JP2009024017A

JP2009024017A - 長期持続性成長ホルモン放出因子誘導体

Info

Publication number: JP2009024017A
Application number: JP2008208279A
Authority: JP
Inventors: Dominique P Bridon; ピー．ブリドンドミニク; Nissab Boudjellab; バウドジェラブニッサブ; Roger Leger; レガーロジャー; Martin Robitaille; ロビタイルマーティン; Lucie Jette; ジェットルーシー; Corinne Benquet; ベンケットコリン
Original assignee: ConjuChem Biotechnologies Inc
Current assignee: ConjuChem Biotechnologies Inc
Priority date: 2001-02-02
Filing date: 2008-08-12
Publication date: 2009-02-05
Also published as: BR0206919A; CA2435563A1; CN1491233A; US20030073630A1; US7268113B2; ZA200305641B; EP1355941A2; CN101696240A; AU2002233082B2; WO2002062844A2; EA200300856A1; EA006484B1; JP2008106073A; WO2002062844A3; JP2004520395A

Abstract

【課題】ヒトおよび動物における成長ホルモンの内因性の生成または放出を促進するための、延長されたインビボ半減期を有するＧＲＦペプチド誘導体を提供すること。
【解決手段】成長ホルモン放出因子誘導体であって、この成長ホルモン放出因子誘導体は、成長ホルモン生成活性または成長ホルモン放出活性を有するペプチド；およびこのペプチドに結合された反応性要素を含み、この誘導体は、インビボまたはインビトロで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、成長ホルモン放出因子誘導体。
【選択図】なし

Description

（発明の分野）
本発明は、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）誘導体に関する。特に、本発明は、ヒトおよび動物における成長ホルモンの内因性の生成または放出を促進するために、延長されたインビボ半減期を有するＧＲＦペプチド誘導体に関する。

（発明の背景）
成長ホルモン（ＧＨ）（ソマトトロピンとしても知られる）は、下垂体前葉中の成長ホルモン産生細胞（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｓ）と呼ばれる細胞によって合成され、そして分泌される約１９０アミノ酸のタンパク質ホルモンである。これは、成長および代謝の制御に、主に関与する。これはまた、ヒトおよび動物の両方で使用するための薬学的生成物として、非常に興味深い。ＧＨの生成は、多くの因子（ストレス、栄養、睡眠およびＧＨ自体）によって調節される。しかし、その一次制御因子は、以下の２つの視床下部ホルモンである：
−成長ホルモン放出因子（ＧＲＦまたはＧＨＲＨ）（ＧＨの合成および分泌を刺激する、４４アミノ酸配列）、および；
−ソマトスタチン（ＳＳ）（ＧＲＦに応答して、ＧＨ放出を阻害する）。

ＧＲＦ（１〜４４）の生物学的活性は、このペプチドのＮ末端部分に存在することが示されている。完全な内因性の活性および効力もまた、インビトロおよびインビボの両方で、ＧＲＦ（１〜２９）で実証された。さらに、ＧＲＦの持続性投与は、正常な生理学的条件下と同一の、下垂体由来のＧＨの偶発的分泌パターンを誘導する。近年、Ｍｅｒｃｋおよび他の製薬会社によって開発された、合成ペプチド（例えば、成長ホルモン放出ペプチド（ＧＨＲＰ）ならびにペプチド模倣物）は、内因性ＧＨの放出を刺激するようなそれらの能力を実証した。Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅによって８０年代半ばに開発された、別のアナログである三置換型ＧＲＦ_１〜２９（［ｄｅｓ−アミノ−Ｔｙｒ^１，Ｄ−Ａｌａ^２，Ａｌａ^１５］−ＧＲＦ_１〜２９）は、長期化した作用期間を有するＧＲＦスーパーアゴニストである。

ＧＨ分泌促進剤（ＧＨＳ）は、オーファンＧ−タンパク質結合化レセプター（ＧＨＳ−Ｒ）を介して、下垂体からＧＨの放出を刺激することが知られている。近年、ＧＨＳ−Ｒに対する別の内因性リガンドが、グレリンとして同定された。これは、オクタノイル化（Ｓｅｒ^３でｎ−オクタノイルを有する２８残基のペプチド）ペプチドである。

組換えＧＨ（ｒＧＨ）は、１９８５に最初に生成され、そして、今は、医学的使用および獣医学的使用の両方のために市販されている。しかし、ｒＧＨの長期間の安全性は、未だ決定されていない。さらに、ヒトにおいて、ｒＧＨの使用から生じる様々な副作用（すなわち、左心室質量インデックス、血清リポタンパク質の増加、および免疫パラメーターの微弱な変化）が報告されている。最後に、ｒＧＨの頻繁なボーラス注射は、レセプターの進行性ダウンレギュレーションを引き起こし、従って、時間が経つと、その効力が減少することが知られている。

これらの実際の欠点に加えて、外因性ＧＨは種特異的であり、このことは、異なる種（すなわち、ヒトおよび動物）中で成長および他の有利な効果を増強する際に、その利点を制限する。少量のＧＲＦは、処置された動物の血液へのＧＨの実質的な下垂体放出を引き起こすということが見出されている。従って、ＧＲＦは、成長ホルモンが所望される場合
、重要な治療的有用性を有する。例えば、これは、下垂体低下性（ｈｙｐｏｐｉｔｕｉｔａｒｙ）小人症、ＧＨ生成異常に起因する糖尿病、および加齢プロセスの遅延の処置において使用され得る。ＧＲＦの内因性の生成または放出から利益を受ける多くの他の疾患または状態が、以下に列挙される。さらに、ＧＲＦは、農学分野においても有用である。農学的使用の例としては、より早い販売を可能とするような、ブタ、ウシなどの増強された食肉生産が挙げられる。ＧＲＦはまた、乳牛のミルク生産を刺激することも知られている。

現在まで、ペプチド関連ＧＨ分泌促進物質の使用に関する主な欠点は、長期間（例えば、数日〜数週間）にわたるＧＨの実質的な直線的および持続的な送達を提供し得る適切な技術が欠如していることである。

ＧＲＦ（１〜２９）は、治療的特性を有する多くの他のペプチドと同様に、インビボで極めて不安定であり、このことは、ヒトおよび動物におけるＧＨの放出を促進するための薬学的生成物としてのＧＲＦ（１〜２９）の使用を、有意に制限する。ＧＲＦ１〜２９の半減期は一般に、１０分〜１３分を上回らないので、これは、１日に数回ボーラス注射されなければならないか、または測定可能なＧＨ放出を維持し得るように注入されなければならない。

長期間作用性のＧＲＦのアナログを開発するために、有意な研究の試みが過去数年にわたって展開されてきた。改良された作用持続期間を有する種々の新規なアナログが合成されたが、これらのアナログのいずれも、ＧＨ放出薬剤に必要とされる基準を満たしていない。さらに、いかなる処方物も、規定された期間にわたって、動物またはヒト中でこのような不安的なペプチドを放出することが知られていない。

米国特許第５，８４６，９３６号は、増強された効力、増大された酵素安定性および改良された半減期安定性を有すると言われるＧＲＦアナログを開示する。この特許は、そのアナログが種々のアジュバント（例えば、血清アルブミン）と共に投与され得ることを記載する。この特許中で示される半減期の安定性の結果のみが、インビトロである。インビボでのこのペプチドの実際の安定性についてのデータはない。

米国特許第４，９６３，５２９号は、ＧＲＦおよびヒト血清アルブミンまたはグリシンを含む、固体形態または液体形態のＧＲＦ組成物を開示する。この組成物はまた、緩衝液を含み得、そして、ＧＲＦを安定化するといわれ得る。

ＷＯ９７２４４４５は、成長ホルモン（ｈＧＨ）と組換えアルブミンの分子との融合体を開示する。このような融合タンパク質は、非融合成長ホルモンを超える、増大した循環半減期を有すると言われる。リンカー（必要に応じて切断可能である）は、アルブミン分子と成長ホルモンとの間に挿入され得、ｈＧＨのレセプターへの結合を促進する。

ＷＯ００６９９００は、ペプチダーゼ安定化ペプチドの生成についての方法を開示する。一連のＧＲＦペプチドは、この出願で開示される方法に従って安定化され得る潜在的な候補物質として列挙されるが、それらのいずれも、明細書本文中に詳細に例示されない。

ゆえに、被験体（動物またはヒト）中でＧＨの放出を促進し得る長期持続性化合物を開発する必要が非常にある。このような促進は、好ましくは、ｒＧＨの好ましくない副作用を伴わず、延長された期間にわたり維持されるべきである。

（発明の要旨）
本発明に従って、ここで、対応する非改変の（またはネイティブの）ＧＲＦペプチド配列と比較した場合、延長されたインビボ半減期を有する、成長ホルモン放出因子（ＧＲＦ）誘導体を提供する。さらに具体的には、この誘導体は、そこに結合された反応性要素を含み、そして、インビボまたはエキソビボのいずれかで、安定な共有結合を形成するために血液成分上の利用可能な官能基と反応し得るＧＲＦペプチドまたはそのアナログを含む。この反応性要素は、このペプチドのＮ末端、このペプチドのＣ末端、またはペプチド鎖に沿う任意の他の利用可能な部位に結合され得る。

好ましい血液成分は、免疫グロブリン（ＩｇＧおよびＩｇＭを含む）、血清アルブミン、フェリチン、ステロイド結合タンパク質、トランスフェリン、チロキシン結合タンパク質、α−２−マクログロブリンなどのようなタンパク質を含み、血清アルブミンおよびＩｇＧがより好ましく、そして、血清アルブミンが最も好ましい。

好ましい反応性要素は、インビボまたはインビトロ（またはエキソビボ）のいずれかで、血液成分上に存在するアミノ基、ヒドロキシ基、またチオール基と反応することによって、血液成分と共有結合を形成し得る。最も好ましい実施形態において、タンパク質上の官能基はチオール基であり、そして、反応性要素は、Ｍｉｃｈａｅｌアクセプター（例えば、アクロレイン誘導体、α，β−不飽和ケトン、α，β−不飽和エステル、α，β−不飽和アミド、α，β−不飽和チオエステルなど）、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミドブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、または最も好ましくはマレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ））である。

本発明の別の実施形態において、薬学的に受容可能なキャリアと組合せた本発明のＧＲＦ誘導体を含む薬学的組成物が提供される。このような組成物は、被験体中の内因性のＧＨの生成または放出の促進に有用である。この組成物はまた、ＧＨ生成異常から生じる疾患または状態を処置または予防するための薬学的組成物または獣医学的組成物の製造のために使用され得る。このような疾患または状態の一覧を、以下に示す。

本発明のさらなる実施形態において、被験体（動物またはヒト）中のＧＨの内因性の生成または放出を促進する方法が提供される。この方法は、被験体に、有効量の本発明のＧＲＦ誘導体を、単独でかまたは薬学的キャリアと組合せて投与する工程を包含する。

本発明のさらなる実施形態において、ＧＨ生成異常から生じる疾患または状態を処置または予防する方法が提供され、本方法は、被験体に、有効量の本発明のＧＲＦ誘導体を、単独でかまたは薬学的キャリアと組合せて投与する工程を包含する。

本発明のさらなる局面において、血液成分に共有結合された本発明のＧＲＦ誘導体を含む結合体が、提供される。

本発明のさらなる局面において、被験体におけるＧＲＦペプチドのインビボ半減期を延長する方法を提供し、本方法は、本ＧＲＦ誘導体を血液成分に共有結合させる方法を包含する。この共有結合は、インビボまたはインビトロで起こり得る。

好ましいＧＲＦは、ＧＲＦ（１〜４４）およびそのアナログ（例えば、ＧＨＲＰ−６、ヘキサレリン（Ｈｅｘａｒｅｌｉｎ）、グレリン（Ｇｈｒｅｌｉｎ）、ＧＨＲＰ−１、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−２、Ｂ−ＨＴ９２０、ＧＲＦ（１〜２９）、ならびに以下に列挙されるようなそれらのアナログおよびフラグメント（但し、このような任意のアナログまたはフラグメントが、ＧＲＦの実質的に類似の活性を有する））のようなペプチドである。米国特許第４，４１１，８９０号；同第４，５１７，１８１号；同第４，５１８，５８６号
；同第４，５２８，１９０号；同第４，５２９，５９５号；同第４，５６３，３５２号；同第４，５８５，７５６号；同第４，５９５，６７６号；同第４，６０５，６４３号；同第４，６１０，９７６号；同第４，６２６，５２３号；同第４，６２８，０４３号；同第４，６８９，３１８号；同第４，７３４，３９９号；同第４，７８４，９８７号；同第４，８４３，０６４号；同第５，７５６，４５８号；欧州特許第０１８８２１４号；ＷＯ８９／０７１１０号；ＷＯ８９／０７１１１号およびＷＯ９３／０４０８１号（これらは全て、本明細書中に参考として援用される）は、本発明に従う誘導体化に適切な、さらなるＧＲＦアナログを提供する。

連結する基が、反応性要素およびＧＲＦペプチドの間で存在する場合、好ましくは、以下のように定義されるが、これらに限定されない：直鎖Ｃ_１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ_１〜１０アルキル；直鎖Ｃ_１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ_１〜１０アルキル、もしくは部分的にペルフルオロ化された直鎖Ｃ_１〜１０アルキルもしくは分枝Ｃ_１〜１０アルキル；１つ以上の炭素原子がＯもしくはＳで置換されて、エーテルもしくはチオエーテルを形成する、Ｃ_１〜１０アルキルもしくはフルオロアルキル（例えば、ＺがＯもしくはＳである−Ｚ−、ＣＨ_２ＣＨ_２−、−Ｚ−ＣＦ_２ＣＨ_２−、−Ｚ−ＣＨ_２ＣＦ_２−もしくは−Ｚ−ＣＦ_２−ＣＦ_２−）；置換基が同一であるかもしくは異なり、そして、ＣＨ_２、Ｏ、Ｓ、ＮＨ、ＮＲ（ここで、ＲはＨ、Ｃ_１〜１０アルキルもしくはＣ_１〜１０アシルである）である、ｏ−置換、ｍ−置換またはｐ−置換されたフェニル；または、置換されたヘテロシクリル（例えば、フラン、チオフェン、ピラン、オキサゾールもしくはチアゾール）。
上記に加えて、本発明は、以下を提供する：
（項目１）
成長ホルモン放出因子誘導体であって、以下：
成長ホルモン生成活性または成長ホルモン放出活性を有するペプチド；および
該ペプチドに結合された反応性要素
を含み、該誘導体は、インビボまたはインビトロで、血液成分上の官能基と共有結合し得る、成長ホルモン放出因子誘導体。
（項目２）
前記ペプチドが、ヒトＧＲＦ、ウシＧＲＦ、ニワトリＧＲＦ、サケＧＲＦおよびブタＧＲＦを含む、項目１に記載の誘導体。
（項目３）
項目２に記載の誘導体であって、ここで、前記ペプチドが、以下：

のＧＲＦ配列を含み、ここで、
Ａ_１は、Ｔｙｒ、Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、３−ＭｅＨｉｓ、ｄｅｓＮＨ_２Ｈｉｓ、ｄｅｓＮＨ_２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−ＨｉｓまたはＬｙｓ−３−ＭｅＨｉｓであり；
Ａ_２は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｌａ、（Ｎ−メチル）Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＮｌｅまたはＮｖａｌであり；
Ａ_４は、ＡｌａまたはＧｌｙであり；
Ａ_５は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ａ_７は、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ_８は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ａ_９は、ＡｌａまたはＳｅｒであり；
Ａ_１１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_１２は、Ｌｙｓ、（Ｎ−Ｍｅ）Ｌｙｓ、ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_１３は、ＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ａ_１５は、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＧｌｙであり；
Ａ_１８は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ_２０は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_２１は、Ｌｙｓ、（Ｎ−Ｍｅ）ＬｙｓまたはＡｓｎであり；
Ａ_２２は、ＴｙｒまたはＬｅｕであり；
Ａ_２４は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ａ_２５は、ＳｅｒまたはＡｓｐであり；
Ａ_２６は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ａ_２７は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり；
Ａ_２８は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｓｐであり；
Ａ_２９は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；そして、
Ａ_３０は、存在しないか、ＸまたはＸ−Ｌｙｓであり、ここで、Ｘは存在しないか、または配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕもしくはそのフラグメントであり、ここで、該フラグメントは、Ｃ末端から１〜１５アミノ酸縮小され；そして、ここで、該フラグメント由来の１つのアミノ酸残基は、必要に応じて、リジン残基で置換され得；そして、ここで、該Ｃ末端は、遊離のカルボン酸または対応するアミドであり得；
但し、Ａ_２がＡｌａである場合、該フラグメントは、５〜８アミノ酸縮小されたフラグメントではない、誘導体。
（項目４）
Ａ_３０が、Ｘ−Ｌｙｓであり、そして、ここで、Ｘが存在しない、項目３に記載の誘導体。
（項目５）
Ａ_２がＤ−Ａｌａである、項目４に記載の誘導体。
（項目６）
Ａ_１５がＡｌａである、項目３に記載の誘導体。
（項目７）
Ａ_２がＤ−Ａｌａであり、Ａ_８がＧｌｎであり、Ａ_１５がＡｌａであり、Ａ_２７がＬｅｕであり、Ａ_３０がＸ−Ｌｙｓであり、そしてＸが存在しない、項目３に記載の誘導体。
（項目８）
項目３に記載の誘導体であって、前記ＧＲＦ配列が、以下：

からなる群より選択される、各ＧＲＦ配列は、必要に応じて、Ｎ末端またはＣ末端にリジン残基を含み；そして、ここで、前記反応性要素が、マレイミド含有基である、誘導体。（項目９）
前記ＧＲＦ配列が、前記Ｃ末端にさらなるリジン残基を含む、項目８に記載の誘導体。
（項目１０）
項目１に記載の誘導体であって、以下：

からなる群より選択される誘導体。
（項目１１）
前記血液成分が、血液タンパク質を含む、項目３に記載の誘導体。
（項目１２）
薬学的に受容可能なキャリアと組合せて項目３に記載のＧＲＦ誘導体を含む、薬学的組成物。
（項目１３）
被験体中の内因性ＧＨの生成または放出を促進するための、項目１２に記載の組成物。
（項目１４）
ＧＨ生成異常をから生じる疾患または状態を処置または予防するための、項目１２に記載
の組成物。
（項目１５）
被験体中のＧＨの内因性の生成または放出を促進する方法であって、該方法は、有効量の項目３に記載の誘導体を、単独でかまたは薬学的キャリアと組合せて被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１６）
ＧＨ生成異常から生じる疾患または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、有効量の項目３に記載の誘導体を、単独でかまたは薬学的キャリアと組合せて被験体に投与する工程を包含する、方法。
（項目１７）
血液成分に共有結合された、項目３に記載の誘導体を含む、結合体。
（項目１８）
成長ホルモン放出活性を有するペプチドのインビボ半減期を延長する方法であって、該方法は、該ペプチドを血液成分に共有結合させる工程を包含する、方法。
（項目１９）
ＧＨ生成異常から生じる疾患または状態を処置または予防する方法であって、該方法は、有効量の項目１７に記載の結合体を、単独でかまたは薬学的キャリアと組合せて被験体に投与する工程を包含する、方法。

（発明の詳細な説明）
インビボでの生体結合体化（ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、体内における、ＧＲＦ誘導体に標的血液成分の生物物理学的パラメーターを与えることを介して、生物学的活性の延長された持続期間を提供しながら、元の改変されていないＧＲＦの生物学的活性の実質的な保持を可能にする様式で、分子（例えば、本発明のＧＲＦ誘導体）を標的血液成分（好ましくはタンパク質）に共有結合させるプロセスである。

本発明の目的のために、用語「アナログ」は、ネイティブなＧＲＦ配列に由来する異なるアミノ酸配列を有するが、類似する活性または匹敵する活性を有するペプチドを含むアミノ酸配列を含むことを意味する。このようなアナログは、好ましくは少なくとも６０％、そしてより好ましくは少なくとも８０％、そして最も好ましくは少なくとも９５％の、同数のアミノ酸残基を有するＧＲＦまたはＧＲＦのフラグメントのいずれかと同じアミノ酸配列を有する。

より好ましい実施形態において、本発明のＧＲＦ誘導体は、直接的または結合基を介してのいずれかで反応性要素に結合することによって改変されているＧＲＦペプチドを含み、反応性要素は、血液成分（好ましくは血液タンパク質）と共有結合を形成し得る。反応性要素は、水性の環境において安定でなければならず、そしてそれらの好ましい実施形態は、カルボキシ基、ホスホリル基、イミデート基、またはエステルまたは混合した無水物のいずれかとしてのアシル基を含む。共有結合は、一般的に反応性要素と血液成分のアミノ基、ヒドロキシ基、チオール基との間で形成される。アミノ基は、好ましくはカルボキシ基、ホスホリル基またはアシル基のような反応性要素と共有結合を形成し；ヒドロキシ基は、好ましくは活性化エステルのような反応性要素と共有結合を形成し；そしてチオール基は、好ましくは、エステルまたは混合した無水物のような反応性要素と共有結合を形成する。好ましい血液成分としては、血清アルブミン、免疫グロブリンまたはそれらの組み合わせのような移動性の血液成分が挙げられ、そして好ましい反応性要素としては、マレイミド基のような無水物が挙げられる。最も好ましい実施形態において、血液成分は、血清アルブミンである。

血液成分は、好ましくは移動性であり、これは、この血液成分が任意の長期間（一般的に５分、より通常には１分を超えない）ある位置に固定していないことを意味する。これ
らの血液成分は、膜結合性ではなく、そして少なくとも０．１μｇ／ｍｌの最小濃度で長期間血液中に存在する。好ましい移動性血液成分としては、血清アルブミン、トランスフェリン、フェリチンならびにＩｇＭおよびＩｇＧのような免疫グロブリンが挙げられる。移動性血液成分の半減期は、少なくとも約１２時間である。

本発明のＧＲＦ誘導体は、ペプチドを含むので、保護基は、誘導体の合成プロセスの間必要であり得る。これらの保護基は、ペプチド合成の分野では従来的であり、そしてそれ自体との反応からペプチド誘導体を保護し得る化学的部分として一般的に記載され得る。様々な保護基は、市販され、そしてその例は、本明細書中に参考として援用される米国特許第５，４９３，００７号に見出され得る。適切な保護基の代表的な例としては、アセチル、フルオレニルメチルオキシカルボニル（ＦＭＯＣ）、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ＢＯＣ）、ベンジルオキシカルボニル（ＣＢＺ）などが挙げられる。表１は、アミノ酸の３文字および一文字の両方の略語を提供する。

本発明のＧＲＦ誘導体は、血液成分との結合体化後、ペプチダーゼ安定化長期耐久化合物を形成する。１つ以上のさらなるアミノ酸は、それらのペプチドへの結合を促進するために反応性要素の添加前にペプチドに付加され得ることもまた意図される。このような付加は、Ｃ末端、Ｎ末端またはこれらの間においてなされ得る。従って、得られたペプチド誘導体は、被験体（動物またはヒト）に投与され得、その結果、血液成分との結合体化がインビボで生じるか、またはこの誘導体は、被験体（動物またはヒト）の血液成分にインビボで最初に結合体化し得、そして以下に記載されるような得られた結合体もしくは長期耐久ペプチターゼ安定化ペプチド誘導体は、被験体に投与される。

ＧＲＦ配列に存在するか、ＧＲＦ配列で置換されたかまたはＧＲＦ配列に付加された任意のアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸またはＬ−アミノ酸あるいはそれらの組み合わせであり得る。Ｌ−アミノ酸が一般的に好ましい。ネイティブなＧＲＦペプチド配列（１〜２９）ま
たは（１〜４４）内の以下の置換または変異は、独立してかまたは組み合わせてかのいずれかで本発明の好ましい実施形態を示す：２位のＤ−アラニン；８位のグルタミン；１１位のＤ−アルギニン；１２位の（Ｎ−Ｍｅ）Ｌｙｓ；１５位のアラニン；および２７位のロイシン。

本発明はまた、ＧＲＦフラグメントを含み、このフラグメントは、天然に存在するＧＲＦペプチドの配列に対して実質的に相同な配列を含むが、ＧＲＦのネイティブなペプチド上に天然に見出されるアミノ末端および／またはカルボキシ末端で、１つ以上のさらなるアミノ酸を欠如し得る。従って、本発明は、天然に存在するＧＲＦ配列に通常存在する１つ以上のアミノ酸を欠如し得るＧＲＦのポリペプチドフラグメントに関し、但し、このようなポリペプチドは、好ましくはＧＲＦの成長ホルモン放出活性と少なくとも実質的に等しい成長ホルモン放出活性を有する。

本発明はまた、重要でないアミノ酸置換を有する（従って天然の配列とは異なるアミノ酸配列を有する）上記のアナログまたはフラグメントの明白なまたは平凡な改変体を包含し、但し、このような改変体は、ＧＲＦの成長ホルモン放出活性に実質的に類似する成長ホルモン放出活性を有する。明白なまたは平凡な置換の例としては、別の残基に対する１つの塩基性残基の置換（すなわちＬｙｓに対してＡｒｇ）、別の残基に対する１つの疎水性残基の置換（すなわちＩｌｅに対してＬｅｕ）、別の残基に対する１つの芳香族残基の置換（すなわちＴｙｒに対してＰｈｅ）などが挙げられる。さらに、他の平凡な改変体は、アナログを含み、ここで元の配列の実質的な構造的アナログを生じる保存的置換が、得られる。このような保存的置換の例としては、限定されないが、アスパラギン酸に対してグルタミン酸および逆もまた同様；アスパラギンに対してグルタミンおよび逆もまた同様；またはスレオニンに対してセリンおよび逆もまた同様；アルギニンに対してリジンおよび逆もまた同様；あるいはお互いに対してイソロイシン、バリンまたはロイシンのいずれか、が挙げられる。

ペプチダーゼ安定化ＧＲＦ誘導体は、対応する非安定化ＧＲＦアナログよりもインビボのペプチダーゼ存在下でより安定である。ペプチダーゼ安定性は、血清または血液中のネイティブなＧＲＦアナログの半減期と、血清または血液中の反応基を含む対応する誘導体の半減期との比較によって決定される。半減期は、誘導体ペプチドまたは非改変ペプチドの投与後、血清または血液をサンプリングし、そしてそれぞれの化合物の活性を決定することによって決定される。

より詳細には、本発明は、ＧＲＦの改変に関し、そしてそれらの顕著な治療的特性の実質的な変更なしでの、血液成分との選択的な結合体化を介して、そのバイオアベイラビリティ、延長されたインビボ半減期および分布の延長を改善するためのペプチドに関する。

より好ましい実施形態において、本発明に従う誘導体化のために適切なＧＲＦペプチド配列は、以下の配列である：
Ａ_１−Ａ_２−Ａｓｐ−Ａ_４−Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ａ_７−Ａ_８−Ａ_９−Ｔｙｒ−Ａ_１１−Ａ_１２−Ａ_１３−Ｌｅｕ−Ａ_１５−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａ_１８−Ａｌａ−Ａ_２０−Ａ_２１−Ａ_２２−Ｌｅｕ−Ａ_２４−Ａ_２５−Ａ_２６−Ａ_２７−Ａ_２８−Ａ_２９−Ａ_３０
ここで、
Ａ_１は、Ｔｙｒ、Ｎ−Ａｃ−Ｔｙｒ、Ｈｉｓ、３−ＭｅＨｉｓ、ｄｅｓＮＨ_２Ｈｉｓ、ｄｅｓＮＨ_２Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−Ｔｙｒ、Ｌｙｓ−ＨｉｓまたはＬｙｓ−３−ＭｅＨｉｓであり；
Ａ_２は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｎ−メチル−Ｄ−Ａｌａ、（Ｎ−メチル）−Ａｌａ、Ｇｌｙ、ＮｌｅまたはＮｖａｌであり；
Ａ_４は、ＡｌａまたはＧｌｙであり；
Ａ_５は、ＭｅｔまたはＩｌｅであり；
Ａ_７は、Ａｓｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ_８は、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＳｅｒであり；
Ａ_９は、ＡｌａまたはＳｅｒであり；
Ａ_１１は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_１２は、Ｌｙｓ、（Ｎ−Ｍｅ）ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_１３は、ＶａｌまたはＬｅｕであり；
Ａ_１５は、Ａｌａ、ＬｅｕまたはＧｌｙであり；
Ａ_１８は、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ａ_２０は、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ＬｙｓまたはＤ−Ｌｙｓであり；
Ａ_２１は、Ｌｙｓ、（Ｎ−Ｍｅ）ＬｙｓまたはＡｓｎであり；
Ａ_２２は、ＴｙｒまたはＬｅｕであり；
Ａ_２４は、ＧｌｎまたはＨｉｓであり；
Ａ_２５は、ＳｅｒまたはＡｓｐであり；
Ａ_２６は、ＬｅｕまたはＩｌｅであり；
Ａ_２７は、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＮｌｅであり；
Ａ_２８は、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、ＡｌａまたはＡｓｐであり；
Ａ_２９は、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；そして、
Ａ_３０は、存在しないか、ＸまたはＸ−Ｌｙｓであり、ここで、Ｘは存在しないか、または配列Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕもしくはそのフラグメントであり、ここで、フラグメントは、Ｃ末端から１〜１５アミノ酸減少され；そして、ここで、フラグメント由来の１つのアミノ酸残基は、必要に応じて、リジン残基で置換され得；そして、ここで、Ｃ末端は、遊離のカルボン酸または対応するアミドであり得；
但し、Ａ_２がＡｌａである場合、フラグメントは、５〜８アミノ酸に減少されたフラグメントではない。

本発明は、特に以下のための治療剤および延長されたインビボ半減期を有するＧＲＦ誘導体の関連の使用に関する：
−成長ホルモンのレベルの増加；
−本発明のＧＲＦ誘導体アナログを被験体に投与し、そして成長ホルモン応答を測定することによる成長ホルモンの欠乏の診断；
−下垂体性小人症の処置；
−成長遅延の処置または予防；
−骨折の修復または損傷治癒の促進；
−やけど患者または大きな手術を受けた患者の回復の促進；
−筋肉の強度、移動性、皮膚の厚さの維持、代謝のホメオスタシスまたは腎臓のホメオスタシスの改善；
−うっ血性心不全の処置または予防；
−老化に関する弱さの処置または予防；
−骨粗しょう症の処置または予防；
−肥満症の処置または予防；
−大きな手術後のタンパク質異化応答の減弱；
−悪液質および慢性疾患に起因するタンパク質損失の減少；
−タンパク質同化作用（タンパク質節約効果を含む）の改善；
−脂肪分解効果の誘導；および／または
−成長ホルモン分泌細胞機能の向上。

全ての上記の方法は、ヒトまたは動物のいずれかに適用され得る。

成長ホルモンの内因性の生成および放出の促進に加えて、本発明のＧＲＦ誘導体は、ＧＲＦペプチド「骨格」内の１つ以上の部位でアミノ酸置換を取り込むか、あるいはＣ末端および／もしくはＮ末端が１つ以上の塩基性残基の付加によって改変されたＧＲＦ種の改変体であるか、またはインビボでの所望でない生化学的攻撃および分解からペプチド末端を保護するために、ペプチド化学の当該分野において通常使用される型のブロック基を取り込むように改変されたＧＲＦ種の改変体である。従って、本発明のＧＲＦ誘導体は、以下に挙げられる（限定されないが）任意のＧＲＦ種に関して、アミノ酸置換を取り込む：ヒトＧＲＦ、ウシＧＲＦ、ラットＧＲＦ、ブタＧＲＦなど（これらの配列は、多数の著者によって報告されている）。より好ましい実施形態において、リジン残基は、ＧＲＦペプチド配列のＣ末端またはＮ末端で付加される。

好ましい実施形態において、タンパク質上官能基は、チオール基であり、そして反応性要素は、マレイミドまたはマレイミド含有基（例えば、γ−マレイミド−ブチリルアミド（ＧＭＢＡ）、マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）、（２−アミノ）エトキシ酢酸（ＡＥＡ）−ＭＰＡ、エチレンジアミン（ＥＤＡ）−ＭＰＡまたは［２−（２−アミノ）エトキシ）］エトキシ酢酸（ＡＥＥＡ）−ＭＰＡおよびこれらの組み合わせ）である。組み合わせの例としては、限定されないが、（ＡＥＥＡ−ＥＤＡ）−ＭＰＡ；（ＡＥＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡ、（ＡＥＡ−ＡＥＥＡ）−ＭＰＡなどが挙げられる。

マレイミド基は、反応混合物のｐＨが６．５と７．４との間に維持される場合、ペプチドのスルフヒドリル基に対してより選択的である。ｐＨ７．０で、スルフヒドリルとのマレイミド基の反応速度は、アミンとの反応速度よりも１０００倍速い。マレイミド基とスルフヒドリルとの間の安定なチオエーテル結合は、生理学的条件下で切断され得ない結合を形成する。

本発明のＧＲＦ誘導体は、血液成分の特異的標識化を提供する。このような特異的標識化（特に、マレイミドを用いる）は、いくつかの利点を提供する。チオール基は、インビボでアミノ基より少なく、そして結果として、マレイミド誘導体は、より少数のタンパク質に共有結合する。例えば、血清アルブミンにおいて、１分子あたり１つの遊離チオール基のみが存在する。従って、ＧＲＦ−マレイミド−アルブミン結合体は、アルブミンに対するペプチドの約１：１のモル比を含む傾向がある。アルブミンに加えて、ＩｇＧ分子（クラスＩＩ）はまた、遊離チオール基を有する。ＩｇＧ分子および血清アルブミンは、血液中で大多数の可溶性タンパク質を構成するので、それらはまた、マレイミド−置換ＧＲＦに共有結合するために利用可能な大多数の遊離のチオール基を構成する。

さらに、遊離チオール含有血液タンパク質の間でさえ、マレイミドでの特異的標識化は、アルブミン自体の独特の特性に起因して、ペプチドマレイミド−アルブミン結合体の優先的な形成を導く。アルブミンの単一の遊離チオール基（種の間で高度に保存される）は、アミノ酸残基Ｃｙｓ_３４に位置する。アルブミンのＣｙｓ_３４は、他の遊離チオール含有タンパク質上の遊離チオールと比較して増加した反応性を有することが最近証明されている。これは、アルブミンのＣｙｓ_３４についての非常に低い５．５のｐＫ値に部分的に起因する。これは、一般的なシステイン残基についての代表的なｐＫ値（これは代表的には、約８である）よりもかなり低い。この低いｐＫに起因して、通常の生理学的条件下で、アルブミンのＣｙｓ_３４は、主にイオン化形態であり、その反応性を劇的に上昇させる。Ｃｙｓ_３４の低いｐＫ値に加えて、Ｃｙｓ_３４の反応性を増強する別の因子は、アルブミンのＶ領域の１つのループの表面に近接する間隙に存在する位置にある。この位置は、Ｃｙｓ_３４を、全ての種類のリガンドに非常にアクセス可能にし、そして遊離のラジカルトラップおよび遊離のチオールスカベンジャーとしてのＣｙｓ_３４の生物学的な役割において重要な因子である。結果として、反応速度の加速は、他の遊離チオール含有タンパク質を有するペプチド−マレイミドの反応速度と比較して１０００倍ほどの速さであり得る
。

ペプチド−マレイミド−アルブミン結合体の別の利点は、Ｃｙｓ_３４において特異的に、アルブミンに対してペプチドを１：１でロードすることに伴う再現性である。従来の活性化技術（例えば、グルタルアルデヒド、ＤＣＣ、ＥＤＣおよび他の化学的アクチベータ（例えば、遊離アミンの化学的アクチベータ）を用いる技術）は、この選択性を欠いている。例えば、アルブミンは、５２個のリジン残基を含み、このうち２５〜３０個は、アルブミンの表面上に位置し、そして結合体にとってアクセス可能である。これらのリジン残基を活性化すること、あるいは、これらのリジン残基を介して結合するようにペプチドを修飾することは、結合体の不均一な集団を生じる。等モル比（すなわち、１：１）のペプチド：アルブミンが使用される場合でさえ、最終的な結果は、ランダムな結合体集団の生成であり、いくつかは、アルブミンの各分子に連結した不正確な数のペプチドを含み、そして各々の結合体は、２５〜３０個の利用可能なリジン部位のいずれか１つにおいてランダムに結合したペプチドを有する。結果として、正確な化合物の特徴付けは、再現性の非存在はもちろんのこと、実際には不可能である。さらに、アルブミンのリジン残基を介した結合体は、アルブミン１分子当たり、より多くの治療剤を送達する利点を少なくとも有すると考えられたが、研究により、アルブミンに対する治療剤の１：１の比が好ましいことが示されている。Ｓｔｅｈｌｅら、Ａｎｔｉ−ＣａｎｃｅｒＤｒｕｇｓ、１９９７、８、６７７−６８５（これは、本明細書中でその全体が援用される）による論文において、グルタルアルデヒドを介して結合体化したアルブミンに対する抗癌メトトレキセートの１：１の比が、最も見込みのある結果を生じたことが報告された。これらの結合体は、腫瘍細胞によって取り込まれるが、一方、５：１〜２０：１のメトトレキセート分子を保有する結合体は、変更されたＨＰＬＣプロフィールを有し、そしてインビボで肝臓によって迅速に取りこまれる。従って、より高い比では、アルブミンに対するコンフォメーション変化は、治療剤のためのキャリアとしてのその有効性を減少すると考えられる。

本発明のＧＲＦ誘導体の制御された投与、および特にマレイミド反応性要素を含むＧＲＦによって、アルブミンおよびＩｇＧの、特異的なインビボでの標識および結合が制御され得る。代表的な投与において、投与されたペプチド誘導体の８０〜９０％がアルブミンに結合し、そして５％未満がＩｇＧに結合したことが示された。存在する遊離チオール（例えば、グルタチオン）の微量結合もまた生じる。このような特異的結合は、投与される治療剤の推定半減期の正確な計算を可能にする場合に、インビボでの使用のために好ましい。

制御された特異的インビボ結合を提供することに加えて、マレイミド置換されたＧＲＦペプチドは、エキソビボでの血清アルブミンおよびＩｇＧの特異的標識を提供し得る。このようなエキソビボの結合は、血液、血清または精製された血液成分（例えば、血清アルブミンおよび／またはＩｇＧ）を含む生理食塩水に、マレイミド−ペプチドを添加することを包含する。好ましい様式において、この誘導体は、マレイミドによって、必要に応じてリンカー基を介して置換され、そして生理食塩水中でヒト血清アルブミンと反応される。一旦、本発明のＧＲＦ誘導体によってエキソビボで修飾されると、血液、血清または生理食塩水は、インビボの処置のために、血液に再投与され得る。

マレイミド置換されたＧＲＦペプチドは、一般に、水溶液の存在下および遊離アミンの存在下で、非常に安定である。マレイミド置換されたＧＲＦペプチドは、遊離チオールと反応するので、保護基が、それら自身との反応からマレイミド置換されたＧＲＦペプチドを保護する必要はない。さらに、ペプチド誘導体の安定性の増加は、さらなる精製工程（例えば、ＨＰＬＣ）を使用して、インビボでの使用に適切な高度に精製された生成物を調製することを可能にする。最後に、増加した化学的安定性は、より長い保存期間を有する生成物を提供する。

血液成分に対するＧＲＦ誘導体の所望の結合体は、動物またはヒトであり得る被験体にこれらの誘導体を直接投与することによって、インビボで調製され得る。この投与は、ボーラスの形態で行われ得るか、または規制流れ（ｍｅｔｅｒｅｄｆｌｏｗ）などを使用する注入により、ゆっくりと時間をかけて導入され得る。

あるいは、この結合体はまた、血液または市販の精製血液成分を、本発明のＧＲＦ誘導体と合わせ、血液成分上の官能基に対するＧＲＦ誘導体の共有結合を可能にし、次いで結合体化した血液または結合体化した精製血液成分を宿主に戻すか、または投与することによって、エキソビボで調製され得る。さらに、上記はまた、個々の血液成分または限定数の成分（例えば、赤血球、免疫グロブリン、血清アルブミンなど）を最初に精製し、そしてこれらの成分を存在する化合物誘導体とエキソビボであわせることによっても、達成され得る。次いで、標識された血液または血液成分は、インビボで治療的に有効な結合体を提供するために、被験体に戻され得る。血液はまた、エキソビボでの扱いの間の凝集を予防するために、処理され得る。

（ペプチド合成）
ＧＲＦペプチドは、当業者に周知の固相ペプチド化学の標準的な方法によって、合成され得る。例えば、ペプチドは、Ｓｔｅｗａｒｄら、ＳｏｉｌｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ、第二版、ＰｉｅｒｃｅＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉｌｌ．（１９８４）に記載される手順に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ合成機を使用して、固相化学技術によって合成され得る。同様に、ペプチドフラグメントが合成され得、引き続いて一緒に合わせられるかまたは連結されて、より大きなペプチドを形成し得る。これらの合成ペプチドフラグメントはまた、特定の位置でアミノ酸置換を有して作製され得る。

固相ペプチド合成について、多くの技術の要約が、Ｓｔｅｗａｒｔら、「ＳｏｉｌｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」、Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎＣｏ．（ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ）、１９６３およびＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ、ＨｏｒｍｏｎａｌＰｒｏｔｅｉｎａｎｄＰｅｐｔｉｄｅｓ、１９７３、２、４６に見出され得る。古典的な溶液合成については、例えば、Ｓｃｈｒｏｄｅｒら、「ＴｈｅＰｅｐｔｉｄｅ」、第１巻、ＡｃａｃｅｍｉｃＰｒｅｓｓ（ＮｅｗＹｏｒｋ）を参照のこと。一般に、このような方法は、成長するペプチド鎖に、１以上のアミノ酸または適切に保護されたアミノ酸の連続的付加を含む。通常、第一のアミノ酸のアミノ基またはカルボキシル基のいずれかが、適切な保護基によって保護される。次いで、保護されたアミノ酸または誘導体化アミノ酸は、不活性な固体支持体に結合されるか、または、適切に保護された相補的な（アミノまたはカルボキシル）基を有する配列中に次のアミノ酸を、アミド結合の形成に適切な条件下で付加することによって、溶液中で使用されるかのいずれかである。次いで、保護基を、この新たに付加されたアミノ酸残基から除去し、（適切に保護された）次のアミノ酸を付加するなどする。

全ての所望のアミノ酸が、適切な配列に連結された後、任意の残りの保護基（および任意の固体支持体）を引き続いて除去するか、または同時に最終ポリペプチドを得る。この一般的手順の単純な改変によって（例えば、（キラル中心を不斉化しない条件下で）保護トリペプチドを適切に保護されたジペプチドに結合させて、脱保護後にペンタペプチドを形成することによって）、成長する鎖に同時に１つ以上のアミノ酸を付加することが可能である。

本発明のＧＲＦ誘導体を調製する特に好ましい方法としては、固相ペプチド合成が挙げられ、ここでこのアミノ酸α−Ｎ末端は酸感応基または塩基感応基によって保護される。
このような保護基は、ペプチド連結形成の条件に安定であるが、成長ペプチド鎖またはこれらに含まれる任意のキラルセンターのラセミ化を破壊することなくに容易に除去可能な性質を有するべきである。Ｎ−保護基およびカルボキシ保護基の例は、Ｇｒｅｅｎｅ，「ＰｒｏｔｅｃｔｉｖｅＧｒｏｕｐｓＩｎＯｒｇａｎｉｃＳｙｎｔｈｅｓｉｓ」（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮｅｗＹｏｒｋｐｐ．１５２〜１８６（１９８１））に開示され、これは参考として本明細書中で援用される。Ｎ−保護基の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：低級アルカノイル基（例えば、ホルミル、アセチル（「Ａｃ」）、プロピオニル、ピバロイル（ｐｉｖａｌｏｙｌ）、ｔ−ブチルアセチルなど）；他のアシル基（例えば、２−クロロアセチル、２−ブロモアセチル、トリフルオロアセチル、トリクロロアセチル、フタルイル、ｏ−ニトロフェノキシアセチル、ｏ−クロロブチリル、ベンゾイル、４−クロロベンゾイル、４−ブロモベンゾイル、４−ニトロベンゾイル、など）；スルホニル基（たとえば、ベンゼンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、ｏ−ニトロフェニルスルホニル、２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ））；カルバメート形成基（例えば、ｔ−アミルオキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル、ｐ−クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル、２−ニトロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ブロモベンジルオキシカルボニル、３，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、２，４−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、４−エトキシベンジルオキシカルボニル、２−ニトロ−４，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、３，４，５−トリメトキシベンジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニルイル）−１−メチルエトキシカルボニル、α，α−ジメチル−３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル、ベンズヒドリルオキシカルボニル、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、ジイソプロピルメトキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボニル、エトキシカルボニル、メトキシカルボニル、アリルオキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、フェノキシカルボニル、４−ニトロフェノキシカルボニル、フルオレニル−９−メトキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル（ｉｓｏｂｏｒｎｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロペンチルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル（ａｄａｍａｎｔｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）、シクロヘキシルオキシカルボニル、フェニルチオカルボニル）；アリールアルキル基（例えば、ベンジル、ビフェニルイソプロピルオキシカルボニル、トリフェニルメチル、ベンジルオキシメチル、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）など）およびシリル基（例えば、トリメチルシリルなど）。好ましいα−Ｎ−保護基は、ｏ−ニトロフェニルスルフェニル；９−フルオレニルメチルオキシカルボニル；ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｂｏｃ）、イソボルニルオキシカルボニル；３，５−ジメトキシベンジルオキシカルボニル；ｔ−アミルオキシカルボニル；２−シアノ−ｔ−ブチルオキシカルボニルなどであり、９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）がより好ましい。その一方、好ましい側鎖Ｎ−保護基としては、リジンおよびアルギニンのような側鎖アミノ基に対しては２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル（ｐｍｃ）、ニトロ、ｐ−トルエンスルホニル、４−メトキシベンゼン−スルホニル、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、およびアダマンチルオキシカルボニル；チロシンに対してはベンジル、ｏ−ブロモベンジルオキシカルボニル、２，６−ジクロロベンジル、イソプロピル、ｔ−ブチル（ｔ−Ｂｕ）、シクロヘキシル、シクロペニルおよびアセチル（Ａｃ）；セリンに対してはｔ−ブチル、ベンジルおよびテトラヒドロピラニル；ヒスチジンに対しては、トリチル、ベンジル、Ｃｂｚ、ｐ−トルエンスルホニル、および２，４−ジニトロフェニル；トリプロファンに対してはホルミル；アスパラギン酸およびグルタミン酸に対してはベンジルおよびｔ−ブチル；そしてシステインに対してはトリフェニルメチル（トリチル）が挙げられる。

カルボキシ保護基は、慣習的に、カルボン酸保護エステルまたはアミド基と呼ばれる。このようなカルボキシ保護基は、当業者に周知であり、米国特許第３，８４０，５５６号
および同第３，７１９，６６７号（これらの開示は、参考として本明細書中で援用される）に記載されるようにペニシリンおよびセファロスポリンにおけるカルボキシル基の保護において広範に使用されている。代表的なカルボキシ保護基としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｃ_１〜Ｃ_８低級アルキル；アリールアルキル（例えば、フェネチルまたはベンジルおよび（アルコキシベンジル基またはニトロベンジル基のような）これらの置換された誘導体；アリールアルケニル（例えば、フェニルエテニル）；
アリールおよび（５−インダニルのような）この置換された誘導体；ジアルキルアミノアルキル（例えば、ジメチルアミノエチル）；アルカノイルオキシアルキル基（例えば、アセトキシメチル、ブチリルオキシメチル、バレリルオキシメチル（ｖａｌｅｒｙｌｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）、イソブチリルオキシメチル、イソバレリルオキシメチル、１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、１−（ピバロイルオキシ）−１−エチル、１−メチルー１−（プロピオニルオキシ）−１−エチル、ピバロイルオキシメチル、プロピオニルオキシメチル）；シクロアルカノイルオキシアルキル基（例えば、シクロプロピルカルボニルオキシメチル、シクロブチルカルボニルオキシメチル、シクロペンチルカルボニルオキシメチル、シクロヘキシルカルボニルオキシメチル）；アロイルオキシアルキル（例えば、ベンゾイルオキシメチル、ベンゾイルオキシエチル）；アリールアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、ベンジルカルボニルオキシメチル、２−ベンジルカルボニルオキシエチル）；アルコキシカルボニルアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルアルキル（例えば、メトキシカルボニルメチル、シクロヘキシルオキシカルボニルメチル、１−メトキシカルボニル−１−エチル）；アルコキシカルボニルオキシアルキルまたはシクロアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、メトキシカルボニルオキシメチル、ｔ−ブチルオキシカルボニルオキシメチル、１−エトキシカルボニルオキシ−１−エチル、１−シクロヘキシルオキシカルボニルオキシー１−エチル）；アリールオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（フェノキシカルボニルオキシ）エチル、２−（５−インダニルオキシカルボニルオキシ）−エチル）；アルコキシアルキルカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（１−メトキシ−２−メチルプロパン−２−オイルオキシ（ｏｙｌｏｘｙ））−エチル）；アリールアルキルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（ベンジルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アリールアルケニルオキシカルボニルオキシアルキル（例えば、２−（３−フェニルプロペン−２−イルオキシカルボニルオキシ）エチル）；アルコキシカルボニルアミノアルキル（例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニルアミノメチル）；アルキルアミノカルボニルアミノアルキル（例えば、メチルアミノカルボニルアミノメチル）；アルカノイルアミノアルキル（例えば、アセチルアミノメチル）；ヘテロ環カルボニルオキシアルキル（例えば、４−メチルピペラジニル−カルボニルオキシメチル）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル（例えば、４−メチルピペラジニルカルボニルオキシメチル）；ジアルキルアミノカルボニルアルキル（例えば、ジメチルアミノカルボニルメチル、ジエチルアミノカルボニルメチル）；（５−（低級アルキル）−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−ｔ−ブチル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル）；および（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）アルキル（例えば、（５−フェニル−２−オキソ−１，３−ジオキソレン−４−イル）メチル。代表的なアミドカルボキシ保護基としては、アミノカルボニル基および低級アルキルアミノカルボニル基が挙げられるがこれらに限定されない。上記のカルボキシ保護基の中で、低級アルキル、シクロアルキルエステルもしくはアリールアルキルエステル（例えば、メチルエステル、エチルエステル、プロピルエステル、イソプロピルエステル、ブチルエステル、ｓｅｃ−ブチルエステル、イソブチルエステル、アミルエステル、イソアミルエステル、オクチルエステル、シクロヘキシルエステル、フェニルエチルエステルなど）またはアルカノイルオキシアルキル、シクロアルカノイルオキシアルキル、アロイルオキシアルキルまたはアリールアルキルカルボニルオキシアルキルエステルが好ましい。好ましいアミドカルボキシ保護基は、低級アルキルアミノカルボニル基である。

固相ペプチド合成法において、α−Ｃ−末端アミノ酸は、適切な固体支持体または樹脂に結合される。上記の合成に有用な適切な固体支持体は、試薬および段階的な濃縮−脱保護反応の反応条件に不活性であり、そして使用される媒体に不溶である、材料である。α−Ｃ末端カルボキシペプチドの合成に好ましい固体支持体は、４−ヒドロキシメチルフェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）である。このαーＣ末端アミドペプチドのための好ましい固体支持体は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ）から入手される４−（２’，４'−ジメトキシフェ
ニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシアセトアミドエチル樹脂である。このα−Ｃ−末端アミノ酸は、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）またはＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）（使用するかまたは使用しない）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム−（ヘキサフルオロホスフェート）（ＢＯＰ）またはビス（２−オキソ−３−オキサゾリジニル）ホスフィンクロリド（ＢＯＰＣｌ）によって樹脂にカップリングされ、カップリングは、ジクロロメタンまたはＤＭＦのような溶媒中で１０℃〜５０℃の温度で約１〜約２４時間行われる。

固体支持体が、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂である場合、上記のようにα−Ｃ−末端アミノ酸によるカップリングの前に、このＦｍｏｃ基は２級アミン（好ましくはピペリジン）によって切断される。脱保護された４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ−アセトアミドエチル樹脂にカップリングする好ましい方法は、ＤＭＦ中のＯ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロ−ホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。連続的な保護アミノ酸のカップリングは、当該分野で公知の従来の様式で自動ポリペプチド合成機で実行され得る。

α−Ｎ−末端側の成長ペプチドからのＦｍｏｃ保護基の除去は、例えば、２級アミン（好ましくはピペリジン）での処理によって従来どおりに達成される。次いで、それぞれの保護アミノ酸は、約３倍の過剰モル濃度において導入され、そしてそのカップリングは好ましくはＤＭＦ中で実行される。このカップリング剤は、通常、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、１当量）、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、１当量）、および必要に応じて１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ、１当量）である。

固相合成の最後、このペプチドは、連続的な操作かまたは単一の操作のいずれかで樹脂から除去され、そして脱保護される。このポリペプチドの除去および脱保護は、樹脂結合ポリペプチドを、チオアニゾール、トリイソプロピルシラン、フェノール、およびトリフルオロ酢酸を含む切断剤で処理することによる一回の操作において従来どおりに達成され得る。ポリペプチドのα−Ｃ−末端がアルキルアミドである場合、この樹脂は、アルキルアミンを用いるアミノ分解によって切断される。あるいは、このペプチドは、エステル交換（例えば、メタノールを用いて）によって除去され得、続いてアミノ分解または直接アミド基転移によって除去され得る。この保護ペプチドは、この時点で精製され得るかまたは直接、次の工程に移される。この側鎖保護基の除去は、上記の切断混合物を使用して達成される。十分に脱保護されたペプチドは、以下のいずれかまたはすべての型を使用するクロマトグラフィー工程のシーケンスによって生成され得る：弱酸樹脂（酢酸型）によるイオン交換；非誘導化ポリスチレン−ジビニルベンゼン（例えば、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＸＡＤ^ＴＭ）による疎水性吸着クロマトグラフィー；シリカゲル吸着クロマトグラフィー
；カルボキシメチルセルロースによるイオン交換クロマトグラフィー；分配クロマトグラフィー（例えば、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５^ＴＭ、ＬＨ−２０^ＴＭまたは向流分配）；高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、特に、オクチルシリカまたはオクタデシルシリルシリカが、カラム充填相に結合されている逆相ＨＰＬＣ。当業者の誰もが、どのクロマトグラフィー工程またはシーケンスが、ＧＲＦペプチドの満足な精製を得るのに好ましいかを容易に決定し得る。

これらのペプチドの分子量は、ＱｕａｄｒｕｐｏｌｅＥｌｅｃｔｒｏＳｐｒａｙ質量分析器を使用して測定される。

本発明のＧＲＦ誘導体の生成のための合成プロセスは、ＧＲＦ誘導体に含まれる種々の要素の性質（すなわち、このＧＲＦの配列、連結基および反応性要素）に依存して大きく変化する。この合成手順は、単純性、高収率および平均反応性を保証するよう選択され、そして高度に精製された生成物を得る。通常、この化学的な反応基は、その合成の最終段階でカップリングされる。本発明のＧＲＦ誘導体の生成のための特定の方法は、以下に記載される。

化学的な反応性要素が、ポリペプチドが元のＧＲＦペプチドの実質的な比率、活性および／または有益な影響を（全てではないにしても）保持しながら血液成分に結合され得る側に配置されることは、不可避である。

より好ましい実施形態において、各ＧＲＦ誘導体は、以下の基準に従って合成される：末端カルボキシル基が、ペプチド上で利用可能であり、薬理学的活性の保持に重大な意味を持たず、かつ他の感応性官能基がペプチド上に存在しない場合、カルボン酸は、連結基の反応性要素の修飾のための接着部分として選択される。この末端カルボキシル基が、薬理学的活性に含まれるかまたはどのカルボン酸も利用可能でない場合、薬理学的活性の保持に重要な意味を持たない任意の他の感応性官能基が、連結基の反応性要素の修飾のための接着部分として選択される。いくつかの感応性官能基が、ペプチド上で利用可能である場合、保護基の組合せは、連結基／反応性要素の付加および全ての保護された感応性感応基の脱保護後に薬理学的活性がなお保持されるような方法において使用される。感応性感応基がペプチド上で利用可能でない場合、合成の試みは、生物学的活性の保持およびレセプター特性または標的特性の保持が得られるような方法での元のペプチドの修飾を可能にする。この場合、この修飾は、好ましくはペプチドの反対の末端で生じる。

本発明のＧＲＦ誘導体は、その治療効果を最適化するよう単独でかまたは他の薬物もしくは薬学的産物との組み合わせで使用され得る。これらは、生理学的に受容可能な媒体（例えば、脱イオン水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水、水性エタノールまたは他のアルコール、血漿、タンパク様溶液、マンニトール、水性グルコース、アルコール、植物油など）で投与され得る。含まれ得る他の添加物として緩衝液（ここでこの培地は一般的には約５〜１０の範囲のｐＨに緩衝され、この緩衝液は一般的には約５０〜２５０ｍＭの濃度である）、塩（ここで塩の濃度は一般的には約５〜５００ｍＭの範囲である）、薬学的に受容可能な安定剤などが挙げられる。この組成物は、便利な貯蔵および輸送のために凍結乾燥され得る。

本発明のペプチド誘導体は、経口的に、非経口的（例えば、血管内（ＩＶ）、動脈内に（ＩＡ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）など）に投与され得る。投与は、注入によって適切な状況においてなされ得る。いくつかの例では、官能基の反応が比較的遅い場合、投与は、経口、経鼻、直腸、経皮またはエアロゾルであり得、ここでこの結合体の性質は、血管系への輸送を可能にする。所望の場合、１度以上の注射が使用され得るが、通常は１度の注射が行われる。このペプチド誘導体は、任意の首尾良い手段によって投与され得、
その手段としては、注射器、外套針、カテーテルなどが挙げられる。投与の特定の様式は、投与量によって、１度の大量瞬時投与であるか連続的な投与であるかなどによって変化する。好ましくは、その投与は、血管内投与であり、ここで注入の部位は、本発明にとって重要ではなく、好ましくは速い血流が存在する部位（例えば、静脈内、末梢血管または中心静脈）である。他の経路は、投与が遅延放出技術または保護マトリクスと結び付けられた用途を見出し得る。この意図は、ペプチドが血液に効果的に拡散され、その結果血液成分と反応し得ることである。この結合体の濃度は、非常に広範であり、一般的には約１ｐｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。この血管内総投与量は、一般的には約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌであり、より一般的には約１ｍｇ／ｍｌ〜約５ｍｇ／ｍｌである。

長寿命の血液成分（例えば、免疫グロブリン、血清アルブミン、赤血球および血小板）への結合によって多くの利点を生じる。本発明のペプチド誘導体の活性は、数日間、延長され、そして潜在的には数週間にまで延長される。１回のみの投与が、この期間の間で必要とされる。より大きい特異性が、活性成分が大分子に最初に結合することによって達成され、細胞内に取り込まれて、他の生理学的プロセスと干渉する可能性はほとんどない。

哺乳動物宿主の血液は、ペプチドの活性および／またはペプチド誘導体の存在に対してモニタリングされ得る。異なる時間に宿主の血液の一部またはサンプルを取り出すことによって、ペプチドが治療的に活性であるのに十分な量で長寿命血液成分に結合するか否かが測定され、その後、血液におけるペプチドのレベルが測定され得る。所望の場合、ペプチドが共有結合される血液成分も測定され得る。特異的なマレイミド置換されたペプチドは、血清アルブミンおよびＩｇＧの半減期を計算するのが容易である。モニタリングはまた、ペプチド活性のアッセイ、ＨＰＬＣ−ＭＳまたはペプチドを指向する抗体を使用することによって行われ得る。

本発明の別の局面は、ペプチドに特異的な抗体を使用して生物学的サンプル（例えば、血液）においてＧＲＦペプチドまたはその結合体の濃度を測定する方法およびこのようなペプチドまたは結合体と潜在的に関連する毒性に対する処置としてのこのような抗体の使用に関する。これは、患者におけるＧＲＦ誘導体のインビボでの存在および寿命が延長されることにより、処置の間に新たな問題（毒性に対する可能性の増加を含む）が引き起こされ得るという理由で有利である。「抗−誘導体」抗体（モノクローナルかポリクローナルのいずれか）の使用は、特定の誘導体に対して特異性を有しており、任意のこのような問題の媒介を補助し得る。この抗体は、産生され得るかまたは、特定の修飾されたペプチド、または薬剤の免疫原性フラグメント、または薬剤の抗原決定基に対応する合成免疫原によって免疫された宿主から誘導され得る。好ましい抗体は、ペプチド誘導体のネイティブ形態、誘導体形態および結合体形態に対して高い特異性および親和性を有する。このような抗体はまた、酵素、蛍光色素、または放射標識で標識化され得る。

ＧＲＦ誘導体に対する抗体特異性は、誘導体化されたペプチド特異的抗体の導入のために精製されたペプチドを使用することによって産生され得る。抗体の導入によって、動物への注射による免疫応答の刺激だけでなく、合成抗体または他の特異的結合分子の生成における類似の工程（例えば、遺伝子組換え免疫グロブリンライブラリのスクリーニング）を意図する。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が、当該分野において周知の手順によって産生され得る。

この抗体はまた、血流における誘導体の存在をモニタリングするのに使用され得る。血液サンプルおよび／または血清サンプルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによって分析され得る。このような技術は、血液成分に対するＧＲＦ誘導体の結合の測定のための血液または血清の分析を可能にする。

抗−治療薬剤抗体がまた、ＧＲＦ誘導体の投与によって誘導された毒性の処置に使用され得、エキソビボまたはインビボで使用され得る。エキソビボ法としては、固体支持体に固定された抗−治療薬剤抗体を使用する毒性の免疫透析処置が挙げられる。インビボ法としては、抗体−薬剤複合体のクリアランスを誘導するのに有効量の治療薬剤抗体の投与が挙げられる。

この抗体は、ＧＲＦ誘導体およびこれらの結合体を、患者の血液から滅菌条件下で血液を抗体に接触させることによってエキソビボで除去するのに使用され得る。例えば、抗体は固定され得るかまたはそうでなければカラムマトリクスに固定され得、そして患者の血液が患者から取り出され、このマトリクスを通される。このＧＲＦ誘導体は、抗体および低濃度のＧＲＦ誘導体を含む血液に結合し、患者の循環系に戻され得る。除去されるＧＲＦ誘導体の量は、圧力および流速を調節することによって制御され得る。ＧＲＦ誘導体の患者の血清成分からの優先的な除去は、例えば、抗−治療抗体を含むマトリクスを介して血清成分を通過する前に、半透膜の使用によってかまたは当該分野において公知の方法による細胞成分からの血清成分の最初の分離によってもたらされ得る。あるいは、誘導体結合体化血液細胞（例えば、赤血球）の優先的な除去は、患者の血液の血清成分を除去するために、患者の血液中の赤血球の回収および濃縮ならびにこれらの細胞と固定化された抗−ペプチド抗体との接触によってもたらされ得る。

この抗−ペプチド抗体は、処置のためにＧＲＦ誘導体またはその結合体を受ける患者にインビボで非経口的に投与され得る。この抗体は、ＧＲＦ誘導体および結合体と結合する。一旦結合すると、このＧＲＦ誘導体活性は完全にブロッキングされない場合、邪魔され、それによって患者の血流におけるＧＲＦ誘導体の生物学的に有効な濃度を減少させ、そして有害な副作用を最小限に抑える。さらに、結合された抗体−ペプチド複合体は、患者の血流からのＧＲＦ誘導体および結合体のクリアランスを容易にする。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために提供され、どの手段によっても本発明の範囲を制限するものとして解釈されない。他のものが示されない限り、Ｌ−配置の光学活性保護アミノ酸を使用した。

（合成）
ＧＲＦ誘導体の合成が、誘導体の生成の間に手動のＳｙｍｐｈｏｎｙ^ＴＭペプチド合成器における自動固相手順を使用して実施された。この合成を、Ｆｍｏｃ−保護Ｒａｍａｇｅ^ＴＭアミドリンカー樹脂によってＦ−ｍｏｃ保護アミノ酸を使用して実施した。カップリングを、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）溶液におけるアクチベーター混合物として使用することによって達成した。このＦ−ｍｏｃ保護基を、２０％のピペリジン／ＤＭＦを使用して除去した。必要な場合、Ｂｏｃ−保護アミノ酸を、ペプチドが樹脂から切断された後に遊離Ｎ_α−末端を生成するためにＮ−末端で使用した。合成の間に使用した全てのアミノ酸は他に記載されない限り、Ｌ−立体化学を有した。シグマコートされたガラス反応容器を合成の際に使用した。

（実施例１）

工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで行なった。以下の保護されたアミノ酸を、連続的に樹脂に添加した：

これらを、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、そして配列に従って、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化した。Ｆｍｏｃ保護基の除去を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中の２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンの溶液を用いて、２０分間で成し遂げた（工程１）。最後のアミノ酸のアミノ基を、Ｏ−ベンゾトリアゾール−１−イル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）およびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）を用いて活性化した酢酸を用いてアセチル化した。

工程２：ペプチドを、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分割し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿した。この粗製ペプチドを、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される対応する粗製材料を生成した。

（実施例２）
（実施例１のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであることを除いて、上記の実施例１と同様に実行した。

工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ_６Ｈ_６：ＣＨＣｌ_３（１：１）：２．５％ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）中に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４の溶液を用いて２時間処理することによって成し遂げた。次いで、樹脂を、ＣＨＣｌ_３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。

工程３：次いで、合成を、３−マレイミドプロピオン酸（ＭＰＡ）の添加のために再自動化した。全カップリングの間、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。

工程４：誘導体を、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニゾールおよび５％
フェノールを用いて樹脂から分割し、続いてドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿した。この粗製誘導体を、ポリプロピレンの焼結化漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中のアセトニトリルの混合物（０．１％ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される、対応する粗ＧＲＦ誘導体を生成した。

（実施例３）

工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで実行した。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した：

工程２：この工程を、実施例１の工程２と同じ様式で実行した。

（実施例４）
（実施例３のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、実施例３と同様に実行した。

工程２〜４：これらの工程を、実施例２の工程２〜４と同様の様式で実行した。

（実施例５）

工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで実行した。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂に連続的に添加した。

工程２：この工程を、実施例１の工程２と同様の様式で実行した。

（実施例６）
（実施例５のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）
−ＯＨであったことを除いて、実施例５と同様に実行した。

（実施例７）

工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで実行した。以下の保護化アミノ酸を、実施例１の工程１に記載する手順に従って、樹脂連続的に添加した。

（実施例８）
（実施例７のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであることを除いて、実施例７と同様に実行した。

（実施例９）

（実施例１０）
（実施例９のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであることを除いて、実施例９と同様に実行した。

（実施例１１）
（実施例９のＧＲＦペプチドの第２の長期持続性誘導体）

工程１：固体相ペプチド合成を、１００μｍｏｌのスケールで実行した。以下の保護下アミノ酸を、実施例１の工程１に記載される手順に従って樹脂に連続的に添加した。

（実施例１２（牛肉ＧＲＦ））

（実施例１３）
（実施例１２のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、実施例１２と同様に実行した。

（実施例１４（牛肉ＧＲＦ））

（実施例１４）
（実施例１３のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、実施例１３と同様に実行した。

工程２：Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）基の選択的脱保護化を、手動で実行し、そして樹脂を、５ｍＬのＣ_６Ｈ_６：ＣＨＣｌ_３（１：１）：２．５％ＮＭＭ（ｖ：ｖ）：５％ＡｃＯＨ（ｖ：ｖ）に溶解した３当量のＰｄ（ＰＰｈ_３）_４の溶液を用いて２時間処理することによって達成した（工程２）。次いで、この樹脂を、ＣＨＣｌ_３（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ中２０％ＡｃＯＨ（６×５ｍＬ）、ＤＣＭ（６×５ｍＬ）、およびＤＭＦ（６×５ｍＬ）を用いて洗浄する。

工程３：次いで、この合成を、Ｆｍｏｃ−ＡＥＥＡ−ＯＨ（Ｆｍｏｃ−アミノエトキシエトキシ酢酸）の添加について再自動化した。カップリング毎の間、樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。適切な脱保護化後、ＭＰＡ（３−マレイミドプロピオン酸）を、ＡＥＥＡスペーサーにアンカーし、そして再度樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を用いて３回洗浄し、そしてイソプロパノールを用いて３回洗浄した。

工程４：このペプチドを、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分割し、続いて、ドライアイスで冷却したＥｔ_２Ｏ（０〜４℃）によって沈殿した。この粗製誘導体を、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中アセトニトリルの混合物（０．１％ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して、精製プロセスにおいて使用される対応する粗製誘導体を生成した。

（実施例１５（牛肉ＧＲＦ））

（実施例１６）
（実施例１５のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、実施例１５と同様に実行した。

工程２〜４：これらの工程を、実施例１４の工程２〜４と同様の様式で実行した。

（実施例１７（牛肉ＧＲＦ））

（実施例１８）
（実施例１７のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、樹脂に添加した第１のアミノ酸がＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ａｌｏｃ）−ＯＨであったことを除いて、実施例１７と同様に実行した。

（実施例１９）
（実施例１７のＧＲＦペプチドの第２の長期持続性誘導体）

（実施例２０（サケＧＲＦ））

（実施例２１）
（実施例２０のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、実施例２０と同様に実行した。

（実施例２２（サケＧＲＦ））
（実施例２０のＧＲＦペプチドの第２の長期持続性誘導体）

（実施例２３（鶏肉ＧＲＦ））

（実施例２４）
（実施例２３のＧＲＦペプチドの長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、実施例２３と同様に実行した。

（実施例２５）
（実施例２３のＧＲＦペプチドの第２の長期持続性誘導体）

（実施例２６）
（実施例１のＧＲＦペプチドの第２の長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、最後の成分（ＭＰＡ）を合成の終わりに樹脂に添加することを除いて、上記の実施例１と同様に実行した。

工程２：この誘導体を、８５％ＴＦＡ／５％ＴＩＳ／５％チオアニゾールおよび５％フェノールを用いて樹脂から分割し、続いて、ドライアイスで冷却した（０〜４℃）Ｅｔ_２Ｏによって沈殿した。この粗製誘導体を、ポリプロピレンの焼結漏斗上に収集し、乾燥させ、４０％の水中アセトニトリルの混合物（０．１％ＴＦＡ）に再溶解し、そして凍結乾燥して精製プロセスにおいて使用される対応する粗製ＧＲＦ誘導体を生成した。

（実施例２７）
（実施例１のＧＲＦペプチドの第３の長期持続性誘導体）

工程１：この工程を、最後から２番目の成分がＦｍｏｃ−ＡＥＥＡであり、そして最後の成分が（ＭＰＡ）であることを除き、上記の実施例１のように実行した。

工程２：この工程は、実施例２６の工程２と同様である。

（精製手順）
各成分を、Ｖａｒｉａｎ（Ｄｙｎａｍａｘ）調製二元ＨＰＬＣシステムを用いて、調製逆相ＨＰＬＣによって精製した。この精製を、水／ＴＦＡ混合物（Ｈ_２Ｏ中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ａ））およびアセトニトリル／ＴＦＡ（ＣＨ_３ＣＮ中０．１％ＴＦＡ（溶媒Ｂ））で平衡化したＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａ１０μフェニル−ヘキシル、５０ｍｍ×２５０ｍｍカラム（粒子１０μ）を用いて実行した。溶出を、２８〜３８％Ｂ勾配で１８０分間にわたって実行することによって５０ｍＬ／分で達成した。ペプチドを含む画分を、２１４および２５４ｎｍでＵＶ吸光度（ＶａｒｉａｎＤｙｎａｍａｘＵＶＤＩＩ）によって検出した。

この画分を、２５ｍＬのアリコートで収集した。所望の産物を含む画分を、ＬＣ／ＭＳ上に直接注入した後に質量検出によって同定した。選択した画分を、分析ＨＰＬＣ（２０分間にわたり、２０〜６０％Ｂ；ＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘＬｕｎａ５μ フェニル−ヘキシル、１０ｍｍ×２５０ｍｍカラム、０．５ｍＬ／分）によって連続的に分析して、プールについて９０％以上の純度で画分を同定した。このプールを液体窒素を用いて凍結乾燥し、そして少なくとも２日間連続的に凍結乾燥して白色の粉末を得た。

（インビトロでの結果）
本ＧＲＦ誘導体のいくつかの効力を、ラットの下垂体前葉の初代細胞培養アッセイにおいてＧＨ分泌を有意に増加する能力として評価した。新鮮なラットの初代下垂体細胞を、種々の濃度の成分に４時間暴露し、そして培養培地中のＧＨレベルを、ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ＭＯ）製の市販のＲＩＡキットを用いて測定した。

（方法論）
下垂体全体を、麻酔した正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットからとりだし、そしてファンギゾンおよび硫硫ゲンタマイシンを含む新鮮な培養培地に直接収集した。細胞を、下垂体収集後１時間以内で初代細胞培養物について調製した。個々の下垂体を、細かくし、そして組織フラグメントを、継続的な穏やかに攪拌しながらトリプシンを用いて消化した。組織片を、パスツールピペットを用いて機械的に破砕し、そしてさらに１５分間インキュベートした。細胞を、破砕し、２回洗浄し、そして新鮮な培地を含む２４ウェルプレートに播種した。７２時間の培養後、細胞を、無血清培地を用いて２回洗浄し、次いでＧＲＦアナログまたはＧＲＦ誘導体と共にか、または伴わず４時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、そしてラジオイムノアッセイ（ＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈ，ＭＯ製キット）によってラットの成長ホルモンの定量的測定についてアッセイした。

図中に見られ得るように、この結果は、全ての本ＧＲＦ誘導体が、１０^−６〜１０^−１３Ｍの間の範囲の濃度でＧＨ分泌を刺激し得ることを示す。刺激の指標は、市販のＧＲＦ（１〜２９）およびＤ−Ａｌａ−ＧＲＦ（１〜２９）（両方ともＰｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ製）得た指標に匹敵し得た。

（インビボでの結果）
本ＧＲＦ誘導体のインビボでの効力を、自由に動く動物におけるＧＨ分泌を有意に増加する能力として評価した。この化合物を、カテーテル処理した正常なＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにボーラス注射（１μｍｏｌ／ｋｇ）として皮下に投与した。連続的な血液サンプルを、採取して、化合物投与に続く急性のＧＨ放出を測定した。

（方法論）
カテーテル処理した７〜８週齢の雌性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、実験の前に少なくとも５日間ラットハーネスに取り付けて、ストレスを避けた。実験の着手は、
９ＡＭ〜１１ＡＭの間のみであった。各処理群は、８匹のラットから構成された。この化合物を、腰骨の領域に皮下注射することによって一回投与した。連続的な血液サンプルを、投薬前、および注射の５分後、１０分後、１５分後、２０分後、３０分後および６０分後に採取した。血漿を収集し、そしてサンプルを、ラジオイムノアッセイによるＧＨ決定のためにＬｉｎｃｏＲｅｓｅａｒｃｈ（ＭＯ）に直接送った。統計学的決定（ｔ検定）を、ＭｉｃｒｏＳｏｆｔＥｘｃｅｌ^ＴＭソフトウェアを用いて実行した。

図中に見出され得るように、全ての本ＧＲＦ誘導体は、正常なラットモデルにおいてＧＨ分泌を誘導し得た。

（薬物動態学の研究）
薬物動態学の研究を、実施例５および６の化合物について実行した。各化合物を、雄性のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに皮下注射（１μｍｏｌ／ｋｇ）または静脈内注射（１００ｎｍｏｌ／ｋｇ）した。連続的な血液サンプルを、投薬前、薬剤投与の５分後、３０分後および６０分後ならびに２時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、４８時間後、７２時間後および９６時間後に採取した。血漿を収集し、そしてラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）による分析まで凍結した。ヒトネイティブＧＲＦ（1〜２９）に対して惹
起される市販のポリクローナル抗体を使用して化合物を検出した。このアッセイの感度は、３００〜１０，０００ｐＭであった。結果として、いくつかのサンプルが、分析のために希釈された。薬物動態学のプロフィールの結果は、図９に明らかである。見出され得るように、実施例５の化合物（すなわち、ネイティブなペプチド）は、非常に迅速に消失する。実際に、皮下投与されるか、または静脈内投与される実施例５の化合物は、投与の６０分後に検出され得なかった。これは、ＧＲＦ（１〜２９）および他のそのアナログについての文献で報告されるＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける結果と一致し、それらの終末の半減期およびバイオアベイラビリティー（ＳＣ／ＩＶ）のパーセンテージを考慮する（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，９：２０７〜２０９、およびＪ．Ｅｎｄｏｃｒ．，１０７：Ｒ５〜Ｒ８を参照のこと）。

一方で、本発明に従って誘導された実施例５のネイティブなペプチドである、実施例６の化合物は、９６時間後で検出可能なままである。さらなるデータが、以下の表２に示される。

本発明は、その特定の実施形態と関連して記載されるが、さらなる改変が可能であることが理解され、そして本願は、一般に、本発明の原理に従う本発明の任意のバリエーション、使用または適応をカバーすることが意図され、そして本発明が属する分野内で公知または慣習的に実行されているような本発明の記載から離れた本発明の任意のバリエーション、使用または適応、および本明細書中で前述した基本的特徴に適用され得るような本発
明の記載から離れた本発明の任意のバリエーション、使用または適応、および添付の特許請求の範囲に従うような本発明の記載から離れた本発明の任意のバリエーション、使用または適応を含む。

図１は、種々の濃度の市販のＧＲＦ（１〜２９）、ならびに実施例１および実施例２の化合物との４時間のインキュベーション後の、ラット前原発細胞（ａｎｔｅｒｉｏｒｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌ）由来のＧＨ分泌を示す。図２は、種々の濃度の市販のＤ−Ａｌａ−ＧＲＦ（１〜２９）、ならびに実施例３および実施例４の化合物との４時間のインキュベーション後の、ラット前原発細胞由来のＧＨ分泌を示す。図３は、種々の濃度の実施例５および実施例６の化合物との４時間のインキュベーション後の、ラット前原発細胞由来のＧＨ分泌を示す。図４は、種々の濃度の実施例７および実施例８の化合物との４時間のインキュベーション後の、ラット前原発細胞由来のＧＨ分泌を示す。図５は、実施例１および実施例２の化合物の単回皮下ボーラス注射後の、正常Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＧＨ分泌を示す。図６は、実施例３および実施例４の化合物の単回皮下ボーラス注射後の、正常Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＧＨ分泌を示す。図７は、実施例５および実施例６の化合物の単回皮下ボーラス注射後の、正常Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットにおけるＧＨ分泌を示す。図８は、単回皮下ボーラス注射後の、正常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、ＧＨ分泌（総曲線下面積；ＡＵＣ）を示す。図９は、雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける、実施例５および実施例６の化合物の薬物動態的プロフィールを示す。

Claims

明細書に記載の発明。