JP2009035499A - E−セレクチンの発現抑制剤及び美白剤の評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ボタンピ抽出物を含有する、ケラチノサイトに発現するELAM−1の発現抑制剤、並びに被験物質の存在により、ELAM−1の発現又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現が抑制されるか否かを評価する美白剤の評価方法。
【選択図】 なし
Description
〔1〕 ボタンピ抽出物を含有する、ケラチノサイトで発現するE−セレクチンの発現抑制剤、
〔2〕 被験物質の存在下での細胞におけるE−セレクチンの発現又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるE−セレクチンの発現又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記E−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
〔3〕 前記細胞が、ケラチノサイトである前記〔2〕記載の美白剤の評価方法、
〔4〕 (A)被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、E−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
(C)前記ステップ(B)で得られた細胞におけるE−セレクチンの発現量又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔2〕又は〔3〕記載の美白剤の評価方法、
〔5〕 (a)E−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
(b)前記ステップ(a)で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
(c)前記ステップ(b)で得られた細胞におけるE−セレクチンの発現量又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む前記〔2〕又は〔3〕記載の美白剤の評価方法、並びに
〔6〕 被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、E−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記E−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記E−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法、
に関する。
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
(C)前記ステップ(B)で得られた細胞におけるELAM−1の発現量又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ELAM−1又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ELAM−1又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法(実施態様1の方法)である。
(b)前記ステップ(a)で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
(c)前記ステップ(b)で得られた細胞におけるELAM−1の発現量又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記ELAM−1又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記ELAM−1又は前記ELAM−1をコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む方法である(実施態様2の方法)。
正常ヒト新生児包皮表皮角化細胞(ケラチノサイト)〔商品名:NHEK(F) 新生児包皮表皮角化細胞、カスケード バイオロジックス(Cascade Biologics)製、倉敷紡績株式会社供給〕を、HuMedia−KG2培地(倉敷紡績株式会社製)2mlが入った細胞培養プレートの各ウェルに播種し、37℃、CO2濃度:5体積%で24時間培養した。
ボタンピ抽出物の非存在下で培養したこと(ボタンピ抽出物非処理)を除き、前記実施例1と同様に操作を行ない、cRNAを得た。
ボタンピ抽出物の非存在下で培養し(ボタンピ抽出物非処理)、かつ紫外線を照射しなかったこと(紫外線非照射)を除き、前記実施例1と同様に操作を行ない、cRNAを得た。
前記実施例1、比較例1及び比較例2それぞれで得られたcRNAを、DNAマイクロアレイ(商品名:Human 1A Oligo Microarray Kit、Agilent Technologies社製)に供し、その後、60℃で17時間インキュベーションして、それにより、DNAマイクロアレイ上のDNAとハイブリダイゼーションさせた。その後、前記DNAマイクロアレイを洗浄した。
ボタンピ抽出物(商品名:ボタンピ抽出液、製品番号:50455511、丸善製薬株式会社製)を最終濃度5.0体積%(固体成分濃度:0.1質量%)となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し(ボタンピ抽出物非処理)、かつ紫外線を照射しなかったこと(紫外線非照射)を除き、前記実施例2と同様に操作を行ない、in situハイブリダイゼーション用試料を得た。
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと(ボタンピ抽出物非処理)を除き、前記実施例2と同様に操作を行ない、in situハイブリダイゼーション用試料を得た。
配列番号:1に示される塩基配列からなる核酸をpGEM(登録商標)−Tベクター〔プロメガ株式会社製〕のクローニングサイトに組み込んで得られた産物を鋳型とし、DIG RNA labeling Kit(SP6/T7)〔ロシュ(Roche)製〕を用いてPCRを行ない、蛍光標識プローブを作製した。
ボタンピ抽出物(商品名:ボタンピ抽出液、製品番号:50455511、丸善製薬株式会社製)を最終濃度5.0体積%(固体成分濃度:0.1質量%)となるようにリン酸緩衝生理食塩水に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養したこと(ボタンピ抽出物非処理)を除き、前記実施例3と同様に操作を行ない、cDNAを得た。
ボタンピ抽出物含有試料の非存在下で培養し(ボタンピ抽出物非処理)、かつ紫外線を照射しなかったこと(紫外線非照射)を除き、前記実施例3と同様に操作を行ない、cDNAを得た。
前記実施例3、比較例5及び比較例6それぞれのcDNAを鋳型として、ELAM−1の核酸レベルでの発現を、Real−Time PCRにより解析した。
ボタンピ抽出物(商品名:ボタンピ抽出液、製品番号:50455511、丸善製薬株式会社製)を最終濃度1体積%(固体成分濃度:0.04質量%)となるように、50質量%エタノール水溶液に添加し、ボタンピ抽出物含有試料を得た。
前記実施例4のボタンピ抽出物含有試料を、年齢24歳〜40歳の12名の被験者(実験番号1〜12)の上腕内側部に、1日3回、1週間にわたって塗布した。また、対照として、50質量%エタノール水溶液を、前記と同様に、12名の被験者(実験番号1〜12)の上腕内側部に、1日3回、1週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位及び前記対照の塗布部位に、UV−Bランプ(型名:GL20SE、三共電機株式会社製)により、1MED相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射1週間後、色差計(株式会社村上色彩技術研究所製、CMS−1200)を用いて、紫外線照射部位の皮膚色のL*値及び紫外線非照射部位の皮膚色のL*値を測定した。次に、式(I):
前記実施例4で得られたボタンピ抽出物含有試料を、12名の被験者(実験番号13〜24)の上腕内側部に、1日3回、1週間にわたって塗布した。その後、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位に、UV−Bランプ(型名:GL20SE、三共電機株式会社製)により、1MED相当の紫外線量の紫外線を照射した。紫外線照射24時間後、レーザードップラー血流量計〔商品名:PeriScan PIM3、プレイメド(PREIMED)社製〕を用いて、レーザードップラー法により、紫外線照射部位における血流量を測定した。なお、対照として、前記実施例4で得られたボタンピ抽出物含有試料に代えて、50質量%エタノール水溶液を用いて、前記と同様に操作を行ない、血流量を測定した。さらに、前記ボタンピ抽出物含有試料の塗布部位における血流量と前記対照の塗布部位における血流量とから、式(III):
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
被験物質をリン酸緩衝生理食塩水に添加し、被験物質含有試料を得る。
紫外線照射と被験物質含有試料の存在下での培養との順番を逆にしたことを除き、前記実験例1と同様に、ELISAにより、被験物質含有試料の非存在下に培養した細胞における前記ELAM−1の発現量(ポリペプチドレベル)と、前記被験物質含有試料の存在下に培養した細胞における前記ELAM−1の発現量(ポリペプチドレベル)とを比較する。
商品名:BIAcore X100〔ビアコア株式会社製〕を用いて、被験物質の存在下及び非存在下のそれぞれの条件下での可溶化E−セレクチン標品と、シアリルルイスXとの間の相互作用及びその度合い(結合強度)を解析する。
Claims (6)
- ボタンピ抽出物を含有してなる、ケラチノサイトで発現するE−セレクチンの発現抑制剤。
- 被験物質の存在下での細胞におけるE−セレクチンの発現又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現と、被験物質の非存在下での細胞におけるE−セレクチンの発現又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現とを調べ、前記被験物質の存在により、前記E−セレクチンの発現又は前記核酸の発現が抑制されるか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
- 前記細胞が、ケラチノサイトである請求項2記載の美白剤の評価方法。
- (A)被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下において、E−セレクチンを発現する細胞を培養するステップ、
(B)前記ステップ(A)で得られた細胞に紫外線を照射するステップ、及び
(C)前記ステップ(B)で得られた細胞におけるE−セレクチンの発現量又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、被験物質の非存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、被験物質の存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項2又は3記載の美白剤の評価方法。 - (a)E−セレクチンを発現する細胞に紫外線を照射するステップ、
(b)前記ステップ(a)で得られた細胞を、被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に培養するステップ、及び
(c)前記ステップ(b)で得られた細胞におけるE−セレクチンの発現量又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量を測定し、前記被験物質の非存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量に比べて、前記被験物質の存在下に培養した細胞における前記E−セレクチン又は前記E−セレクチンをコードする核酸の発現量が減少するか否かを評価するステップ、
を含む請求項2又は3記載の美白剤の評価方法。 - 被験物質の存在下及び非存在下それぞれの条件下に、E−セレクチンの生物学的活性を測定し、被験物質の非存在下における前記E−セレクチンの生物学的活性に比べて、前記被験物質の存在下における前記E−セレクチンの生物学的活性が低下するか否かを評価することを特徴とする美白剤の評価方法。
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