JP2009007284A

JP2009007284A - 酸化セリウムを内包するフェリチンを形成する方法

Info

Publication number: JP2009007284A
Application number: JP2007169311A
Authority: JP
Inventors: Mitsuhiro Okuda; 充宏奥田
Original assignee: Panasonic Corp
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2007-06-27
Filing date: 2007-06-27
Publication date: 2009-01-15

Abstract

【課題】タンパク質アポフェリチンを利用して酸化セリウムのナノ粒子の元となる酸化セリウム−アポフェリチン複合体を得ること。
【解決手段】本発明は、酸化セリウムを内包するフェリチンを形成する方法であって、前記方法は、Ｃｅ^３＋およびアポフェリチンを、図３の二重丸または丸の条件で緩衝液に混合する混合工程を有する。
【選択図】図３

Description

本発明は、酸化セリウムを内包するフェリチンを形成する方法に関する。

特許文献１にも例示されるように、アポフェリチンに代表されるような、内部に空洞を有するタンパク質の当該空洞に金属、金属塩、または金属化合物を充填させ、さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、量子ドットに代表されるドット体を有する半導体装置の製造方法が知られている。

特開２００３−８６７１５号公報

本発明者は、アポフェリチンの空洞に酸化セリウムを充填させること、すなわち、酸化セリウム−アポフェリチン複合体の形成を試みた。

本発明者の知るかぎり、酸化セリウム−アポフェリチン複合体の作製方法の公知文献はない。

本発明者はこの課題を鋭意検討した結果、３価のセリウム塩を用いて、酸化セリウム−アポフェリチン複合体が得られると言う知見を見出し、本発明を完成させた。

本発明は、酸化セリウム−アポフェリチン複合体を効率よく製造する方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明は、酸化セリウムを内包するフェリチンを形成する方法であって、前記方法は、Ｃｅ^３＋およびアポフェリチンを、図３の二重丸または丸の条件で緩衝液に混合する混合工程を有する。

本発明によれば、均一な大きさを有する酸化セリウムのナノ粒子を効率よく得るための、酸化セリウムを内包するフェリチンを得ることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。

本明細書においては、「酸化セリウムを内包するフェリチン」と「酸化セリウム−アポフェリチン複合体」とは同一の意味であり、これらを単に「複合体」と呼ぶことがある。

本明細書においては、濃度はｍＭ（ミリモーラ、すなわち、ｍｍｏｌ／Ｌ、ミリモル／リットル）により表される。これは得られた緩衝液、とりわけセリウム塩を供給した後の緩衝液における試薬の濃度を意味する。

すなわち、「アポフェリチンの濃度が１μＭである」と記載した場合、これはセリウム塩を供給した後の緩衝液に含まれるアポフェリチンの濃度が１μＭという意味である。緩衝液に供給されているアポフェリチンにおけるアポフェリチン濃度が１μＭという意味ではない。別途、記載しない限り、セリウム塩を供給する前における緩衝液に含まれるアポフェリチンの濃度が１μＭという意味でもない。

ｐＨについても同様であり、別途、記載しない限り、セリウム塩を供給した後の緩衝液のｐＨを意味する。

（フェリチンについて）
内部に空洞を有するタンパク質として、フェリチンを挙げることができる。

天然のフェリチンはウマの脾臓から公知の方法で得ることができる。

効率性の観点から、天然のフェリチンからＮ末端の１塩基目から８塩基目までの塩基を除去した欠失フェリチンを用いることが多いが、このような欠失フェリチンもまた、用語「フェリチン」に含まれる。

さらに、内部の空洞に金属、金属塩、または金属化合物が充填されていないフェリチンを「アポフェリチン」と呼ぶ。用語「フェリチン」には、金属、金属塩、または金属化合物が充填されている。特に本発明では、フェリチンに酸化セリウムが充填されている。なお、用語「充填」と用語「内包」とは同一の意味である。

以下、図１を用いて、アポフェリチンについて説明する。

図１（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。

図１（ａ）に示すように、アポフェリチン１０は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニット２０が非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状タンパク質である。

そして、その直径は約１２ｎｍであり、通常のタンパク質に比べて、高い熱安定性と高いｐＨ安定性を有している。

さらに、アポフェリチン１０の中心には、図１（ｂ）に示すように直径約７ｎｍの空洞状の保持部４０を有し、外部とチャンネル３０を介してつながっている。

アポフェリチンに充填された酸化セリウムからなるナノ粒子の直径は、アポフェリチンの保持部４０の直径とほぼ等しく、約７ｎｍである。

空洞を有するアポフェリチンであれば、単一種類のアミノ酸配列から成るサブユニットから構成されているアポフェリチンであっても、複数のサブユニットから構成されているアポフェリチンであっても良い。

それらの中でも、同一のアミノ酸配列を有するサブユニットで構成されるタンパク質、もしくは単一のモノマーから構成されるリコンビナントであるタンパク質、例えばリコンビナントフェリチンなどは、構造が安定で、温度に対する耐性が高いため、変性を生じにくく好ましい。

以上述べたように、本実施の形態によれば、用いるアポフェリチンの空洞状の保持部の形状、大きさに応じた酸化セリウムのナノ粒子を形成することができる。

ここでいう「ナノ粒子」とは、５０ｎｍ以下で、かつ粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げれば、直径１ｎｍ〜５０ｎｍの粒子がナノ粒子に相当する。

アポフェリチンの濃度は実施例４および表３から明らかなように、０．２１μＭ以上４．３６μＭ以下であることが好ましい。

アポフェリチン濃度が０．２１μＭ未満になるとアポフェリチン濃度が薄すぎるため、非効率的である。

アポフェリチン濃度が４．３６μＭを超えることは、非効率的である。

（セリウムイオンについて）
緩衝液は３価のセリウムイオンを含有する。４価のセリウムイオンは、酸化セリウムがアポフェリチンの内部に形成されることに寄与しない。

３価のセリウムイオンの由来は特に限定されず、一般にセリウム塩として緩衝液に供給される。

後述する実施例２および表１からも明らかなように、３価のセリウム塩を緩衝液に供給することが必須である。

３価のセリウムイオンの濃度は１ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることが好ましい。

３価のセリウムイオンの濃度が１ｍＭ未満ではあまりにもセリウムイオン濃度が薄すぎるために複合体の形成が困難となる傾向がある。

後述する実施例１および図３からも明らかなように、３価セリウムイオンの濃度が１０ｍＭ以下であることが好ましく、これよりも濃度が高くなると収率が低下し得る。

３価のセリウムイオンの濃度が１０ｍＭを超えることは、非効率的である。

３価の塩化セリウムの代わりに、３価の硫酸セリウムを緩衝液に供給しても好ましく、３価の塩化セリウム、３価の硝酸セリウム、もしくは３価の酢酸セリウムを緩衝液に供給することが特に好ましい。

明瞭に記載しない限り、セリウム塩（ＩＩＩ）と記載されていれば、３価のセリウム塩を示す。同様に、明瞭に記載しない限り、セリウム塩（ＩＶ）と記載されていれば、４価のセリウム塩を示す。

（緩衝液について）
緩衝液は、一般的に溶液のｐＨを一定に保つ作用を持つと考えられている。

特に限定しなければ、緩衝液は発明者が望むｐＨで、ｐＨを一定にする作用を持つ緩衝液を指す。

緩衝液はセリウム塩を入れてからのｐＨを一定に保つ。

緩衝液は後述する実施例３および表２からも明らかなように、緩衝液の種類によらない。

緩衝液は特に限定しないが、ＰＩＰＥＳ、ＴＲＩＳ、ＴＡＰＳ緩衝剤を用いることが好ましい。

緩衝液は特に限定しないがＨＥＰＥＳ緩衝液を用いることが特に好ましい。

一般的に緩衝液のｐＨを調整するには強酸か強塩基が使われる。一般的にはｐＨを調整するには塩酸もしくは水酸化ナトリウムを加えて調整する。本発明で使用した緩衝剤は、塩酸、水酸化ナトリウム、もしくはアンモニアで調整しており、また塩酸、水酸化ナトリウム、アンモニアの混合物でもかまわない。アンモニア濃度は８０ｍＭ以下であることが好ましい。

本発明の実施例で記載されているＨＥＰＥＳｐＨ７．０との記載は水酸化ナトリウムを用いて、ｐＨ７．０に調整した溶液である。この他の実施例でも同じ操作をしている。

確認のため記載しておくが、全ての実施例における図３および表１〜表５に記載のｐＨはセリウム塩を添加して、２０時間後のｐＨであり、混合させるために使用した緩衝液原液のｐＨではない。

なお、３価のセリウムイオン添加工程の前に、緩衝液にアポフェリチンを添加することが好ましい。

（その他）
複合体を得るにあたっては、室温もしくはアポフェリチンなどのタンパク質１０が変性しない温度範囲、例えば７０℃以下で、かつスターラーなどで攪拌しながら混合して行うことが好ましい。

緩衝液にセリウム塩を供給した後、２０時間以上放置する。

その後、遠心分離などにより、緩衝液から複合体を得ることができる。

（実施例）
以下、本発明を実施例（実験データ）と共にさらにより詳細に説明する。

（実施例１）
実施例１では、３価セリウムイオン濃度およびｐＨについて実験したデータを示す。

以下に示されるＬ鎖アポフェリチンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液に３価の塩化セリウム（ＩＩＩ）を添加した。
２０００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０５０μＬ
２５００ｍＭＮａＯＨ１２μＬ
２３．８７μＭＬ鎖アポフェリチン１８．２μＬ
１００ｍＭ塩化セリウム（ＩＩＩ）４０μＬ
ミリＱ水８７９．８μＬ
ｐＨは、その値が７．０になるように、水酸化ナトリウムを加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、塩化セリウムを含む溶液の攪拌後のｐＨは７．０であった。

塩化セリウムを添加した後のＨＥＰＥＳの濃度は１００ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のアポフェリチンの濃度は０．４４μＭであり、塩化セリウムを添加した後の塩化セリウムの濃度は４ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のｐＨは７．０であった。緩衝液の総量は１ｍＬであった。

なお、後述する実施例２〜６においても、緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その後、ＨＥＰＥＳ緩衝液を２３℃で２０時間放置した。

次いで、遠心分離機を用いて、３０００ｒｐｍで１０分、遠心分離して沈殿物を除去した。この操作は他の実施例でも同じである。

なお無機物質−アポフェリチン複合体の観察方法はすでに知られているが、ここでは念のため、以下、説明する。

一般的な透過型電子顕微鏡専用のカーボン膜が張られたグリッドに遠心分離後の溶液を２．５μＬ滴下した。

カーボン膜が張られたグリッドの上にある余剰の溶液は、濾紙に染み込まし除去した。

そして、酸化セリウム−アポフェリチン複合体がのっているカーボン膜の張られたグリッドの上に１％金グルコースを２．５μＬ滴下し、３分間放置し、余剰溶液をろ紙に染み込ませた。

その後、５分間の自然乾燥を行い、透過型電子顕微鏡で確認した。この操作は他の実施例でも同じである。

アポフェリチンを、直接電子顕微鏡で観察すると、何も見えない。

そこで、金グルコースと呼ばれる染色剤でアポフェリチンを染色する。すると、アポフェリチンの周りが金グルコースで占められることにより、アポフェリチン自体は白い丸、アポフェリチンのまわりは黒くなり、アポフェリチンを確認することができる。

なお、金グルコースはアポフェリチンの中には入らない。

酸化セリウムのコアが入っているフェリチンでは、白い丸の真ん中に黒い酸化セリウムのコアが見える。

ドーナツ状に見えるのがフェリチンであり、白いドーナツ部がフェリチンのタンパク質部分、ドーナツの内側が酸化セリウムのコアである。

このようにして、コアの入ったドーナツ状のフェリチンの数とコアの入っていない白丸のアポフェリチンの数を数えて、写真に写っているアポフェリチン＋フェリチンの数の内、何パーセントがフェリチンであるか、各セリウム塩濃度とｐＨについて確認した。その結果が図３である。この判定方法は他の実施例でも同じである。

図３は、３価セリウムイオン濃度およびｐＨに対して酸化セリウム−アポフェリチン複合体の形成状態を求めた結果を示している。

図３の記号は、タンパク質の全量に対する酸化セリウム−アポフェリチン複合体の形成比率を示し、「◎」は５０％以上、「○」は１０％以上５０％未満、「×」は１０％未満またはほとんど形成されていないことを表している。このことは、表１〜表５でも同じである。

すなわち、図３に示す「◎」または「○」の領域で効率よく酸化セリウム−アポフェリチン複合体を形成できることが確認された。

図２は、３価セリウムイオン濃度が４ｍＭでｐＨ７．０である場合の透過型電子顕微鏡写真である。

矢印に示されるフェリチンに酸化セリウムが含まれている。

（実施例２）
この実施例２では、好ましいセリウム化合物（セリウム塩）に関するデータを示す。

実施例１とほぼ同様に、セリウム塩を添加した後のＨＥＰＥＳの濃度は１００ｍＭであり、セリウム塩を添加した後のアポフェリチンの濃度は０．４４μＭであり、セリウム塩を添加した後のセリウム塩の濃度は４ｍＭであり、セリウム塩を添加した後のｐＨの値を７．０近傍に調整して行なった。

緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その際、セリウムイオンの供給源として、塩化セリウム（ＩＩＩ）、硝酸セリウム（ＩＩＩ）、酢酸セリウム（ＩＩＩ）、硫酸セリウム（ＩＩＩ）、硫酸セリウム（ＩＶ）を用いた。

その結果を、以下の表１に示す。

表１に示すように、硝酸セリウム（ＩＩＩ）、酢酸セリウム（ＩＩＩ）、硫酸セリウム（ＩＩＩ）において複合体を形成できるが、３価のセリウム化合物である、硫酸セリウム（ＩＩＩ）が好ましく、塩化セリウム（ＩＩＩ）、硝酸セリウム（ＩＩＩ）、酢酸セリウム（ＩＩＩ）が特に好ましい。

硫酸セリウム（ＩＶ）においては複合体の形成は確認されなかった。

実施例１と併せてデータを見ると、これらセリウム化合物（セリウム塩）の中でも、四価のセリウムでは複合体が形成されないことが理解できる。

３価のセリウム塩を用いた全ての溶液が複合体を形成していることから、３価のセリウム塩を用いることが複合体の形成には必須であることが理解できる。

（実施例３）
この実施例３では、緩衝液に関するデータを示す。

実施例１とほぼ同様に、塩化セリウムを添加した後の緩衝液の濃度は１００ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のアポフェリチンの濃度は０．４４μＭであり、塩化セリウムを添加した後の塩化セリウムの濃度は４ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のｐＨの値を７．０近傍に調整して行なった。

緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その際、緩衝液の種類として、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、ＴＲＩＳ緩衝液もしくはＴＡＰＳ緩衝液を用いた。

その結果を、以下の表２に示す。

表２に示すように、全ての緩衝液において、複合体を形成が確認できた。

実施例１と併せてデータを見ると、全ての緩衝液で複合体が形成していることから、緩衝液の種類に問わず、複合体の形成が可能であることが理解できる。

（実施例４）

この実施例４では、好ましいアポフェリチン濃度のデータを示す。

実施例１とほぼ同様に、塩化セリウムを添加した後の緩衝液の濃度は１００ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のアポフェリチンの濃度は４．３６μＭであり、塩化セリウムを添加した後の塩化セリウムの濃度は４ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のｐＨの値を７．０近傍に調整して行なった。

緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その際、アポフェリチン濃度を変更して検討した。なお、アポフェリチンは、Ｌ鎖アポフェリチンとして供給した。

以下に示されるＬ鎖アポフェリチンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液に３価の塩化セリウム（ＩＩＩ）を添加した。
２０００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０５０μＬ
２５００ｍＭＮａＯＨ１２μＬ
２３．８７μＭＬ鎖アポフェリチン１８２．３μＬ
１００ｍＭ塩化セリウム（ＩＩＩ）４０μＬ
ミリＱ水７１５．７μＬ
ｐＨは、その値が７．０になるように、水酸化ナトリウムを加えることにより調整した。

その結果を、以下の表３に示す。

表３に示すように、アポフェリチンの濃度が０．２１μＭ以上、４．３６μＭ以下の範囲で酸化セリウム−アポフェリチン複合体を形成できることが理解できる。

（実施例５）
この実施例５では、アンモニアに関するデータを示す。

アンモニアはｐＨを調整されるために利用されことがある。

実施例１に記載されているような、水酸化ナトリウムの代わりに、アンモニアを利用することがある。

また水酸化ナトリウムとアンモニアを併用することもある。

ここでは実施例１とほぼ同様に、塩化セリウムを添加した後の緩衝液の濃度は１００ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のアンモニア濃度は３０ｍMであり、塩化セリウムを添加した後のアポフェリチンの濃度は０．４４μＭであり、塩化セリウムを添加した後の塩化セリウムの濃度は４ｍＭであり、塩化セリウムを添加した後のｐＨの値を７．０近傍に調整して行なった。

緩衝液の総量は１ｍＬであった。

２０００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．０５０μＬ
１０００ｍＭアンモニア３０μＬ
２３.９８μＭＬ鎖アポフェリチン１８.２μＬ
１００ｍＭ塩化セリウム（ＩＩＩ）４０μＬ
ミリＱ水８６１．８μＬ
その結果を、以下の表４に示す。

表４に示すように、アンモニア濃度が０ｍＭ以上、８０ｍＭ以下の範囲で酸化セリウム−アポフェリチン複合体を形成できることが理解できる。

（実施例６）
この実施例６では、好ましいアポフェリチン種に関するデータを示す。

緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その際、アポフェリチンの種類として、Ｌ鎖Ｎ端８残基欠損アポフェリチンおよびＬ鎖天然配列アポフェリチンを用いて検討した。

その結果を、以下の表５に示す。

表５に示すように、いずれのアポフェリチンにおいても酸化セリウム−アポフェリチン複合体を形成できることが理解できる。

本発明の酸化セリウム−アポフェリチン複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化セリウムのナノ粒子を効率よく得ることができる。

さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、酸化セリウムからなるドット体を有する半導体装置を得ることができる。また自動車三元用の助触媒や、燃料電池電極の助触媒としても利用できる。

（ａ）アポフェリチンの構造を示す模式図（ｂ）図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図本発明の実施例１に係る酸化セリウム−アポフェリチン複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真酸化セリウム−アポフェリチン複合体を形成できるＣｅ^３＋イオン濃度とｐＨとの間の関係を示す表

符号の説明

１０タンパク質（アポフェリチン）
２０モノマーサブユニット
３０チャンネル
４０保持部
５０酸化セリウム
６０酸化セリウム−アポフェリチン複合体

Claims

酸化セリウムを内包するフェリチンを形成する方法であって、
前記方法は、Ｃｅ^３＋およびアポフェリチンを緩衝液に混合する混合工程を有し、
前記Ｃｅ^３＋および前記アポフェリチンを前記緩衝液に添加した後のｐＨが６．６以上７．８以下であり、
前記Ｃｅ^３＋および前記アポフェリチンを前記緩衝液に添加した後のＣｅ^３＋の濃度が０ｍＭを超えて１０ｍＭ以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が０ｍＭを超えて１ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは７．２以上７．８以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が１ｍＭを超えて１．５ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは７．１以上７．６以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が１．５ｍＭを超えて２ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは７．０以上７．６以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が２ｍＭを超えて４ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．９以上７．３以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が４ｍＭを超えて５ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．８以上７．３以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が５ｍＭを超えて６ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．６以上７．２以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が６ｍＭを超えて８ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．６以上７．１以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が８ｍＭを超えて９ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．６以上７．０以下であり、
前記Ｃｅ^３＋の濃度が９ｍＭを超えて１０ｍＭ以下の場合には、前記ｐＨは６．６以上６．９以下である、方法。
前記混合工程において、ＣｅＣｌ_３、Ｃｅ（ＮＯ_３）_３、Ｃｅ_２（（ＳＯ_４）_３）、またはＣｅ（ＣＨ_３ＣＯＯ）_３を混合する、請求項１に記載の方法。
前記緩衝液がＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＲＩＳ、またはＴＡＰＳである、請求項１に記載の方法。
前記Ｃｅ^３＋および前記アポフェリチンを前記緩衝液に添加した後のアポフェリチンの濃度が０．２１μＭ以上４．３６μＭ以下である、請求項１に記載の方法。
前記緩衝液はアンモニアを含有し、前記Ｃｅ^３＋および前記アポフェリチンを前記緩衝液に添加した後のアンモニアの濃度が８０ｍＭ以下である、請求項１に記載の方法。
前記アポフェリチンが、Ｌ鎖Ｎ端８残基欠損アポフェリチンまたはＬ鎖天然配列アポフェリチンである、請求項１に記載の方法。