JP2008546757A - 炭酸脱水酵素阻害活性を有するスルホンアミド誘導体とその治療薬と診断試薬としての使用 - Google Patents

Abstract

本発明は低酸素条件下で選択的に結合し、酵素仲介の腫瘍酸性化を逆転できるＣＡ ＩＸ選択性阻害剤であるスルホンアミドA-(Q)_n-Ar-SChNHRを開示する。これらの化合物は腫瘍関連ＣＡアイソザイム阻害に基づく抗ガン治療と同様に低酸素腫瘍の画像化に有用である。
【選択図】図１

Description

本発明は医療製薬分野、特にスルホンアミド誘導体、その製剤用プロセス、その薬剤と診断手段としての使用及びそれら含有組成物に関する。

ここ数年炭酸脱水酵素（CA, EC4.2.1.1）阻害性を有する多くのスルホンアミド（スプラン、シーティ等（Supuran, C.T. et al.）、メディカルリサーチレビュー（Med. Res. Rev.、２００３年、２３巻、１４６−１８９頁；スプラン、シーティ（Supuran, C.T. et al.）、スコザフーァバ、エイ（Scozzafava, A.）、コンウエイ、ジェイ（Conway, J.）編、炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、シーアールシープレス（CRC Press）、（テイラーアンドフランシスグループ（Taylor and Francis Group））、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（Florida）、２００４年、１−３６３頁及びその記載文献；カッシーニ、エイ等（Casini, A, et al）、カレントキャンサードラッグターゲッツ（Curr. Cancer Drug Targets）、２００２年、２巻、５５−７５頁；パストレコーバ、エス等（Pastorekova, S. et al）、ジャーナルオブエンザイインヒビションアンドメディシナルケミストリー（J. Enz. Inhib. Med. Chem.）、２００４年、１９巻、１９９−２２９頁；スコザッファーバ、エイ等（Scozzafava, A. et al）、カレントメディシナルケミストリー（Curr. Med. Chem.）、２００３年、１０巻、９２５−９５３頁）がインビトロとインビボの腫瘍細胞の成長を様々の程度阻害することが知られている（上記と又パルッキラ、エス（Parkkila, S.）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、２０００年、９７巻、２２２０−２２２４頁；タイチャー、ビーエイ等（Teicher, B.A., et al）等、アンチキャンサーリサーチ（Anticancer Res.）、１９９３年、１３巻、１５４９−１５５６頁；スプラン、シーティ（Supuran, C.T.）、スコザファーバ、エイ（Scozzafava, A.）、ヨーロピアンジャーナルオブメディシナルケミストリー（Eur. J. Med. Chem.）、２０００年、３５巻、８６７−８７４頁；スプラン、シーティ（Supuran, C.T. et al.）、スコザファーバ、エイ（Scozzafava, A.）、ジャーナルオブエンザイムインヒビション（J. Enz. Inhib.）、２０００年、１５巻、５９７−６１０頁；スコザファーバ、エイ（Scozzafava, A.）、スプラン、シーティ（Supuran, C.T. et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２０００年、１０巻、１１１７―１１２０頁；スプラン、シーティ等（Supuran, C.T. et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリー（Bioorg. Med. Chem.）、２００１年、９巻、７０３−７１４頁参照）。現在同定された１５のヒトＣＡの中でこのプロセスに関与する正確な一つ又は複数のイソザイムは最近まで未知であったが、主としてアイソザイムとして腫瘍に存在するＣＡ ＩＸの発見（パストレック、ジェイ等（Pastorek, J. et al）等、オンコーゲン（Oncogene）、１９９４年、９巻、２７８８−２８８８頁：オパブスキー、アール（Opavsky, R. et al）等、ゲノム（Genomics）、１９９６年、３３巻、４８０−４８７頁）及び次いでＣＡ ＸＩＩの発見（ツレッシ、オー等（Tureci, O. et al）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９８年、９５巻、７６０８−７６１３頁）により、この分野のより詳細な研究の開始点が与えられた。初期の“ＣＡ−腫瘍関係”の研究で殆ど理解されなかった他の課題は、同じ腫瘍型に属する種々の腫瘍株化細胞（例えば白血病、非小細胞肺ガン、卵巣癌、メラノーマ、結腸ガン、中枢神経ガン、腎臓ガン、前立腺ガン又は乳ガン）が、通常３０μＭ−１０ｎＭ範囲のＣＩ_５０値（腫瘍細胞成長を５０％阻害する阻害剤容量モル濃度）を有するスルホンアミド誘導体類により非常に異なる感受性をなぜ示すかである（ヨーロピアンジャーナルオブメディシナルケミストリー（Eur. J. Med. Chem.）、２０００年、３５巻、８６７−８７４頁；ジャーナルオブエンザイムインヒビション（J. Enz. Inhib.）、２０００年、１５巻、５９７−６１０頁； バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２０００年、１０巻、１１１７―１１２０頁；バイオオーガニックメディシナルケミストリー（Bioorg. Med. Chem..）、２００１年、９巻、７０３−７１４頁）。ＣＡ ＩＸ／ＸＩＩが全ての腫瘍型には存在せず（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、シーアールシープレス（CRC Press）、（テイラーアンドフランシスグループ（Taylor and Francis Group））、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（Florida）、２００４年、１−３６３頁及びその記載文献；ジャーナルオブエンザイインヒビションアンドメディシナルケミストリー（J. Enz. Inhib. Med. Chem.）、２００４年、１９巻、１９９−２２９頁；カレントメディシナルケミストリー（Curr. Med. Chem.）、２００３年、１０巻、９２５−９５３頁）、更にアイソザイムＩＸ−現在最も良く研究されているアイソザイム−のレベルが、低酸素誘引因子ＨＩＦ−１によるＣＡ９遺伝子の直接転写活性化により、低酸素状態に応答して劇的に増加することがより最近に初めて発見された（バイコフ、シーシー等（Wykoff, C.C. et al）、キャンサーリサーチ（Cancer Res.）、２０００年、６０巻、７０７５−７０８３頁）。その後腫瘍でのＣＡ ＩＸ発現は悪い予後兆候であることも示された（ポッター、シーピーエス（Potter, C.P.S.）、ハリス、エイエル（Harris, A.L.）、ブリティッシュジャーナルキャンサー（Brit. J. Cancer）、２００３年、８９巻、２−７頁）。
酸性細胞外ｐＨ（ｐＨｅ）は、血管新生因子の上方制御、プロテアーゼ、浸潤増加及び免疫機能損傷を含む複数の機構による腫瘍進行と関連づけられてきた（スタブ、エム等（Stubbs, M. et al）、モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；ヘルムリンガー、ジー等（Helmlinger, G. et al）、クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁；福丸、ディ等（Fukumura, D. et al）、キャンサーリサーチ（Cancer Res.）、２００１年、６１巻、６０２０−６０２４頁；加藤、ワイ等（Kato, Y. et al.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、１９９２年、２６７巻、１１４２４−１１４３０頁；マーティネス−ザグリアン等（Martinez-Zaguilan, et al）、クリニカルエクスペリメンタルメタスタシス（Clin. Exp. Metastasis）、１９９２年、１４巻、１７６−１８６頁；フィッシャー、ビー等（Fischer, B., et al）、クリニカルイムノロジー（Clinical Immunol.）、２０００年、９６巻、２５２−２６３頁）。
更に酸性ｐＨｅは抗ガン剤吸収に影響でき、慣用化学療法と放射線照射療法に対する腫瘍細胞の反応を調節できる（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、シーアールシープレス（CRC Press）、（テイラーアンドフランシスグループ（Taylor and Francis Group））、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（Florida）、２００４年、１−３６３頁及びその記載文献；ジャーナルオブエンザイインヒビションアンドメディシナルケミストリー（J. Enz. Inhib. Med. Chem.）、２００４年、１９巻、１９９−２２９頁；カレントメディシナルケミストリー（Curr. Med. Chem.）、２００３年、１０巻、９２５−９５３頁）。腫瘍微環境の酸性化は、通常解糖により過剰産生され不適切な腫瘍脈管構造により除去が不十分な乳酸の蓄積に帰属された（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁；ニュウエル、ケイ等（Newell, K. et al）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９３年、９０巻、１１２７−１１３１頁）。高速度での解糖はそのエネルギー発生のための嫌気的代謝に大きく依存する低酸素細胞には重要である（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁；ニュウエル、ケイ等（Newell, K. et al）、プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９３年、９０巻、１１２７−１１３１頁）。しかし解糖欠乏性細胞に関する実験により、乳酸産生はだけが腫瘍酸性化をもたらす機構では無いことが最近示された。解糖欠乏性細胞は減量した乳酸のみ産生する、いずれにせよインビボで酸性腫瘍を形成することが示された（プロシーディングオブナショナルアカデミーオブサイエンス、ユーエスエイ（Proc. Natl. Acad. Sci. USA）、１９９３年、９０巻、１１２７−１１３１頁）。解糖損傷細胞と親細胞の代謝プロフィルの比較により、乳酸以外に他の分子−炭酸ガス−が腫瘍酸性度に対する重要なソースであることが示された（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁）。炭酸ガスの水和は触媒しでは生理ｐＨで非常に遅いプロセスであるので、炭酸ガスと重炭酸塩間の相互変換に関与する酵素の存在はハウスキーピング細胞に本質的に不可欠であり、これら酵素がＣＡ類である。幾つかの独特の性質に基づき腫瘍関連イソザイムＣＡ ＩＸは、腫瘍微環境酸性化での役割で最善の候補のように思われた。従ってＣＡ ＩＸは細胞外露出酵素の活性部位を有する内在性膜血漿タンパクであり（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、スプラン、シーティ（Supuran, C.T.）、スコザファーバ、エイ（Scozzafava, A.）、コンウエイ、ジェイ（Conway, J.）編、シーアールシープレス（CRC Press）、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（FL）、ユーエスエー（U.S.A.）、２００４年、２５３−２８０頁；バイオオーガニックメディシナルケミストリー（Bioorg. Med. Chem.）、２００１年、９巻、７０３−７１４頁）、高触媒活性を有し（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、スプラン、シーティ（Supuran, C.T.）、スコザファーバ、エイ（Scozzafava, A.）、コンウエイ、ジェイ（Conway, J.）編、シーアールシープレス（CRC Press）、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（FL）、ユーエスエー（U.S.A.）、２００４年）、数個の正常組織にのみ存在するが、その生態発現は多くの腫瘍型と強く関連する（ポッター、シーピーエス（Potter, C.P.S.）、ハリス、エイエル（Harris, A.L.）、ブリティッシュジャーナルキャンサー（Brit. J. Cancer）、２００３年、８９巻、２−７頁）。最後にＣＡ ＩＸレベルはＨＩＦ−１によるＣＡ９遺伝子の直接転写活性化により、低酸素状態に対する反応で劇的に増加する（バイコフ、シーシー等（Wykoff, C.C., et al）、キャンサーリサーチ（Cancer Res.）、２０００年、６０巻、７０７５−７０８３頁；フィッシャー、ビー（Fischer, B.）、クリニカルイミュノロジー（Clinical Immunol.）、２０００年、９６巻、２５２−２６３頁）。従ってＣＡ ＩＸは腫瘍のｐＨ制御に必要な要件全てを有する。
ブルーベーカー、ケイ等（Burbaker, K, et al.）（ジャーナルオブヒストケミストリーアンドシトケミストリー（The Journal of Histochemistry and Cytochemistry）、４７巻（４号）、５４５−５５０頁、１９９９年）は破骨細胞、ＣＡ ＩＩとＣＡ ＩＶの炭酸脱水酵素局在化のためのボデピー（Bodipy）５５８／５６８修飾アセタゾールアミドが最も鋭敏な形であると記述している。
特定炭酸脱水酵素ＩＸ阻害活性を有するスルホンアミド誘導体が、ＷＯ２００４／０４８５４４に記載されている。
最新技術での意見とは反対に、本発明は低酸素条件下で細胞外ｐＨを酸性にするのは、乳酸でなくＣＡ ＩＸの能力であることを発見した。
スバストーバ、イー等（Svastova, E. et al）、（エフイービーエスレター（FEBS Letters）、１９巻、１１月、２００４年、５７７巻、３号、４３９−４４５頁）は、ＣＡ ＩＸの選択的阻害剤として４−スルファモイルフェニルメチルチオウレイドフルオレセインを開示している。この化合物は低酸素誘引のＣＡ ＩＸ内在化による細胞質蓄積に遭遇すると考えられる（スバストーバ、イー等（Svastova, E. et al）、エクスペリメンタルセルリサーチ（Exp. Cell Res.）、２００３年、２９０巻、３３２−３４５頁）。
ＣＡ ＩＸ阻害剤の細胞外保持は、細胞内の異なるＣＡ類に対する可能な活性による副作用発生を防ぎために重要である。
この問題は上述のＷＯ２００４／０４８５４４でも直面し、ピリジニウム残基を有するスルホンアミド誘導体により解決された。陽イオン成分が化合物を膜不透過にする。又上述のスバストーバ、イー等（Svastova, E. et al）、エフイービーエスレター（FEBS Letters）、１９巻、１１月、２００４年、５７７巻、３号、４３９−４４５頁参照。
上に説明したように細胞外の低ｐＨは腫瘍進行と治療に重要な因子であり、それ故腫瘍環境の細胞外ｐＨの制御、更には逆転の必要すらある。
蛍光成分を有する特定のスルホンアミド類が強力なＣＡ ＩＸ阻害性を有し、低酸素条件下で生ずる細胞外ｐＨを逆転出来ることを見いだした。

本発明の目的は、低酸素腫瘍でのこのイソザイムを画像化するか、阻害するのに有用で、正常ｐＨを保持する蛍光性尾部を有する新種の強力なＣＡ ＩＸ阻害剤である。
本発明の目的は式（Ｉ）の化合物であり、
A-(Q)_n-Ar-SO₂NHR （Ｉ）
ここで
Ａは蛍光染料成分であり、
Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m又は-NH-CX-NH-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは酸素又は硫黄原子であり、R₁はＣ_１−Ｃ_４アルキレンであり、ｍは数０又は１であり、
ｎは数０又は１であり、
ＡｒはＣ_６−Ｃ_１０の芳香族基又は酸素、窒素又は硫黄原子からなる基から選択の少なくとも一つのヘテロ原子含有複素環芳香族基であり、該芳香族基及び複素環芳香族基は任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換されても良く、
Ｒは水素原子又はB-SO₂NH₂基であり、ここでＢは（C₁−C₄）_rアルキレン芳香族基又はアルキレン複素環芳香族基であり、ここでｒは０又は１であるが、
４−スルファモイルフェニルメチルチオウレイドフルオレセインを除き、
その医薬容認水和物、溶媒和物及び塩である。
本発明に従う化合物は広範の炭酸脱水酵素Ｉ及びＩＩに関して腫瘍関連炭酸脱水酵素ＩＸの選択的阻害活性と云う予期しない性質を示す。
更に本発明に従う化合物は細胞膜を透過せず、従って選択的活性を増強する。
本発明化合物の他の重要な特性は、低酸素性腫瘍の細胞外の酸性ｐＨを逆転する能力である。
それ故これら化合物は以下の説明項で詳細に開示するように、診断試薬及び治療薬として有用である。
本発明の更なる目的は、式（Ｉ）化合物の製剤プロセス、特に腫瘍分野での薬物調整と診断手段としてのその使用、更には腫瘍診断と治療法である。
本発明の他目的は、式（Ｉ）の化合物含有の組成、特に医薬組成と診断組成である。
本発明のこれらと他の目的を実施例又は図を用いて更に詳細に開示する。

本発明に従うと式（Ｉ）のＡ基は蛍光染料成分を表す。この用語は技術の通常技量者により良く理解されている。定義の例は米国特許５，９１９、９２２とそこに記載の文献及び市販カタログの全てに提供されている。蛍光染料の好ましい例はフルオレセイン（ＣＡＳＲＮ２３２１−０７−０５）である。
Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、Ｘは酸素又は硫黄原子、R₁はＣ_１−Ｃ_４アルキレンであり、ｍは数０又は１である。
Ｃ_６−Ｃ_１０芳香族基はフェニル、１−ナフチル又は２−ナフチルを意味する。
複素環芳香族基は酸素、窒素又は硫黄原子からなる一群から選択の少なくとも一つのヘテロ原子含有のＣ_３−Ｃ_１２炭素環式化合物を意味する。１，３，４−チアジアゾールが好ましい複素環基である。
好ましい基Ｃ_１−Ｃ_４アルキレン基はメチレンとエチレンである。アルキレン基は分岐しても良いが、全炭素原子数は最大４である。
フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素が好ましいハロゲン原子である。
医薬容認塩と溶媒和物については、技術の通常技量者には周知であり、更に説明する必要はない。例えばウエルマス、シージー（Wermuth, C.G.）、スタール、ピーエッチ（Stahl, P.H.）編、薬剤塩と物性ハンドブック、選択及び使用（Handobook of Pharmaceutical Salts, Properties, Selection and Use）、フェルラーグヘルベティカキミカアクタ（Verlag Helvetica Chimica Acta）、チューリッヒ（Zurich）、２００２年参照。適切塩の例はナトリウム、カリウム、リチウム、アミンである。
式（Ｉ）の化合物の第一の好ましいグループは、Ｑが-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは酸素又は硫黄原子であり、Ｒ_１はＣ_１−Ｃ_４アルキレンであり、ｍは数０又は１であり、Ａｒは任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたフェニルであり、Ｒは水素原子の化合物である。
式（Ｉ）の化合物の第二の好ましいグループは、Ｑが-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは硫黄原子であり、ｍは０であり、Ａｒは任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたフェニルであり、Ｒは水素原子の化合物である。
式（Ｉ）の化合物の第三の好ましいグループは、Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは硫黄原子であり、Ｒ_１はＣ_１−Ｃ_２アルキレン、ｍは数は１であり、Ａｒは任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたフェニルであり、Ｒは水素原子の化合物である。
式（Ｉ）の化合物の第四の好ましいグループは、Ｑが-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは硫黄原子であり、ｍは０であり、Ａｒはフェニルであり、ＲはB-SO₂NH₂基であり、ここでＢは１，３，４−チアジアゾール−２−イルの化合物である。
好ましい化合物群全てで最も好ましい蛍光染料残基Ａはフルオレセインである。
この基の可能な位置に関して制限はない。例えば蛍光染料成分Ａはこれらの基の任意の可能な位置に分子残基を持ちうると同様に、Ａｒ基の任意の可能な位置に-SO₂NHR基と A-(Q)_n基をそれぞれ持ちうる。Ｂが芳香族基又は複素環芳香族基の場合、同じことが適用される。
本発明に従うと特に好ましい化合物は
４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
４−スルファモイルフェニルエチルチオウレイドフルオレセイン、
２−ヨードー４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
３−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセイン、
４−（５−スルファモイル−（１，３，４）−チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセインである。
この好ましい化合物は以下の図式に示す。

好ましい化合物の他の一群は以下の通りである。
４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（１）、
３−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（２）、
２−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（３）、
４−スルファモイルフェニルメチルウレイドフルオレセイン（４）、
４−スルファモイルフェニルエチルウレイドフルオレセイン（５）、
２−フルオロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（６）、
２−クロロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（７）、
２−ブロモ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（８）、
２−ヨード−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（９）、
４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイルフェニル）ウレイドフルオレセイン（１０）、
４−（５−スルファモイル（１，３，４）−チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルウレイドフルオレセイン（１１）である。

本発明の他の目的は式（Ｉ）化合物の製剤プロセスであり、ここでＡが上に定義し式（ＩＩ）A-NH₂の化合物と、Ｘ，Ｒ_１、ｍ及びＡｒが上に定義した式（ＩＩＩ）-XC-NH-(R₁)_m-Ar-SO₂NHRとの反応を含む好ましくはフルオレセイン残基である。
代わりにＡとＸが上に定義した式（ＩＶ）A-NCXの化合物と、Ｒ_１、ｍ及びＡｒが上に定義した式（Ｖ）H₂N-(R₁)_m-Ar-SO₂NHRとの間の反応を実施する。
反応条件は技術の技量者には周知であり、特に説明する必要はないが、例えばカッシーニ、エイ等（Casini, A. et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、２０００年、４３巻、４８８４−４８９２頁；イノセンチ、エイ等（Innocenti, A. et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、２００４年、４７巻、５２２４−５２９９頁参照。
本発明に従う第二実施形態では、式（Ｉ）の化合物は構造的に関連したチオ尿素に関して以前に報告された（スプラン、シーティ等（Supuran, C.T., et al.）、ヨーロピアンジャーナルオブメディシナルケミストリー（Eur. J. Med. Chem.）、１９９８年、３３巻、８３−９３頁）ようにフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）２とアミノ／ヒドラジノ置換芳香族／複素環スルホンアミド４との反応で合成できる。
以下の図式により本発明によるプロセスの典型的実施形態を示す。
図式１

通常第一のプロセスでは、フルオレセインアミン（１）とイソチオシアネートスルホンアミド（３）を好ましくは等モル量、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド又は相当物のような適切な有機溶剤に溶解し、その反応混合物を反応に影響しない温度、例えば室温で攪拌する。反応は完了するまで（監視する）継続し、次いで水に溶解し、適切な溶剤（例えば酢酸エチル）で抽出する。所望の生成物は有機層に存在、通常乾燥し（例えば、無水硫酸ナトリウム）、濾過し、真空下に濃縮する。次いで必要に応じて生成物は、例えばフラッシュクロマトグラフィのような通常法により精製する。
第二のプロセスでは、フルオレセインイソチオシアネートとアミノスルホンアミド誘導体を等モル量、例えばＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド又は相当物のような適切な有機溶剤に溶解し、次いでトリエチルアミンのような十分量、例えば等モル量の有機アミンを加え、生成反応混合物を反応に影響しない温度、例えば室温で攪拌する。反応は完了するまで（監視する）継続し、次いで水に溶解し、適切な溶剤（例えば酢酸エチル）で抽出する。所望の生成物は有機層に存在、通常乾燥し（例えば無水硫酸ナトリウム上で）、濾過し、真空下に濃縮する。次いで必要に応じて生成物は、例えばフラッシュクロマトグラフィのような通常法により精製する。
ウレイドフルオレセイニルスルホンアミド類は文献（スミス、ジェイ（Smith, J.）、ジャーナルオブオーガニックケミストリー（J. Org. Chem.）、１９６５年、３０巻、１２６０−１２６２頁）に記載のように、アミノフルオレセインＡ（市販の誘導体）とイソシアネートスルホンアミド類Ｂ（大部分は市販誘導体である相応アミノスルホンアミドとホスゲンとを還流トルエン中で合成する。H₂N-R-SO₂NH₂ + COCl₂ = OCN-R-SO₂NH₂ + 2HCl））（図式２）を縮合して合成する。実際にウレイド化合物は上述のように相応チオウレイドと同様に合成される。
図式２

本発明に従う化合物は選択的炭酸脱水酵素ＩＸ阻害剤類である。
この性質によりこれら化合物は低酸素腫瘍識別用のプローブとして有用である。特に識別できる腫瘍は炭酸脱水酵素ＩＸ陽性腫瘍である。
腫瘍の識別は最も広い意味を指す。識別はインビボ、即ち生体又はインビトロ、即ち罹患被験者又はこの腫瘍で影響を受けた被疑者から採取した腫瘍組織試料のいずれかで実施できる。蛍光検出を用いる任意の方法が適用できる。好ましい方法はポジトロンエミッショントモグラフィーである。
プローブのインビボ使用を提供する実施形態では、この化合物は炭酸脱水酵素検出用、特に炭酸脱水酵素ＩＸ検出用に、より特別に炭酸脱水酵素ＩＸ陽性腫瘍検出用試薬製剤に有用なこと意図する。
本発明の他の目的は式（Ｉ）化合物を含む蛍光試薬である。この試薬は膜結合炭酸脱水酵素ＩＸを発現する腫瘍細胞検出に有用である。この試薬は腫瘍造影用診断キットの組成部に組み入れられる。該蛍光試薬と関連組成とキットの在来的製剤は技術的に周知である（例えばＷＯ９８／４１６４９及びそこに記載の文献参照）。
式（Ｉ）の化合物は薬物調整に有用である。
本発明の好ましい実施形態では薬物は炭酸脱水酵素阻害作用を有し、より好ましくは炭酸脱水酵素アイソザイムＩＸに対する阻害作用を有する。
これらの性質のお陰で式（Ｉ）の化合物は特に低酸素腫瘍治療用の薬物又は方法で有用である。この種腫瘍の例としては、腎臓癌腫、乳癌腫、肺癌腫、頭頚部癌腫、神経膠腫、中皮腫、胃癌腫、結腸癌腫、胆道癌腫、膵臓癌腫、子宮癌種、子宮内膜癌腫、上皮扁平細胞癌腫／基底細胞癌腫がある。
より特別にはこの薬物は低酸素腫瘍の酸性化を逆転するのに有効である。
本発明に従う薬物は炭酸脱水酵素ＩＸ陽性腫瘍の治療に有効である。
本発明の該薬物は例えば抗ガン治療との併用療法に使用できる。抗ガン治療は最も広い意味を指し、化学療法、放射線照射療法、併用療法を含む。
本発明に従うとこの薬剤組成は、少なくとも１つの活性成分を有意な治療効果が生ずる量含有する。本発明が包含する組成は全く便宜的であり、例えばレミントンの薬剤科学ハンドブック（Remington's, Pharmaceutical Science Handbook）、マック出版（Mack Pub.）、ニューヨーク（N.Y.）、最新版で示された方法のように、薬剤工業での慣行的方法で得られる。選択投与経路に従いこの組成類は経口投与、非経口投与又は静脈内投与に適する固体又は液体形態である。本発明に従う組成類は活性成分と一緒に少なくとも１つの医薬容認媒体物又は賦形剤を含有する。配合アジュバント、例えば可溶化剤、分散剤、懸濁剤又は乳化剤はは特に有用でである。
以下の実施例により該発明を更に説明する。
概要：^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルはＤＭＳＯ−ｄ_６を溶剤として、テトラメチルシランを内部基準として用いてブルーカー（Bruker）ＤＲＸ−４００スペクトロメーターで記録した。化学シフトをテトラメチルシランからの低磁場δ（ｐｐｍ）で表し、カップリング定数（Ｊ）をヘルツで表した。電子イオン化マススペクトル（３０eV）をウオーター（Water）ＭｉｃｒｏＭａｓｓＺＱでポジティブモード又はネガティブモードで記録した。

式（Ｉ）化合物合成の一般法
方法Ａ；
フルオレセインイソチオシアネート（０．００１モル）とアミノスルホンアミド誘導体（０．００１モル）をジメチルフォルムアミド５ｍｌに溶解し、次いでトリエチルアミン（０．００１モル）を加え、混合物を室温で反応が完結するまで（ＴＬＣで監視する）攪拌した。次いで反応混合物を水に溶解し、酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下に濃縮した。次いで生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した。
方法Ｂ；
フルオレセインアミン（０．００１モル）とイソチオシアネートスルホンアミド（０．００１モル）をＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド５ｍｌに溶解し、混合物を室温で反応が完結するまで（ＴＬＣで監視する）攪拌した。次いで反応混合物を水に溶解し酢酸エチルで抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し、濾過し、真空下に濃縮した。次いで生成物をフラッシュクロマトグラフィで精製した。
上記の方法に従い適切な試薬を用いるて以下の化合物を得た。
４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン（５a）： ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.45 (s, 1H), 10.35 (s,1H), 10.15 (s, 2H), 8.2 (d, 1H, J=1.85 Hz), 7.85 (dd, 1H, J=2Hz), 7.8 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.7 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.35 (s, 2H), 7.25 (d, 2H J=8.2 Hz), 6.7 (d, 2H, J=2 Hz), 6.6 (m, 4H); MS ESI⁺ m/z 562 (M+H)⁺. ESI^- m/z 560 (M-H)^-。
４−スルファモイルフェニルエチルチオウレイドフルオレセイン（５ｃ）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz), ¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz)δ10.15 (s, 2H), 9.95 (s, 1H), 8.25 (s, 1H), 8.1 (s, 1H), 7.8 (d, 2H, J=6.6Hz), 7.7 (d, 1H, J=8.1 Hz), 7.5 (d, 2H, J=8.3 Hz), 7.3 (s, 2H), 7.2 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.7 (d, 2H, J=4.1 Hz), 6.65-6.55 (m, 4H), 3.8 (q, 2H, J=7.3 Hz, J=4.8 Hz), 3 (t, 2H, J=7.4 Hz); MS ESI⁺ m/z 590 (M+H)⁺. ESI^- m/z 588 (M-H)^-。
２−ヨードー４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン（５ｈ）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.45 (s, 1H), 10.15 (s, 2H), 9.8 (s, 2H), 8.3 (dd, 2H, J=15.8 Hz, 1.8 Hz), 7.63 (d, 1H, J=8.3Hz), 7.5 (s, 2H), 7.26 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.7 (d, 2H, J=2.3 Hz), 6.6 (m, 4H); MS ESI^- m/z 686 (M-H)^-。
３−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン（５i）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.4 (s, 1H), 10.35 (s,1H), 10.15 (s, 2H), 8.2 (d, 1H, J=1.7 Hz), 7.97 (d, 1H, J=1.6Hz), 7.83 (dd, 1H, J=8.3 Hz, J=1.8 Hz), 7.75 (d, 1H, J=8 Hz), 7.62 (dd, 1H, J=6.6 Hz, J=1.4 Hz), 7.55 (t, 1H, J=7.8 Hz), 7.44 (s, 2H), 7.24 (d, 2H J=8.3 Hz), 6.7 (d, 2H, J=2.1 Hz), 6.6 (m, 4H); MS ESI⁺ m/z 562 (M+H)⁺,584 (M+Na)⁺. ESI- m/z 560 (M-H)^-。
４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセイン（５ｊ）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.45 (2s, 2H), 10.25 (s,2H), 8.23 (d, 2H, J=6 Hz), 7.8 (m, 7H), 7.48 (d, 2H, J=8.2 Hz), 7.35 (s, 2H), 7.25 (d, 1H, J=8.2 Hz), 6.7 (d, 2H, J=1.7 Hz), 6.6 (m, 4H), 4.1 (d, 2H, J=5.9 Hz); MS ESI⁺ m/z 731 (M+H)⁺,753 (M+Na)⁺. ESI m/z 729 (M-H)^-。
４−（５−スルファモイル−（１，３，４）チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセイン（５ｋ）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.45 (s, 2H), 10.15 (s, 3H), 8.4 (s, 1H), 8.45 (m, 1H), 8.25 (dd, 1H, J=9.8 Hz, J=1.8 Hz), 7.83 (m, 3H), 7.73 (m, 2H), 7.25 (dd, 1H, J=12.4 Hz, J=8.3 Hz), 6.7 (d, 2H, J=2.5 Hz), 6.6 (m, 4H); MS. ESI- m/z 723 (M-H)^-。
ウレイドフルオレセイニルスルホンアミド類はアミノフルオレセイン（市販誘導体, シグマ−アルドリッチ（Sigma-Aldrich）、ミラノ（Milan）、イタリー（Italy））とイソシアネートスルホンアミド類（大部分は市販誘導体である相応アミノスルホンアミドとホスゲンを還流トルエン中で合成する。H₂N-R-SO₂NH₂ + COCl₂ = OCN-R-SO₂NH₂ + 2HCl）とを縮合して合成する。
上記の方法に従い適切な試薬を用いることで以下の化合物を得た。
４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（１）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.49 (s, 1H), 10.38 (s,1H), 10.21 (s, 2H), 8.25 (d, 1H, J=1.85 Hz), 7.85 (dd, 1H, J=2Hz), 7.81 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.72 (d, 2H, J=8.7 Hz), 7.35 (s, 2H), 7.21 (d, 2H J=8.2 Hz), 6.73 (d, 2H, J=2 Hz), 6.60 (m, 4H); MS ESI⁺ m/z 546 (M+H)⁺. ESI^- m/z 544 (M-H)^-。
３−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（２）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz), δ10.51 (s, 1H), 10.43 (s,1H), 10.23 (s, 2H), 8.25 (d, 1H, J=1.7 Hz), 7.95 (d, 1H, J=1.6Hz), 7.83 (dd, 1H, J=8.3 Hz, J=1.8Hz), 7.78 (d, 1H, J=8 Hz), 7.64 (dd, 1H, J=6.6 Hz, J=1.4 Hz), 7.52 (t, 1H, J=7.8 Hz), 7.46 (s, 2H), 7.27 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.68 (d, 2H, J=2.1 Hz), 6.60 (m, 4H); MS ESI⁺ m/z 546 (M+H)⁺. ESI^- m/z 544 (M-H)^-。
２−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（３）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz), δ10.45 (s, 1H), 10.35 (s,1H), 10.18 (s, 2H), 8.20 (d, 1H, J=1.85Hz), 7.95 (d, 1H, J=1.6Hz), 7.83 (dd, 1H, J=8.3 Hz, J=1.8 Hz), 7.78 (d, 1H, J=8 Hz), 7.64 (dd, 1H, J=6.6 Hz, J=1.4 Hz), 7.35 (s, 2H), 7.25 (d, 2H J=8.2 Hz), 6.7 (d, 2H, J=2 Hz), 6.6 (m, 4H); MS ESI⁺ m/z 546 (M+H)⁺. ESI^- m/z 544 (M-H)^-。
４−スルファモイルフェニルメチルウレイドフルオレセイン（４）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.62 (s, 1H), 9.13 (s,1H), 8.24 (s, 1H), 7.83 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.75 (d, 1H, J=8.0 Hz), 7.56 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.17 (d, 1H J=8.0 Hz), 6.70-6.5 (m, 6H); MS ESI⁺ m/z 560 (M+H)⁺. ESI^- m/z 558 (M-H)^-。
４−スルファモイルフェニルエチルウレイドフルオレセイン（５）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.63 (s, 1H), 9.34 (s,1H), 8.26 (s, 1H), 7.81 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.78 (d, 1H, J=8.0 Hz), 7.54 (d, 2H, J=8.1 Hz), 7.17 (d, 1H J=8.0 Hz), 6.70-6.5 (m, 6H), 3.13 (t, 2H); MS ESI⁺ m/z 574 (M+H)⁺. ESI^- m/z 572 (M-H)^-。
２−フルオロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（６）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.40 (s, 1H), 10.21 (s, 2H), 9.88 (s,2H), 8.38 (dd, 2H, J=15.8 Hz, J=1.8 Hz), 7.61 (d, 1H, J=8.3 Hz), 7.47 (s, 2H), 7.29 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.70 (d, 2H, J=2.3 Hz), 6.62 (m, 4H); MS ESI^- m/z 562 (M-H)^-。
２−クロロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（７）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.46 (s, 1H), 10.17 (s, 2H), 9.81 (s,2H), 8.36 (dd, 2H, J=15.8 Hz, J=1.8 Hz), 7.60 (d, 1H, J=8.3 Hz), 7.45 (s, 2H), 7.28 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.73 (d, 2H, 2.3 Hz), 6.60 (m, 4H); MS ESI^- m/z 578 (M-H)^-。
２−ブロモ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（８）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.48 (s, 1H), 10.21 (s, 2H), 9.86 (s,2H), 8.35 (dd, 2H, J=15.8 Hz, J=1.8 Hz), 7.63 (d, 1H, J=8.3 Hz), 7.52 (s, 2H), 7.23 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.71 (d, 2H, 2.3 Hz), 6.60 (m, 4H); MS ESI^- m/z 623 (M-H)^-。
２−ヨード−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン（９）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.45 (s, 1H), 10.19 (s, 2H), 9.78 (s, 2H), 8.35 (dd, 2H, J=15.8 Hz, J=1.8 Hz), 7.68 (d, 1H, J=8.3 Hz), 7.54 (s, 2H), 7.32 (d, 1H J=8.3 Hz), 6.77 (d, 2H, 2.3 Hz), 6.62 (m, 4H); MS ESI^- m/z 680 (M-H)^-。
４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイル）フェニルウレイドフルオレセイン（１０）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.47 (2s, 2H), 10.21 (s, 2H), 8.28 (d, 2H, J=6 Hz), 7.82 (m, 7H), 7.54 (d, 2H, J=8.2 Hz), 7.36 (s, 2H), 7.25 (d, 1H J=8.2 Hz), 6.71 (d, 2H, J=1.7 Hz), 6.63 (m, 4H), 4.12 (d, 2H, J=5.9 Hz); MS ESI⁺ m/z 731 (M+H)⁺, 753 (M+Na)⁺. MS ESI^- m/z 713 (M-H)^-。
４−（５−スルファモイル−（１，３，４）−チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルウレイドフルオレセイン（１１）；¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ10.44 (s, 2H), 10.19 (s, 3H), 8.46 (s,1H), 8.40 (m, 1H), 8.21 (dd, 1H, J=12.4 Hz, J=8.3 Hz), 7.86 (m, 3H), 7.70 (m, 2H), 7.24 (dd, 1H, J=9.8 Hz, J=1.8 Hz), 6.71 (d, 2H, J=2.5 Hz), 6.64 (m, 4H); MS ESI^- m/z 707 (M-H)^-。
生物試験
赤血球膜経由の貫通性
トリス緩衝液（ｐＨ７．４０、５ｍＭ）で数回完全に洗浄し、１０分間遠心分離した新鮮な単離ヒト赤血球１０ｍｌ量を、スルホンアミド阻害剤３ｍＭ溶液２５ｍＬで処理した。３７°Ｃで穏やかに攪拌しながら３０−１２０分間インキュベートした。インキュベート時間３０分、６０分及び４８時間後、それぞれ非結合阻害剤全てを除くために、その赤血球を１０分間再度遠心分離し、上澄みを廃棄し、上述の緩衝液１０ｍＬで三回この細胞を洗浄した。次いでこの細胞を蒸留水２５ｍＬに溶解し、膜類と他の不溶不純物を除去するために遠心分離した。得られた溶液を１００°Ｃで５分間加熱し（ＣＡ類を変性するために）、存在する可能性のあるスルホンアミド類を高速薄層クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）法（ゴンマー、ジーエス（Gomaa, Z.S.）、バイオメディカルクロマトグラフィ法（Biomed. Chromatogr.）、１９９３年、７巻、１３４−１３５頁）と分光光度法的（アビジン、エッチ等（Abdine, H. et al）、ジャーナルオブアソシエーションオフィシャルアナリティカルケミストリー（J. Assoc. Off. Anal. Chem.）、１９７８年、６１巻、６９５−７０１頁）な二つの方法により各試料で定量した。
ＨＰＬＣ；本発明者はゴンマー（Gomaa）の上記法の変形を以下のように開発した。市販の５μｍボンダパック（Bondapak）Ｃ−１８カラムをアセトニトリル−メタノール−リン酸緩衝液（ｐＨ７．４）１０：２：８８（容積／容積／容積）からなる移動相と、スルファジアジン（シグマ（Sigma））０．３ｍｇ／ｍＬを内部標準として流速３ｍＬ／分で分離に用いた。保持時間はアセタゾラミドで１２．６９分、スルファジアジンで４．５５分、ベンゾラアミドで１０．５４分、アミノベンゾラアミドで１２．３２分、７で８．７６分、８で４．１２分、５ｂで６．５０分、５ｃで６．２７分であった。溶離液は吸光度を継続的に監視した（アセタゾラミドは２５４ｎｍで、他のスルホンアミド類の場合には２７０−３１０ｎｍ範囲の波長で）。
分光光度法的に；アビジン、エッチ等（Abdine, H. et al）、ジャーナルオブアソシエーションオフィシャルアナリティカルケミストリー（J. Assoc. Off. Anal. Chem.）、１９７８年、６１巻、６９５−７０１頁）のｐＨ誘導分光光度分析の変形を用い、例えばアセタゾラミドではそれぞれ２６０ｎｍと２９２ｎｍで、スルファニルアミドではそれぞれ２２５ｎｍと２６５ｎｍで作業した。各阻害剤の標準液を膜貫通性実験に用いたものと同じ緩衝液で作成した。
細胞培養；ＭＤＣＫ細胞とヒーラ細胞、更にはそれらの形質移入誘導体を、以前に記述のように（スバストーバ、イー等（Svastova, E., et al.）、エクスペリメンタルセルリサーチ（Exp. Cell Res.）、２００３年、２９０巻、３３２−３４５頁）２２．４ｍＭ重炭酸緩衝液で緩衝し栄養補助食品含有の１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（バイオウイテッカー（BioWhittaker）、ベルビールス（Verviers）、ベルギー（Belgium））を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で成長した。標準的実験条件を維持するために、ナプコ（Napco）７０００恒温器で発生する低酸素状態（酸素２％、炭酸ガス５％でバランスは窒素）に移す２４時間前に、細胞は常に６ｃｍのシャーレ当たり密度０．８―１ｘ１０^６で培地３ｍｌに蒔いて、更に４８時間（異なるように記述してない場合）成長した。正常酸素圧状態の平行シャーレを炭酸ガス５％を有する空気でインキュベートした。各実験終了時直後にイフセット（ＩＦＳＥＴ）ホットラインカップフェット（Hot-Line CupFET）ｐＨセンサーを有する携帯用アーガス（ARGUS）ｐＨメーター（セントロン（Sentron）、ローデン（Roden）、オランダ（Netherlands））を用いて培地のｐＨを測定し、次いでこの培地を回収して標準アッセイキット（シグマ（Sigma）、セントルイス（St. Louis）、ミズーリ（MO））により乳酸含量決定し、生成培養物の比較が可能なことを保証するよう細胞数を数え、平行シャーレは免疫蛍光法で処理するか又は免疫沈降法及び／又は免疫ブロット法用に抽出した。
細胞のスルホンアミド処理；スルホンアミド類を２０％ＤＭＳＯを含むリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に１００ｍＭ濃度に溶解し、細胞に添加する直前に所望最終濃度に培地で希釈した。スルホンアミド類処理開始直後に、この細胞を低酸素状態に移し４８時間インキュベートした。平行培地は正常酸素圧状態で同じ時間維持した。実験終了時に培地のｐＨを上記のように測定し、ＰＢＳで三回洗浄した生細胞との蛍光スルホンアミド５ｃの結合を、２０倍のプランフオル（PlanFluor）対物レンズを備えたニコン（Nikon）Ｅ４００落射蛍光顕微鏡で見て写真を撮った。画像をニコンクールピックス（Nikon Coolpix）９９０で取得した。
ＣＡ ＩＸ変異体のクローン作成と形質移入；Ｎ末端プロテオグリカン（ＰＧ）ドメイン又は中央ＣＡドメインのいずれかが欠けるＣＡ ＩＸ欠失変異体のクローン形成を記載のように実行した（ザットビコーバ、エム等（Zat'ovicova, M. et al）、ジャーナルオブインミュノロジカルメソッド（J. Immunol. Methods）、２００３年、２８２巻、１１７−１３４頁）。構造的にＣＡ ＩＸタンパク質又はその変異形態を発現するＭＤＣＫとヒーラ細胞株は、ジーンセラピーシステム（Gene Therapy Systems）（サンジエゴ（San Diego）、カルフォルニア（CA））のジーンポーター（GenePorter））ＩＩ形質移入キットを用いて、各組み替えプラスミドｐＳＧ５Ｃ−ＣＡ ＩＸ、ｐＳＧ５Ｃ−ΔＣＡ及びｐＳＧ５Ｃ−ΔＰＧとｐＳＶ２neoプラスミドとを１０：１の比で同時導入して得た。形質移入細胞はＧ４１８（ライフテクノロジー（Life Technologies）、ゲイサーバーグ（Gaithersburg）、メリーランド（MD））５００−１０００μｇ／ｍｌ存在下で選択に付し、クローンし、ＣＡ ＩＸ発現を試験し、拡大した。クローン変異物の影響を除くために、各ＣＡ ＩＸ形態を発現する少なくとも三つのクローン株細胞を分析した。空ｐＳＧ５ＣとｐＳＶ２neoで同時導入し、同様の選択とクローン形成手順に付した細胞を負の対照として用いた。
間接免疫蛍光法；カバーガラス上で成長した細胞を−２０°Ｃで氷冷メタノールで５分間固定した。１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＰＢＳ−ＢＳＡ）含有ＰＢＳで３７°Ｃで３０分インキュベートして非特異的結合を遮断した。この細胞をプロテオグリカン（ＰＧ）ドメインを目指すＣＡ ＩＸ特異的単クローン抗体Ｍ７５（（ザットビコーバ、エム等（Zat'ovicova, M. et al）、ジャーナルオブインムノロジカルメソッド（J. Immunol. Methods）、２００３年、２８２巻、１１７−１３４頁）、又はＣＡドメインを目指すＣＡ ＩＸ特異的単クローン抗体Ｖ／１０（（ザットビコーバ、エム等（Zat'ovicova, M. et al）、ジャーナルオブインミュノロジカルメソッド（J. Immunol. Methods）、２００３年、２８２巻、１１７−１３４頁）含有の雑種細胞腫培地で３７°Ｃで一時間インキュベートし、ＰＢＳ−ＢＳＡで四回洗浄し、フルオレセインチオシアネート（ＦＩＴＣ）複合の抗マウス免疫グロブリン（ＩｇＧ）（ベクターラボラトリー（Vector Laboratories）、バーリンゲーム（Burlingame）、カルフォルニア（CA））でインキュベートし、以前のように洗浄した。最後に細胞をシティフルオール（Citifluor）（エイガーサイエンティフィック（Agar Scientific）、エゼックス（Essex）、英国（UK））で培地を乗せるスライドにマウントし、ニコン（Nikon）Ｅ４００顕微鏡で見て写真に撮った。
免疫ブロット；細胞単層を冷ＰＢＳで二回すすぎ、プロテアーゼ阻害剤のコンプリート混合物（ローチェダイアグノスティック社（Roche Diagnostics GmbH）、マンハイム（Mannheim）、ドイツ（Germany））含有の氷冷ＲＩＰＡ緩衝液（ＰＢＳ中に１％のトリトンＸ−１００（Triton X-100）と１％のデオキシコール酸塩）に３０分間氷上で可溶化した。抽出物を回収し、４°Ｃで１０分間１５０００ｒｐｍで遠心分離にかけて清澄にし、−８０°Ｃで保存した。抽出物のタンパク質濃度をＢＣＡタンパク質検定用試薬（ピアース（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（IL））を用いて定量した。全細胞抽出物（タンパク質５０μｇ／レーン）をそれぞれ還元条件と非還元条件下で、１０％ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）ゲルで分離した。次いでタンパク質をＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）膜（アメルシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、リトルチャルフォントバッキングハムシャイアー（Little Chalfont Buckinghamshire）、英国（UK））に移した。ＰＢＳ中に０．２％ノニデット（Nodit）Ｐ４０を有する５％脱脂粉乳で遮断後、この膜を単クローン抗体（MAbs）（不希釈雑種細胞腫培地）で精査し、洗浄し、１／７５００に希釈した二次抗マウスＨＲＰ接合ブタ抗体（セバファルマ（Sevapharma）、プラハ（Prague）、チェコ共和国（Czech Republic））で処理した。タンパク質バンドをＥＣＬキット（アメルシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech）、リトルチャルフォントバッキングハムシャイアー（Little Chalfont Buckinghamshire）、英国（UK））を用いて増強化学発光により可視化した。
細胞のビオチン化と免疫沈降；細胞を氷冷緩衝液Ａ（２０ｍＭ炭酸水素ナトリウム、０．１５Ｍ食塩、ｐＨ８．０）で洗浄し、ＮＨＳＬＣ−ビオチン（ピアース（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（IL））１ｍｇ含有の緩衝液Ａで４°Ｃで６０分間インキュベートした。ビオチン化後細胞を緩衝液Ａで五回洗浄し、上述のようにＲＩＰＡで可溶化した。雑種細胞腫培地１ｍｌ中の単クローン抗体Ｖ／１０を、室温で２時間プロテインＡ−セファローズ（Protein A-Sepharose）（ファルマシア（Pharmacia）、ウプサラ（Uppsala）、スエーデン（Sweden））の５０％懸濁液２５μｌと結合した。ビオチン化細胞抽出物（２００μｌ）をプロテインＡ−セファローズ（Protein A-Sepharose）の５０％懸濁液２μｌで前もって清澄にし、次いで結合単クローン抗体（ＭＡｂ）に添加した。プロテインＡ−セファローズ（Protein A-Sepharose）に回収した免疫複合体を洗浄し、２−メルカプトエタノール有りと無しのレムリ負荷緩衝液中で５分間沸騰し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（１０％）電気泳動により分離した。その後タンパク質をＰＶＤＦ膜に移し、ペルオキシダーゼ複合化ストレプトアビジン（１／１０００、ピアース（Pierce）、ロックフォード（Rockford）、イリノイ（IL））で明らかにし、次いで増強化学発光を行った。
ＣＡ阻害
図式３に示した幾つかの好ましい化合物５a−５ｋによるアイソザイムＩ， ＩＩ及びＩＸに対する阻害データは表１に報告する（カーリファ、アールジー（Khalifah, R.G.）、ジャーナルオブバイオロジカルケミストリー（J. Biol. Chem.）、１９７１年、２４６巻、２５６１−２５７３頁）。
以下の図式２で示した幾つかの標準阻害剤のデータも、本発明者のグループが以前に報告した化合物と同様に比較のために示す。
図式３

表１
アイソザイムＩ，ＩＩ及びＩＸに対する本論文に報告の蛍光スルホンアミド５と標準ＣＡ阻害剤の阻害データ
＊ 報告値の５−１０％範囲の誤差（三つの異なる分析から）
a 炭酸ガス水和法によるヒト（クローン化）アイソザイム；ｂ炭酸ガス水和法によるヒトクローン化アイソザイムの触媒ドメイン
生体外研究で用いた４−アミノエチルベンゼンスルホンアミド７（バロー、ディ等（Vullo, D., et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２００３、１３巻、１００５−１００９頁）とホモスルファニルアミドの２，４，６−トリメチルピリジニウム誘導体８（スコッザファーバ、エイ等（Scozzafava, A, et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、４３巻、２９２−３００頁（２０００）；パストレコーバ、エス等（Pastorekova, S. et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、２００４、１４巻、８６９−８７３頁）のデータも又示す。
化合物１−１１は炭酸脱水酵素アイソザイムＩ、ＩＩ（細胞質ゾル型）とＩＸとＸＩＩ（膜貫通局在化した腫瘍関連アイソフォーム）のインビトロ阻害剤として試験した（表２）。これら化合物は腫瘍関連アイソザイムＩＸとＸＩＩの優れた阻害剤（Ｋ_Ｉ−ｓはそれぞれＣＡ ＩＸに対して６−４６ｎＭ、ＣＡ ＸＩＩに対して３−１８ｎＭの範囲）であるが、同時に広範囲の細胞質ゾルアイソザイムＩとＩＩには効果の低い阻害剤（Ｋ_Ｉ−ｓはアイソフォームＣＡ Ｉ対して４１０−１９００ｎＭ、ＣＡ ＩＩに対して１３−７６ｎＭの範囲）であることが観察される。
表２
アイソザイムＩ，ＩＩ、ＩＸ及びＸＩＩに対するここで報告した新規蛍光スルホンアミド類１−１１の阻害データ
＊＊ 報告値の５−１０％範囲の誤差（三つの異なる分析から）
a 炭酸ガス水和法によるヒト（クローン化）アイソザイム；ｂ炭酸ガス水和法によるヒトクローン化ドアイソザイムの触媒ドメイン
赤血球細胞膜経由の生体外貫入
ミリモル溶液の阻害剤による種々の期間（３０−６０分で開始し４８時間まで）のヒト赤血球インキュベート後の赤血球中のスルホンアミド類のレベルを表３に示す。その方法はゴマー、ジーエス（Gomaa, Z.S.）、バイオメディカルクロマトグラフィ（Biomed. Chromatogr.）、１９９３年、７巻、１３４−１３５頁；アブジン、エッチ等（Abdine, H., et al.）、ジャーナルオブアソシエーションオフィシャルアナリティカルケミストリー（J. Assoc. Off. Anal. Chem.）、１９７８年、６１巻、６９５−７０１頁、ウイストランド、ピージェイ（Wistrand, P.J.）、リンドキスト、エイ（Lindquist, A.）、炭酸脱水酵素―生化学と遺伝学から生理学と臨床医学（in Carbonic Anhydrase-From Biochemistry and Genetics to Physiology and Clinical Medicine）、ボットレ、エフ（Botre, F）、グロス、ジー（Gros, G.）、ストリー、ビーティ（Storey, B.T.）編、ヴィシーエッチ（VCH）、ワインハイム（Weinheim）、１９９１年３５２−３７８頁に開示されている。
表３
血液１０ｍＬをスルホンアミド溶液（５ｍＭトリス緩衝液中の３ｍＭのスルホンアミド４、ｐＨ７．４）に暴露後３０分と６０分での赤血球中のスルホンアミドＣＡ阻害剤レベル（μＭ）。スルホンアミド濃度はＨＰＬＣと電子分光法（ＥＳ）の二つの方法で決定した。詳細は実験の部参照。
＊標準誤差（三つの測定から）＜５％；a ＨＰＬＣ法^１８；ｂ 電子分光法（アブジン、エッチ等（Abdine, H., et al.）、ジャーナルオブアソシエーションオフィシャルアナリティカルケミストリー（J. Assoc. Off. Anal. Chem.）、１９７８年、６１巻、６９５−７０１頁）。
低酸素状態の細胞外ｐＨのＣＡ ＩＸ仲介酸性化とスルホンアミド類によるその阻害
低酸素圧（Ｈ、２％酸素）／正常酸素圧（Ｎ、２１％酸素）でのｐＨｅ値決定に用いたＣＡ ＩＸ形質移入のＭＤＣＫ細胞とニセ形質移入対照を、ＣＡ ＩＸ単クローン抗体（Ｍａｂ）Ｍ７５（ザトビコーバ、エム等（Zat'ovicova, M. et al.）、ジャーナルオブイムノロジカルメソッド（J. Immunol. Methods）、２００３年、２８２巻、１１７−１３４頁）を用いて免疫ブロットにより分析した。形質移入のＭＤＣＫ細胞を免疫蛍光法で分析し、一定培地容積で成長した細胞中のｐＨｅ値と乳酸濃度を求めた。三つの異なるクローンの形質移入体と各クローンに対する三つの平行シャーレについて五つの独立な実験を行った。結果を平均値と標準偏差を示すヒストグラムに図示する。
一定培地容積で成長した細胞中のｐＨｅ値と乳酸濃度を図１に示す。
三つの異なるスルホンアミドＣＡ Ｉ（該発明に従う蛍光誘導体５ｃを含む）の低酸素のＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞との結合とそのｐＨｅに対する効果を図２に示す。
スルホンアミド８，７及び５ｃ（濃度０．１ｍＭと１ｍＭで）を低酸素状態に移す直前にそれぞれＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞に加え、４８時間後にｐＨｅを測定した。各阻害剤に対して一試料につき少なくとも三つの平行シャーレと共に三つの独立な実験を行った。
腫瘍ヒーラ（ＨｅＬａ）とシーハ（ＳｉＨa）子宮頚癌細胞の蛍光スルホンアミド５ｃによる処理と腫瘍ｐＨに対するその効果を図３に示す。
ヒーラとシーハ子宮頚癌細胞をそれぞれ１ｍＭの５ｃ不在又は存在下のいずれかで正常酸素圧と低酸素圧で４８時間インキュベートした。対照シャーレに対し処理シャーレで測定したｐＨ値の平均差を、指示標準偏差と共にヒストグラムに示す。実験は各試料に対して少なくとも三つの平行シャーレを用いて三回繰り返した。
表１のデータは本発明化合物の細胞質ゾルアイソザイムｈＣＡ ＩとｈＣＡ ＩＩと同様に膜貫通の腫瘍関連アイソザイムｈＣＡ ＩＸに対する阻害物性、更には標準的臨床使用阻害剤（アセタゾラミドＡＡＺ、メタゾラミドＭＺＡ、エトキシゾラミドＥＺＡ，ジクロルフェナミドＤＣＰ及びインジスラムＩＮＤ）又は腫瘍関連ＣＡ類（７や８のような）を標的にする本発明者により以前研究された幾つかのスルホンアミドの阻害物性を示す（バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２００３、１３巻、１００５−１００９頁；スコッザファーバ、エイ等（Scozzafava, A, et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、４３巻、２９２−３００頁（２０００）；パストレコーバ、エス等（Pastorekova, S. et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、２００４、１４巻、８６９−８７３頁）。表１のデータに関して以下のことに留意する必要がある。（i）蛍光スルホンアミド類５は遅速細胞質ゾルアイソザイムｈＣＡ Ｉに対して中程度乃至弱い阻害剤の挙動を示し、阻害定数は４８０−１５００Ｎｍの範囲である。このアイソザイムは実際にｈＣＡ ＩＩ又はｈＣＡ ＩＸに比べてスルホンアミド類により低い親和性を有することが良く知られている（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、シーアールシープレス（CRC Press）、（テイラーアンドフランシスグループ（Taylor and Francis Group））、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（Florida）、２００４年、１−３６３頁及びその記載文献）。従ってこれらの蛍光スルホンアミド類は、このアイソザイムに対して臨床使用化合物ＡＺＡ、ＭＺＡ又はＤＣＰと類似の親和性を示す一方、エトキシゾラミドＥＺＡとインジスラムＩＮＤは遙かに強力なＣＡ Ｉ阻害剤（Ｋ_Ｉ−ｓは２５−３１Ｎｍの範囲）である。化合物７と８は又穏やかなｈＣＡ Ｉ阻害物性を示す（表１）。（ii）蛍光スルホンアミド類５は主要細胞質ゾルアイソザイムｈＣＡ ＩＩに対して有効な阻害剤として非常に緻密な挙動を示し、Ｋ_Ｉ−ｓは２７−５２Ｎｍの範囲である。
実際ｈＣＡ ＩＩとスルホンアミドとの付加物の幾つかのＸ線結晶研究では、芳香族／複素環スルホンアミド骨格に付着した尾部が、アミノ酸残基と中間と同様に活性部位入り口両者で広く接触し、その結果この酵素に対するナノモル親和性をもたらす（バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２００４、１４巻、２１７−２２３頁；ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、２００４年、４７巻、５５０−５５７頁；ジャーナルオブエンザイムインヒビションメディシナルケミストリー（J. Enz. Inhib. Med. Chem.）、２００３年、１８巻、３０３−３０８頁；バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２００３、１３巻、２７５９−２７６３頁；バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Lett.）、２００４、１４巻、２３５７−２３６１頁）。従ってこのシリーズのスルホンアミド類で最も良いｈＣＡ ＩＩ阻害剤はアミノベンゾラミド誘導体５ｋとスルファニリルホモスルファニルアミド５ｊであるが、上述のように他の化合物は５ｊと５ｋよりほんの僅か阻害性が低いだけである。これらの化合物は臨床使用誘導体に比し効果の低いＣＡ ＩＩ阻害剤で、通常８−１５Ｎｍ範囲のＫ_Ｉ値Ｉを示す（ＤＣＰはＫ_Ｉが３８Ｎｍとより効果の低い阻害剤である）。簡単な誘導体の７と８は又効果がより低いＣＡ ＩＩ阻害剤である。（Ｋ_Ｉ−_Ｓは５０−１６０Ｎｍの範囲を有する。）（iii）蛍光スルホンアミド類５はＫ_Ｉ−_Ｓは１６−３５Ｎｍ範囲を有する腫瘍関連アイソザイムＣＡ ＩＸに対して非常に良い阻害性を示す。ＣＡ ＩＩで観察された状態と同様に、該研究に含まれる広範囲な構造に対する活性での重要な変化はなく、上記の説明で説明できる。しかしこれらの化合物はｈＣＡ ＩＩ阻害剤より良いｈＣＡ ＩＸ阻害剤として作用し、ＣＡ ＩＸ阻害剤に基づく可能な薬はＣＡ ＩＩ、ＣＡ ＩＶ又はＣＡＶのような他の広範囲なＣＡではなく、標的のガン関連アイソザイム（即ちＣＡ ＩＸとＣＡ ＸＩＩ）と出来るだけ多く結合する必要があるので、これは目覚ましい発見であることを指摘するのは重要である。多分これは本発明者が既に以前報告した（バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、２００４、１４巻、８６９−８７３頁）ように、ｈＣＡ ＩＸ活性部位が細胞質ゾルアイソザイムｈＣＡ ＩＩの活性部位より大きい云う事実による。又これらの新規スルホンアミド類５のＣＡ ＩＸ阻害性は臨床試験での抗腫瘍スルホンアミドであるインジスラムを含む臨床使用スルホンアミド類のＣＡ ＩＸ阻害性と同範囲であることを指摘する必要がある。
赤血球細胞膜経由の生体外貫入
インキュベート時間３０分、６０分及び４８時間後赤血球（高濃度のアイソザイムＩとＩＩを含有する、即ち１５０μＭのｈＣＡ Ｉと２０μＭのｈＣＡ ＩＩを含有するが、膜結合ＣＡ ＩＶ又はＣＡ ＩＸを含まない；炭酸脱水酵素―生化学と遺伝学から生理学と臨床医学（Carbonic Anhydrase-From Biochemistry and Genetics to Physiology and Clinical Medicine）、ボットレ、エフ（Botre, F）、グロス、ジー（Gros, G.）、ストリー、ビーティ（Storey, B.T.）編、ヴィシーエッチ（VCH）、ワインハイム（Weinheim）、１９９１年３５２−３７８頁）中のスルホンアミド５ｂ、５ｃ、７，８、ＡＺＡ及びＭＺＡのレベルを、これら化合物の生体膜経由貫入性を調べるために測定した。ｈＣＡ ＩＸは細胞外に露出した活性部位を有する膜貫通タンパク質なので、膜非透過性誘導体（又は透過性減少の誘導体）は、細胞質ゾルＣＡアイソザイムのＣＡ Ｉ又はＣＡ ＩＩではなくｈＣＡ ＩＸの選択的阻害をもたらす。これはこの種化合物に属する将来の薬で非常に望ましい物性と考えられる。本発明者は以前に既に８が代表物である正電荷を持つピリジニウム置換スルホンアミド類は、古典的スルホンアミド類が非極性で非荷電である（酵素活性部位と結合する種であるイオン化スルホンアミド類と平衡しているが）という事実により容易に膜を横切る古典的スルホンアミド類とは対照的に、実際膜非透過であることを示した（スコッザファバ、エイ等（Scozzafava, A, et al.）、ジャーナルオブメディシナルケミストリー（J. Med. Chem.）、４３巻、２９２−３００頁（２０００）；パストレコーバ、エス等（Pastorekova, S. et al.）、バイオオーガニックメディシナルケミストリーレター（Bioorg. Med. Chem. Let.）、２００４、１４巻、８６９−８７３頁；スプラン、シーティ（Supuran, C.T. et al.）、ジャーナルオブエンザイムインヒビションメディシナルケミストリー（J. Enz. Inhib. Med. Chem.）、２００４年、１９巻、２６９−２７３頁）。
実際非荷電のスルホンアミドのＡＺＡ、ＭＺＡ及びアミノエチルベンゼンスルホンアミド７は生体膜に容易に貫入し、事実上１時間後には赤血球（ＲＢＣ）を飽和することが観察される（表３）。４８時間後にはＲＢＣ内にこれら三つのスルホンアミド類が同レベル（実験誤差限界内）で観察された。反対にピリジニウムの荷電化合物８はＲＢＣ内に非常に少量のみ検出され、明らかに陽イオンの性質により膜に貫入出来ないことが示された。４８時間の長いインキュベート時間後でさえ、痕跡量だけの陽イオンスルホンアミドがＲＢＣ内に存在することが、細胞溶解物でその同定に用いる二つの分析法で証明され、互いに良く一致した（非常に少量の検出スルホンアミド誘導体は微量の膜類による溶解物汚染によるかもしれない（表３））。ここで研究したフルオレセインスルホンアミド誘導体５ｂと５ｃは、暴露時間３０−６０分で膜透過性の減少を示し、暴露時間４８時間後では僅かに透過し易くなった。これらの発見はこれら化合物にカルボン酸成が存在することと、発明者の実験条件（ｐＨ７．４）で、大部分の蛍光スルホンアミドは陽イオンスルホンアミド８と同様に陰イオンのカルボン酸型であるという事実で説明できる。これらカルボン酸塩はなお対応する膜透過性の酸―中性分子―と化学平衡にあり、これによりインキュベート４８時間後に何故いくらかのスルホンアミドは膜を横切るが説明できる（一方８はいずれの中性分子とも平衡ではなく、これがＲＢＣでインキュベート４８時間後でも何故化合物が膜を横切れない理由である）。これらのレベルは未だ非常に小さく、化合物５がｈＣＡ ＩＩよりｈＣＡ ＩＸへより良い親和性を示す事実を考えると、インビボでガン関連の膜貫通アイソザイムＩＸはこれら化合物により大部分阻害されていると仮定する。
低酸素状態での細胞外ｐＨのＣＡ ＩＸ仲介酸性化とスルホンアミド類によるその阻害
腫瘍細胞でのＣＡ ＩＸの発現は、嫌気代謝の種々の成分と酸放出経路と同時に低酸素により強く誘導される（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁）。これによりＣＡ ＩＸ寄与の識別を複雑になり、ｐＨｅに全体変化を生ずる。それ故本発明者はモデルとして自身のＣＡ ＩＸは含有せず、ヒトＣＡ ＩＸタンパク質を構成的な形で発現するために安定に形質移入したＭＤＣＫ不死化イヌ腎臓上皮細胞を用いた。免疫ブロット分析で示されるようにＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ形質移入体でのＣＡ ＩＸのレベルは、酸素２％で４８時間維持した低酸素細胞と酸素２１％でインキュベートした正常酸素圧細胞と同程度であった（図１a）。免疫蛍光分析では低酸素細胞での染色膜は（スバストーバ、イー等（Svastova, E. et al.）、エクスペリメンタルセルリサーチ（Exp. Cell. Res.）、２００３年、２９０巻、３３２−３４５頁）で記載のように、細胞間接触の低酸素誘引による攪乱でより不明確であるが、ＣＡ ＩＸは正常酸素圧細胞と低酸素圧細胞両者表面に主として局在化した（図１ｂ）。培地ｐＨ測定は正常酸素圧対応物と比較すると、低酸素状態でのインキュベートよりＣＡ ＩＸ陽性細胞培養液と同様にＣＡ ＩＸ陰性細胞培養液で予期される細胞外酸性化をもたらした（図１ｃ）。しかし低酸素細胞を相互比較すると、ｐＨｅはＣＡ ＩＸ含有細胞では顕著に減少することが明らかになった。ＣＡ ＩＸ陽性細胞に対するＣＡ ＩＸ陰性細胞のｐＨｅ値間で、僅かな差が正常酸素圧で見られた。ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞での定常的な低酸素非依存のＣＡ ＩＸレベルを考慮すると、この発見は低酸素がＣＡ ＩＸの触媒性能を活性化し、ｐＨｅ酸性化の増加をもたらすことを示唆する。
低酸素誘引の酸性化が乳酸生成増加で起こる可能性を除外するために、本発明者はｐＨｅを測定し、ＣＡ ＩＸ陰性形質移入体とＣＡ ＩＸ陽性形質移入体両者での培地中の対応乳酸濃度を測定した（図１ｄ）。低酸素状態で１６時間維持した細胞は、正常酸素圧の平行培養液に比べｐＨｅ値には有意な差は示さなかった。両条件下でＣＡ ＩＸ形質移入細胞培地は、対照ニセ形質移入細胞の培地よりやや低いｐＨを有した（図１ｄ）。４８時間後正常酸素圧細胞のｐＨｅは、ＣＡ ＩＸを含有するか否かにかかわらず減少した。このｐＨｅの減少は明らかに乳酸の蓄積と連結し、その最終濃度はＣＡ ＩＸ陽性細胞とＣＡ ＩＸ阻害剤陰性細胞で同じであった。ＭＤＣＫニセ培養液の４８時間の低酸素処理は、平行の正常酸素圧細胞に比べ僅かなｐＨｅ減少をもたらす一方、ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞の培地は正常酸素圧の対応物よりかなり酸性が強かった。低酸素状態のニセ形質移入細胞で認められるｐＨｅの僅かな減少は、乳酸濃度増加に帰しその結果低酸素誘引の代謝変化をもたらすかもしれない。又相応の割合でのＣＡ ＩＸ発現細胞培地の酸性化に起因するのかもしれない。しかしＣＡ ＩＸ陽性細胞とＣＡ ＩＸ陰性細胞の４８時間培養液での乳酸生成には実質的な差はないので、残存ｐＨｅの減少はＣＡ ＩＸの触媒活性により説明出来るかもしれない。
ＣＡ ＩＸの酵素活性が酸性化増加の原因である場合には、酸性化はスルホンアミドにより遮断でき、良く理解された機構（炭酸脱水酵素―その阻害剤と活性化因子（Carbonic anhydrase-its inhibitors and activators）、シーアールシープレス（CRC Press）、（テイラーアンドフランシスグループ（Taylor and Francis Group））、ボカラトン（Boca Raton）、フロリダ（Florida）、２００４年、１−３６３頁及びその記載文献）で炭酸脱水酵素を効果的に阻害するであろう。更に蛍光スルホンアミド５ｃを用いて正常酸素圧又は低酸素圧のいずれかで４８時間インキュベートしたＣＡ ＩＸ陽性細胞とＣＡ ＩＸ陰性細胞両者の処理と蛍光分析を行った。５ｃが生じる蛍光信号は以前のデータと完全に一致して、低酸素ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞にのみ検出され、その正常酸素圧の対応物及び低酸素及び正常酸素圧のニセ形質移入対照では不在であった。この観察は５ｃが他のＣＡアイソフォームと相互作用せず、低酸素状態で活性化したＣＡ ＩＸとのみ結合することを示唆する。結局これらの結果はＣＡ ＩＸ活性が低酸素ＭＤＣＫ−ＣＡ ＩＸ細胞での培地酸性化に不可欠であり、この酸性化はスルホンアミド類によるＣＡ ＩＸ阻害により逆転すると云う確かな証拠を提供する。
ＣＡ ＩＸ仲介の酸性化現象が内在性ＣＡ ＩＸを発現する腫瘍細胞で何らかの意義があるか否かを知るために、本発明者はそれぞれヒーラ（HeLa）とシーハ（SiHa）子宮頚癌細胞ののｐＨｅに対するスルホンアミド５ｃの効果を調べた。低酸素下では腫瘍細胞はＣＡ ＩＸを含むより高いレベルの複数ＨＩＦ−１対象物を協調的に発現した（セメンザ、ジーエル（Semenza, G.L.）、ネーチャーレビューオブキャンサー（Nature Rev. Cancer）、２００３年、３巻、７２１−７３２頁）。更に多くの成分の低酸素経路での活性及び血漿膜を横切るイオン輸送のような関連ｐＨ制御機構は、細胞内の中性ｐＨ維持のために異常に増加する（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁）。これにより正常酸素圧のヒーラ（HeLa）細胞とシーハ（SiHa）細胞に対する低酸素圧のヒーラ（HeLa）とシーハ（SiHa）細胞のｐＨｅ減少がかなり説明される（図３）。アシドーシスは５ｃにより減少したが、ＣＡ ＩＸ活性化は低酸素での多くの結果の一つに過ぎないと言う考えを支持する。更に５ｃはより高いレベルのＣＡ ＩＸを発現する低酸素圧のヒーラ（HeLa）細胞とシーハ（SiHa）細胞と結合するが、ＣＡ ＩＸ発現の減少した正常酸素圧の細胞とは結合しない。この蛍光阻害剤との結合能により示されたように、低酸素圧の腫瘍細胞で発現のＣＡ ＩＸは触媒的に活性であった。注目すべきは低酸素の細胞に対する蛍光阻害剤の活性化ＣＡ ＩＸとの排他的結合により、画像化目的、例えばポジトロンエミッショントモグラフィーでの低酸素腫瘍の可視化のために類似スルホンアミドベース化合物の使用という魅力的な可能性を提供する。更にＣＡ ＩＸ選択性スルホンアミド誘導体は、腫瘍微環境でｐＨｅを減少し、その結果腫瘍の攻撃性と薬物取り込みを減少するようにデザインした治療方針成分として働く可能性がある（モレキュラーメディシントゥデイ（Mol. Med. Today）、２０００年、６巻、１５−１９頁；クリニカルキャンサーリサーチ（Clin. Cancer Res.）、２００２年、８巻、１２８４−１２９１頁；タイチャー、ビーエイ等（Teicher, B.A., et al）、アンチキャンサーリサーチ（Anticancer Rese.）、１９９３年、１３巻、１５４９−１５５６頁）。

図１は低酸素（Ｈ、酸素２％）／正常酸素圧（Ｎ、酸素２１％）でのＣＡ ＩＸ形質移入のメイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）細胞とニセ形質移入対照のｐＨｅと乳酸濃度の値を示す。 図２は低酸素のメイディンダービーイヌ腎臓（ＭＤＣＫ）−ＣＡ ＩＸ細胞と三つの異なるスルホンアミドＣＡ Ｉ（該発明に従う蛍光性化合物５ｃを含む）との結合と、ｐＨｅに対するその効果を示す。 図３は蛍光性スルホンアミド５ｃによるヒーラ（ＨｅＬａ）とシーハ（ＳｉＨａ）子宮頚部癌処理と、腫瘍ｐＨに対するその効果を示す。

Claims (30)

1. 式（Ｉ）の化合物で
   A-(Q)_n-Ar-SO₂NHR （Ｉ）
   ここで
   Ａは蛍光染料成分であり、
   Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m又は-NH-CX-NH-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは酸素又は硫黄原子であり、ＲはＣ_１−Ｃ_４アルキレンであり、ｍは数０又は１であり、
   ｎは数０又は１であり、
   ＡｒはＣ_６−Ｃ_１０の芳香族基又は酸素、窒素又は硫黄原子からなる一群から選択の少なくとも一つのヘテロ原子含有複素環芳香族基であり、該芳香族基及び複素環芳香族基は任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換され、
   Ｒは水素原子又はB-SO₂NH₂基であり、ここでＢは（Ｃ_１−Ｃ_４）_ｒアルキレン芳香族基又は（Ｃ_１−Ｃ_４）_ｒアルキレン複素環芳香族基であり、ここでｒは０又は１であるが
   ４−スルファモイルフェニルメチルチオウレイドフルオレセインを除き、
   それらの医薬容認水和物、溶媒和物及び塩である式（Ｉ）の化合物。
2. Ａｒは任意に少なくとも１つのハロゲン原子で置換されたフェニルで、Ｒは水素原子である請求項１に記載の化合物。
3. Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは硫黄原子であり、ｍは数０であり、Ａｒは任意に少なくとも一つのハロゲン原子で置換されたフェニルであり、Ｒは水素原子である請求項２記載の化合物。
4. ＲはB-SO₂NH₂基であり、ここでＢは芳香族基及び複素環芳香族基である請求項１に記載の化合物。
5. Ｑは-NH-CX-NH-(R₁)_m基であり、ここでＸは硫黄原子であり、ｍは数０であり、Ａｒはフェニルであり、ＲはB-SO₂NH₂基であり、ここでＢは１，３，４―チアジアゾール−２−イルである請求項４に記載の化合物。
6. Ａがフルオレセイン残基である請求項１乃至請求項５のいずれか一項に記載の化合物。
7. ４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
   ４−スルファモイルフェニルエチルチオウレイドフルオレセイン、
   ２−ヨードー４−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
   ３−スルファモイルフェニルチオウレイドフルオレセイン、
   ４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセイン、
   ４−（５−スルファモイル−（１，３，４）チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルチオウレイドフルオレセイン
   からなる一群から選択の請求項１に記載の化合物。
8. ４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ３−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ２−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ４−スルファモイルフェニルメチルウレイドフルオレセイン、
   ４−スルファモイルフェニルエチルウレイドフルオレセイン、
   ２−フルオロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ２−クロロ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ２−ブロモ−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ２−ヨード−４−スルファモイルフェニルウレイドフルオレセイン、
   ４−（４−スルファモイルベンジルスルファモイル）フェニルウレイドフルオレセイン、
   ４−（５−スルファモイル（１，３，４）チアジアゾール−２−イルスルファモイル）フェニルウレイドフルオレセイン
   からなる一群から選択の請求項１に記載の化合物。
9. Ａが上に定義した式（ＩＩ）A-NH₂の化合物と、Ｘ，Ｒ_１、ｍ及びＡｒが上に定義した式（ＩＩＩ）XCN-(R₁)_m-Ar-SO₂NHRの化合物との反応を含む請求項１の化合物の製剤プロセス。
10. ＡとＸが上定義した式（ＩＶ）A-NCXの化合物と、Ｒ_１、ｍ及びＡｒが上に定義した式（Ｖ）-NH₂-(R₁)_m-Ar-SO₂NHRの化合物との反応を含む請求項１に記載の化合物の製剤プロセス。
11. 低酸素腫瘍識別用プローブとしての請求項１乃至請求項８の化合物の用途。
12. 該腫瘍が炭酸脱水酵素ＩＸ陽性である請求項１１に記載の用途。
13. 該識別をポジトロンエミッショントモグラフィーで実施する請求項１１又は１２のいずれか一項に記載の用途。
14. 生体物質での炭酸脱水酵素検出用試薬の製剤のために請求項１乃至請求項８の化合物の用途。
15. 該被験者がヒトである請求項１４に記載の用途。
16. 該炭酸脱水酵素が炭酸脱水酵素ＩＸである請求項１４又は１５に記載の用途。
17. 該検出をポジトロンエミッショントモグラフィーで実施する請求項１４乃至請求項１６のいずれか一項に記載の用途。
18. 薬物製剤のために請求項１−８に記載の化合物の用途。
19. 炭酸脱水酵素阻害作用を有する薬物製剤のために請求項１乃至請求項８に記載の化合物の用途。
20. 該薬物が脱水酵素アイソザイムＩＸに対して選択的阻害活性を有する請求項１９に記載の用途。
21. 該薬物が低酸素腫瘍の治療に有効な請求項１９又は２０のいずれか一項に記載の用途。
22. 該薬物が低酸素腫瘍酸性化の逆転に有効な請求項１９乃至請求項２１のいずれか一項に記載の用途。
23. 該薬物が炭酸脱水酵素ＩＸ陽性腫瘍に有効な請求項１９乃至請求項２１のいずれか一項に記載の用途。
24. 該腫瘍が腎臓癌腫、乳癌腫、肺癌腫、頭頚部癌腫、神経膠腫、中皮腫、胃癌腫、結腸癌腫、胆道癌腫、膵臓癌腫、子宮癌種、子宮内膜癌腫、上皮扁平細胞癌腫／基底細胞癌腫からなる一群から選択した請求項１９乃至請求項２３のいずれか一項に記載の用途。
25. 該薬物を併用療法で用いる請求項１９乃至請求項２４のいずれか一項に記載の用途。
26. 該治療が抗ガン治療である請求項２５に記載の用途。
27. 少なくとも１つの医薬容認成分との混合物である請求項１乃至請求項８のいずれか一項の化合物を含む薬剤組成。
28. 請求項１乃至請求項８のいずれか一項の化合物を含む蛍光試薬。
29. 請求項１乃至請求項８のいずれか一項の化合物を含む診断キット。
30. 請求項１乃至請求項８のいずれか一項の化合物を含む腫瘍画像化用組成。