CN103877020B - 一种柠檬醛亚微乳及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柠檬醛亚微乳及其制备方法，所述如下方法制得：在10～30℃条件下将乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌均匀，在搅拌条件下滴加柠檬醛形成油相，再加入超纯水制得柠檬醛亚微乳，所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～3:0.25～1:1.5～5，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.02g/ml；本发明制得水包油型亚微乳剂的粒径较小，粒子分布均匀，稳定性好；通过鼻腔喷雾给药或者雾化吸入方式给药可以促进药物吸收，增加局部药物浓度；该亚微乳对哮喘大鼠的作用，将柠檬醛亚微乳采用雾化方式给药可以明显减轻哮喘大鼠的症状，为柠檬醛的临床应用奠定基础。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种亚微乳及制备，特别涉及一种柠檬醛亚微乳及其制备方法，该亚微乳具有抗哮喘作用，可以采用鼻腔喷雾或者雾化给药。
（二）背景技术
柠檬醛（citral），分子式为C10H16O，是一种从樟科木姜子属植物山苍子果实中提取得到的一种具有柠檬香味的单萜化合物，它含有α-柠檬醛和β-柠檬醛两种顺反异构体，它们均为柠檬醛的有效成分（罗曼,蒋立科.安徽黄山山苍子香精油成分GC-MS分析[J].作物研究,2006,3:256-258.），本专利所述的柠檬醛是指α-柠檬醛和β-柠檬醛顺反异构体组成的成分。柠檬醛是合成多种香料的主要原料，也是制药工业中重要的中间体。研究表明柠檬醛具有抗哮喘、抗肿瘤、抗氧化、抗过敏和抗菌等作用（周坚.山苍子油药理与临床研究进展[J].中西医结合杂志,1991,11(8):509-512）。但由于柠檬醛是萜烯类化合物，呈油状，水溶性差，性质不稳定，常温下易挥发且易氧化，使其应用受到一定限制。
目前国内关于山苍子油剂型的专利较少，关于柠檬醛剂型的研究则尚未发现。检索到相关山苍子油剂型的专利主要有：中国专利CN201110426466.4中介绍了一种山苍子油微胶囊悬浮剂及其制备方法，是一种农药制剂。中国专利CN201210140302.X叙述了一种山苍子油防霉防蛀缓释微胶囊及其制备方法，是一种防霉防蛀剂。本发明根据亚微乳具有保护脂溶性药物、提高药物稳定性、延长药物作用时间、不良反应少等特点，并利用药用级乳化剂吐温80和司盘80毒性极小的特点，将其作为混合乳化剂，且加入助乳化剂和稳定剂，将柠檬醛制成O/W型的亚微乳剂，可提高柠檬醛的溶解度及稳定性，便于其更好地发挥药物作用。本发明通过工艺优化将柠檬醛制成亚微乳，对其理化性质进行考察，并通过药理实验探讨该亚微乳的抗哮喘作用，为其在临床上的应用提供实验依据。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种柠檬醛亚微乳及其制备方法，该制剂是一种水包油型（O/W）亚微乳，在药用级乳化剂吐温80和司盘80的作用下，加入助乳化剂如甘油，稳定剂如卵磷脂，使其和乳化剂混和均匀后，加入主药柠檬醛，最后加入水相，使柠檬醛包裹在水中，形成水包油型的亚微乳，增加了柠檬醛的稳定性，可以减少过敏反应等。亚微乳与体液相容性好，无限稀释亦不会产生大于1μm的不溶性颗粒。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种柠檬醛亚微乳，所述柠檬醛亚微乳由如下方法制得：在10～30℃条件下将乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌均匀，在搅拌条件下滴加柠檬醛形成油相，再加入超纯水制得柠檬醛亚微乳，所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～3:0.25～1:1.5～5，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.02g/ml；所述乳化剂为非离子表面活性剂，所述助乳化剂为甘油或聚乙二醇（分子量为400），所述稳定剂为卵磷脂（99%，食品级，苏州鑫发生物科技有限公司）。
进一步，优选所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～2:0.25～0.75:1.5～5，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.015g/ml。
进一步，优选所述乳化剂为吐温80（即聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯）与司盘80（即山梨糖醇酐单油酸酯）以体积比1:1～3组成的混合物。
更进一步，所述柠檬醛亚微乳配方优选为：所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比1:0.5～2:0.25:2，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.01g/ml；所述乳化剂为吐温80与司盘80以体积比1:1～3组成的混合物，所述助乳化剂为甘油，所述稳定剂为卵磷脂。
本发明还提供一种制备所述柠檬醛亚微乳的方法，所述方法为：在10～30℃条件下，将乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌均匀（优选搅拌速率为10000～15000r/min），在搅拌条件下滴加柠檬醛形成油相，滴加完毕后加入超纯水，以10000～20000r/min的转速搅拌2～5min，获得水包油型（O/W）柠檬醛亚微乳；所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和水体积比为1:0.5～3:0.25～1:1.5～5，所述稳定剂卵磷脂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.02g/ml。
本发明所述柠檬醛是从山苍子油中减压精馏得到的柠檬醛，方法参照（和承尧,于军.减压精馏法分离提取柠檬醛[J].云南化工,2005,32(5):9-12.）通过GC-MS检测其柠檬醛总含量≥95%。
所述超纯水是指将娃哈哈纯净水经美国Millipore超纯水系统（型号Milli-Q）处理得到的超纯水，其电阻率为18.2MΩ.cm。
本发明柠檬醛亚微乳可以制成鼻腔喷雾剂和雾化吸入剂等，通过鼻腔喷雾给药或者雾化给药可用于哮喘治疗。
本发明柠檬醛亚微乳中乳化剂是该亚微乳的重要成分，采用药用级非离子型表面活性剂，吐温80和司盘80。助乳化剂的应用有利于控制和减小乳滴粒径，本发明中选用甘油或聚乙二醇，优选甘油。稳定剂可以提高油水界面膜的稳定性，使制得的亚微乳外观更好，性质更稳定。本发明中选用天然磷脂类，优选卵磷脂。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明乳化剂采用药用级吐温80和药用级司盘80组成的混合物，属于非离子型表面活性剂，具有相容性较好，毒副作用极小，不易发生配伍变化等特点，加入助乳化剂和稳定剂，采用高速乳化机搅拌，制得水包油型亚微乳剂的粒径较小，粒子分布均匀，稳定性好；通过鼻腔喷雾给药或者雾化吸入方式给药可以促进药物吸收，增加局部药物浓度；进行药理实验观察该亚微乳对哮喘大鼠的作用，将柠檬醛亚微乳采用雾化方式给药可以明显减轻哮喘大鼠的症状，为柠檬醛的临床应用奠定基础。
（四）附图说明
图1为α-柠檬醛的标准曲线图。
图2为β-柠檬醛的标准曲线图
图3为实施例1柠檬醛亚微乳的粒径分布图。
图4为实施例1柠檬醛亚微乳的Zeta电位图。
图5为HE染色图片（×400），图中A为空白组，B为模型组，C为阳性对照组，D为柠檬醛亚微乳低剂量组，E为柠檬醛亚微乳中剂量组，F为柠檬醛亚微乳高剂量组，G为柠檬醛低剂量组，H为柠檬醛中剂量组，I为柠檬醛高剂量组。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
柠檬醛亚微乳组成：
柠檬醛：乳化剂：甘油：超纯水=1:0.5:0.25:2（体积比），乳化剂为吐温80：司盘80=1:2（体积比）的混合，卵磷脂质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005g/ml。
制备方法：在25℃条件下，分别取0.33ml吐温80、0.66ml司盘80、甘油0.5ml、卵磷脂10mg在10000r/min的速度下搅拌混溶，加入柠檬醛2ml，形成油相，再加入4ml超纯水到上述油相中，使其在乳化机（型号IKA T18，厂家：德国IKA伊卡集团有限公司）中以15500r/min的速度搅拌4min，即得水包油（O/W）型柠檬醛亚微乳。
柠檬醛亚微乳的性能测试：
（1）柠檬醛亚微乳的包封率测定：
主要采用GC-MS（型号7890A GC-5975C MSD，厂家：美国Agilent公司），条件：色谱柱HP-5MS5%Phenyl Methyl Siloxane（30m×0.25μm×0.25mm）；载气：He；柱温：初始温度50℃保持2min，以2℃/min升至115℃，再以5℃/min升至180℃，再以2℃/min升至200℃，并保持10min；进样口温度250℃；载气流量1.0ml/min；进样量1μl；分流模式进样，分流比20:1。离子源：EI电离源；电子能量70eV；光电倍增器管电压200V；四级杆温度150℃；离子源温度230℃；溶剂延迟8min；离子源扫描范围10-600m/z。
方法是：精密量取实施例1制备的柠檬醛亚微乳1.0ml，加适量丙酮破乳并定容100ml，得柠檬醛亚微乳破乳溶液。再精密量取实施例1制备的1ml柠檬醛亚微乳，在4℃、10000r/min条件下离心30min，取50μl下层水溶液用丙酮稀释10倍获得丙酮稀释液，再取0.5ml柠檬醛亚微乳破乳溶液，分别进样，平行进样三次，进样量均为1μl。采用峰面积归一化法，根据柠檬醛标准曲线定量，柠檬醛经GC-MS分析是由α-柠檬醛和β-柠檬醛的混合物，它们是顺反异构体，根据柠檬醛对照品溶液的α-柠檬醛标准曲线方程对α-柠檬醛定量，根据β-柠檬醛标准曲线方程对β-柠檬醛定量。α-柠檬醛的线性回归方程为：y=(4.817×106)x+4.445×105（r2为0.999），β-柠檬醛的线性回归方程为：y=(5.600×106)x+4.854×105（r2为0.999），得出该亚微乳离心后水溶液中游离柠檬醛浓度及柠檬醛亚微乳破乳溶液中柠檬醛浓度，乘以各自的稀释倍数，即得游离柠檬醛的重量(W游离)及亚微乳中柠檬醛的总重量(W总)，根据公式:包封率=［(W总－W游离)/W总］×100%，计算得出该制剂中柠檬醛的平均包封率为91.25%。
柠檬醛标准曲线的制备：精密吸取质量浓度97%柠檬醛标准溶液（批号49277，厂家：上海晶纯实业有限公司）5、10、15、25、30μl，分别加入到5个10ml的容量瓶中，分别用丙酮溶解并定容，摇匀，采用孔径为0.22μm的聚醚砜有机膜(厂家：德国MEMBRANA公司)过滤，分别量取1.5ml透过液放入相应进样瓶中，进行GC-MS定性定量分析，分别以标准品中相应柠檬醛的质量浓度作为相应标准曲线的横坐标，质谱中碎片离子峰的响应值作为相应标准曲线的纵坐标，分别获得α-柠檬醛标准曲线和β-柠檬醛标准曲线。α-柠檬醛标准曲线和β-柠檬醛的标准曲线分别见图1和图2。
（2）柠檬醛亚微乳粒径和Zeta电位的测定：
采用Nano-ZS90激光纳米粒度分析仪（型号Nano-ZS90，厂家：英国Malvern仪器有限公司）测定实施例1柠檬醛亚微乳，结果表明，该亚微乳粒径体积较小，分布范围较窄而且分布均匀。多分散指数PDI为0.111，平均粒径为237nm，如图3所示，平均Zeta电位为-28.7mV，如图4所示。
（3）柠檬醛亚微乳稳定性常数KE的测定：
取3ml实施例1制备的柠檬醛亚微乳置于5ml离心试管中，以4000r/min转速离心15min，用移液枪量取试管底部水溶液50μl用超纯水稀释200倍，摇匀，以超纯水为空白，在500nm波长处测定吸光度。同法从未经离心的柠檬醛亚微乳中精密量取底部亚微乳溶液50μl，稀释相同倍数，同法测定，稳定性常数KE计算公式如下：KE=(A0-A)/A0×100%，0<KE<1，其中A0为未离心的离心管底部柠檬醛亚微乳稀释液在500nm波长处的吸光度；A为设定条件下经离心后离心管底部柠檬醛亚微乳稀释液在500nm波长处测得的吸光度。结果，实施例1的KE值为0.12。稳定性常数KE值越小说明分散油滴在离心力作用下上浮或下沉的速度越小，因此可知实施例1的稳定性好。
（4）柠檬醛亚微乳的稳定性试验：
量取3ml实施例1制备的柠檬醛亚微乳置于离心管中，以4000r/min转速离心20min，观察乳剂柠檬醛亚微乳的离心稳定性；把乳剂置于40℃的恒温水浴环境中，加热24h后取出，放入4℃冰箱中冷藏24h，考察该乳剂的耐热和耐寒稳定性；取适量乳剂常温下储存在玻璃瓶中，密封，观察放置6个月后的乳剂有无分层现象，考察其长期稳定性。
稳定性试验结果表明：实施例1柠檬醛亚微乳为均匀的乳白色亚微乳，未出现分层，柠檬醛亚微乳的离心稳定性、耐热和耐寒稳定性及长期放样稳定性较好。
（5）柠檬醛亚微乳对哮喘大鼠的作用：
分组：选用成年雄性Wistar大鼠90只，体重200-220g，随机分为9组，即空白组（组1）、模型组（组2）、阳性对照组（布地奈德雾化液组，厂家：AstraZeneca澳大利亚公司，组3）、柠檬醛亚微乳低剂量组（低剂量组，组4）、柠檬醛亚微乳中剂量组（中剂量组，组5）、柠檬亚微乳醛高剂量组（高剂量组，组6）、柠檬醛低剂量组（组7）、柠檬醛中剂量组（组8）、柠檬醛高剂量组（组9），每组10只，其中，柠檬醛亚微乳均取自实施例1。
哮喘模型的制备：大鼠为SPF级，在浙江中医药大学实验动物研究中心SPF级环境中正常饲养。除空白组外，其余各组（组2-组9）第1天于两后脚掌和两腹股沟四点皮下注射质量浓度为0.1%的鸡卵白蛋白（OVA，Grade V，美国Sigma公司，用10%的氢氧化铝凝胶溶解，使其质量浓度为0.1%)每点注射0.2ml，并腹腔注射0.2ml进行致敏，共1ml；组1以同样的注射方式给予等量的生理盐水。第8天组2-组9于腹腔注射1ml0.1wt%的OVA进行致敏，组1腹腔注射等量的生理盐水致敏。第15天开始，组2、组3、组7、组8和组9分别给予1%的OVA溶液，通过超声雾化器，以最大雾化量雾化激发，每日1次，每次30min，共激发4周。空白组（组1）用等量生理盐水激发。组3在OVA雾化攻击前2h进行雾化给药1mg/ml布地奈德50ml；组4、组5和组6分别给予用生理盐水溶解并配制质量浓度分别为20mg/ml、40mg/ml、60mg/ml柠檬醛亚微乳溶液（按实施例1制备的柠檬醛亚微乳）各50ml。组7、组8和组9分别雾化给药柠檬醛1000mg、2000mg、3000mg。组1、组2雾化给予等量生理盐水，每日1次，每次30min，连续4周。大鼠末次OVA雾化攻击24h后，麻醉处死，取左肺用4%多聚甲醛溶液充分固定，行脱水、石蜡包埋、病理切片，苏木精-伊红（HE）染色，显微镜下观察大鼠肺组织病理变化情况。结果见图5。
肺组织病理切片结果表明：空白组大鼠肺部正常，而模型组大鼠肺部炎性细胞浸润、上皮损伤，平滑肌增厚；阳性对照（布地奈德）组肺部平滑肌厚度趋于正常；柠檬醛低、中、高剂量组与模型组比较，其炎性细胞浸润略减少，上皮损伤略减轻；柠檬醛亚微乳低、中、高剂量组肺部炎症与模型组比较炎性细胞浸润减少，上皮损伤减轻，柠檬醛亚微乳高剂量组，上皮损伤明显减轻，平滑肌厚度明显减少，炎性细胞浸润明显减少。这表明柠檬醛亚微乳治疗效果比柠檬醛更明显，这是因为柠檬醛亚微乳相比于柠檬醛，具有提高药物稳定性、延长药物作用时间的特点，其药效作用也更持久。因此，柠檬醛亚微乳对哮喘具有较好的治疗效果。
实施例2
柠檬醛亚微乳组成：
柠檬醛：乳化剂：聚乙二醇：超纯水=1:1:0.25:2（体积比），乳化剂为吐温80：司盘80=1:3（体积比）的混合，卵磷脂质量用量以柠檬醛体积用量计为0.01g/ml。
制备方法同实施例1，温度条件是20℃。实施例2柠檬醛亚微乳的性能测试方法同实施例1。测得3批柠檬醛亚微乳平均包封率为87%，多分散指数PDI为0.204，平均粒径为269nm，平均Zeta电位为-27.6mV，稳定性常数KE值为0.20。稳定性试验结果表明该3批柠檬醛亚微乳稳定性较好。
实施例3
柠檬醛亚微乳组成：
柠檬醛：乳化剂：甘油：超纯水=1:2:0.25:2（体积比），乳化剂为吐温80：司盘80=1:1（体积比）的混合，卵磷脂质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005g/ml。
制备方法同实施例1，温度条件是10℃。实施例3柠檬醛亚微乳的性能测试方法同实施例1。测得3批柠檬醛亚微乳平均包封率为83%，多分散指数PDI为0.219，平均粒径为260nm，平均Zeta电位为-26.5mV，稳定性常数KE值为0.29。稳定性试验结果表明该3批柠檬醛亚微乳稳定性较好。
实施例4
柠檬醛亚微乳组成：
柠檬醛：乳化剂：甘油：超纯水=1:0.5:0.25:1.5（体积比），乳化剂为吐温80：司盘80=1:2（体积比）的混合，卵磷脂质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005g/ml。
制备方法同实施例1，温度条件是30℃。实施例4柠檬醛亚微乳的性能测试方法同实施例1。测得3批柠檬醛亚微乳平均包封率为84%，多分散指数PDI为0.234，平均粒径为277nm，平均Zeta电位为-25.8mV，稳定性常数KE值为0.31。稳定性试验结果表明该3批柠檬醛亚微乳稳定性较好。
实施例5
柠檬醛亚微乳组成：
柠檬醛：乳化剂：甘油：超纯水=1:3:1:5（体积比），乳化剂为吐温80：司盘80=1:3（体积比）的混合，卵磷脂质量用量以柠檬醛体积用量计为0.02g/ml。
制备方法同实施例1，温度条件是25℃。实施例5柠檬醛亚微乳的性能测试方法同实施例1。测得3批柠檬醛亚微乳平均包封率为81%，多分散指数PDI为0.238，平均粒径为298nm，平均Zeta电位为-25.8mV，测得平均包封率为81%，稳定性常数KE值为0.34。稳定性试验结果表明该3批柠檬醛亚微乳稳定性较好。
Claims (5)
1.一种柠檬醛亚微乳，其特征在于所述柠檬醛亚微乳由如下方法制得：在10～30℃条件下将乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌均匀，在搅拌条件下滴加柠檬醛形成油相，再加入超纯水制得柠檬醛亚微乳，所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～3:0.25～1:1.5～5，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.02g/ml；所述乳化剂为吐温80与司盘80以体积比1:1～3成的混合物，所述助乳化剂为甘油或聚乙二醇，所述稳定剂为卵磷脂。
2.如权利要求1所述柠檬醛亚微乳，其特征在于所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～2:0.25～0.75:1.5～5，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.015g/ml。
3.如权利要求1所述柠檬醛亚微乳，其特征在于所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～2:0.25:2，所述稳定剂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.01g/ml；所述乳化剂为吐温80与司盘80以体积比1:1～3组成的混合物，所述助乳化剂为甘油，所述稳定剂为卵磷脂。
4.如权利要求1所述柠檬醛亚微乳，其特征在于所述柠檬醛亚微乳按如下方法制备：在10～30℃条件下，将乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌均匀，在搅拌条件下滴加柠檬醛形成油相，滴加完毕后加入超纯水，以10000～20000r/min的转速搅拌2～5min，获得柠檬醛亚微乳；所述柠檬醛与乳化剂、助乳化剂和超纯水体积比为1:0.5～3:0.25～1:1.5～5，所述稳定剂卵磷脂的质量用量以柠檬醛体积用量计为0.005～0.02g/ml。
5.如权利要求4所述柠檬醛亚微乳的制备方法，其特征在于所述乳化剂、助乳化剂和稳定剂混合后搅拌速率为10000～15000r/min。
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