JPH07501819A - Ｏ−グリコシル化修飾による白血球および血小板のセレクチン依存性接着を阻害する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 Ｏ−グリコジル化修飾による白血球および血小板のセレクチン依存性接着を阻害 する方法発明の背景 セレクチンは、ＥＬＡＭ−１（内皮性白血球接着分子−１）、ＧＮＰ−１４０（ ＣＤ６２；　ＰＡＤＧＥＭ）およびＬＥＣＣＡＭ−１（７ウスのＭｅｌ−１４、 ヒトのＬｅｕ−８）を含む、分子のファミリーであり、特異的な炭水化物のエピ トープを発現する血液細胞および腫瘍細胞の、内皮細胞（ＥＣ’　ｓ）および血 小板への接着を主として媒介する。この分子は、Ｎ−末端レクチンドメイン（炭 水化物結合ドメイン）、表皮成長因子（ＥＧＦ）　ドメイン、補体制御性反復配 列、貫膜ドメインおよび細胞質Ｃ−末端ドメインからなる構造的モチーフを共有 する。

ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０のレクチンドメインは、炭水化物の構造物で あるシアロシル（ｓｉａｌｏｓｙｌ）　−Ｌｅ　（ＳＬｅ　）　（Ｌ。

ｗｅら、Ｃｅ１ｌ、６３：　４７５．　１９９０；　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ　ら、５ ｃｉｅｎｃｅ、２５０：１１３０、　１９９０；　Ｐｏ１ｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｕ、Ｓ、Ａ。

、　８８：　６２２４．１９９１）およびシアロシル−Ｌｅ　（ＳＬｅ　）Ｈａ ｎｄａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、、 印刷中）に結合する。ＳＬｅ　およびＳＬｅ　は、腫瘍関連抗原であるので（Ｈ ａｋｏｍｏｒｉ、　Ａｄｖ、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、、　５２：　３３１．１ ９８９　）　、セレクチンは、血小板およびＥＣ’　ｓへの腫瘍細胞の接着を決 定しくｄｅｆｉｎｅ）、転移を開始する重要な役割を果たすらしい（Ｈａｋｏｍ ｏｒｉ、　Ｃｕｒｒ、　０ｐｉｎ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　し６４６．１９９１ ）。

炎症部位に補給される白血球と、活性化された血管系内皮細胞との相互作用、あ るいは活性化された血小板との相互作用は、炎症における最初の事象である。し かしながら、一般に、補給される白血球の数は過剰であり、その結果例えば、血 管壁を越えて周囲組織への白血球の浸潤、または白血球と血小板もしくは他の血 液細胞成分との凝集によって生じる塞栓および微小塞栓の発生、が起こる。

腫瘍細胞と活性化血小板または活性化血管系内皮細胞との相互作用は、白血球に ついて上述されたものと類似の事象、つまり接着と塞栓および微小塞栓の発展を 引き起こし得る。腫瘍細胞の内皮細胞への接着、および腫瘍細胞の血管外遊出ま たは血管外化（ｅｘｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）は、転移の初期の 事象と見なされている。

白血球または腫瘍細胞による、内皮細胞または血小板への接着ては、インターロ イキン−１（ＩＬ−１）が白血球によって産生される。ＩＬ−１は、ＥＬＡＭ− １の発現を誘導する。多くの腫瘍細胞が、内皮細胞を活性化しＥＬＡＭ−１発現 を誘導するＴＧＦβまたはＴＮＦαを産生ずる。さらに、白血球および腫瘍細胞 は両方とも、血小板を活性化しＧＭＰ−１４０発現を誘導する酵素性因子および ＡＤＰを放出する。

ＥＬＡＭ−１およびＧＭＰ−１４０は、ＳＬｅ　またはＳＬｅ　を発現する腫瘍 細胞または白血球の内皮細胞への接着を媒介するのに役立つ。同様に、ＧＮＰ− １４０を発現する活性化血小板は、ＳＬｅ　またはＳＬｅ　を発現する腫瘍細胞 または白血球に接着する。

従って、セレクチン発現、あるいは白血球または腫瘍細胞上のＳＬｅ　またはＳ Ｌｅ　発現の阻害により、白血球または腫瘍細胞の内皮細胞または血小板への接 着を最小にするか、または防止し、これにより血栓症／塞栓症、炎症、組織損傷 および、それから生じる転移を最小にするか、または防止することは、有益であ ろう。

発明の概略 白血球または腫瘍細胞の内皮細胞または血小板への接着を最小にするか、または 防止する組成物および方法を提供することが本発明の目的であり、ここで接着は 内皮細胞または血小板上に発現されるセレクチンによって媒介されるものである 。

それおよび他の目的は、内皮細胞および血小板の表面上に発現されるセレクチン 分子のレクチンドメインによって認識され結合される、白血球または腫瘍細胞上 に発現される炭水化物構造物の発現を阻害するための、組成物および方法の開発 において達成されてきた。

本発明は、０−グリコジル化またはＯ−グリコジル化の伸長（ｅｘｔｅｎｓｉｏ ｎ）を阻害することにより、ＳＬｅ　またはＳＬｅ　の発現をブロックするため の組成物および方法に関する。体系的な研究により、Ｎ−グリコジル化の阻害剤 ではなく、Ｏ−グリコジル化伸長の阻害剤が、白血球または腫瘍細胞によるＳＬ ｅ　またはＳＬｅ　の発現をブロックし、それにより、白血球または腫瘍細胞の 内皮細胞および血小板への接着を阻害することが明らかにされた。

図面の簡単な説明 図ＩＡおよびＩＢは、フローサイトメーター（ｆｌｏｗ　ｃｙｔ。

ｍｅｔｅｒ）で検出される蛍光細胞のグラフを示す。次に、Ｂｚ−ａ−ＧａｌＮ Ａｃで処理されていない、または処理されたＨＬ６０細胞を、ＳＬｅ　に特異的 に結合する抗体（ＳＮＨ４）に曝しくｅｘｐｏｓｅ）、図ＩＡ［あるいは、構造 物０−ｒ−ＧａｌＮＡｃに結合する蛍光標識したカタツムリレクチン（Ｈｅｌｉ ｘ　ｐｏｍａｔｉａ　Ｉｅｃｔｉｎ）に曝す、図ＩＢ］、および適切な蛍光で標 識した二次抗体に曝した。

これらのグラフは、細胞の数および種々のレベルの蛍光強度を示す。図ＩＡでは 、−曲線は非処理肛６０細胞を示し；−・−曲線はＢｚ−ａ−ＧａＩＮＡｃおよ び５ＮＨ４で処理されたＩＩＬ６０細胞を示し；そして−−一曲線はＢｚ−ａ− ＧａｌＮＡｃおよびコントロールの抗体で処理されたＨＬ６０細胞を示す。図Ｉ Ｂでは、−曲線は非処理１１Ｌ６０細胞を示し、および−・−曲線はレクチンに 曝すのに先立ってＢｚ−α−ＧａｌＮＡｃに曝した肛６０細胞を示す。

図２Ａおよび２Ｂは、Ｎ−グリコジル化阻害剤であるカスタノスペルミン（ｃａ ｓｔａｎｏｓｐｅｒｍｉｎｅ）およびスワインソニン（ｓｗａｉｎｓｏｎｉｎｅ ）に曝した肛６０細胞を、フローサイトメーターでトレースしたものを示す。− 曲線は非処理ＨＬ６０細胞を示し；−・−曲線はカスタノスペルミンおよび５Ｌ ｅＸ抗体（ＳＮＨ３は図２ＡＳＳＮＨ４は図２Ｂ）で処理されたＨＬ６０細胞を 示し；−・・−曲線はスワインソニンで処理したＨＬ６０細胞を示し；そして− 一一一曲線はカスタノスペルミンで処理およびコントロールの非特異的マウスＩ ｇＧまたはＩｇＭ抗体で処理したＨＬ６０細胞を示す。

図３Ａおよび３Ｂは、処理および非処理ＨＬ６０、Ｃｏ１ｏ２０５およびＵ９３ ７細胞の、内皮細胞への結合（図３Ａ）およびＥＬＡＭ−１でコートしたプレー トへの結合（図３Ｂ）を示すグラフである。図３Ａては、ソリッドバー（ｓｏｌ ｉｄ　ｂａｒ）は活性化されていない内皮細胞を示し、オープンバー（ｏｐｅｎ 　ｂａｒ）は活性化された内皮細胞を示す。骨髄性）ＩＬ６０細胞、結腸のＣｏ １ｏ２０５腫瘍細胞および単球性Ｕ９３７白血病細胞は、Ｂｚ−α−ＧａｌＮＡ ｃに曝されなかった（−）か、または曝された（＋）。

図４Ａおよび４Ｂは、非活性化（ソリッドバー）および活性化（オープンバー） 内皮細胞に対する、細胞の結合（図４ＡではＨＬ６０、図４ＢではＣｏ１ｏ２０ ５　）を示す。抗ＥＬＡＭ−１は、ＥＬＡＭ−１に関する抗体である。ＤＭＮＭ は、ジメチル−ノジリマイシンを示す。５ＷＳＮは、スワインソニンである。Ｃ ３ＴＰは、カスタノスペルミンである。Ｂｚ−σ−Ｇ１ｃＮＡｃは、ベンジル− α−Ｎ−アセチルグルコサミンである。ＴＭは、ツニカマイシンである。１ｌＬ ６０細胞を、種々のグリコジル化阻害剤とともに培養し、トリチウム標識し、次 に内皮細胞の単層に添加した。ツニカマイシンは、Ｈし６０細胞に毒性であった 。

図５Ａおよび５Ｂは、非処理（−）ならびにＢｚ−ａ−ＧａｌＮＡＣ処理（＋） ＨＬ６０細胞およびＵ９３７細胞の、非活性化（ソリッドバー）または活性化（ オープンバー）血小板［図５Ａはトロンビンで活性化し、図５Ｂは１０−７Ｍ　 （最終濃度）のホルボール１２−ミリステートβアセテート（ＰＭＡ）で活性化 した］との結合を示す。

発明の詳細な説明 本明細書で使用される場合、「細胞」は、核を有する、および血小板のような除 核された、エレメントを包含する。

「白血球」は通常、好中球、マクロファージおよびリンパ球を含む血液系および リンパ系に関連する細胞、あるいはセレクチンに認識され結合されるリガンドを 発現する、あらゆる他の細胞である。

本発明は、セレクチンの結合機能を介して白血球および腫瘍細胞が内皮細胞およ び血小板に接着する（セレクチン依存性接着）のを阻害するための、組成物およ び方法に関する。それは、細胞を、Ｏ−グリコジル化またはＯ−グリコジル化伸 長の阻害剤に曝す（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）ことによって得られる。

糖タンパク質におけるグリコジル化は、（ｉ）セリン（Ｓｅｔ）もしくはスレオ ニン（Ｔｈｒ）のＯ−グリコジル化；または（ｉｉ）アスパラギン（Ａｓｎ）の Ｎ−グリコジル化に基づく。１つの糖がアミノ酸残基に結合した後、炭水化物の 鎖は、最初に複合体化された糖に更なる糖残基を連続的に付加することにより、 成長（ｄｅｖｅｌｏｐ）　Ｌ得る。従って、糖タンパク質の成長は、最初のグリ コジル化と関連し、アミノ酸に付加したポリサッカライド鎖を形成するために、 モノサッカライド誘導体からの伸長を包含し得る。

Ｎ−グリコジル化または０−グリコジル化を修飾するとして知られる試薬が公知 である（例えば、Ｎ−グリコジル化の阻害剤が、Ｅｌｂｅｉｎ、　Ａｎｎ、　Ｒ ｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　５６：　４９７．１９８７に論評されている）。

ジメチル−ノジリマイシン、ツニカマイシン、スワインソニンおよびカスタノス ペルミン［シグマケミカル（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）、セント ルイス、ミズーリ州、から入手される］は、Ｎ−グリコジル化の適切な阻害剤で ある。

ベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミン（Ｂｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃ）　（同 様に、シグマから入手される）は、カタツムリレクチン（Ｈｅｌｉｘ　ｐｏｍａ ｔｉａ　１ｅｃｔｉｎ）により認識されるエピトープである０−α−ＧａｌＮＡ ｃの蓄積を導くＯ−グリコジル化の伸長を阻害する（Ｋｕａｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６４：　１９２７１．１９８９）。

他のＯ−グリコジル化およびＯ−グリコジル化伸長の阻害剤の同定は、Ｓｅｒま たはＴｈｒの０−グリコジル化が起きたかどうか、および内部に含まれる糖鎖の サイズ並びに糖残基が何であるかを決定するのに当該分野で既知の方法を使用し て、為され得る。特異的な阻害剤が本発明の実施に使用され得るかどうかは、本 明細書に開示されている方法、あるいはセレクチン依存性接着がそれによって阻 害されるかどうかを決定するためのあらゆる他の同等の方法を実施して決定され 得る。

セレクチンによって認識されることが可能な、ｔｌＬ６０　（骨髄性細胞）　、 Ｃｏ１ｏ２０５　（結腸癌細胞）およびＵ９３７　（単球性白血病細胞）の、炭 水化物エピトープであるＳＬｅ　およびＳＬｅ　は、主として〇−結合鎖の形態 で存在する。Ｎ−結合鎖で存在するＳＬｅ　またはＳＬｅ　は、セレクチンとく にＥＬＡＭ−１によっては有効に認識され得ない。〇−結合鎖、Ｎ−結合鎖また はグリコスフィンゴリピッドで存在する同じエピトープの識別的認識のための正 確な原理は、いまだ不明のままであるが、〇−結合構造は、ムチン型の糖タンパ ク質またはロイコシアリン（ｌｅｕｋｏｓｉａｌｉｎ）分子にしばしば観察され るように、塊になる（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ）傾向がある（Ｆｕｋｕｄａ、　Ｇｌ ｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１：　３４７．１９９１）。対照的に、Ｎ−結合構造 は、塊を形成しない。

Ｂｚ−α−ＧａｌＮＡｃは、〇−結合炭水化物鎖の伸長を阻害する、０−グリコ ジル化の修飾因子（ｍｏｄｉ　ｆ　１ｅｒ）である。しかしながら、本発明の実 施の中で、他のＯ−グリコジル化阻害剤は、骨髄性細胞または腫瘍細胞のセレク チン依存性接着をブロックするのに同程度か、より効果的であり得た。α−Ｇａ ｌＮＡｃの全身的投与は胛前性であることが知られているため（Ｌｉｅｈｒら、 Ｖｉｒｃｈｏｗｓ　Ａｒｃｈ、Ｂ　Ｃｅ１１．　Ｐａｔｈ、、２６：　３３１． 　１９７８）、Ｂｚ−＋−ＧａｌＮＡｃを高濃度で含有するリポソームのような マイクロカプセルを、抗Ｌｅ　または抗ＳＬｅ　モノクローナル抗体（ｍＡｂ’ 　ｓ）と複合体化し、それによって、Ｌｅ　またはＳＬｅ　を発現する骨髄性ま たは腫瘍性細胞のセレクチン依存性接着をブロックするこ、とを手段として、問 題の細胞の標的化および副作用の最小化を為し得る。あるいは、Ｂｚ−α−Ｇａ ｌＮＡｃを含む、Ｌｅ　発現リポソームが使用され得る。

Ｌｅ　分子間の相互作用は知られており（Ｅｇｇｅｎｓら、Ｊ、　Ｂｉ。

１、　Ｃｈｅｍ、、　２６４：　９４７６、１９８９　）　、そのようなリポソ ームの適用は、Ｌｅ　ならびにＳＬｅ　を発現する骨髄性細胞または腫瘍細胞を 効果的に標的化し得た。

０−グリコジル化またはＯ−グリコジル化伸長の阻害剤は、あらゆる種々の当該 分野で認識されている手段により、投与され得る。その手段、経路および治療上 の規制（ｒｅｇｉｍｅｎ）は、医薬分野で既知のルーチンな手順に従って、決定 され得る。例えば、０−グリコジル化またはＯ−グリコジル化伸長の阻害剤、ま たは医薬的に受容可能なその塩は、医薬を供給するために、医薬的に受容可能な 希釈剤、担体または賦形剤と混合され得る。医薬は、粉末、錠剤、ゲルまたは溶 液を含む、種々の形態をとり得る。医薬的に受容可能な希釈剤は、既知の緩衝剤 および塩類を含む。０−グリコジル化またはＯ−グリコジル化伸長の阻害剤の製 剤は、公知の経路、即ち、経口的、筋肉内的、経静脈的などで投与され得る。

上述したように、本発明は、マイクロカプセルを使用して実施され得る。リポソ ームのようなマイクロカプセルの作製および使用は、当該分野で公知である。マ イクロカプセルの使用は、より全身的な経路による投与に関連する、扱いにくい 副作用を伴うことなしに、有効成分の局所的な高濃度を確実にすることができる 。

医薬的に有効な用量の規制（ｒｅｇｉｍｅｎ）は、患者の例えば、疾病、年齢お よび体重に関連して変更し得る。適切な投薬量は、適切なインビトロ試験システ ム、動物モデルおよび臨床治験を用いて決定される。適切な投薬量は、インビト ロで約２　ｍＭのＢｚ−α−ＧａｌＮＡｃに等しいものである。０−グリコジル 化またはＯ−グリコジル化伸長のより大きな阻害性活性を有する他の試薬は、適 切に少ない投薬量で投与され得る。

本発明の種々の局面は、以下の非制限的実施例の中で例示される。とくに言及さ れることがなければ、すべての重量および容量は、ｗ／ｖまたはｖ／ｖで示され るものである。

実施例 １１Ｌ６０（ＣＣＬ　２００）　、Ｃｏ１ｏ２０５（ＣＣＬ　２２２）および［ ９３７（ＣＲＬ　１５９３）を、ＡＴＣＣから入手した。ＨＵＶＥＣ’ｓ　（ヒ ト謄静脈内皮細胞）を、セルシステムズ（Ｃｅｌｌ　Ｓｙｓｔｅｍｓ）　（カー クランド、ワシントン州）から入手した。細胞を、ＡＴＣＣにより推奨されるよ うに、または公知の手順に従って、培養した。主としてベヴイラクア（Ｂｅｖｉ 　１ａｃｑｕａ）らの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ＳＣ’ｓを 、コンフルエントな単層として使用した。活性化のために、単層をＩＬ−１に曝 した。

ＨＬ６０、Ｃｏ１ｏ２０５およびＵ９３７の細胞を、培養の間、種々の阻害剤に 曝した。アッセイより３日前に、種々の阻害剤試薬を、指示された濃度で、細胞 培養物に添加した。次に、懸濁液を遠心分離し、それから得られた細胞ペレット を、新しい培地に懸濁し、その後アッセイのために使用した。

Ｂｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃがＯ−グリコジル化を阻害したことを確認するために、 ＨＬ６０細胞を、２　ｍＭのＢｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃに７２時間曝し、続いて、 ＳＬｅ　に特異的な抗体である５ＮＨ３およびＳＮＨ４（Ｍｕｒｏｉら、Ｂｌｏ ｏｄ　、印刷中）およびＳＬｅ　に特異的な抗体であるＣＡ１９−９（ＣＡ１９ −９（ら、Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、、　２５７：　１４３６５．　１９８２ ）に曝した。−次抗体を、２×１０５細胞当たり２−５μｇ／ｍｌの濃度で使用 した。実験では、コントロール抗体として、シグマから入手したマウスＩｇＧま たはＩｇＭを使用した。

二次抗体は、タボコーポレーション（Ｔａｇｏ　Ｃｏ、）　（バーリンゲイム、 カリフォルニア州）から入手した、適切に滴定されたＦＩＴＣ標識したヤギ抗マ ウスＩｇ抗体であった。標識細胞の数、およびその蛍光の程度を、エピマウス・ プロフィールフローサイトメーター（Ｅｐｉｃｓ　Ｐｒｏｆｉｌｅ）　［＝７ウ ルター（Ｃｏｕｌｔｅｒ）　、ヒアｏ−（Ｈｉａｌｅａｈ）　、フロリダ州コで 評価した。

２　ｍＭのＢｚ−＋−ＧａｌＮＡｃの存在下に７２時間細胞を培養すると、抗Ｓ Ｌｅ　モノクローナル抗体（ｍＡｂ’　ｓ）である５ＮＨ３およびＳＮ旧との反 応性による測定として、ＳＬｅ　発現の完全な、または殆ど完全なブロックを生 じた。５ＮＨ３との僅かな残留的反応が、ＨＬ６０細胞について観察された。Ｂ ｚ−α−Ｇａ　Ｉ　ＮＡｃと共に培養されたＣｏ１ｏ２０５およびＵ９３７細胞 については、５ＮＨ３あるいは５ＮＨ４に対しても、抗ＳＬｅ　モノクローナル 抗体（ｍＡｂ）であるＣＡ１９−９に対しても、反応はなかった。Ｂｚ−＋−Ｇ ａｌＮＡｃの効果を反映する、ＨＬ６０細胞に関するフローサイトメトリーのパ ターンは、図ＩＡに示される。Ｂｚ−４−にａｌＮＡｃ処理された細胞のみが、 ５ＮＨ４に対し大きく低下した反応性を示した（図ＩＡ）。

処理された、および非処理の肛６０細胞もまた、適切に滴定されたＦＩＴＣ標識 したカタツムリレクチン（シグマ）に曝され、フローサイトメーターで分析され た。ＨＬ６０細胞をＢｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃに曝露した結果、ａ−ＧａｌＮＡｃ を認識するカタツムリレクチンとの有意な反応が生じた。Ｂｚ−α−ＧａｌＮＡ ｃは、細胞表面での〇−結合炭水化物の鎖伸長をブロックし、鎖伸長なしに〇− 結合α−ＧａｌＮＡＣの蓄積を生じる（図ＩＢ）。

０−グリコジル化修飾の効果とは対照的に、Ｎ−グリコジル化に影響する試薬、 例えば１０μｇ　７ｍｌスワインソニンおよび１００μｇ　７ｍｌカスタノスペ ルミン（これらは、Ｎ−結合複合体型構造の形成をブロックする）は、ＳＬｅ　 発現に対する阻害効果を有しなかった（ＢＬ６０細胞に対するそれら試薬の効果 については、図２Ａおよび２Ｂを参照）。スワインソニンは、それら細胞でのＳ Ｌｅ　発現に対して無視してよいほどの効果を有しただけだが、カスタノスペル ミンは、ＳＬｅ　発現を僅かに増大させた（図２Ａは、５ＮＨ３との反応；図２ Ｂは、５ＮＨ４との反応）。スワインソニンは、１１Ｌ６０細胞の活性化ＨＵＶ ＥＣ’　ｓへの接着を僅かに減少させた（図４を参照）。

処理された細胞の内皮細胞への結合能力を評価するために、コンフルエンシーま で培養されたＨＵＶＥＣ’　ｓを、Ｉ　Ｕ／ｍｌのインターロイキン−１β（ル ー１）で４時間刺激した。次に、Ｂｚ−α−ＧａｌＮＡｃによるＯ−グリコジル 化阻害をされた、またはされていない、既知の手順に従って［３■］チミジンで 代謝的に標識された、ＨＬ６０、Ｃｏ１ｏ２０５またはＵ９３７細胞を、単層に 添加した。１時間インキュベートした後、放射性カウントを細胞数に転換するこ とによって、接着細胞を定量した（図３Ａおよび３Ｂ）。

２、ｍＭのＢｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃで処理されたそれらの細胞のみが、刺激され たＨＵＶＥＣ’　ｓへの接着の明らかな阻害を示した（図３　Ａ）　。Ｂｚ−＋ −ＧａｌＮＡｃ処理された細胞のみがＥＬＡＭ−１でコートされたプラスチック プレート上の接着の有意な減少を示したので、この効果は明らかにＥＬＡＭ−！ 依存性接着の消失に起因する（図３　Ｂ　）　。Ｂｚ−ａ−Ｇａ、１ＮＡｃの阻 害性効果は、ＨＬ６０およびＣｏ１ｏ２０５細胞について明らかであったが、Ｕ ９３７細胞については幾分弱かった（図３Ａ）。［メリーランド州、ロツクヴイ レ、オーツカアメリカ（Ｏｔｓｕｋａ　Ａｍｅｒｉｃａ）のウォルター・ニュー マン（Ｗａｉｔｅｒ　Ｎｅｗｍａｎ）博士から入手したＥＬＡＭ−１タンパク質 を、ＰＢＳ中０．５μｇ　／ｍｌのアリコート５０μｌを、ファルコンプロビン ド（Ｆａｌｃｏｎ　Ｐｒｏｂｉｎｄ）プレートのウェルに加えた。プレートを、 −晩４℃でインキュベートし、ウェルをＰＢＳで洗浄し、そして使用の前に、１ ％ＢＳＡ溶液でブロックした。］ 種々のＮ−グリコジル化阻害剤（１００μｇ　７ｍｌカスタノスペルミン、１０ μｇ　７ｍｌスワインソニンおよび１００μｇ　／ｍｌジメチルーノジリマイシ ン）の存在下での細胞の培養は、ＨＬ６０またはＣｏ１ｏ２０５細胞においてＳ Ｌｅ　またはＳＬｅ　の発現を阻害せず、それら細胞のＨＵＶＥＣ’　ｓへの接 着にも影響しなかった（図４Ａ）。カスタノスペルミンは、肛６０細胞における ＳＬｅ　発現を実際に増加させたが（図ＩＢ）、この阻害剤は、ＨＬ６０細胞の ＨＵＶＥＣ’　Ｓへの接着を僅かに減少させた（図４Ａ）。

ＳＬｅ　発現Ｃｏ１ｏ２０５細胞の活性化ＨＵｖＥＣ′Ｓへの接着もまた、０． ５μｇ　７ｍｌツニカマイシンを含む種々のＮ−グリコジル化阻害剤によっては 影響されなかった（図４Ｂ）。活性化ＨＵＶＥＣ’　ｓ上の、ＨＬ６０およびＣ ｏ１ｏ２０５の両方の細胞の接着は、２　ｍＷのＢｚ−ａ−ＧａｌＮＡｃにより 阻害され、同様ニ２ｍＭノ濃度で使用された異性体のＢｚ−＋−Ｇ１ｃＮＡｃに よっては阻害されなかった（図４Ａおよび４Ｂ）。５μｇ　／ｍｌの濃度のＥＬ ＡＭ抗体（Ｊ、　Ｉｍｍ、、　１４５：　８１９．１９９０）　ヘの曝露は、結 合を阻害した。この結果は、Ｎ−グリコジル化された側鎖上に存在するＳＬｅ　 エピトープが、セレクチンによって適切に認識されないことを示唆する。

トロンビンにより、またはホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（Ｐ ＭＡ）により活性化された血小板への、ＨＬ６０およびＵ９３７細胞の接着に対 する、Ｂｚ−＋−ＧａｌＮＡｃの効果を測定した。血小板を、「血小板豊富な血 漿」　（オレゴン赤十字、ポートランド、オレゴン州）から分離した。混入赤血 球を、遠心分離（８０ｘｇ、　１０分間）により取り除いた。血小板を、遠心分 離（３００ｘｇ　、　１０分間）により得て、２２　ｍＭのクエン酸三ナトリウ ムおよび０．３５％ＢＳＡを含むタイロード緩衝液（ｐＨ６，５）中で１回洗浄 し、そして同じ緩衝液に１×１０９血小板／ｍｌの濃度に再懸濁した。全ての手 順は、室温で行った。

ｐＨ７，２のタイロード緩衝液中の血小板懸濁液（１×１０８７ｍ１）に、トロ ンビン（最終濃度Ｉ　Ｕ／ｍｌ　）またはＰＭＡ　（最終濃度１０’　Ｍ）を添 加し、その混合物を攪拌することなく、３７℃で１０分間インキュベートした。

４８ウエルプレート［コスタ−サイエンティフィック（Ｃｏｓｔａｒ　５ｃｉｅ ｎｔｉｆｉｃ）　、ケンブリッジ、マサチューセッツ州］の各ウェルを、ＰＢＳ 中ポリＬ−リジン溶液（１００μｇ　／ｍｌ）で満たし、１時間インキュベート した。次に、各ウェルを、ＰＢＳで洗浄し、ＢＳＡでブロックし、そして６×１ ０７血小板を含む１５０μｌのＰＢＳを添加した。プレートを遠心分離（３００ ｘｇ　、７分間）し、さらに室温で３０分間インキュベートした。

結合した血小板を、ＰＢＳ中０．１％グルタルアルデヒドを添加して、２分間４ ℃で固定した。各ウェルを、ＰＢＳ中１０　ｍｙグリシンで洗浄し、そしてプレ ートを、ＰＢＳ中　５％ＢＳＡを含む０．１％アジ化ナトリウム、１０ｍＭグリ シンとともに１時間、室温でインキュベートした。培養培地（５％　Ｆｅ２を含 むＲＰＭＩ　１６４０　’）で洗浄した後、［３■］チミジンで標識した１×１ ０６のＨＬ６０細胞またはＵ９３７細胞を、各ウェルに添加した。室温で４５分 間インキュベーション後、非結合細胞を吸引し、ウェルを培地（５％ＦＣ３を含 むＲＰＭＩ　１６４０　’）で１回洗浄した。結合細胞を、ＰＢＳ中０．０５％ トリプシン−０，０２％ＥＤＴＡ　［アーヴインサイエンティフィック（Ｉｒｖ ｉｎｅ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）　］で脱離し、液体シンチレーションカウンタ ーで計数した。

活性化血小板上の、肚６０およびＵ９３７の両方の細胞の接着は、細胞がＢｚ− α−ＧａｌＮＡｃで前処理されたときには、有意に減少した。この効果は、トロ ンビンで活性化された血小板（図５Ａ）およびＰＭＡで活性化された血小板（図 ５Ｂ）の両方で観察された。

本発明は、特定の実施態様および実施例を参考にして詳しく例示されたが、種々 の変化および修飾が、本発明の精神および範囲から逸脱することなく為され得る ことは明らかであろう。

フロントベージの続き （７２）発明者　ハンダ　カズコ アメリカ合衆国　９８１１９　ワシントン　シアトル　スウィート　３０５　エ リオットアベニュ　ウェスト　２０１　ザ　バイオメンブレン　インスティテユ ート内 （７２）発明者　ハコモリ　センイチロウアメリカ合衆国　９８１１９　ワシン トン　シアトル　スウィート　３０５　エリオットアベニュ　ウェスト　２０１ 　ザ　バイオメンブレン　インスティテユート内

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｏ−グリコシル化阻害剤またはＯ−グリコシル化伸長阻害剤、または医薬的 に受容可能なその塩、および医薬的に受容可能な希釈剤、担体または賦形剤を含 有する治療用組成物。
2. ２．前記阻害剤がベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミンである請求項１に 記載の組成物。
3. ３．前記阻害剤がマイクロカプセル中に含まれる請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記マイクロカプセルがその外部表面上にＬｅｘ、シアリル（ｓｉａｌｙｌ ）ＬｅｘまたはシアリルＬｅａに特異的に結合可能なリガンドを付着した請求項 ３に記載の組成物。
5. ５．前記リガンドがＬｅｘである請求項４に記載の組成物。
6. ６．前記リガンドが抗体である請求項４に記載の組成物。
7. ７．第二の細胞上に発現されるセレクチンにより特異的に結合されるリガンドを 発現する第一の細胞を有効量のＯ−グリコシル化阻害剤またはＯ−グリコシル化 伸長阻害剤に曝すことを包含する細胞の相互作用を阻害する方法。
8. ８．前記阻害剤がシアリル（ｓｉａｌｙｌ）−Ｌｅｘ、シアリルーＬｅａまたは Ｌｅｘの発現を減少させる請求項７に記載の方法。
9. ９．前記阻害剤がベンジル−α−Ｎ−アセチルガラクトサミンである請求項７に 記載の方法。
10. １０．前記第二の細胞が内皮細胞または血小板である請求項７に記載の方法。
11. １１．前記第一の細胞が白血球または腫瘍細胞である請求項７に記載の方法。
12. １２．前記阻害剤がマイクロカプセル中に含まれる請求項７に記載の方法。
13. １３．前記マイクロカプセルがその外部表面上にＬｅｘ、シアリル（ｓｉａｌｙ ｌ）ＬｅｘまたはシアリルＬｅａに特異的に結合可能なリガンドを付着した請求 項１２に記載の方法。
14. １４．前記リガンドがＬｅｘである請求項１３に記載の方法。
15. １５．前記リガンドが抗体である請求項１３に記載の方法。