JP2009190982A - 酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】内部に空洞を有するタンパク質を利用して酸化亜鉛のナノ粒子の元となる酸化亜鉛−タンパク質複合体を得ること。
【解決手段】本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体は、フェリチンに代表されるような内部に空洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニアを含有する緩衝液を添加する工程を有する。
【選択図】なし

Description

本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法に関する。

特許文献１にも例示されるように、フェリチンに代表される内部に空洞を有するタンパク質の当該空洞に金属、金属塩、または金属化合物を充填させ、さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、量子ドットに代表されるドット体を有する半導体装置の製造方法が知られている。
特開２００３−８６７１５号公報 国際公開第２００６／１３２０５０号パンフレット 特開２００６−２６９６６０号公報

本発明者は、タンパク質の空洞に酸化亜鉛を充填させること、すなわち、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造を試みた。

特許文献２に示されているように酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造には過酸化水素水を用いることが必須とされている。

本発明者の知るかぎり、過酸化水素水を用いないで、酸化亜鉛−タンパク質複合体の作製方法の公知文献は無い。

本発明者は鋭意検討した結果、過酸化水素水を用いなくても、酸化亜鉛−タンパク質複合体を得られるという知見を見出し、本発明を完成させた。

本発明は、酸化亜鉛−タンパク質複合体を、効率よく製造する方法を提供することを目的とする。

上記目的を達成する本発明に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法は、内部に空
洞を有するタンパク質、亜鉛イオン、およびアンモニア、を含有する緩衝液の濃度が、数１から数１０までの関係式を満たすように添加する工程を有する。

タンパク質濃度を（Wｍｇ／mL）、亜鉛イオン濃度を（ＸｍＭ）、アンモニア濃度を（ＺｍＭ）、ｐHの値（Ｙ）とおいた時、数１から数９までの関係式を満たす。

（数１）３≦Ｘ≦１０
（数２）Ｙ２≦Ｙ≦Ｙ１
（数３）Ｙ１＝０．０２８６Ｘ＋９．９１４３
（数４）Ｙ２＝０．０４２９Ｘ＋９．３７１４
（数５）Ｚ２≦Ｚ≦Ｚ１
（数６）Ｚ１＝２８．５７１Ｘ＋４０．９５２
（数７）Ｚ２＝７．１４２９Ｘ＋６６．９０５
（数８）０．２≦（Ｘ／１０）≦０．４の時はＷ＝（Ｘ／１０）
（数９）０．４≦（Ｘ／１０）の時はＷ＝０．４
亜鉛イオン添加工程の前に、緩衝液にタンパク質を添加する亜鉛イオン添加工程を有することが好ましい。

タンパク質添加工程の前に、緩衝液にアンモニアを添加する亜鉛イオン添加工程を有することが好ましい。

緩衝液はＣＡＰＳＯ緩衝液であることが好ましい。

アンモニアは亜鉛イオンに配位していることが好ましい。

内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンであることが好ましい。

本発明によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得るための、酸化亜鉛を内包するフェリチンを得ることができる。

以下、フェリチン、亜鉛イオン、およびアンモニアを緩衝液に添加する工程を有する本発明を詳細に説明する。

本明細書においては、「酸化亜鉛−タンパク質複合体」を単に「複合体」と呼ぶことがある。

また、濃度についてはｍＭ（ミリモーラ、すなわち、ｍｍｏｌ／Ｌ、ミリモル／リットル）を用いるが、これは得られた緩衝液、とりわけ亜鉛イオンを供給した後の緩衝液における試薬の濃度を意味する。

すなわち、「アンモニアの濃度が１００ｍＭである」と記載した場合、これは亜鉛イオンを供給した後の緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１００ｍＭという意味である。

緩衝液に供給されるアンモニア水におけるアンモニア濃度が１００ｍＭという意味ではない。また、別途、記載しない限り、亜鉛イオンを供給する前における緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１００ｍＭという意味でもない。

ｐＨについても同様であり、別途、記載しない限り、亜鉛イオンを供給した後の緩衝液のｐＨを意味する。

（内部に空洞を有するタンパク質について）
内部に空洞を有するタンパク質としては、フェリチンを挙げることができる。

天然のフェリチンはウマの脾臓から公知の方法で得ることができる。

本明細書で用いられる用語「フェリチン」とは、天然の（すなわち、野生の）フェリチンの他、遺伝子組み替え技術により一部の塩基が他の塩基に置換された遺伝子組み替えフェリチンを含む。このような遺伝子組み替えフェリチンは、特開２００３−３３１９１号公報に例示される。

さらに、内部の空洞に金属、金属塩、または金属化合物が充填されていないフェリチンを、充填されたフェリチンと区別するために「アポフェリチン」と呼ぶことがあるが、明瞭にこれらを区別しない限り、用語「フェリチン」にはアポフェリチンを含む。

以下、図１を用いて、アポフェリチンについて説明する。

図１（ａ）は、アポフェリチンの構造を示す模式図であり、図１（ｂ）は、図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図である。

図１（ａ）に示すように、アポフェリチン１０は、１本のポリペプチド鎖から形成されるモノマーサブユニット２０が非共有結合により２４個集合した分子量約４６万の球状たんぱく質である。

そして、その直径は約１２ｎｍであり、通常のたんぱく質に比べて、高い熱安定性と高いｐＨ安定性を有している。

さらに、アポフェリチン１０の中心には、図１（ｂ）に示すように直径約７ｎｍの空洞状の保持部４０を有し、外部とチャンネル３０を介してつながっている。

以下では、アポフェリチン１０の保持部４０に、ナノ粒子が形成されるメカニズムについて、生体内で行われている鉄原子を例に説明する。

アポフェリチン１０の外部と内部とを結ぶチャンネル３０の表面には、ｐＨ５以上の条件下でマイナス電荷を持つアミノ酸が露出している。

そして、プラス電荷を持っている２価の鉄イオンは、マイナス電荷を持つアミノ酸との静電相互作用によりチャンネル３０に取り込まれる。

さらに、アポフェリチン１０の保持部４０の内表面には、チャンネル３０の内表面と同じく、ｐＨ５以上でマイナス電荷を持つアミノ酸残基であるグルタミン酸残基が多く露出している。

そのため、チャンネル３０から取り込まれた２価の鉄イオンは、一部のサブユニット内にあるｆｅｒｒｏｘｉｄａｓｅｃｅｎｔｅｒ（鉄酸化活性中心）と呼ばれる場所で酸化され、内部の保持部４０へと導かれる。そして、静電相互作用により鉄イオンは濃縮されて、フェリハイドライト（５Ｆｅ2Ｏ3・９Ｈ2Ｏ）結晶の核形成が起こる。

その後、順次取り込まれる鉄イオンは、フェリハイドライト結晶の核に付着して酸化鉄からなる核が成長し、直径７ｎｍの酸化鉄からなるナノ粒子が保持部４０内に形成される。

現在までに、このアポフェリチンを用いて、人工的に以下に示すような鉄以外の金属や金属化合物を担持させたナノ粒子−アポフェリチン複合体が作製されている。

例えば、マンガン、ウラン、ベリリウム、アルミニウムおよび亜鉛などである。

なお、上記では、鉄イオンのアポフェリチンへの取り込みメカニズムについて述べたが、これまでに導入が報告されている他の金属イオンについても、鉄イオンとほぼ同じメカニズムで進むと考えられる。

そして、これらの金属あるいは金属化合物からなるナノ粒子の直径も、アポフェリチンの保持部４０の直径とほぼ等しく、約７ｎｍである。

空洞を有するタンパク質であれば、単一のサブユニットから構成されているタンパク質であっても、複数のサブユニットから構成されているタンパク質であってもアポフェリチンの代わりに用いることができる。

タンパク質は、その空洞の形状が球状に限定されることはなく、ロッド状、リング状などの保持部を有するものであってもよい。一例として、Ｄｐｓタンパク質およびウイルスタンパク質を挙げることができる。

例えば、Ｄｐｓタンパク質（直径９ｎｍであり、内部に直径４ｎｍの保持部を有する球殻状たんぱく質）を用いた場合、直径が４ｎｍの酸化亜鉛のナノ粒子を作製することができる。

ウイルスタンパク質としては、例えば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶ、ＨＳＶ、Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ、Ｒｅｏｖｉｒｕｓ、ＬＡ−１、Ｐｏｌｙｏｍａ、ＣａＭＶ、ＨＰＶ、ＲｏｓｓＲｉｖｅｒ、ＳｐＶ−４、φＸ１７４、ＦＨＶ、ＨＲＶ−１４、Ｐｏｌｉｏなどが挙げられる。

その中でも、取り扱いの容易性や形状を考慮すれば、ＣＰＭＶ、ＣＣＭＶのウイルスタンパク質を用いることが好ましい。

以上述べたように、本実施の形態によれば、用いるたんぱく質の空洞状の保持部の形状、大きさに応じた酸化亜鉛のナノ粒子を形成することができる。

ここでいう「ナノ粒子」とは、５０ｎｍ以下で、かつ粒子として安定に存在する大きさ以上の粒子をいう。一例を挙げれば、直径１ｎｍ〜５０ｎｍの粒子がナノ粒子に相当する。

（亜鉛イオンについて）
緩衝液は亜鉛イオンを含有する。

亜鉛イオンの由来は特に限定されず、一般に金属塩として緩衝液に供給される。

収率の観点からは、後述する実施例２および図３からも明らかなように、アンモニアを緩衝液に供給しておくことが好ましい。

亜鉛イオンの濃度は３ｍＭ以上１０ｍＭ以下であることが好ましい。

亜鉛イオンの濃度が３ｍＭ未満ではあまりにも亜鉛イオン濃度が薄すぎるために複合体の形成が困難となる傾向がある。

後述する実施例２および図３からも明らかなように、亜鉛イオンの濃度が６．５ｍＭであることが最も好ましく、これよりも濃度が高くなると収率が低下し得る。

亜鉛イオンの濃度が１０ｍＭを超えることは、非効率的である。

特に、硝酸亜鉛を用いる場合、この傾向および効率性が顕著に現れる。

硝酸亜鉛の代わりに、酢酸亜鉛もしくは硫酸亜鉛を緩衝液に供給しても良い。

緩衝液に亜鉛イオンを供給した後、１８時間以上放置する。

その後、遠心分離などにより、緩衝液から複合体を得ることができる。

（アンモニアについて）
緩衝液はアンモニアを含有する。

本発明においては、アンモニアは亜鉛イオンに配位子として配位していると考えられる。

アンモニアは、アンモニア水として緩衝液に供給される。

後述する実施例２および図３からも明らかなように、亜鉛イオン濃度を（ＸｍM）とした時、アンモニアの濃度（ＺmM）は
（数１）３≦Ｘ≦１０
（数５）Ｚ２≦Ｚ≦Ｚ１
（数６）Ｚ１＝２８．５７１Ｘ＋４０．９５２
（数７）Ｚ２＝７．１４２９Ｘ＋６６．９０５
であることが好ましい。

（緩衝液について）
緩衝液としては特に限定されないが、ＣＡＰＳＯ緩衝液を用いることが好ましい。

後述する実施例３および図４からも明らかなように、亜鉛イオン濃度を（ＸｍM）とした時、緩衝液のｐＨ（Ｙ）は
（数１）３≦Ｘ≦１０
（数２）Ｙ２≦Ｙ≦Ｙ１
（数３）Ｙ１＝０．０２８６Ｘ＋９．９１４３
（数４）Ｙ２＝０．０４２９Ｘ＋９．３７１４
であることが好ましい。

緩衝液の種類は実施例６および表３からも明らかなように、ＭＥＳ緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液でかまわない。

以下、本発明を実施例（実験データ）と共にさらにより詳細に説明する。

（実施例１）
この実施例１では、酸化亜鉛−タンパク質複合体の作製の一例を示す。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニアをＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／mL 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 ３２５μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水 １５０μＬ
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水 ３２１．６μＬ
ｐＨは、その値が９．８になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のｐＨは９．８であった。

硝酸亜鉛を添加した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭであり、硝酸亜鉛を添加した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／mLであり、硝酸亜鉛を添加した後の硝酸亜鉛の濃度は６．５ｍＭであり、硝酸亜鉛を添加した後のアンモニアの濃度は１５０ｍＭであった。硝酸亜鉛を添加した後のｐＨは９．８であった。緩衝液の総量は１ｍＬであった。なお、後述する実施例２〜６においても、緩衝液の総量は１ｍＬであった。

その後、ＣＡＰＳＯ緩衝液を１８時間放置した。

次いで、遠心分離機を用いて、３０００ｒｐｍで２０分、遠心分離して沈殿物を除去した。

図２は、実施例１の透過型電子顕微鏡写真である。

矢印に示されるフェリチンに酸化亜鉛が含まれている。

なお、この写真の取り方はすでに知られているが、ここでは念のため、以下、説明する。

タンパク質だけのアポフェリチンを、直接電子顕微鏡で観察すると、何も見えない。そこで、金グルコースと呼ばれる染色剤でアポフェリチンを染色する。すると、アポフェリチンの周りが金グルコースで占められることにより、アポフェリチン部分は白い丸、アポフェリチンのまわりは黒くなり、アポフェリチンを確認することができる。なお、金グルコースはアポフェリチンの中には入らない。

酸化亜鉛のコアが入っているフェリチンでは、白い丸の真ん中に黒い酸化亜鉛のコアが見える。すなわち、ドーナツ状に見えているのが、フェリチンであり、白いドーナツ部がフェリチンのタンパク質部分、ドーナツの内側が酸化亜鉛のコアである。

このようにして、コアの入ったドーナツ状のフェリチンの数とコアの入っていない白丸のアポフェリチンの数を数えて、写真に写っているアポフェリチン＋フェリチンの数の内、何パーセントがフェリチンであるか、確認した。

写真を確認した結果、８０％以上のフェリチンに酸化亜鉛のコアが確認された。

すなわち、特許文献２を初めとする従来例からは考えられない過酸化水素水が無い溶液で効率よく酸化亜鉛−タンパク質複合体を形成できることが確認された。

（実施例２）
この実施例２では、アンモニア濃度および亜鉛イオン濃度について実施したデータを示す。

本実施例では、以下に示すように、溶液の亜鉛イオン濃度を一定にしておいて、アンモニアの濃度を調整することにより、実施したデータを示す。

本実施例では３種類の亜鉛イオン濃度で、アンモニア濃度について実施したデータを示す。

第１の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が３ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のｐＨが９．８近傍となるように水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニウム（アンモニア水）、およびＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／ｍＬ 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 １５０μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリQ水
アンモニア濃度は、その値がそれぞれの溶液で７５ｍＭの時は７５μＬ、９０ｍＭの時は９０μＬ、１２０ｍＭの時は１２０μＬ、１５０ｍＭの時は１５０μＬになるように、アンモニア水を加えることにより調整した。

ミリＱ水は、各アンモニア濃度の溶液で、総量が１ｍＬになる量を入れた。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．８近傍になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のアンモニア濃度は、それぞれの溶液で、７５ｍＭ、９０ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭであった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は３ｍＭであった。硝酸亜鉛を混合した後のｐＨは９．８近傍であった。

第２の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が６．５ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のｐＨが９．８近傍となるように水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニウム（アンモニア水）、およびＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／ｍＬ 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 ３２５μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水
アンモニア濃度は、その値がそれぞれの溶液で１００ｍＭの時は１００μＬ、１５０ｍＭの時は１５０μＬ、２５０ｍＭの時は２５０μＬになるように、アンモニア水を加えることにより調整した。

ミリＱ水は、各アンモニア濃度の溶液で、総量が１ｍＬになる量を入れた。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．８近傍になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のアンモニア濃度は、それぞれの溶液で、１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２５０ｍＭであった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は６．５ｍＭであった。硝酸亜鉛を混合した後のｐＨは９．８近傍であった。

第３の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が１０ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のｐＨが９．８近傍となるように水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニウム（アンモニア水）、およびＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／ｍＬ 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 ５００μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水
アンモニア濃度は、その値がそれぞれの溶液で１３０ｍＭの時は１３０μＬ、１４０ｍＭの時は１４０μＬ、３２０ｍＭの時は３２０μＬ、３４０ｍＭの時は３４０μＬになるように、アンモニア水を加えることにより調整した。

ミリＱ水は、各アンモニア濃度の溶液で、総量が１ｍＬになる量を入れた。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．８近傍になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のアンモニア濃度は、それぞれの溶液で、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、３２０ｍＭ、３４０ｍＭであった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／ｍＬ、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は１０ｍＭであった。硝酸亜鉛を混合した後のｐＨは９．８近傍であった。

そして、得られた溶液を、室温中に１８時間放置し、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を検討した。

このとき、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態の評価は、実施例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の観察により行った。

以下に、上記３つの亜鉛イオン濃度で得られた溶液を室温中で１８時間放置した後の酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態をまとめて図３に示す。なお、図３は、溶液のアンモニア濃度の値と亜鉛イオンの濃度に対する酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を相対的に示している。

図３は、硝酸亜鉛濃度とアンモニア濃度の変化に対する酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を求めた結果である。

図中の記号は、タンパク質の全量に対する酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成比率を示し、「◎」は８０％以上、「○」は１０％以上８０％未満、「△」は１０％未満、「×」は０％またはほとんど形成されていないことを表している。このことは、図４でも同じである。

図３に記載されている直線Ｚ１はＺ１＝２８．５７１Ｘ＋４０．９５２、直線Ｚ２はＺ２＝７．１４２９Ｘ＋６６．９０５を示しており、数値（ｍＭ）はアンモニア濃度を示している。

図３に示されるように、緩衝液に含まれる硝酸亜鉛濃度が、３mM以上、１０ｍM以下の時に、亜鉛イオン濃度を（ＸｍM）とし、アンモニアの濃度（ＺmM）とすると
（数１）３≦Ｘ≦１０
（数５）Ｚ２≦Ｚ≦Ｚ１
（数６）Ｚ１＝２８．５７１Ｘ＋４０．９５２
（数７）Ｚ２＝７．１４２９Ｘ＋６６．９０５
で記載される範囲において、酸化亜鉛−タンパク質複合体が形成できることが理解される。

（実施例３）
この実施例３では、ｐＨおよび亜鉛イオン濃度について実施したデータを示す。

本実施例では、以下に示すように、溶液の亜鉛イオン濃度を一定にしておいて、pHを水酸化ナトリウムで調整することにより実施した。

本実施例では３種類の亜鉛イオン濃度で、ｐHについて実施したデータを示す。

第１の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が３ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のアンモニア濃度が１００ｍＭとなるようにアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニアをＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／mL 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 １５０μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水 １００μＬ
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水 ５４６．６μＬ
ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．４、９．５、１０．０、１０．６になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のｐＨは、それぞれの溶液で９．４、９．５、１０．０、１０．６であった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／mL、硝酸亜鉛を混合した後のアンモニア濃度は１００ｍM、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は３ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。

第２の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が６．５ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

この領域では、実施例１と同様にして溶液を作製した。

溶液中のアンモニア濃度が１５０ｍＭとなるようにアンモニア水を反応溶液に混合した。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．２、９．８、１０．６になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のｐＨは、それぞれの溶液で９．２、９．８、１０．６であった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／mL、硝酸亜鉛を混合した後のアンモニア濃度は１５０ｍM、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は６．５ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。

第３の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が１０ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のアンモニア濃度が２５０ｍＭとなるようにアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニアをＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／mL 市販アポフェリチン ３．３６μＬ
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 ５００μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水 ２５０μＬ
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水 ４６．６μＬ
ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．６、９．８、１０．２、１０．６になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後のｐＨは、それぞれの溶液で９．６、９．８、１０．２、１０．６であった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアポフェリチンの濃度は０．２ｍｇ／mL、硝酸亜鉛を混合した後のアンモニア濃度は２５０ｍM、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は１０ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。

そして、得られた溶液を、室温中に１８時間放置し、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を検討した。

このとき、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態の評価は、実施例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の観察により行った。

以下に、上記３つの亜鉛イオン濃度で得られた溶液を室温中で１８時間放置した後の酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態をまとめて図４に示す。なお、図４は、溶液のｐＨの値と亜鉛イオンの濃度に対する酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を相対的に示している。

図４に記載されている直線Ｙ１はＹ１＝０．０２８６Ｘ＋９．９１４３、直線Ｙ２はＹ２＝０．０４２９Ｘ＋９．３７１４を示している。

図４に示されるように、緩衝液に含まれる硝酸亜鉛濃度が、３mM以上、１０ｍM以下の時に、亜鉛イオン濃度を（ＸｍM）とし、ｐHを（Ｙ）とすると
（数１）３≦Ｘ≦１０
（数２）Ｙ２≦Ｙ≦Ｙ１
（数３）Ｙ１＝０．０２８６Ｘ＋９．９１４３
（数４）Ｙ２＝０．０４２９Ｘ＋９．３７１４
で記載される範囲において、酸化亜鉛−タンパク質複合体が形成できることが理解される。

（実施例４）
この実施例４では、タンパク質濃度について実施したデータを示す。

本実施例では、以下に示すように、溶液の亜鉛イオン濃度を一定にしておいて、タンパク質濃度を調整することにより実施した。

本実施例では２種類の亜鉛イオン濃度で、タンパク質濃度について実施したデータを示す。

第１の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が３ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のアンモニア濃度が１００ｍＭとなるようにアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニアをＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／mL 市販アポフェリチン
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 １５０μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水 １００μＬ
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水
５９．５４ｍｇ／mLの市販アポフェリチンは、硝酸亜鉛を混合した後の市販アポフェリチン濃度が０．１ｍｇ／mLの時は１．６８μＬ、０．２ｍｇ／mLの時は、３．３６μＬ、０．３ｍｇ／mLの時は５．０４μＬ、０．４ｍｇ／mLの時は６．７２μＬ、２０ｍｇ／mLの時は３３５．９１μＬ入れた。

ミリＱ水は、各市販アポフェリチン濃度で、総量が１ｍＬになる量を入れた。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．５になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後の市販アポフェリチン濃度は、それぞれの溶液で、０．１ｍｇ／mL、０．２ｍｇ／mL、０．３ｍｇ／mL、０．４ｍｇ／mL、２０ｍｇ／mLであった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアンモニア濃度は１００ｍM、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は３ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。

そして、得られた溶液を、室温中に１８時間放置し、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を検討した。

このとき、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態の評価は、実施例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の観察により行った。

第２の亜鉛イオン濃度は溶液中の亜鉛イオン濃度が６．５ｍMとなるように硝酸亜鉛を反応溶液に混合した。

溶液中のアンモニア濃度が１５０ｍＭとなるようにアンモニア水を反応溶液に混合した。

以下に示される市販アポフェリチン、硝酸亜鉛、およびアンモニアをＣＡＰＳＯ緩衝液に添加した。

５９．５４ｍｇ／mL 市販アポフェリチン
２０ｍＭ 硝酸亜鉛 ３２５μＬ
１０００ｍＭ アンモニア水 １５０μＬ
２５０ｍＭ ＣＡＰＳＯ ２００μＬ
ミリＱ水
５９．５４ｍｇ／mLの市販アポフェリチンは、硝酸亜鉛を混合した後の市販アポフェリチン濃度が０．１ｍｇ／mLの時は１．６８μＬ、０．２ｍｇ／mLの時は、３．３６μＬ、０．３ｍｇ／mLの時は５．０４μＬ、０．４ｍｇ／mLの時は６．７２μＬ、２０ｍｇ／mLの時は３３５．９１μＬ入れた。

ミリＱ水は、各市販アポフェリチン濃度で、総量が１ｍＬになる量を入れた。

ｐＨは、その値がそれぞれの溶液で９．８になるように、水酸化ナトリウムおよびアンモニア水を加えることにより調整した。

ここで混合した溶液の、硝酸亜鉛を含む溶液の攪拌後の市販アポフェリチン濃度は、それぞれの溶液で、０．１ｍｇ／mL、０．２ｍｇ／mL、０．３ｍｇ／mL、０．４ｍｇ／mL、２０ｍｇ／mLであった。

なお、硝酸亜鉛を混合した後のＣＡＰＳＯの濃度は５０ｍＭ、硝酸亜鉛を混合した後のアンモニア濃度は１５０ｍM、硝酸亜鉛を混合した後の硝酸亜鉛は６．５ｍＭであった。ｐＨの調整は主として水酸化ナトリウムを緩衝液に添加することによって行った。

そして、得られた溶液を、室温中に１８時間放置し、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を検討した。

このとき、酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態の評価は、実施例１と同様、透過電子顕微鏡（ＴＥＭ：ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）の観察により行った。

以下に、上記２つの亜鉛イオン亜鉛で得られた溶液を室温中で１８時間放置した後の酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態をまとめて表１に示す。なお、表１は、亜鉛イオン濃度の値とタンパク質の濃度に対する酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を相対的に示している。

表１に示されるように、緩衝液に含まれる硝酸亜鉛濃度が、３mM以上、１０ｍM以下の時に、亜鉛イオン濃度を（ＸｍM）とし、タンパク質濃度を（Ｗｍｇ／mL）とすると
（数１）３≦Ｘ≦１０
（数８）０．２≦（Ｘ／１０）≦０．４の時はＷ＝（Ｘ／１０）
（数９）０．４≦（Ｘ／１０）の時はＷ＝０．４
で記載される範囲において、酸化亜鉛−タンパク質複合体が形成できることが理解される。

（実施例５）
この実施例５では、好ましい亜鉛化合物（亜鉛塩）に関するデータを示す。

実施例１とほぼ同様に、亜鉛イオンを添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１５０ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／mL、亜鉛イオンが６．５ｍＭ、ＣＡＰＳＯ溶液の濃度が５０ｍＭで、ｐＨの値を９．８近傍に調整して行った。

その際、亜鉛イオンの供給源として、酢酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛を用いた。

その結果を、表２に示す。

表２に示すように、いずれの亜鉛化合物においても複合体を形成できることが理解できる。

（実施例６）
この実施例６では、好ましい緩衝剤の種類に関するデータを示す。

実施例１とほぼ同様に、亜鉛イオンを添加した後に緩衝液に含まれるアンモニアの濃度が１５０ｍＭ、アポフェリチンが０．２ｍｇ／mL、亜鉛イオンが６．５ｍＭ、緩衝液の濃度が５０ｍＭで、ｐＨの値を９．８近傍に調整して行った。

その際、緩衝剤の供給源として、ＣＡＰＳＯ、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳを用いた。

その結果を、表３に示す。

表３に示すように、いずれの亜鉛化合物においても複合体を形成できることが理解できる。

本発明の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法によれば、均一な大きさを有する酸化亜鉛のナノ粒子を効率よく得ることができる。

さらにこのようなタンパク質を複数個、二次元的に整列させた後に当該タンパク質を焼失させることにより、酸化亜鉛からなるドット体を有する半導体装置を得ることができる。

（ａ）アポフェリチンの構造を示す模式図 （ｂ）図１（ａ）のＡ−Ａ線断面図 本発明の実施の形態に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成状態を示す透過電子顕微鏡写真 本発明の実施例２に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成範囲を表しているグラフ 本発明の実施例３に係る酸化亜鉛−タンパク質複合体の形成範囲を表しているグラフ

符号の説明

１０ タンパク質（アポフェリチン）
２０ モノマーサブユニット
３０ チャンネル
４０ 保持部
５０ 酸化亜鉛
６０ 酸化亜鉛−タンパク質複合体

Claims (9)

1. 内部に空洞を有するタンパク質（Ｗｍｇ／mL）、亜鉛イオン（ＸｍＭ）、およびアンモニア（ＺｍＭ）を含有する緩衝液で構成される溶液で、ｐＨ（Ｙ）を含む関係が以下の式を満たすことを特徴とする、酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
   ３≦Ｘ≦１０、Ｙ２≦Ｙ≦Ｙ１、Ｙ１＝０．０２８６Ｘ＋９．９１４３、Ｙ２＝０．０４２９Ｘ＋９．３７１４、Ｚ２≦Ｚ≦Ｚ１、Ｚ１＝２８．５７１Ｘ＋４０．９５２、Ｚ２＝７．１４２９Ｘ＋６６．９０５、０．２≦（Ｘ／１０）≦０．４の時は、W=Ｘ／１０、ただし０．４≦（Ｘ／１０）の時はＷ＝０．４
2. 前記緩衝液に硝酸亜鉛を添加する亜鉛イオン添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
3. 前記緩衝液に酢酸亜鉛を添加する亜鉛イオン添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
4. 前記緩衝液に硫酸亜鉛を添加する亜鉛イオン添加工程を有する、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
5. 前記緩衝液がＣＡＰＳＯ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
6. 前記緩衝液がＨＥＰＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
7. 前記緩衝液がＭＥＳ緩衝液である、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
8. 前記アンモニアが前記亜鉛イオンに配位している、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。
9. 前記内部に空洞を有するタンパク質はフェリチンである、請求項１に記載の酸化亜鉛−タンパク質複合体の製造方法。