封率的测定和粒径、多相分散系数、电位的测定；
包封率的测定包括：吸取1mL制备好的脂质体于试管中，加入3mL的正己烷，用Vortex-1漩涡振荡机振荡3min，然后放入离心机中离心，设置参数3000r/min，温度4-6℃，离心时间5min，离心完之后吸取上层清液于50mL烧瓶中，重复上述步骤两次，将两次吸取的上层清液合并在一起，用旋转蒸发仪旋干，然后用无水乙醇冲洗下来，定容于5mL棕色容量瓶中，之后用1mL的注射器吸取定容完的液体，用0.22μm的滤头过滤于棕色液相小瓶待测；
粒径、多相分散系数、电位的测定包括：
平均粒径的测定：运用激光纳米粒度仪检测脂质体的平均粒径及多相分散系数；设置参数为温度25℃，平衡稳定时间20s，运行次数14次,间隔时间1s，稳定时间2s；将脂质体样品用超纯水稀释100倍；每个样品重复测定3次取平均值；脂质体的粒径越小，可利用度越高，PDI即多项分散系数，数值越大表示脂质体分散越不均匀，一般选择PDI小于0.3；
电位的测定：运用激光纳米粒度仪测定脂质体的电位，温度设置为25℃，平衡稳定时间为120s，最大运行20s，稳定时间2s；脂质体样品用超纯水稀释100倍后进行测定，分别测量3次取平均值；Zeta电位的绝对值越大，粒子之间的排斥力越大，表示脂质体越稳定；
透射电子显微镜表征方法：将上述制备的脂质体用超纯水稀释至一定浓度，采用负染法对脂质体样品进行微观形貌观测。用注射器将稀释的脂质体滴至铜网上，铜网的孔径选用300目规格，放置10min后，用滤纸小心吸去铜网上多余的液体，滴加适量的2％磷钨酸进行负染8min，然后用滤纸吸去多余的磷钨酸，用透射电子显微镜进行观察；
步骤S6：复合脂质体的制备条件优化以及影响因素的考察：影响单因素的实验包括植物甾醇月桂酸酯的量、辅酶Q10的量、吐温-80的量、缓冲溶液的pH；
复合脂质体的影响单因素的考察：
植物甾醇月桂酸酯的量：在制备脂质体过程中，改变植物甾醇月桂酸酯的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的植物甾醇月桂酸酯，分别为1mg、2mg、3mg、4mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg；
辅酶Q10的量：在制备脂质体过程中，改变辅酶Q10的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的辅酶Q10，分别为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg；
吐温-80的量：在制备脂质体过程中，改变吐温-80的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的吐温-80，分别为0mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg，大豆磷脂酰胆碱为80mg，辅酶Q10为10mg；
缓冲溶液的pH：制备脂质体过程中，只改变PBS即缓冲溶液的pH值，保持其他因素不变，配置缓冲溶液的pH分别为7.0、7.2,、7.4、7.6、7.8，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg，月桂酸酯2mg；
采用Box-Behnken实验设计，优化上述对包埋率影响显著的因素，通过二次多项式回归拟合，结合方差分析及各因素相互交互作用，确定植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10脂质体的最佳制备工艺条件；
参见图1，得出辅酶Q10含量与峰面积之间的关系式：
y＝11687x+2640.9
其中，y表示峰面积，x表示辅酶Q10的浓度，得出辅酶Q10浓度在6-120μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系；
当植物甾醇月桂酸酯的量1-3mg时，复合脂质体粒径为70nm左右；4mg时，脂质体粒径明显增加至103.99nm；植物甾醇月桂酸酯的量为1-2mg时，PDI值没有明显变化；而在3-4mg时，PDI值明显增大，但均小于0.3；植物甾醇月桂酸酯的加入对Zeta值的影响没有显著规律；参见图2，随着植物甾醇月桂酸酯含量的增加，月桂酸酯的含量为1mg、2mg时，辅酶Q10包封率为93％以上；含量为3mg、4mg时，包封率为90％以下；因此，植物甾醇月桂酸酯的加入量为1-2mg时辅酶Q10包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当辅酶Q10的量在5-10mg时复合脂质体的粒径为70nm左右，PDI值变化不大；当量为15mg、20mg、25mg时，粒径明显增大为120nm以上，PDI值也增加至0.4以上,辅酶Q10的加入量对zeta值的影响较小，无明显规律；参见图3，辅酶Q10的量为5-10mg时，包封率在92％以上；辅酶Q10的含量在5mg-25mg时，包封率逐渐降低，均在84％以下；因此，辅酶Q10的加入量为5-10mg时包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当吐温-80的量为0-10mg时，复合脂质体的粒径为245.8nm和101.59nm，PDI值也在0.4左右；当吐温-80的量为20-50mg时，粒径在60-80nm范围内，PDI值在0.232-0.281之间，均小于0.3，复合脂质体的分散度较高，吐温-80的量对电位的变化没有明显规律；参见图4，当吐温-80的量为0mg时，辅酶Q10的包封率低于40％，随着吐温的含量从10mg逐渐增加到了40mg时，辅酶Q10的包封率达到峰值，当吐温含量再增加时，包封率又出现了下降的趋势；
当PBS的pH值为7.0时，复合脂质体的粒径为81.25nm；当PBS的pH值为7.2-8.0时，复合脂质体的粒径接近70nm，PDI值无明显变化，pH值的变化对于复合脂质体的电位影响没有显著规律；参见图5，当pH值为7.4时，复合脂质体对辅酶Q10的包封率达到94％以上，复合脂质体分散比较均匀；当pH值为7.0、7.2、7.6、7.8时，辅酶Q10的包封率均在90％以上，没有较大波动，表明PBS的pH值在比较小的范围内波动时，对包封率的变化的影响比较小；
步骤S7：响应面法优化实验：结合单因素试验，以辅酶Q10的包封率为重要参考指标，设计三因素三水平共十七组实验，植物甾醇月桂酸酯的量为因素A，辅酶Q10的量为因素B，吐温-80的量为因素C，采用正交设计优选植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备条件处方，参见图6-7，通过响应面实验设计方案及结果，并进行多元回归方程拟合和方差分析，得到自变量的二次多项回归方程：
Y＝93.7-1.12A-3.19B+5.54C+1.65AB+0.9AC+1.83BC-3.84A2-1.11B2-3.91C2
响应面实验模型方差分析结果得出，回归模型极显著，P<0.0001；模型R2＝0.9819，表明实际结果与预测值一致，模型调整的相关系数R2＝0.9586，表明该模型中响应值的变化为95.86％由所选的自变量决定，进一步说明该模型能够准确预测出响应值与自变量之间的关系；P失拟项＝0.0526，不显著，表明模型误差较小，可用于预测实验结果；综上所述，该模型拟合程度良好，可以用于植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺优化；
一次项B、C，二次项A2、C2对于复合脂质体辅酶Q10包埋率的影响为极显著，P<0.01，一次项A；交互项AB、BC影响显著，p<0.05；
步骤S8：根据模型回归方程可知复合脂质体制备的优化工艺条件：月桂酸酯2mg，辅酶Q10为8mg，吐温-80为39mg，大豆磷脂80mg，PBS缓冲溶液的体积为10mL，水浴温度为50℃，理论的包封率为95.9％；
步骤S9：制备验证；
响应面曲率越大，等高线越密集，说明这两个影响因素的交互作用对包封率的影响较大；
参见图8-10，辅酶Q10和植物甾醇月桂酸酯交互对包封率的影响最为明显，月桂酸酯和吐温-80交互对包封率影响比较微弱，三个因素的交互对结果的影响为：AB>BC>AC。
根据响应面综合，脂质体的最佳制备工艺为：月桂酸酯2mg，辅酶Q10为8mg，吐温-80为39mg，大豆磷脂80mg，PBS缓冲溶液的体积为10mL，水浴温度为50℃，理论的包封率为95.9％，为了检验响应面优化结果的可靠性，采用上述制备工艺，制备脂质体，参见图11，测得复合脂质体的平均包封率为94％，与理论值的偏差1.9％，脂质体呈现球形，表面光滑，没有明显的凹陷，平均粒径在70nm左右，PDI在0.220，电位的绝对值在10mv左右。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：磷酸盐缓冲溶液的配置；
用电子天平精确称取4.7991g磷酸氢二钠、1.0297g的磷酸二氢钠，8.500g的NaCl置于1L的烧杯用超纯水溶解，用1mol/L的盐酸溶液和1mol/L的氢氧化钠溶液调节pH,定容至1L，得到pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；
步骤S2：辅酶Q10标准曲线的绘制；
用电子天平准确称取0.0030g的辅酶Q10的标准品，用无水乙醇超声溶解，并定容于25mL容量瓶中；分别移取10mL、5mL、4mL、2mL、1mL、0.5mL的辅酶Q10标准溶液，用无水乙醇定容于10mL的容量瓶中，得到浓度为120μg/mL、60μg/mL、24μg/mL、12μg/mL、6μg/mL的辅酶Q10溶液，采用高效液相色谱测量峰面积，根据不同浓度辅酶Q10溶液的峰面积绘制峰面积与浓度关系的标准工作曲线；
步骤S3：通过高效液相法测定辅酶Q10的包封率及保留率；
高效液相色谱条件：C18柱，3.9nm×150nm的不锈钢色谱柱，直径为4μm；流动相为甲醇：正己烷＝4：1；柱温30℃；流速为0.8ml/min；检测波长275nm；进样量10μL，
包埋辅酶Q10量＝辅酶Q10总含量-游离辅酶Q10的量；
步骤S4：复合脂质体的制备；
利用电子天平准确称取40mg吐温-80、80mg大豆磷脂、2mg月桂酸酯、8mg辅酶Q10于100mL圆底烧瓶，加入10mL有机溶剂溶解，放置30分钟以上后进行减压旋转蒸发，除去有机溶剂，旋蒸过程中控制真空泵压力，0.02MPa条件下10min，0.04MPa条件下10min，0.05MPa条件下10min，压力保持30min,在瓶壁上形成均匀的薄膜，加入10mL pH＝7.4的磷酸盐缓冲溶液，再次控制压力为0.02MPa旋蒸10min，把薄膜完全洗脱下来，用超声乳化分散器在冰水浴环境下探针式超声8min，超声功率：200w；频率：1s开/1s关，得到澄清透亮的溶液，置于冰箱冷藏备用；
步骤S5：复合脂质体的表征包括包封率的测定和粒径、多相分散系数、电位的测定；
步骤S6：复合脂质体的制备条件优化以及影响因素的考察：影响单因素的实验包括植物甾醇月桂酸酯的量、辅酶Q10的量、吐温-80的量、缓冲溶液的pH；
步骤S7：响应面法优化实验：结合单因素试验，以辅酶Q10的包封率为重要参考指标，设计三因素三水平共十七组实验，植物甾醇月桂酸酯的量为因素A，辅酶Q10的量为因素B，吐温-80的量为因素C，采用正交设计优选植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备条件处方，通过响应面实验设计方案及结果，并进行多元回归方程拟合和方差分析，得到自变量的二次多项回归方程：
Y＝93.7-1.12A-3.19B+5.54C+1.65AB+0.9AC+1.83BC-3.84A2-1.11B2-3.91C2
响应面实验模型方差分析结果得出，回归模型极显著，P<0.0001；模型R2＝0.9819，表明实际结果与预测值一致，模型调整的相关系数R2＝0.9586，表明该模型中响应值的变化为95.86％由所选的自变量决定，进一步说明该模型能够准确预测出响应值与自变量之间的关系；P失拟项＝0.0526，不显著，表明模型误差较小，可用于预测实验结果；综上所述，该模型拟合程度良好，可以用于植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺优化；
一次项B、C，二次项A2、C2对于复合脂质体辅酶Q10包埋率的影响为极显著，P<0.01，一次项A；交互项AB、BC影响显著，p<0.05；
步骤S8：根据模型回归方程可知复合脂质体制备的优化工艺条件：月桂酸酯2mg，辅酶Q10为8mg，吐温-80为39mg，大豆磷脂80mg，PBS缓冲溶液的体积为10mL，水浴温度为50℃，理论的包封率为95.9％；
步骤S9：制备验证。
2.根据权利要求1所述的植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，其特征在于，所述步骤S4中，有机溶剂选用氯仿：甲醇＝2：1的比例配制。
3.根据权利要求1所述的植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，其特征在于，所述步骤S5中，
包封率的测定包括：吸取1mL制备好的脂质体于试管中，加入3mL的正己烷，用Vortex-1漩涡振荡机振荡3min，然后放入离心机中离心，设置参数3000r/min，温度4-6℃，离心时间5min，离心完之后吸取上层清液于50mL烧瓶中，重复上述步骤两次，将两次吸取的上层清液合并在一起，用旋转蒸发仪旋干，然后用无水乙醇冲洗下来，定容于5mL棕色容量瓶中，之后用1mL的注射器吸取定容完的液体，用0.22μm的滤头过滤于棕色液相小瓶待测；
粒径、多相分散系数、电位的测定包括：
平均粒径的测定：运用激光纳米粒度仪检测脂质体的平均粒径及多相分散系数；设置参数为温度25℃，平衡稳定时间20s，运行次数14次,间隔时间1s，稳定时间2s；将脂质体样品用超纯水稀释100倍；每个样品重复测定3次取平均值；脂质体的粒径越小，可利用度越高，PDI即多项分散系数，数值越大表示脂质体分散越不均匀，一般选择PDI小于0.3；
电位的测定：运用激光纳米粒度仪测定脂质体的电位，温度设置为25℃，平衡稳定时间为120s，最大运行20s，稳定时间2s；脂质体样品用超纯水稀释100倍后进行测定，分别测量3次取平均值；Zeta电位的绝对值越大，粒子之间的排斥力越大，表示脂质体越稳定；
透射电子显微镜表征方法：将上述制备的脂质体用超纯水稀释至一定浓度，采用负染法对脂质体样品进行微观形貌观测。用注射器将稀释的脂质体滴至铜网上，铜网的孔径选用300目规格，放置10min后，用滤纸小心吸去铜网上多余的液体，滴加适量的2％磷钨酸进行负染8min，然后用滤纸吸去多余的磷钨酸，用透射电子显微镜进行观察。
4.根据权利要求1所述的植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10复合脂质体的制备工艺，其特征在于，所述步骤S6中，复合脂质体的影响单因素的考察：
植物甾醇月桂酸酯的量：在制备脂质体过程中，改变植物甾醇月桂酸酯的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的植物甾醇月桂酸酯，分别为1mg、2mg、3mg、4mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg；
辅酶Q10的量：在制备脂质体过程中，改变辅酶Q10的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的辅酶Q10，分别为5mg、10mg、15mg、20mg、25mg，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg；
吐温-80的量：在制备脂质体过程中，改变吐温-80的量，保持其他因素不变，准确称取不同量的吐温-80，分别为0mg、10mg、20mg、30mg、40mg、50mg，植物甾醇月桂酸酯为2mg，大豆磷脂酰胆碱为80mg，辅酶Q10为10mg；
缓冲溶液的pH：制备脂质体过程中，只改变PBS即缓冲溶液的pH值，保持其他因素不变，配置缓冲溶液的pH分别为7.0、7.2,、7.4、7.6、7.8，吐温-80为40mg,大豆磷脂酰胆碱为80mg,辅酶Q10为10mg，月桂酸酯2mg；
采用Box-Behnken实验设计，优化上述对包埋率影响显著的因素，通过二次多项式回归拟合，结合方差分析及各因素相互交互作用，确定植物甾醇月桂酸酯辅酶Q10脂质体的最佳制备工艺条件；
得出辅酶Q10含量与峰面积之间的关系式：
y＝11687x+2640.9
其中，y表示峰面积，x表示辅酶Q10的浓度，得出辅酶Q10浓度在6-120μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系；
当植物甾醇月桂酸酯的量1-3mg时，复合脂质体粒径为70nm左右；4mg时，脂质体粒径明显增加至103.99nm；植物甾醇月桂酸酯的量为1-2mg时，PDI值没有明显变化；而在3-4mg时，PDI值明显增大，但均小于0.3；植物甾醇月桂酸酯的加入对Zeta值的影响没有显著规律；随着植物甾醇月桂酸酯含量的增加，月桂酸酯的含量为1mg、2mg时，辅酶Q10包封率为93％以上；含量为3mg、4mg时，包封率为90％以下；因此，植物甾醇月桂酸酯的加入量为1-2mg时辅酶Q10包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当辅酶Q10的量在5-10mg时复合脂质体的粒径为70nm左右，PDI值变化不大；当量为15mg、20mg、25mg时，粒径明显增大为120nm以上，PDI值也增加至0.4以上,辅酶Q10的加入量对zeta值的影响较小，无明显规律；辅酶Q10的量为5-10mg时，包封率在92％以上；辅酶Q10的含量在5mg-25mg时，包封率逐渐降低，均在84％以下；因此，辅酶Q10的加入量为5-10mg时包封率较高，复合脂质体分散比较均匀；
当吐温-80的量为0-10mg时，复合脂质体的粒径为245.8nm和101.59nm，PDI值也在0.4左右；当吐温-80的量为20-50mg时，粒径在60-80nm范围内，PDI值在0.232-0.281之间，均小于0.3，复合脂质体的分散度较高，吐温-80的量对电位的变化没有明显规律；当吐温-80的量为0mg时，辅酶Q10的包封率低于40％，随着吐温的含量从10mg逐渐增加到了40mg时，辅酶Q10的包封率达到峰值，当吐温含量再增加时，包封率又出现了下降的趋势；
当PBS的pH值为7.0时，复合脂质体的粒径为81.25nm；当PBS的pH值为7.2-8.0时，复合脂质体的粒径接近70nm，PDI值无明显变化，pH值的变化对于复合脂质体的电位影响没有显著规律；当pH值为7.4时，复合脂质体对辅酶Q10的包封率达到94％以上，复合脂质体分散比较均匀；当pH值为7.0、7.2、7.6、7.8时，辅酶Q10的包封率均在90％以上，没有较大波动，表明PBS的pH值在比较小的范围内波动时，对包封率的变化的影响比较小。
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| JP2009062308A (ja) * | 2007-09-05 | 2009-03-26 | Cosmo Shokuhin Kk | リポソーム安定剤及びこれを含むリポソーム並びに食品 |
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| CN109463751A (zh) * | 2018-12-25 | 2019-03-15 | 江苏艾兰得营养品有限公司 | 一种辅酶q10脂质体的保健食品的制备方法 |
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2022
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