JP2009057351A - 抗コレステロール剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ローヤルゼリーのエタノール溶液から、クロロホルム、酢酸エチル、およびn−ブタノール可溶性成分を除去して得られた酸性の水溶性抽出物およびローヤルゼリー中の成分の内、分子量10,000以下でかつ酸性の水溶性抽出物は、スクアレンエポキシダーゼ(SE)遺伝子の発現抑制作用を有する。よって、これらの水溶性抽出物は抗コレステロール剤として有用である。
【選択図】図1
Description
本発明は、ローヤルゼリー(RJ)由来の成分を有効成分とする抗コレステロール剤に関する。
RJは、血清コレステロールおよび脂質低下作用ならびに四塩化炭素による肝臓障害の改善作用など特に肝臓に対して多くの薬理作用を示す。
(1)RJ50%エタノール抽出物の作成
RJ ((株)クヰンビーガーデン社製、中国浙江省産)50gに50%エタノール溶液500mLを加え、10分間攪拌し、1時間超音波処理を行なった。さらに4℃中において、遠心分離(8000rpm、10分間)後、濾紙(No.2)により濾過した。ろ液は、ロータリーエバポレーターにより濃縮した後、凍結乾燥させた。この50%エタノール抽出物は、使用直前まで-4℃にて冷蔵保存した。
(a) HepG2細胞およびNMuLi細胞の培養および継代
HepG2細胞(ヒト肝由来癌細胞)およびNMuLi細胞(マウス肝由来細胞)(いずれも、大日本住友製薬株式会社製)は、同一の方法により培養および継代を行なった。細胞培養のための培地は、growth mediumを用いた。該growth mediumは、ダルベッコ変法イーグル培地DMEM培地(500mL)を恒温槽にて37℃で温め、そこに非動化した10%子ウシ血清(MOREGATE、50mL)および100ng/mL Penicillin・Streptomycin(5mL)を添加し、作成した。子ウシ血清の非動化は、子ウシ血清を、56℃で30分間処理することにより行った。非動化後、使用時まで-20℃にて保存した。
(i) RJ50%エタノール抽出物のSEの遺伝子発現に対する影響
まず、前記growth mediumにRJ50%エタノール抽出物を0mg/mL、0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.2mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、および1.0mg/mLの濃度となるように添加した。さらに、各培地にcholesterol(10mg/mL)を0.2μg/mLの濃度となるように添加した。
HepG2細胞およびNMuLi細胞からのRNAの抽出は、RNA抽出キットRNAgente totalRNA Isolation system(Promega)を使用して行った。回収した前記細胞にDenaturarion Solution(200μL)を添加し、ボルテックスを用いてホモジネートした。さらに2M Sodium Acetateを20μL添加し、ボルテックスにより攪拌した後、200μL Phenol/Choloroformを加えた。再度、ボルテックスにより攪拌し、15分間氷中にて放置した後、遠心分離(4℃、15000rpm、20分間)を行った。その後、上層を除き、下層と等量のイソプロパノールを加えた。-20℃で5分間放置し、遠心分離(4℃、15000rpm、10分間)後、RNAの沈殿を得た。さらに、その沈殿を200μLの 70%エタノールを用いて濯いだ。遠心分離(15000rpm、5分間)後、沈殿をDry upし、30μL DEPC H2Oにより溶解し、Total RNA溶液を得た。Total RNAの一部を1000倍希釈し、試料のOD260nmおよびOD280nmを分光光度計により測定し、RNAおよびタンパク質の濃度を測定した。
逆転写反応
RNAからcDNAの合成は、ExScriptTMRT reagent Kit(Takara社製)を用いて行った。以下のような組成に溶液を調製し、一反応20μL当たり200ngのTotal RNAを添加し、逆転写反応(42℃で10分間、95℃で2分間)を行い、cDNAを合成した。
試薬 用量
5×ExScriptTMBuffer 4.0μL
dNTP Mixture 1.0μL
Oligo dT Primer 1.0μL
ExScriptTMRtase 0.5μL
RNase Inhibitor 0.5μL
Total RNA 2.0μL
RNase Feed H2O 11.0μL
──────────────────────────
合計 20.0μL
RT-PCRに、以下のプライマーを用いた。
Human Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH):
・GCACCGTCAAGGCTGAGAAC (Forward)
・TGGTGAAGACGCCAGTGGA (Reverse)
Human SE:
・TTGTGATGGGAGTTCAGTACAAGGA (Forward)
・CAGCATGATTTGCTTTAAACTGTGG (Reverse)
Human HMG-CoA reductase:
・GCCTGGCTCGAAACATCTGAA (Forward)
・CTGACCTGGACTGGAAACGGATA (Reverse)
Human LDLR:
・CAACGGCTCAGACGAGCAAG (Forward)
・AGTCACAGACGAACTGCCGAGA (Reverse)
Human SREB-1:
・GGCTCCTGCCTACAGCTTCT (Forward)
・CAGCCAGTGGATCACCACA (Reverse)
Human SREB-2:
・TATGGAGCAGCCTCAACGTCAG (Forward)
・CCGTAGCGACAGTAGCAGGTCA (Reverse)
Mouse GAPDH:
・AAATGGTGAAGGTCGGTGTG (Forward)
・TGAAGGGGTCGTTGATGG (Reverse)
Mouse SE:
・CATGGCTGAACAAATTTACCCACA (Forward)
・CCGCAGACGACCATTCTGAG (Reverse)
SYBR Premix Ex Taq 10μL 450μL
Primer Forward 50μM 0.08μL 3.6μL
Primer Reverse 50μM 0.08μL 3.6μL
DyeII 0.40μL 18μL
滅菌MilliQ水 7.44μL 334.8μL
─────────────────────────────
合計 18μL 810μL
まず、cDNAを95℃で10秒間変性し、次に95℃で5秒間アニーリングを行い、その後60℃で35秒間伸長反応を行う。これを40サイクル繰り返す。その後、さらに95℃で15秒間、60℃で60秒間、そして95℃で15秒間処理し、PCR反応を終了させた。
RJ水抽出画およびRJ50%エタノール抽出物を種々の濃度(0mg/mL、0.033mg/mL、0.075mg/mL、0.15mg/mL、0.3mg/mL、0.6mg/mL、および1.0mg/mL)により、前記growth mediumに添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度により添加した。
有機溶媒を用いたRJの成分分画は下記図3のように行った。まず、200mgのRJ50%エタノール抽出物を秤量し、水を5mL添加し、さらにクロロホルムを5mL添加した。ボルテックスにより試料を溶解した後、遠心分離(4℃、15000rpm、3分間)を行なった。H2O層を移し、再度クロロホルムを5mL添加し、攪拌後遠心分離を行い、2回分の分離溶液層を合わせ、クロロホルム層とした。次に、H2O層に酢酸エチル5mLを添加し、ボルテックスにより攪拌の後、遠心分離(4℃、15000rpm、3分間)を行った。H2O層に再度酢酸エチル5mLを添加し、攪拌後遠心分離を行い、クロロホルム層と同様に1回目と2回目の層を合わせ、酢酸エチル層とした。次に、H2O層に水飽和n-ブタノール5mL添加し、ボルテックスにより攪拌後、4℃、15000rpm、3分間遠心分離(4℃、15000rpm、3分間)を行なった。H2O層に再度水飽和n-ブタノール5mLを添加し、攪拌後遠心分離を行い、前述同様、2回分の層を合わせ、水飽和n-ブタノール層とした。得られた有機溶媒分離溶液は減圧下において溶媒を除去後、凍結乾燥を行なった。H2O層は凍結乾燥にかけた。
クロロホルム抽出画分、酢酸エチル抽出画分、水飽和n-ブタノール抽出画分、および水抽出画分をgrowth mediumに0mg/mL、0.3mg/mL、および1.0mg/mLの濃度となるよう添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度で添加した。
水抽出画分をgrowth mediumに0mg/mL、0.3mg/mL、および1.0mg/mLの濃度で添加した。さらに各培地にcholesterolを0.2μg/mLの濃度で添加した。
H2O抽出エキス(RJ水抽出画分)、RJ上清画分(RJを精製水に溶解して10%の濃度にし、その上清を凍結乾燥してサンプルを作成)、RJ UF10000画分(10%RJ水溶液を分子量10,000の限外ろ過膜(UF)で処理したろ液(分子量10,000以下の成分))を作成し、さらにそれらを培地に添加(0.5mg/mL)して培養肝細胞(HepG2)を培養し、24時間後の肝細胞からTotal RNAを抽出し、SEの遺伝子発現の変化をリアルタイムPCR(Applied Biosystems社製)により定量した。なお、前記H2O抽出エキスをpHメーター(Horiba社製)により測定した結果、pH4.51であった。
Claims (4)
- ローヤルゼリーのエタノール溶液から、クロロホルム、酢酸エチル、およびn−ブタノール可溶性成分を除去して得られた酸性の水溶性抽出物を有効成分とする、抗コレステロール剤。
- ローヤルゼリー中の成分の内、分子量10,000以下でかつ酸性の水溶性抽出物を有効成分とする、抗コレステロール剤。
- スクアレンエポキシダーゼ(SE)遺伝子の発現抑制作用を有する、請求項1または2に記載の抗コレステロール剤。
- Low density lipoprotein receptor (LDLR) の発現増加作用を有さない、請求項1または2に記載の抗コレステロール剤。
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2007
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