JP2008541737A

JP2008541737A - マイクロｒｎａ発現の変化した細胞を標的とすること

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Publication number: JP2008541737A
Application number: JP2008513869A
Authority: JP
Inventors: マイケルマイケル，ゼノン
Original assignee: サウザーンアデレードヘルスサービス−ファインダーズメディカルセンター
Priority date: 2005-06-03
Filing date: 2006-06-02
Publication date: 2008-11-27
Also published as: AU2006254732A1; CA2610702A1; EP1904110A1; EP2377559A1; WO2006128245A1; EP1904110A4

Abstract

本発明は細胞の発現を調節する方法に関する。この方法は、細胞内のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が結果として細胞の発現を調節するのに十分な、細胞における核酸の活性及びもしくは濃度のレベルに至る、細胞の発現を調節する能力を有する核酸を細胞内に導入する段階を含むものであって、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位を含む。
【選択図】図１

Description

本発明は、マイクロRNA活性の変化した細胞の発現を調節する方法、およびマイクロRNA活性の変化に関連した疾患（disease）、異常（condition）または状態（state）の予防および／もしくは治療の方法に関する。

本発明はまた、マイクロRNAの結合部位を有する核酸、そのような核酸を含む細胞および動物、およびその核酸を含む組成物に関する。
この特許出願は2005年6月3日、提出されたUnited States Provisional Patent Application
No.60/687,547から優先権が請求されている。

標的となる遺伝子の発現は、癌のような細胞増殖性疾患を含む、様々な疾患に有効な治療法の開発における最も困難な最も重要な目標の一つである。このような治療法の最終的な目的は、徐放性、持続性、および周囲の健康な組織が治療薬の作用によって比較的影響されずに残っているような治療薬の部位特異性発現を可能にすることである。

しかしながら、本遺伝子治療プロトコールの１つの重大な限界は、治療用遺伝子の発現を制御することができないこと、詳細には適切な組織あるいは細胞型に送達された遺伝子の発現を制限することができないことである。この点において、一部の標的組織において薬剤を特異的に発現させるためには組織特異性プロモーターが適切であるかもしれないが、プロモーターから非疾患細胞も発現する可能性もあるため、癌のような疾患に対してはあまり有用でないことが立証されている。それ故、治療用核酸の発現を標的とする新しい方法を確認することが必要である。

近年、マイクロRNA（miRNA）として知られる短い20〜22個のヌクレオチドRNA分子が、様々な真核系における遺伝子発現を制御するとされている。Caenorhabditis elegansにおいて、miRNAは異色症の遺伝子の翻訳を制御することによって仮性発現の段階間の転位を調整する。Arabidopsisにおける個々のmiRNAが、種々の推定上の転写因子をコードする転写情報の切断を誘導することが立証されている。ショウジョウバエbantam遺伝子は細胞増殖および前アポプトーシス遺伝子hidを制御するmiRNAをコードする。さらに近年には、ヒトmiR143が脂肪細胞の分化を制御することが示されている。

miRNAは、ヘアピン構造を作るためにヒダをつくり、RNaseIII酵素のDicerファミリーの基質として働くより大きな転写情報から形成される。miRNAは真核細胞における内因性遺伝子の発現を抑えるために用いられることもある、実験系であるRNA干渉（RNAi）とこのプロセスを共有する。Dicerの切断産物は、一つの鎖がRNA誘導性サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれるリボヌクレオタンパク複合体内に保持される短いdsRNA分子である。保持されたRNAは、miRNAとその標的との間の相補性の程度によって決まる、切断あるいは翻訳の干渉のいずれかによって不活性化された相補的mRNA配列に対してこの複合体を標的とするための指標として作用する。

本発明はマイクロRNA濃度の変化によって細胞の発現を調節する方法に関しており、また本発明は、一部の疾患細胞が内因性マイクロRNAの発現レベルを変化させたこと、そしてこれらの細胞内のマイクロRNAの発現の変化を利用することによって治療的核酸の発現がこのような細胞を効果的に標的とする可能性があるということがわかってきたことに基づいている。

この文書の中の特許申請書類あるいは先行技術として記載された事柄に対する参考文献は、文書あるいは事柄が既知のものであったか、またはそれに含まれる情報があらゆる請求の優先権主張日においてよく見られる一般的な情報の一部であったという自認として用いられるべきではない。

マイクロRNA活性の変化した細胞の発現を調節する。

本発明は、細胞内のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が、結果として細胞の発現を調節するのに十分な細胞内の核酸の活性および／もしくは濃度のレベルに至る、細胞の発現を調節する方法を可能にするものであって、この方法は細胞の発現を調節する能力を有した核酸を細胞内に導入する段階を含み、この核酸はマイクロRNAの結合の標的部位を含む。

本発明により、さらに細胞の発現を調節する能力を有した核酸、即ちマイクロRNAの結合部位を含めた核酸が得られる。

本発明は、さらに他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なる作用を有するマイクロRNAの結合部位を人工的に生じさせることを含む核酸を提供する。

本発明は、さらに同様の非癌細胞に比較して癌細胞においてマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下する、マイクロRNAの結合部位を含む外因性核酸を含む癌細胞を提供する。

本発明は、さらに癌細胞、即ちマイクロRNA結合の標的部位を含む外因性核酸を含む癌細胞を含む動物を提供する。

本発明は、さらに標的細胞のマイクロRNAの活性が結果として被験者の標的細胞の発現を調節するのに十分な核酸の作用レベルに至る、被験者の標的細胞に関連した疾患（disease）、異常（condition）または状態（state）の予防および/もしくは治療の方法を可能にするものであって、この方法は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を被験者の細胞内に導入する段階を含み、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位を含む。

本発明は、さらに癌細胞あるいは前癌細胞におけるマイクロRNA活性および／もしくは濃度の変化を確認する方法を可能にするものであって、この方法は、癌細胞あるいは前癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定すること、また非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定する段階；そして、非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルに比較して、癌細胞におけるリポーター核酸の発現の増大による癌細胞におけるマイクロRNA活性の低下を確認する段階、の段階を含む。

本発明は、さらに癌細胞に発現する核酸の濃度を調節する方法を可能にするものであって、この癌細胞は同様の非癌細胞に比較してマイクロRNAの活性および/もしくは濃度が変化したものであり、前記の方法は細胞に発現するはずである核酸内にマイクロRNAの結合の標的部位を導入する段階を含む。

本発明は癌細胞を含む多数の細胞が内因性マイクロRNAの発現レベルを変化させたということ、そしてこれらの細胞におけるマイクロRNA発現の変化を利用することによって、治療用核酸の発現がこのような細胞をより効果的に標的とする可能性があることを認識することに基づいている。

さらに、一部のマイクロRNAのレベルが細胞分化の間にまたは正常な発現プログラムの間に調節されることもわかってきており、それ故核酸の発現は、発現プログラムにおける特定の時期および/もしくはマイクロRNAのレベルが変化する時期にこれらの細胞を標的とする可能性がある。

この明細書全体にわたって用いられている様々な用語は当業者によって十分理解される意味を有する。しかしながら、容易に参照できるようにこれらの用語の一部をここで定義づける。

細胞の発現に関して明細書全体にわたって用いられているように「発現（development）」という用語は、現在の状態における細胞の持続性、あるいは正常な発現および/もしくは代謝プログラムおける細胞の持続性を意味すると理解すべきである。

この点において細胞の発現の調節が、例えば細胞の成長の阻害または休止、細胞死、または細胞が通過する正常な発現経路における変化という結果に至る可能性がある。あるいは、細胞発現の調節が例えば細胞の生存または救援、または細胞増殖という結果に至る可能性がある。

この明細書全体にわったって使用されているように「調節する（modulate）」という用語またはその変体は、このプロセスの作用におけるあらゆる変化（増加または減少）を意味すると理解すべきである。例えば、変化がプロセスの活性化、プロセスの阻害、プロセスの時期の変化あるいはプロセスが起こる確率の変化という結果に至る可能性がある。

この明細書全体にわたって使用されているように「核酸」という用語は、あらゆるオリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドを指していると理解すべきである。この核酸はDNAまたはRNAである可能性があり、1本鎖または2本鎖である可能性がある。この核酸はゲノム由来の、DNA由来の（即ちmRNA由来）、ウイルス由来の、あるいは合成の核酸を含むあらゆる種類の核酸であってもよい。細胞の発現を調節する能力を有する核酸は個々の細胞において細胞の発現を阻害するかまたは促進するかのいずれかである核酸であるということがよく理解されるであろう。

この点において、オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは塩基部分、糖部分あるいはリン酸バックボーンの位置で修飾される可能性があり、また核酸の機能を促進するための他の付加基を含んでもよい。オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは当業者には一般的に知られた組成物をもった構造上のあらゆる位置に修飾されることもある。例えば、オリゴヌクレオチドは、5-フルオロウラミル、5-ブロモウラシル、5 -クロロウラシル、5 -ヨードウラシル、ピポキサンチン、キサンチン、4
-アセチルシトシン、5- (カルボキシルヒドロキシルメチル)ウラシル、5 -カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ-D-ガラクトシルケオシン、イノシン、N6-イソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2,2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5-メチルアミノメチルウラシル、5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル、ベータD-マンノシルケオシン、5’ -メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メトキシチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、ウィブトキソシン、プソイドウラシル、ケオシン、2-チオシトシン、5-メチル-2-チオウラシル、2-チオウラシル、4-チオウラシル、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-5-オキシ酢酸（v）、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロヒル）ウラシル、（acp3）w、および2.6ジアミノプリンを含む群から選定した少なくとも1つの修飾された塩基部分を含んでもよい。

オリゴヌクレオチドあるいはポリヌクレオチドは、これらに限定されないが、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびベキソースを含む群から選定した少なくとも1つの修飾された糖部分を含む可能性がある。さらにオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドはホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミドチオエート、ホスホラミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホネート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタールまたはあらゆるその同族体のような、少なくとも1つの修飾されたリン酸バックボーンを含むこともある。

この明細書全体にわたって用いられているように「被験者（subject）」という用語は、動物あるいはヒトの被験者を含むあらゆる多細胞生物を意味すると理解すべきである。例えばこの被験者は霊長類、家畜類（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）、伴侶動物（companion animal）（例えばイヌ、ネコ）、実験動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、トリ）、獣医学的意義のある動物あるいは経済的意義のある動物のような哺乳動物であってもよい。

この明細書全体にわたって用いられているように、「変異体（variant）」という用語は、1つ以上のアミノ酸によって変化するホロペプチドあるいはタンパクのアミノ酸配列を意味すると理解すべきである。この変異体は置換されたアミノ酸が代わりのアミノ酸と類似した構造的または化学的特性を有する、「保存的」変化を有する可能性がある。（例えば、ロイシン、をイソロイシンに置換する）。変異体では、さらに「非保存的」変化（例えば、グリシンをトリプトファンに置換する）あるいは1つ以上のアミノ酸の欠落および／もしくは挿入が生じることもある。この用語はさらに個々のポリペプチドあるいはタンパクに対するアミノ酸の挿入／欠落をその範囲に含む。「機能的変異体（functional variant）」は標準タンパク質またはポリペプチドの機能的能力を保持する変異体を意味すると理解されるであろう。

（発明の全般的な詳細）
前記のように、本発明は、細胞内のマイクロRNA活性および/もしくは濃度が、結果として細胞の発現を調節するのに十分な細胞内の活性および/もしくは濃度に至る、細胞の発現を調節する方法を1つの形態で可能にするものであって、この方法は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を細胞内に導入する段階を含むものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

本発明は一部の疾患細胞が内因性マイクロRNAの発現レベルを変化させたという認識、また核酸の発現が細胞内のマイクロRNAの発現の変化を利用することによってこれらの細胞を効果的に標的とする可能性があるという認識に基づいている。

miRNA発現が低下した場合には、この核酸の発現が実際上標的からはずれることが理解されるであろう。

このように、本発明は遺伝子工学および治療用遺伝子転移のような分野における用途がある。

本発明は、疾患細胞の除去のためにその細胞を標的として細胞毒性のある核酸を発現させるための、あるいは１つ以上の細胞を改善するために疾患細胞を標的として治療用核酸を発現させるための実例として適している。

例えば、結腸腺癌細胞とそれにマッチした正常な粘膜との間に他と異なって発現したマイクロRNAの先の試験では、正常な組織に比較して、腫瘍中の完全に処理されたmiRNAのレベルを有意に低下させた、2種のマイクロRNA、miR-143およびmiR-145を確認した。図1に示したように、これらのmiRNAはより短い成熟miRNAにまで切断されるヘアピン型前駆体から産生される。このように、本発明は例えばmiR-143あるいはmiR-145またはマイクロRNAの発現の低下した細胞の発現を調節するために用いることができる。

細胞内の1つ以上のマイクロRNAのレベルおよび活性の変化は、細胞の発現プログラムの特定の点で起こる変化であると考えられる。例えば、本発明は、個々のmiRNAの構成的発現および/もしくは活性の低下を示す癌細胞の発現の調節に、miRNAの発現および／もしくは活性の変化を引き起こすウイルスに感染した細胞の発現の調節に、あるいはその発現プログラムの個々の段階で個々のmiRNAの活性を調節する胎児性または成人幹細胞発現の調節に適している。

細胞において特定のmiRNAの活性および/もしくは発現が変化したという確認は、ノーザン分析、逆転写PCR（RT-PCR）あるいはRNase protection法のような、当業者にはよく知られた適切な方法を用いて実施できる。

別法として、細胞において特定のmiRNAの活性および/もしくは発現が変化したという確認は、特定のmiRNAの標的部位に関連したリポーター遺伝子の発現によって行なうことができる。この場合には、リポーター遺伝子の発現レベルは細胞内のmiRNAの活性および／もしくは発現レベルと逆に示されるであろう。

miRNAの標的部位を含むリポーター遺伝子の構築のための方法は当業者にはよく知られている。例えば、標的部位はGFPの3’UTRをクローン化され、その構造は細胞内に導入される可能性がある。核酸配列のクローニングのための方法はSambrook , J Fritsch ,E , F.およびManiatis ,T. Malucular Cloning: A Laboratory Manual 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory Press ,ニューヨーク(1989) に記載された通りである。

先に論じたように、miRNAの活性および/もしくは発現の低下は疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）に相関する可能性がある。例えば、癌細胞では多くの場合1つ以上の特定のmiRNAのレベルの低下が認められる。実際に多くの癌についてmiRNA活性および/もしくは発現レベルの低下は、正常な細胞から癌細胞へと進行することに関連する。このように、本発明のこの形態における細胞は癌細胞あるいは前癌細胞であってもよい。

miRNAの活性および／もしくは発現の低下を示す癌細胞の例には結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、胸腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞および前立腺癌細胞が含まれる。

一般的に癌細胞の例には、膀胱癌、骨癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頚部癌、大腸、直腸、肛門、および虫垂の癌を含む直腸結腸癌、食道癌、ホジキン病、腎癌、喉頭癌、白血病、肝癌、肺癌、リンパ腫、黒色腫、母斑および異形成母斑、多発性骨髄腫、筋肉癌、非ホジキンリンパ腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、奇形腫、甲状腺癌、および子宮癌のような癌に関連する細胞が含まれる。本発明には、前癌細胞、例えば前記の癌に関連する前癌細胞を含む前癌細胞も含まれる。

1つの形態において、本発明の様々な形態における細胞は、直腸結腸腺癌あるいは腺腫性ポリープ由来の癌細胞を含む直腸結腸癌または直腸結腸ポリープ由来の癌細胞である。

しかしながら、先に論じたように、本発明の様々な形態における細胞は、例えば胚性幹（ES）細胞あるいは成人幹細胞であってもよい。この点において、マイクロRNAはES細胞が胚様体に分化する時その発現が抑制されるマウスで確認されてきたが、成人の臓器では確認されず、これらのmiRNAが多能性細胞の状態の維持および哺乳動物の初期発生の調節に1つの役割を果たす可能性があることを示している。

本発明の様々な形態に適している他の細胞の例には造血前駆細胞、脂肪細胞、慢性リンパ球B細胞、ニューロン細胞、精子あるいは精子産生細胞、膵内分泌細胞膵ランゲルハンス島を含む、およびEBV、HIV、肝炎およびヘルペス感染細胞を含むウイルス感染細胞が含まれる。

本発明の様々な形態において、発現が調節される細胞はin vitroで分離された細胞、あるいは臓器または組織の細胞、もしくは生物全体（すなわち、動物またはヒトの被験者）に存在する細胞のような生物系に存在する細胞である可能性がある。この点において、”生物系”と言う単語は、多細胞系のいずれかという意味に理解されるべきであり、全生物について、細胞の独立したグループを含むものである。

このように、本発明は生物系の標的細胞の発現を調節するために用いることができる。

したがって、他の形態では、本発明は、標的細胞におけるマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が、結果として標的細胞の発現を調節するのに十分な標的細胞における核酸の活性および／もしくは濃度のレベルに至る、生物系における標的細胞の発現を調節する方法を可能にするものであって、この方法は生物系の標的細胞に生物系の細胞の発現を調節する能力を有する核酸を導入する段階を含み、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位を含む。

1つの形態において、生物系はマイクロRNAの活性および／もしくは発現の変化に関連した疾患（disease）、異常（condition）または状態（state）になりやすいあるいはなっている動物あるいはヒトを含む、動物またはヒトの被験者である。

それ故、本発明はマイクロRNAの活性が変化した標的細胞に関連した疾患（disease）、異常（condition）または状態（state）を予防および／もしくは治療するために適している。

したがって、他の形態において、本発明は、標的細胞におけるマイクロRNA活性の変化が結果として被験者の標的細胞の発現を調節するのに十分な核酸の活性レベルに至る、被験者の標的細胞に関連した疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）を予防および／もしくは治療する方法を提供するものであって、この方法は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を被験者の細胞内に導入する段階を含み、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位を含む。

本発明の様々な形態において、マイクロRNA活性および／もしくは発現の変化に関連した疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）の例は、結腸直腸癌、肺癌,胸腺癌、膀胱癌、乳癌および前立腺癌のような癌；ヒトB細胞慢性リンパ球性白血病；B細胞（Burkitt）リンパ腫；糖尿病のような膵内分泌細胞の障害；EBV、HIV、肝炎およびヘルペス感染細胞のような細胞のウイルス性感染に関連した疾患（disease）および異常（condition）；5q-骨髄異形成症候群（大赤血球性貧血症）；造血機能不全に関連した疾患（disease）および異常（condition）；自己免疫疾患および炎症性疾患（例えばクローン病）；fragileX精神遅滞；Di George症候群・ウイルス腫瘍；脂肪細胞機能不全に関連した疾患（disease）あるいは異常（condition）；胚性または成人幹細胞を用いた治療が可能な疾患（disease）；および精子産生細胞に関連した疾患（disease）および異常（condition）を含む。

治療的効果あるいは適切な効果が得られるために効果的な量の核酸が、本発明の様々な適切な形態において細胞、生物系または被験者に導入/投与されるであろう。

例えば、細胞内に外因性DNAを導入する方法は、Sambrook , J
, Fritsch , E F . およびManiatis , T , Molecular Cloning : A Laboratory
Mannual 第2版Cold Spring Harbor
Laboratory Press , ニューヨーク（1989）に記載されている通りである。

本発明は、標的細胞の発現を阻害する核酸の使用によって標的細胞の発現を阻害するために、あるいは標的細胞の発現を促す核酸の使用によって標的細胞の発現を促進するために用いることができる。例えば、本発明は細胞を選択的に剥離または救援するために用いることができる。細胞の発現が阻害されているか促進されているかを確認する方法は当業者にはよく知られている。

このように、本発明の1つの形態において細胞の発現を阻害することができる。

この場合において、細胞内に導入される核酸は、細胞の発現を阻害する能力を有するであろう。この核酸は1つ以上のmiRNA結合の標的部位を含むため、細胞内の1つ以上のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下は（1つ以上のmiRNAの活性が低下しなかった同様の細胞に比較して）結果として、核酸の発現の増大に至り、そして結果的に細胞の発現を阻害するのに十分な核酸の発現レベルに至る。

したがって、他の形態においては、本発明は、細胞内のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下が結果として細胞の発現を阻害するのに十分な細胞中の核酸の活性および／もしくは濃度に至る、細胞の発現を阻害する方法を可能にするものであって、この細胞はマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下した細胞であり、この方法は細胞の発現を阻害する能力を有する核酸を細胞内に導入する段階を含む方法であって、前記の核酸はマイクロRNA結合に対する標的部位を含む。

1つの形態において、細胞の発現を阻害する能力を有する核酸が、細胞毒性または細胞増殖抑制を有する核酸、あるいは自殺遺伝子をコードする核酸である。この場合において、1つ以上のマイクロRNA結合の標的細胞を含むこのような核酸の細胞内への導入が、結果として1つ以上のmiRNA活性および／もしくは発現の低下したこれらの細胞の発現低下に至るであろう。1つ以上のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下しなかった細胞において、miRNAが作用し、細胞発現が阻害されない、あるいは少なくともmiRNAの活性および／もしくは発現が低下した細胞に比較して阻害されることが少ない核酸の発現が十分低下するであろう。

このように、本発明は個々のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下した細胞を選択的に阻害することを可能にする。1つの形態において、本発明は個々のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下した標的細胞を選択的に除去するために用いることができる。

細胞毒性あるいは自殺遺伝子の例は一般的にGrecoおよびDachs (2001) J Cell
Physiol. 187(1): 22-36に記載された通りであり、単純ヘルペスチミジンキナーゼ[NC_001798: c 48000-46870 (HSV2 ゲノム) ] [gi| 9629267]、E. coli シトシンデアミナーゼ[NC_000913: 355395_356678 (E . Ccli ゲノム) ] [gi| 49175990] 、細菌性E. Coliニトロリダクターゼ[NC_000913 : c603994 604647] [ gi| 49175990 , P . aeruginosa
カルボキシペプチダーゼ G2 [AE 0047061: 3474_4712]、ワサビダイコン過酸化酵素[×57564] [gi| 16095] 、およびE. coli プリンヌクレオシド加リン酸分解酵素[U00096.2: 4618906_4619625(E. coli genome) [gi|
48994873]を含む。これらの遺伝子の活性フラグメントを用いてもよく、機能的変異体を用いてもよい。

1つの形態において、細胞の発現を阻害する能力を有する核酸が単純ヘルペスチミジンキナーゼ、プリンヌクレオチド加リン酸分解酵素およびシトシンデアミナーゼから成る1つの群から選択される。

HSVチミジンキンナーゼ遺伝子のヌクレオチド配列はSEQ
ID NO. 151と表される。

E. coliシトシンデアミナーゼのヌクレオチド配列はSEQ
ID NO. 152と表される。この場合には、開始コドンは哺乳動物の発現構造についてGTGからATGまで変化することに注目すべきである。

HSVチミジンキナーゼ遺伝子およびmiR-145に対するmiRNA標的配列をコードするプラスミドの例は図9に示されているプラスミドpMM-TK/miR-Targである。このプラスミドのヌクレオチド配列はSCQ ID NO.158と表されている。

E. coliシトシンデアミナーゼをコードするプラスミドおよびmiR-145に対する、miRNA標的配列の例は、図10に示されたプラスミドpMM-CD/miR-Targである。このプラスミドのヌクレオチド配列はSEQ ID NO.159と表されている。

他の形態において本発明は細胞発現の促進を可能にする。

細胞に導入された核酸は細胞の発現を促進する能力を有しているであろう。核酸が1つ以上のmiRNA結合の1つ以上の標的部位を含むことになるため、1つ以上のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下が核酸の発現の増大に至り（1つ以上のmiRNAの活性が低下しない同様の細胞と比較して）、その結果細胞の発現を促進するのに十分な核酸の発現レベルに至ることになる。

従って、他の形態においては、本発明は、細胞内のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下が結果として細胞の発現を促進するのに十分な細胞内核酸の活性および／もしくは濃度に至る、細胞の発現を促進する方法を可能にするものであって、このマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下した細胞であり、この方法は細胞の発現を促進する能力を有した核酸を細胞内に導入する段階を含むものであって、前記の核酸はマイクロRNA結合の標的部位を含む。

細胞における発現を促進する能力を有する核酸の例には、顆粒球マクロファージーコロー刺激因子（GM-CSF；ヒト：NM_000758）、GCSF（ヒト：NM_000759；NM_172219；NM_172220）、インターロイキン（ヒト：NM_000641）、および腫瘍壊死因子アルファの（ヒト：NM_000594）のような治療用遺伝子もしくはサイトカイン遺伝子が含まれる。それ故、この核酸はサイトカイン、治療用タンパクあるいはサイトカインまたは治療用タンパクの活性フラグメントをコードすることができる。

サイトカイン遺伝子の場合には、細胞内にサイトカインをコードした核酸を導入することは、結果として1つ以上のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下した細胞の発現の促進に至ることになる。この場合には、この細胞はサイトカインの作用を受けやすいことが理解されるであろう。1つ以上のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下しなかった細胞においては、このmiRNAが作用し細胞発現が促進されない、あるいは少なくとも、miRNAの活性および／もしくは発現が低下した細胞に比較してより少ない程度までしか促進されない核酸発現を十分低下させるであろう。

このように、本発明は、個々のmiRNAの活性および／もしくは発現の低下した標的細胞の発現の選択的促進を可能にする。

細胞の発現を調節する能力を有する核酸の発現には、個々の細胞における挿入された核酸の発現を促すプロモーター、挿入された核酸から転写されたmRNAの効果的なポリアデニル化のポリAシグナル、あるいは翻訳、転写またはmRNA安定性を制御するための他の制御エレメントのような、個々の細胞型において挿入された核酸の発現に対して当業者にはよく知られた様々な制御因子が必要であるということが理解されるであろう。

調節される細胞型によって、発現を促すプロモーターは構成的プロモーター、誘発性プロモーター、あるいは細胞または組織特異性プロモーターであってもよい。

哺乳動物の構成的プロモーターには、ヒポキサンチンホスホリボルシルトランスフェラーゼ（HPTR）、アデノシン、脱アミノ酵素、ピルビン酸キナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ（内因性一方向活性を有する）およびβ-アクチンが含まれる。真核細胞において構成的に機能する代表的なウイルスプロモーターはサルのウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、ラウス肉腫ウイルス、サイトメガウイルス、モロニー白血病ウイルスの長末端反復（LTR）と他のレトロウイルス、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。

誘発性プロモーターには、TetO/TetRシステムによって制御された合成プロモーター、およびいくつかの金属イオンの存在下で転写を誘発するために用いられるメタロチオネインプロモーターのような誘発性プロモーターが含まれる。他の誘発性プロモーターは当業者にはよく知られている。

組織特異性プロモーターは個々の細胞型によって決まってくるであろう。例えば、大腸癌細胞における発現を可能にするプロモーターにはヒト胎児性抗原（CEA）の調節配列が含まれる[accession
: O17131;gi|967132]。

ヒト癌あるいはヒトにおいて正常な細胞が癌細胞に進行する程度に相関するマイクロRNAの例は以下の通りである（5’から3’）：
hsa-let-7a-1 pre-miRNA
precursor:
ugggaugagguaguagguuguauaguuuuagggucacacccaccacugggagauaacuauacaaucuacugucuuuccua
(SEQ ID NO.1)
hsa-let-7 mature miRNA:
ugagguaguagguuguauaguu
(SEQ ID NO.2)

hsa-let-7a-2 pre-miRNA
precursor:
agguugagguaguagguuguauaguuuagaauuacaucaagggagauaacuguacagccu
ccuagcuuuccu (SEQ ID
NO.3)
hsa-let-7a mature
miRNA:
ugagguaguagguuguauaguu
(SEQ ID NO.4)

hsa-let-7a-3 pre-miRNA
precursor:
gggugagguaguagguuguauaguuuggggcucugcccugcuaugggauaacuauacaaucuacugucuuuccu
(SEQ ID NO.5)
hsa-let-7a mature
miRNA:
ugagguaguagguuguauaguu
(SEQ ID NO.6)

hsa-let-7b pre-miRNA
precursor:
cggggugagguaguagguugugugguuucagggcagugauguugccccucggaagauaacuauacaaccuacugccuucccug
(SEQ ID NO.7)
hsa-let-7b mature
miRNA:
ugagguaguagguugugugguu
(SEQ ID NO.8)

hsa-let-7c pre-miRNA
precursor:
gcauccggguugagguaguagguuguaugguuuagaguuacacccugggaguuaacuguacaaccuucuagcuuuccuuggagc
(SEQ ID NO.9)
hsa-let-7c mature
miRNA:
ugagguaguagguuguaugguu
(SEQ ID NO.10)

hsa-let-7f-1 pre-miRNA
precursor:
ucagagugagguaguagauuguauaguugugggguagugauuuuacccuguucaggagauaacuauacaaucuauugccuucccuga
(SEQ ID NO.11)
hsa-let-7f mature
miRNA:
ugagguaguagauuguauaguu
(SEQ ID NO.12)

hsa-let-7f-2 pre-miRNA
precursor:
ugugggaugagguaguagauuguauaguuuuagggucauaccccaucuuggagauaacuauacagucuacugucuuucccacg
(SEQ ID NO.13)
hsa-let-7f mature
miRNA:
ugagguaguagauuguauaguu
(SEQ ID NO.14)

hsa-mir-10b pre-miRNA
precursor:
ccagagguuguaacguugucuauauauacccuguagaaccgaauuugugugguauccguauagucacagauucgauucuaggggaauauauggucgaugcaaaaacuuca
(SEQ ID NO.15)
hsa-miR-10b mature
miRNA:
uacccuguagaaccgaauuugu
(SEQ ID NO.16)

hsa-mir-15b pre-miRNA
precursor:
uugaggccuuaaaguacuguagcagcacaucaugguuuacaugcuacagucaagaugcgaaucauuauuugcugcucuagaaauuuaaggaaauucau
(SEQ ID NO.17)
hsa-miR-15b mature
miRNA:
uagcagcacaucaugguuuaca
(SEQ ID NO.18)

hsa-mir-16-1 pre-miRNA
precursor:
gucagcagugccuuagcagcacguaaauauuggcguuaagauucuaaaauuaucuccaguauuaacugugcugcugaaguaagguugac
(SEQ ID NO.19)
hsa-miR-16 mature
miRNA:
uagcagcacguaaauauuggcg
(SEQ ID NO.20)

hsa-mir-16-2 pre-miRNA
precursor:
guuccacucuagcagcacguaaauauuggcguagugaaauauauauuaaacaccaauauuacugugcugcuuuagugugac
(SEQ ID NO.21)
hsa-miR-16 mature
miRNA:
uagcagcacguaaauauuggcg
(SEQ ID NO.22)

hsa-mir-19b-1 pre-miRNA
precursor:
cacuguucuaugguuaguuuugcagguuugcauccagcugugugauauucugcugugcaaauccaugcaaaacugacugugguagug
(SEQ ID NO.23)
hsa-miR-19b mature
miRNA:
ugugcaaauccaugcaaaacuga
(SEQ ID NO.24)

hsa-mir-19b-2 pre-miRNA
precursor:
acauugcuacuuacaauuaguuuugcagguuugcauuucagcguauauauguauauguggcugugcaaauccaugcaaaacugauugugauaaugu
(SEQ ID NO.25)
hsa-miR-19b mature
miRNA:
ugugcaaauccaugcaaaacuga
(SEQ ID NO.26)

hsa-mir-20 pre-miRNA
precursor:
guagcacuaaagugcuuauagugcagguaguguuuaguuaucuacugcauuaugagcacuuaaaguacugc
(SEQ ID NO.27)
hsa-miR-20 mature
miRNA:
uaaagugcuuauagugcagguag
(SEQ ID NO.28)

hsa-mir-21 pre-miRNA
precursor:
ugucggguagcuuaucagacugauguugacuguugaaucucauggcaacaccagucgaugggcugucugaca
(SEQ ID NO.29)
hsa-miR-21 mature
miRNA:
uagcuuaucagacugauguuga
(SEQ ID NO.30)

hsa-mir-22 pre-miRNA
precursor:
ggcugagccgcaguaguucuucaguggcaagcuuuauguccugacccagcuaaagcugccaguugaagaacuguugcccucugcc
(SEQ ID NO.31)
hsa-miR-22 mature
miRNA:
aagcugccaguugaagaacugu
(SEQ ID NO.32)

hsa-mir-23a pre-miRNA
precursor:
ggccggcugggguuccuggggaugggauuugcuuccugucacaaaucacauugccagggauuuccaaccgacc
(SEQ ID NO.33)
hsa-miR-23a mature
miRNA:
aucacauugccagggauuucc
(SEQ ID NO.34)

hsa-mir-24-1 pre-miRNA
precursor:
cuccggugccuacugagcugauaucaguucucauuuuacacacuggcucaguucagcaggaacaggag
(SEQ ID NO.35)
hsa-miR-24 mature
miRNA:
uggcucaguucagcaggaacag
(SEQ ID NO.36)
hsa-miR-189 mature
miRNA:
gugccuacugagcugauaucagu
(SEQ ID NO.37)

hsa-mir-24-2 pre-miRNA
precursor:
cucugccucccgugccuacugagcugaaacacaguugguuuguguacacuggcucaguucagcaggaacaggg
(SEQ ID NO.38)
hsa-miR-24 mature
miRNA:
uggcucaguucagcaggaacag
(SEQ ID NO.39)

hsa-mir-26a-1 pre-miRNA
precursor:
guggccucguucaaguaauccaggauaggcugugcaggucccaaugggccuauucuugguuacuugcacggggacgc
(SEQ ID NO.40)
hsa-miR-26 mature
miRNA:
auucaaguaauccaggauaggc
(SEQ ID NO.41)

hsa-mir-26b pre-miRNA
precursor:
ccgggacccaguucaaguaauucaggauagguugugugcuguccagccuguucuccauuacuuggcucggggaccgg
(SEQ ID NO.42)
hsa-miR-26b mature miRNA:
uucaaguaauucaggauagguu
(SEQ ID NO.43)

hsa-mir-26a-2 pre-miRNA
precursor:
ggcuguggcuggauucaaguaauccaggauaggcuguuuccaucugugaggccuauucuugauuacuuguuucuggaggcagcu
(SEQ ID NO.44)
hsa-miR-26a mature
miRNA:
uucaaguaauccaggauaggc
(SEQ ID NO.45)

hsa-mir-27b pre-miRNA
precursor:
accucucuaacaaggugcagagcuuagcugauuggugaacagugauugguuuccgcuuuguucacaguggcuaaguucugcaccugaagagaaggug
(SEQ ID NO.46)
hsa-miR-27b mature
miRNA:
uucacaguggcuaaguucugc
(SEQ ID NO.47)

hsa-mir-29a pre-miRNA
precursor:
augacugauuucuuuugguguucagagucaauauaauuuucuagcaccaucugaaaucgguuau
(SEQ ID NO.48)
hsa-miR-29a mature
miRNA:
uagcaccaucugaaaucgguu
(SEQ ID NO.49)

hsa-mir-30a pre-miRNA
precursor:
gcgacuguaaacauccucgacuggaagcugugaagccacagaugggcuuucagucggauguuugcagcugc
(SEQ ID NO.50)
hsa-miR-30a-3p mature
miRNA:
cuuucagucggauguuugcagc
(SEQ ID NO.51)
hsa-miR-30a-5p mature
miRNA:
uguaaacauccucgacuggaag
(SEQ ID NO.52)

hsa-mir-141 pre-miRNA
precursor:
cggccggcccuggguccaucuuccaguacaguguuggauggucuaauugugaagcuccuaacacugucugguaaagauggcucccggguggguuc
(SEQ ID NO.53)
hsa-miR-141 mature
miRNA:
uaacacugucugguaaagaugg
(SEQ ID NO.54)

hsa-mir-142 pre-miRNA
precursor:
gacagugcagucacccauaaaguagaaagcacuacuaacagcacuggaggguguaguguuuccuacuuuauggaugaguguacugug
(SEQ ID NO.55)
hsa-miR-142-5p mature
miRNA:
cauaaaguagaaagcacuac (SEQ
ID NO.56)
hsa-miR-142-3p mature
miRNA:
uguaguguuuccuacuuuaugga
(SEQ ID NO.57)

hsa-mir-143 pre-miRNA
precursor:
gcgcagcgcccugucucccagccugaggugcagugcugcaucucuggucaguugggagucugagaugaagcacuguagcucaggaagagagaaguuguucugcagc
(SEQ ID NO.58)
hsa-miR-143 mature
miRNA:
ugagaugaagcacuguagcuca
(SEQ ID NO.59)

hsa-mir-145 pre-miRNA
precursor:
caccuuguccucacgguccaguuuucccaggaaucccuuagaugcuaagauggggauuccuggaaauacuguucuugaggucaugguu
(SEQ ID NO.60)
hsa-miR-145 mature
miRNA:
guccaguuuucccaggaaucccuu
(SEQ ID NO.61)

hsa-mir-192 pre-miRNA
precursor:
gccgagaccgagugcacagggcucugaccuaugaauugacagccagugcucucgucuccccucuggcugccaauuccauaggucacagguauguucgccucaaugccagc
(SEQ ID NO.62)
hsa-miR-192 mature
miRNA:
cugaccuaugaauugacagcc
(SEQ ID NO.63)

hsa-mir-194-1 pre-miRNA
precursor:
augguguuaucaaguguaacagcaacuccauguggacuguguaccaauuuccaguggagaugcuguuacuuuugaugguuaccaa
(SEQ ID NO.64)
hsa-miR-194 mature
miRNA:
uguaacagcaacuccaugugga
(SEQ ID NO.65)

hsa-mir-194-2 pre-miRNA
precursor:
ugguucccgcccccuguaacagcaacuccauguggaagugcccacugguuccaguggggcugcuguuaucuggggcgagggccag
(SEQ ID NO.66)
hsa-miR-194 mature
miRNA:
uguaacagcaacuccaugugga
(SEQ ID NO.67)

]

hsa-mir-199b pre-miRNA
precursor:
ccagaggacaccuccacuccgucuacccaguguuuagacuaucuguucaggacucccaaauuguacaguagucugcacauugguuaggcugggcuggguuagacccucgg
(SEQ ID NO.68)
hsa-miR-199b mature
miRNA:
cccaguguuuagacuaucuguuc
(SEQ ID NO.69)

hsa-mir-200b pre-miRNA
precursor:
ccagcucgggcagccguggccaucuuacugggcagcauuggauggagucaggucucuaauacugccugguaaugaugacggcggagcccugcacg
(SEQ ID NO.70)
hsa-miR-200b mature
miRNA:
uaauacugccugguaaugaugac
(SEQ ID NO.71)

hsa-mir-200c pre-miRNA
precursor:
cccucgucuuacccagcaguguuugggugcgguugggagucucuaauacugccggguaaugauggagg
(SEQ ID NO.72)
hsa-miR-200c mature
miRNA:
uaauacugccggguaaugaugg
(SEQ ID NO.73)

hsa-mir-320 pre-miRNA
precursor:
gcuucgcuccccuccgccuucucuucccgguucuucccggagucgggaaaagcuggguugagagggcgaaaaaggaugaggu
(SEQ ID NO.74)
hsa-miR-320 mature
miRNA:
aaaagcuggguugagagggcgaa
(SEQ ID NO.75)

hsa-miR-321 mature
miRNA:
uaagccagggauuguggguuc
(SEQ ID NO.76)

hsa-mir-30a pre-miRNA
precursor:
gcgacuguaaacauccucgacuggaagcugugaagccacagaugggcuuucagucggauguuugcagcugc
(SEQ ID NO.77)
hsa-miR-30a-3p mature
miRNA:
cuuucagucggauguuugcagc
(SEQ ID NO.78)
hsa-miR-30a-5p mature
miRNA:
uguaaacauccucgacuggaag
(SEQ ID NO.79)

hsa-mir-29b-1 pre-miRNA
precursor:
cuucaggaagcugguuucauauggugguuuagauuuaaauagugauugucuagcaccauuugaaaucaguguucuuggggg
(SEQ ID NO.80)
hsa-miR-29b mature
miRNA:
uagcaccauuugaaaucaguguu
(SEQ ID NO.81)

hsa-mir-125b-1
pre-miRNA precursor:
ugcgcuccucucagucccugagacccuaacuugugauguuuaccguuuaaauccacggguuaggcucuugggagcugcgagucgugcu
(SEQ ID NO.82)
hsa-miR-125b mature
miRNA:
ucccugagacccuaacuuguga
(SEQ ID NO.83)

hsa-mir-125a pre-miRNA
precursor:
ugccagucucuaggucccugagacccuuuaaccugugaggacauccagggucacaggugagguucuugggagccuggcgucuggcc
(SEQ ID NO.84)
hsa-miR-125a mature
miRNA:
ucccugagacccuuuaaccugug
(SEQ ID NO.85)

hsa-mir-125b-2
pre-miRNA precursor:
accagacuuuuccuagucccugagacccuaacuugugagguauuuuaguaacaucacaagucaggcucuugggaccuaggcggagggga
(SEQ ID NO.86)
hsa-miR-125b mature
miRNA:
ucccugagacccuaacuuguga (SEQ
ID NO.87)

hsa-mir-15a pre-miRNA
precursor:
ccuuggaguaaaguagcagcacauaaugguuuguggauuuugaaaaggugcaggccauauugugcugccucaaaaauacaagg
(SEQ ID NO.88)
hsa-miR-15a mature
miRNA:
uagcagcacauaaugguuugug
(SEQ ID NO.89)

hsa-mir-126 pre-miRNA
precursor:
cgcuggcgacgggacauuauuacuuuugguacgcgcugugacacuucaaacucguaccgugaguaauaaugcgccguccacggca
(SEQ ID NO.90)
hsa-miR-126* mature
miRNA:
cauuauuacuuuugguacgcg
(SEQ ID NO.91)
hsa-miR-126 mature
miRNA:
ucguaccgugaguaauaaugc
(SEQ ID NO.92)

hsa-mir-188 pre-miRNA
precursor:
ugcucccucucucacaucccuugcaugguggagggugagcuuucugaaaaccccucccac
augcaggguuugcaggauggcgagcc
(SEQ ID NO.93)
hsa-miR-188 mature
miRNA:
caucccuugcaugguggagggu
(SEQ ID NO.94)

hsa-mir-331 pre-miRNA
precursor:
gaguuugguuuuguuuggguuuguucuagguauggucccagggaucccagaucaaaccag
gccccugggccuauccuagaaccaaccuaagcuc
(SEQ ID NO.95)
hsa-miR-331 mature
miRNA:
gccccugggccuauccuagaa
(SEQ ID NO.96)

hsa-mir-155 pre-miRNA
precursor:
cuguuaaugcuaaucgugauagggguuuuugccuccaacugacuccuacauauuagcauu
aacag (SEQ ID NO.97)
hsa-miR-155 mature
miRNA:
uuaaugcuaaucgugauagggg
(SEQ ID NO.98)

インスリン分泌の関連するマイクロRNAの例はhsa-miR-375である：
hsa-mir-375 pre-miRNA
precursor:
ccccgcgacgagccccucgcacaaaccggaccugagcguuuuguucguucggcucgcgugaggc
(SEQ ID NO. 160)
hsa-miR-375 mature
miRNA:
uuuguucguucggcucgcguga
(SEQ ID NO.161)

マウスにおける実験に基づいて、hsa-miR-181b-1 は造血に関与すると考えられる
(B 連鎖細胞分化):
hsa-mir-181b-1
pre-miRNA precursor:
ccugugcagagauuauuuuuuaaaaggucacaaucaacauucauugcugucgguggguugaacuguguggacaagcucacugaacaaugaaugcaacuguggccccgcuu
(SEQ ID NO. 162)
hsa-miR-181b mature
miRNA:
aacauucauugcugucgguggg
(SEQ ID NO. 163)

hsa-mir-124a-3
pre-miRNA precursor:
UGAGGGCCCCUCUGCGUGUUCACAGCGGACCUUGAUUUAAUGUCUAUACAAUUAAGGCACGCGGUGAAUGCCAAGAGAGGCGCCUCC
(SEQ ID NO. 166)
hsa-miR-124a mature
miRNA:
UUAAGGCACGCGGUGAAUGCCA
(SEQ ID NO. 167)

hsa-mir-9-2 pre-miRNA
precursor:
GGAAGCGAGUUGUUAUCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGAGUGUAUUGGUCUUCAUAAAGCUAGAUAACCGAAAGUAAAAACUCCUUCA
(SEQ ID NO. 168)
hsa-miR-9 mature miRNA:
UCUUUGGUUAUCUAGCUGUAUGA
(SEQ ID NO. 169)

本発明はさらに、当業者にはよく知られた方法で確認できる前記のヒトmiRNAのオルソログを提供する。miRNAのデータベースはmiRBaseの記録で確認される（http:// microrna. sanger. ac. uk/sequences/）。

このように、本発明は様々な形態で個々に以下のマイクロRNA：hsa-let-7a-1,
hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b,
hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20,
hsa-miR-21, hsa-miR-22, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24,
hsa-miR-26, hsa-miR-26b, hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p,
hsa-miR-141, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145,
hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c,
hsa-miR-320, hsa-miR-321, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b,
hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-126*, hsa-miR-126,
hsa-miR-188, hsa-miR-331, hsa-miR-155, hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する他の種由来のオルソログを提供する。

ホモロジー研究によって確認されたWeber MJ. (2005）New human and
mouse microRNA遺伝子のような、対応するオルソログを確認する方法は当業者にはよく知られている。FEBS J. 272(1): 59-73。

前記のように、miRNAは特定のmRNAに結合することによって遺伝子発現を調節する多くの種のゲノムに内在的にコードされる小さいRNA分子である。miRNAは、ヘアピン構造を作るために折りたたまれ、RNaseIII酵素のDicerファミリーに対する基質として働く大規模な転写情報から形成される。Dicer切断の産物はRNA誘発性サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれるリボヌクレオタンパク内にその1本鎖が保持される短いdsRNA分子である。この保持されたRNAは、その後切断または翻訳干渉のいずれかによって不活性化されるmRNAの標的部位に対してこの複合体を誘導するためのガイドとして作用し、このことはmiRNAとその標的部位の間の相補性の程度によって決まる。

従って、本発明の様々な形態において細胞の発現の調節は、その細胞の発現を調節する能力を有する核酸の切断（あるいは切断しないこと）によって、さらに／もしくはその細胞の発現を調節する能力を有する核酸の翻訳干渉（あるいは翻訳干渉をしないこと）によって行なわれる。

本発明の様々な形態における標的部位は、miRNAに対する相補性を必要とするヌクレオチド配列であるか、あるいは相補性の程度が低下した標的部位であってもよい。miRNAの結合に必要な相補性の程度を測定する方法（標的を切断するため、あるいは標的に翻訳の段階で干渉するために）は、当業者にはよく知られており、例えばLewis BP, Burge CB, Bartel DP., (2005) Conserved
seed pairing, often flanked by adenosines, indicates that thousands of human
genes are microRNA targets. Cell 120(1):15-20 and Saetrom O, Snove O Jr,
Saetrom P., (2005) Weighted sequence motifs as an improved seeding step in
microRNA target prediction algorithms. RNA 11(7):995-1003.

この標的部位は自然に発生した標的部位あるいは人工的に発生した標的部位であってもよい。遺伝子に発生した標的部位の場合には、標的部位が、その遺伝子から1つ以上の付加ヌクレオチドによって核酸内に導入される可能性があることが理解されるであろう。例えば、この標的部位は、mRNAのその未翻訳領域に適切な標的部位を有する遺伝子の3’UTR全体を用いることによって導入できる。

miRNAの、標的部位に結合しmRNAを切断しさらに／もしくは翻訳に干渉する能力は、当業者によく知られた適切な方法で実験的に確かめられる。例えば、psiCHECK^TM2ルシフェラーゼ検定システム（Promega）はin vitroおよびin vivoで共にmiRNA活性を測定するために用いることができる。ノーザンブロット分析およびRT-PCR分析は、標的転写情報の切断を確認するためにも用いることができ、一方ウェスタンブロット解析によってコードされたタンパクの翻訳の低下が検出されるであろう。

この文書の中で先に共に論じたmiRNAの場合には、miRNA結合に対する相補性標的部位は以下の通りである（５’から3’）：
hsa-let-7 mature miRNA
target site:
AACUAUACAACCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 99)

hsa-let-7a mature miRNA
target site:
AACUAUACAACCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 100)

hsa-let-7a mature miRNA
target site:
AACUAUACAACCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 101)

hsa-let-7b mature miRNA
target site:
AACCACACAACCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 102)

hsa-let-7c mature miRNA
target site:
AACCAUACAACCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 103)

hsa-let-7f mature miRNA
target site:
AACUAUACAAUCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 104)

hsa-let-7f mature miRNA
target site:
AACUAUACAAUCUACUACCUCA
(SEQ ID NO. 105)

hsa-miR-10b mature
miRNA target site:
ACAAAUUCGGUUCUACAGGGUA
(SEQ ID NO. 106)

hsa-miR-15b mature
miRNA target site:
UGUAAACCAUGAUGUGCUGCUA
(SEQ ID NO. 107)

hsa-miR-16 mature miRNA
target site:
CGCCAAUAUUUACGUGCUGCUA
(SEQ ID NO. 108)

hsa-miR-16 mature miRNA
target site:
CGCCAAUAUUUACGUGCUGCUA
(SEQ ID NO. 109)

hsa-miR-19b mature
miRNA target site:
UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA
(SEQ ID NO. 110)

hsa-miR-19b mature
miRNA target site:
UCAGUUUUGCAUGGAUUUGCACA
(SEQ ID NO. 111)

hsa-miR-20 mature miRNA
target site:
CUACCUGCACUAUAAGCACUUUA
(SEQ ID NO. 112)

hsa-miR-21 mature miRNA
target site:
UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA
(SEQ ID NO. 113)

hsa-miR-22 mature miRNA
target site:
ACAGUUCUUCAACUGGCAGCUU
(SEQ ID NO. 114)

hsa-miR-23a mature
miRNA target site:
GGAAAUCCCUGGCAAUGUGAU
(SEQ ID NO. 115)

hsa-miR-24 mature miRNA
target site:
CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA
(SEQ ID NO. 116)

hsa-miR-189 mature
miRNA target site:
ACUGAUAUCAGCUCAGUAGGCAC
(SEQ ID NO. 117)

hsa-miR-24 mature miRNA
target site:
CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA
(SEQ ID NO. 118)

hsa-miR-26 mature miRNA
target site:
GCCUAUCCUGGAUUACUUGAAU
(SEQ ID NO. 119)

hsa-miR-26b mature
miRNA target site:
AACCUAUCCUGAAUUACUUGAA
(SEQ ID NO. 120)

hsa-miR-26a mature
miRNA target site:
GCCUAUCCUGGAUUACUUGAA
(SEQ ID NO. 121)

hsa-miR-27b mature
miRNA target site:
GCAGAACUUAGCCACUGUGAA
(SEQ ID NO. 122)

hsa-miR-29a mature
miRNA target site:
AACCGAUUUCAGAUGGUGCUA
(SEQ ID NO. 123)

hsa-miR-30a-3p mature
miRNA target site:
GCUGCAAACAUCCGACUGAAAG
(SEQ ID NO. 124)

hsa-miR-30a-5p mature
miRNA target site:
CUUCCAGUCGAGGAUGUUUACA
(SEQ ID NO. 125)

hsa-miR-141 mature
miRNA target site:
CCAUCUUUACCAGACAGUGUUA
(SEQ ID NO. 126)

hsa-miR-142-5p mature
miRNA target site:
GUAGUGCUUUCUACUUUAUG
(SEQ ID NO. 127)

hsa-miR-142-3p mature
miRNA:
UCCAUAAAGUAGGAAACACUACA
(SEQ ID NO. 128)

hsa-miR-143 mature
miRNA target site:
UGAGCUACAGUGCUUCAUCUCA
(SEQ ID NO. 129)

hsa-miR-145 mature
miRNA target site:
AAGGGAUUCCUGGGAAAACUGGAC
(SEQ ID NO. 130)

hsa-miR-192 mature
miRNA target site:
GGCUGUCAAUUCAUAGGUCAG
(SEQ ID NO. 131)

hsa-miR-194 mature
miRNA target site:
UCCACAUGGAGUUGCUGUUACA
(SEQ ID NO. 132)

hsa-miR-194 mature
miRNA target site:
UCCACAUGGAGUUGCUGUUACA
(SEQ ID NO. 133)

hsa-miR-199b mature
miRNA target site:
GAACAGAUAGUCUAAACACUGGG
(SEQ ID NO. 134)

hsa-miR-200b mature
miRNA target site:
GUCAUCAUUACCAGGCAGUAUUA
(SEQ ID NO. 135)

hsa-miR-200c mature
miRNA target site:
CCAUCAUUACCCGGCAGUAUUA
(SEQ ID NO. 136)

hsa-miR-320 mature miRNA
target site:
UUCGCCCUCUCAACCCAGCUUUU
(SEQ ID NO. 137)

hsa-miR-321 mature
miRNA target site:
GAACCCACAAUCCCUGGCUUA
(SEQ ID NO. 138)

hsa-miR-30a-3p mature
miRNA target site:
GCUGCAAACAUCCGACUGAAAG
(SEQ ID NO. 139)

hsa-miR-30a-5p mature
miRNA target site:
CUUCCAGUCGAGGAUGUUUACA
(SEQ ID NO. 140)

hsa-miR-29b mature
miRNA target site:
AACACUGAUUUCAAAUGGUGCUA
(SEQ ID NO. 141)

hsa-miR-125b mature
miRNA target site:
UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA
(SEQ ID NO. 142)

hsa-miR-125a mature
miRNA target site:
CACAGGUUAAAGGGUCUCAGGGA
(SEQ ID NO. 143)

hsa-miR-125b mature
miRNA target site:
UCACAAGUUAGGGUCUCAGGGA
(SEQ ID NO. 144)

hsa-miR-15a mature
miRNA target site:
CACAAACCAUUAUGUGCUGCUA
(SEQ ID NO. 145)

hsa-miR-126* mature
miRNA target site:
CGCGUACCAAAAGUAAUAAUG
(SEQ ID NO. 146)

hsa-miR-126 mature
miRNA target site:
GCAUUAUUACUCACGGUACGA
(SEQ ID NO. 147)

hsa-miR-188 mature
miRNA target site:
ACCCUCCACCAUGCAAGGGAUG
(SEQ ID NO. 148)

hsa-miR-331 mature
miRNA target site:
UUCUAGGAUAGGCCCAGGGGC
(SEQ ID NO. 149)

hsa-miR-155 mature
miRNA target site:
CCCCUAUCACGAUUAGCAUUAA
(SEQ ID NO. 150)

hsa-miR-375 mature
miRNA target site:
UCACGCGAGCCGAACGAACAAA
(SEQ ID NO.164)

hsa-miR-181b mature
miRNA target site:
CCCACCGACAGCAAUGAAUGUU
(SEQ ID NO. 165)

hsa-miR-124a mature
miRNA target site:
UGGCAUUCACCGCGUGCCUUAA
(SEQ ID NO. 170)

hsa-miR-9 mature miRNA
target site:
UCAUACAGCUAGAUAACCAAAGA
(SEQ ID NO. 171)

DNAであるこの核酸の場合には、当業者には前記の標的配列がT塩基の代わりにU塩基を有するであろうということが理解されるであろう。

本発明の様々な形態において、マイクロRNAの結合に対する標的部位は特定のmiRNAの人工的に発生している結合部位である可能性があり、あるいは自然に発生した遺伝子あるいはmRNAに存在する標的部位である可能性がある。この点において、自然にまたは人工的に発生したマイクロRNAに対する標的部位はKrekら(2005) Nature Genitics 37(5): 495-500に記載されたようにして確認できる。

例えば、miR-143miRNAの場合には、表１はKrekら(2005) Nature Genitics 37(5): 495-500に記載された方法を用いて、欠乏していることを示すパラメータを用いて、hsa-miR-143に対する標的部位を含むことが予測されるヒトmRNAのリストを提供する。

例えば、miR-145miRNAの場合には、表２はKrekら(2005) Nature Genitics 37(5): 495-500に記載された方法を用いて、欠乏していることを示すパラメータを用いて、hsa-miR-145に対する標的部位を含むことが予測されるヒトmRNAのリストを提供する。

マイクロRNA結合の標的部位は、核酸の適切な位置における細胞の発現を調節する能力を有する核酸内に導入することができる。例えば、mRNA内に導入されている標的部位の場合においては（例えば、転写される遺伝子をコードするプラスミド内の適切な位置で標的部位をクローニングする方法によって）、標的部位は1つ以上のmRNAのコード領域である3’UTRと5’UTRに導入してもよい。核酸配列のクローニングの方法は本質的にSambook, J, Fritsch, F. F. およびManiatis,
T. Molecular Cloning: A Laboratoy Mannual 第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク（1989）に記載されている通りである。

例えば、miR-143および／もしくはmiR-145マイクロRNAの標的部位はHSVチミジンキナーゼ遺伝子の3’UTR内をクローン化することができる。この構造はmiR-143あるいはmiR-145マイクロRNAの活性および／もしくは発現の低下した細胞に発現した場合、これらの細胞の選択的除去を引き起こすであろう。

科学合成のような人工的に出現した標的部位の場合、核酸に導入される標的部位は当業者にはよく知られた方法で作り出すことができる。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはSteinら(1988) Nucl. Acids
Res. 16: 3209に記載されているような方法で合成することができる。その後、この標的部位は当業者にはよく知られた方法で核酸内に導入することができる。例えば、結合部位を含む相補性オリゴヌクレオチドはアニーリングし、その後適切なプラスミドの制限部位に導入することができる。

細胞の発現を調節する能力を有する核酸には、miRNA結合の標的部位の1つ以上の複製が含まれることもある。例えば、この核酸は標的部位の2、3、4つ以上の標的部位を含んでもよい。実際に標的部位の複数の複製が、細胞の発現を調節する能力を有する核酸の発現レベルを制御する程度をより大きくする可能性があることが予測される。

標的部位の複製は同一のまたは類似した標的配列の複製、あるいは1つ以上の異なるマイクロRNAに対する標的配列の1つ以上の複製であってもよいと理解されるであろう。

本発明はさらに、マイクロRNAの結合部位を含めた外因性核酸を含む細胞、あるいはマイクロRNAの結合部位に人工的に発生した核酸を含む細胞を提供する。

1つの形態において、この細胞はマイクロRNAの活性が低下した癌細胞あるいは前癌細胞である。癌細胞および前癌細胞の例はこの文書の中で先に論じた通りである。

したがって、他の形態において、本発明は、癌細胞あるいは前癌細胞において、同様の非癌細胞に比較してマイクロRNAの活性および/もしくは濃度が低下した、マイクロRNAの結合部位を含めた外因性核酸を含む癌細胞または前癌細胞を提供する。

前癌細胞あるいは癌細胞のようなこの細胞は、in vitroまたはin vivoにおいて存在できる。例えばこの細胞はin vitroにおける分離された細胞、あるいは臓器、組織または生物全体（例えば動物またはヒト被験者）のような生物系に存在する細胞であってもよい（例えば動物あるいはヒト被験者）。

このように、本発明はさらに、非癌細胞あるいは癌細胞を含む動物またはヒトを提供するものであって、この非癌細胞および癌細胞は共にマイクロRNA結合の標的部位を有する外因性核酸を含み、かつ／もしくは発現する。

したがって、他の形態において、本発明は癌細胞を含む動物を提供するものであって、前記の癌細胞はマイクロRNAの結合に対する標的部位を含めた外因性核酸を含む。

1つの形態において、マイクロRNA結合の標的部位は同様の非癌細胞に比較して、癌細胞における発現および／もしくは活性の低下したマイクロRNAに対する標的部位である。
このような結合部位の例はこの文書の中で先に論じた通りであり、miR-143および／もしくはmiR-145マイクロRNSに対する結合部位を含む。

1つの形態において、外因性核酸は動物の細胞の発現を調節する能力を有する。このような核酸の例はこの文書の中で先に論じた通りである。

細胞における外因性核酸の発現は当業者にはよく知られた方法で細胞内に核酸を導入することによって引き起こされる。原核細胞および真核細胞内に外因性DNAを導入する方法は本質的にSambrook,
J, Fritsch, E. F. およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual第2版Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ニューヨーク（1989）に記載された通りである。

動物の場合には、前記の動物はさらにその動物の細胞のゲノム内に組み込まれ安定である核酸を有する形質転換された動物であってもよい。形質転換された動物を産出する方法は当業者にはよく知られている。

本発明は、細胞の発現を調節する能力を有し、マイクロRNAの結合部位を含む核酸を提供する。

本発明の様々な形態における核酸は、クローニング、in vitroにおける転写（RNAに対する）、化学合成あるいはこのような方法の何らかの組み合わせのような、当業者にはよく知られた方法によって作り出すことができる。本発明はさらに、本発明の核酸を含むベクターおよびそのベクターと核酸を含む細胞を提供することができる。

細胞の発現を調節する能力を有する核酸の例は、この文書の中で先に論じた通りである。このようにこの核酸は細胞の発現を阻害する能力（例えば細胞増殖抑制または細胞毒性作用）を有する可能性があり、あるいは細胞の発現を促進する能力を有する可能性がある。

従って、他の形態において、本発明は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を提供するものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。マイクロRNAの結合部位はこの文書の中で先に論じた通りである。

1つの形態において、マイクロRNAの結合部位は、他の細胞に比較して、細胞における活性および／もしくは濃度の変化したマイクロRNAの結合部位である。

このように、この核酸は他と異なって発現したかつ／もしくは他と異なって活性を示すマイクロRNAの結合部位である。

この核酸は細胞の発現を阻害するかあるいは促進するかのいずれかの能力を有する。発現を調節する能力を有する核酸の例はこの文書の中で先に論じた通りである。

本発明の核酸は、細胞内に核酸を導入するために細胞に対する曝露用の組成物、あるいは動物またはヒト被験者に対する投与用の組成物に用いることができ、もしくはウイルスベクターのような、in vitroの細胞あるいはヒト被験者のような生物系における細胞に核酸を導入するための一部のベクターであってもよい。

この場合に、核酸は動物あるいはヒト被験者における細胞除去のような、動物またヒト被験者における細胞の発現を阻害する例として用いてもよい。

本発明の様々な形態における核酸は、分離された核酸であってもよい。この点において、「分離された（isolated）」という用語は、例えば自然環境から除去される核酸、ポリペプチド、あるいは細胞のような実在するものを意味すると理解すべきである。

本発明の様々な形態における核酸は細胞内に存在しているかおよび／もしくは発現する可能性がある。

したがって、他の形態では、本発明はさらに細胞の発現を調節する能力を有する外因性核酸を含む細胞を提供するものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

この細胞は原核細胞あるいは真核細胞であってもよい。

適している原核細胞の例はEscherichia coliである。このような細胞は核酸を含めたプラスミドを維持するためにおよび／もしくは増殖させるために有用である。適している真核細胞の例はヒト結腸細胞あるいはヒト結腸細胞由来の細胞である。

1つの形態において、この細胞は1つ以上のマイクロRNAのレベルおよび／もしくは活性が変化した真核細胞である。このような細胞の例はこの文書の中で先に論じた通りである。

この細胞はin vitroにおいて分離された細胞、あるいは臓器、組織、あるいは臓器全体（例えば動物あるいはヒト被験者）のような生物系に存在する細胞であってもよい。

1つの形態において、この細胞はマイクロRNAの活性が低下した癌細胞あるいは前癌細胞である。

したがって、他の形態において本発明はマイクロRNAの活性が低下した癌細胞あるいは前癌細胞を提供するものであって、この癌細胞または前癌細胞はこの細胞の発現を調節する能力を有する外因性核酸を含み、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。このマイクロRNAの活性の低下は同様の非癌細胞と類似している。

この癌細胞あるいは前癌細胞はin vitroにおいて分離された細胞あるいは臓器、組織または臓器全体（例えば動物またはヒト被験者）のような生物系に存在する細胞であってもよい。

例えば、この細胞、この細胞の発現を調節する能力を有する外因性核酸を共に発現する非癌細胞および癌細胞を含む動物またはヒト全体に存在する可能性があり、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

このように、本発明はまた非癌細胞および癌細胞を含む動物を提供するものであって、この非癌細胞および癌細胞は共に細胞の発現を調節する能力を有する外因性核酸を含み、さらに／もしくは発現するものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

1つの形態において、マイクロRNAの結合部位では、非癌細胞と比較して癌細胞において活性および／もしくは濃度が変化したマイクロRNAの結合部位である。

本発明は、また他と異なって発現した、および／もしくは他と異なる活性を示すマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を含む核酸を提供する。

したがって、他の形態において本発明は、マイクロRNAが他と異なって発現した、あるいは細胞間で他と異なって活性がある、マイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を人工的に出現させることを含む核酸を提供する。

この核酸は分離された核酸であってもよい。この核酸は細胞内に存在しおよび/もしくは発現する可能性がある。

他と異なって発現した、あるいは活性を示すマイクロRNAの結合部位は、異なる型の細胞間で発現および／もしくは活性が変化したマイクロRNAの結合部位である。

他と異なって発現したマイクロRNAの例には、大腸の腫瘍と正常な大腸組織との間に他と異なって発現したmiR-143およびmiR-145マイクロRNAが含まれる。

1つの形態において、結合部位は、正常細胞または非癌細胞における発現および/もしくは活性のレベルに比較して、癌あるいは前癌細胞における発現および/もしくは活性が低下したマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位である。例えば、このマイクロRNAは、正常細胞あるいは非癌細胞の発現および／もしくは活性のレベルに比較して、癌細胞あるいは前癌細胞の発現および／もしくは活性が低下する可能性がある。

したがって、他の形態において本発明は、同様の非癌細胞に比較して癌細胞においてダウンレギュレートされるマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を含む分離された核酸を提供する。

1つの形態において、この核酸は、細胞の発現を調節する能力を有する核酸である。細胞の発現を調節する能力を有する核酸はこの文書の中で先に論じた通りである。したがってこの核酸は細胞の発現を阻害（例えば細胞毒性あるいは細胞毒性作用）あるいは促進する可能性がある。

1つの形態において、この核酸は、他と異なって発現および／もしくは他と異なって活性を示す同一のあるいは異なるマイクロRNA結合のための2つ以上の結合部位が含まれる。

この核酸は、細胞内に核酸を導入させるために、この細胞に曝露させるためのあるいは動物またはヒト被験者に投与するための組成物に用いることができ、あるいは動物またはヒト被験者の細胞を含む細胞に導入するためのウイルスベクターのようなベクターの一部であってもよい

1つの形態において、この核酸は動物またはヒトの被験者における細胞の除去を含む、動物またはヒトの被験者における細胞の発現を阻害するために用いられる。

マイクロRNAに対する標的部位をデザインするための方法はこの文書の中で先に論じたとおりである。

結合部位が自然に発生するかどうか確認するための方法は当業者にはよく知られている。

例えば、BLASTアルゴリズムは、特定のゲノムにおける１つの標的配列と複数の標的配列の間のヌクレオチドの相同性の程度を測定するために用いることができる。BLASTによってデータベースにおける配列間の局所的整列が確認され、、偶然発生した局所的な整列の確率が予測される。BLASTアルゴリズムはAltschul ら(1990) J, Mol. Bio. 215: 403-410に記載されたとおりである。

この核酸は細胞に導入され、その後発現した外因性核酸であってもよい。

したがって、本発明はさらに、他と異なって発現しかつ／もしくは他と異なって活性を示すマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を含む核酸を提供する。

この細胞は原核細胞あるいは真核細胞であってもよい。

適した原核細胞の例はEscherichia coliである。このような細胞は、核酸を含むプラスミドの維持および／もしくは増殖のために有用である。

1つの形態において、この細胞は１つ以上のマイクロRNAのレベルおよび／もしくは活性の変化した真核細胞である。このような細胞の例はこの文書の中で前記の通りである。

この細胞はin vitroにおいて分離された細胞であり、もしくは臓器、組織、または臓器全体（例えば動物またはヒト被験者）に存在する細胞のような生物系に存在する細胞であってもよい。

1つの形態において、この細胞は癌細胞あるいは前癌細胞である。

したがって、他の形態において、本発明はマイクロRNAに対する自然に発生した結合部位を含めた核酸を含む癌細胞あるいは前癌細胞を提供する。

1つの形態において、この細胞はマイクロRNAの活性の低下した癌細胞あるいは前癌細胞である。

したがって、他の形態において、本発明はマイクロRNAの活性の低下した癌細胞あるいは前癌細胞を提供するものであって、この癌細胞あるいは前癌細胞は、同様の非癌細胞に比較して癌細胞あるいは前癌細胞において他と異なって発現しかつ／もしくは他と異なって活性を示すマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を含む核酸を含む。

例えば、この細胞は非癌細胞および癌細胞を含む動物またはヒト全体に存在し、もしくはそのいずれかまたは両方が人工的に発生したマイクロRNAの結合部位を含む核酸を含みかつ／もしくは発現する可能性がある。

したがって、他の形態において本発明は、癌細胞を含む動物を提供するものであって、そのがん細胞は人工的にマイクロRNAの結合部位を発生した核酸を含む。

1つの形態において、このマイクロRNAは非癌細胞と比較して癌細胞において他と異なって発現し、あるいは他と異なって活性を示す。

したがって、他の形態において、本発明は非癌細胞および癌細胞を含む動物を提供するものであって、この非癌細胞および癌細胞は共に、非癌細胞と比較して、癌細胞において他と異なって発現し、あるいは他と異なって活性を示す人工的に発生するマイクロRNAの結合部位を含む核酸を含みかつ／もしくは発現する。

本発明の核酸は当業者にはよく知られた適切な方法で細胞内に導入することができる。例えばこの核酸はリン酸カルシウム、ウイルス感染、もしくは電気穿孔法、リポフェクション、あるいはパーティクルガン法を用いた形質転換によって細胞内に導入することができる。この点において形質転換された細胞には、挿入されたDNAが内在性に複製したプラスミドとして、あるいは宿主クロモゾームの一部としてのいずれかとして複製が可能である形質転換され安定である細胞、もしくは一過性に一定期間挿入されたDNAあるいはRNAを発現する細胞が含まれる。原核細胞および真核細胞に外因性DNAを導入する方法は本質的にSambrook,
J, Fritsch , E. F. およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory
Manual第2版Cold Spring Harbor
Laboratory Press, ニューヨーク（1989）に記載された通りである。

mRNAである核酸の場合には、mRNAは適切なDNAの転写によって細胞内で作られる可能性がある。あるいは、mRNAは、細胞内に導入される外因性mRNAであってもよい。in vitroにおいてmRNAを生成する方法は当業者にはよく知られている。

DNA鋳型から細胞内に発現したmRNAに対して、標的部位は、当業者にはよく知られた方法で対象の細胞型に使用するために適した発現ベクターをクローン化することができる。核酸配列の分離の方法および適切な発現ベクタをクローニングする方法は本質的にSambrook, J, Fritsch , E. F. およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク（1989）に記載された通りである。この組み換え分子はその後細胞内に導入し核酸をクローン化することができる。このベクターはベクター内に異質の核酸を挿入させる能力のある核酸である可能性がある。例えばこのベクターはすべてまたは一部のウイルスゲノムであるプラスミド、もしくは原核もしくは真核宿主の内在性複製ができるあらゆる他の核酸であってもよい。

本発明はさらに、本発明の様々な核酸を含むベクターを提供する。

1つの形態において、このベクターは、感染によって核酸の標的細胞への導入を可能にするウイルスベクターである。細胞に核酸を送達するために利用することができるこのようなウイルスベクターの例には、組み換えアデノウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えレトロウイルス、組み換えアデノ随伴ウイルス（AAV）、組み換えヘルペスウイルス、組み換えSV-40ウイルス、Epstein-Barr ウイルス、もしくは組み換えワクシニアウイルスのような組み換えポックスウイルスが含まれる。

したがって、1つの形態において、本発明は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を含むウイルスベクターを提供するものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

他の形態において、本発明はさらに他と異なって発現したマイクロRNAに対する人工的に発生した結合部位を含む核酸を含むウイルスベクターを提供する。

この場合において、ウイルスベクターはすべてあるいは一部のウイルスゲノムから作り出すことができることが理解されるであろう。このウイルスベクターはまた、自然に発生したウイルスあるいは組み換えウイルスである可能性があり、さらに複製欠損があるか、または十分な複製能力がある可能性がある。

理解されるであろうが、プラスミドまたはウイルスベクターにおける挿入された適切なDNAの発現には、一般的に当業者にはよく知られた、挿入された核酸の発現のための様々な制御エレメント、例えば特定の細胞における挿入された核酸の発現を促すためのプロモーター、挿入された核酸から転写されたmRNAの効果的なポリアデニル化のためのポリAシグナル、あるいは翻訳、転写またはmRNAの安定性を制御するための他の制御エレメントが必要であろう。

調節される細胞型によって、発現を促すプロモーターは構成的プロモーター、誘発性プロモーターあるいは細胞または組織特異性プロモーターであってもよい。

哺乳動物の構成的プロモーターには、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPTR）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセレートキナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびβ-アクチンが含まれる。真核細胞において構成的に機能する代表的なウイルスプロモーターには、サルのウイルス、乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全症候群ウイルス（HIV）、ラウスニワトリ肉腫、サイトメガロウイルス、モロニー白血病の長末端反復（LTR）と他のレトロウイルス、および単純ヘルペスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。

誘発性プロモーターには、TetO/TetRシステムによって制御された合成プロモーター、およびいくつかの金属イオンの存在下で転写を誘発するために用いられる可能性のあるメタロチオネインプロモーターのような誘発性プロモーターが含まれる。他の誘発性プロモーターは当業者にはよく知られている。

組織特異性プロモーターは個々の細胞型によって決まってくるであろう。例えば、大腸癌細胞における発現を可能にするプロモーターには、ヒト胎児性抗原（CEA）の制御配列が含まれる[accession:
O17131; gi|967132]。

本発明はさらに、この文書の中に記載した様々な核酸を含む組成物を提供する。

したがって、１つの形態において、本発明はさらに、細胞の発現を調節する能力を有する核酸を含む組成物を提供するものであって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む。

他の形態において、本発明は他と異なって発現した、あるいは他と異なって活性を示す人工的に発生したマイクロRNAの結合部位を含めた核酸を含む組成物を提供する。

この組成物は本発明の核酸を細胞に曝露させるために適している。細胞内に核酸を導入する方法はこの文書の中で先に論じたとおりである。

本発明の組成物は、マイクロRNAの活性および／もしくは発現が低下した細胞に関連した疾患（disease）、異常（condition）、または状態（state）を予防および／もしくは治療するための被験者に対する投与に適している。

例えば、核酸は被験者に投与するための組成物を作るために製剤学的に許容できる基剤、安定剤、緩衝剤あるいは賦形剤と組み合わせてもよい。このように、本発明はさらに、許容できる基剤中に本発明の１つ以上の核酸を含む製剤学的組成物を提供する。

核酸は当業者にはよく知られた方法で細胞または被験者に送達できる。例えば、核酸分子は、リポソーム内カプセル化、イオン電気泳動法、あるいは生体分解性のポリマー、ヒドロゲル、シクロデキストリン、乳酸グリコール酸共重合体（PLGA）およびPLCA微粒子、生体分解性ナノカプセル、および生体付着性微粒子のような、他の賦形剤中に組み入れる方法によって細胞に投与できる。核酸分子は、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-GAL）またはポリエチレンイミン-ポリエチレングリコール-3-N-アセチルガラクトサミン（PEI-PEG-3GAL）誘導体のようなその誘導体と共に製剤化あるいは複合体を形成することもできる。

被験者に投与するために、核酸は、製剤学的組成物を作るために安定剤、緩衝材などを共にあるいはこれらを用いないで標準的な方法で投与し、また導入することができる。適した剤形はある程度、例えば経口的、経皮的、注射、あるいはウイルスによる感染による送達などの投与法または投与経路によって決まる。

リポソーム送達メカニズムを用いることが適切である場合、リポソーム形成の標準的プロトコールは以下の通りである。本発明の組成物は、経口投与用の錠剤、カプセルあるいはエリキシル、直腸投与用の坐剤、滅菌溶液、注射用懸濁液、および当業者にはよく知られた他の組成物として製剤化し使用できる。

ポリエチレングリコール脂質（PEG修飾、もしくは循環滞留リポソームまたはステルスリポソーム）は標的組織における薬剤の蓄積を増大させる方法を意図する。

全身的な吸収を引き起こす投与経路には、静脈内、皮下、腹腔内、吸入、経口、肺内および筋肉内投与経路が含まれる。個々のこれらの投与経路によって、本発明の核酸を細胞あるいは組織に曝露する。

本発明の核酸は一般的に疾患（disease）、異常（condition）、または状態（state）を予防し、発症を阻害しあるいは治療する（症状をある程度まで軽減するために）ために製剤学的有効量で送達されるであろう。製剤学的有効量は、治療が行なわれた疾患（disease）、異常（condition）、用いられた組成物、投与経路、治療された被験者の型、考慮に入れた特定の被験者の肉体的特徴、併用薬、および医療の専門家には理解されるであろう他の因子によって決まる。一般的に0.1mg/kgから100 mg/kg体重/日までの量の原薬が投与される。

本発明の核酸、および組成物およびその製剤は、経口的に局所的に、非経口的に、吸入またはスプレーで、従来の非毒性の製剤学的に許容できる基剤、補助薬および／もしくは賦形剤を含む単位用量型の剤形で直腸に、補助薬および／もしくは賦形剤として投与できる。「非経口的に（parenteral）」という用語には経皮の、皮下の、血管内（例えば、静脈内）、筋肉内、あるいは鞘内注射もしくは点適法などが含まれる。

先に論じたように、本発明はさらに、本発明の核酸分子および製剤学的に許容できる基剤を含む製剤学的組成物を提供する。１つ以上の核酸分子は、１つ以上の非毒性の製剤学的に許容できる基剤および／もしくは希釈剤および／もしくは補助剤と共に存在することができる。本発明の核酸分子を含む製剤学的組成物は、例えば錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性または油性懸濁液、分散性散剤または顆粒剤、硬カプセルまたは軟カプセル、あるいはシロップまたはエレキシルのような経口投与に適した剤形である。

経口投与用の組成物は当業者にはよく知られた適切な方法に従って調製できる。組成物には、製剤学的に許容できる製剤を供給するために、１つ以上のこのような甘味料、香味料、色素剤または防腐剤が含まれる。錠剤には、錠剤の製造に適した非毒性の製剤学的に許容できる添加物と混合した原薬が含まれる。これらの添加物は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウムのような不活性希釈剤；顆粒化剤と崩壊剤、例えば、コーンスターチ、あるいはアルギニン酸；結合剤、例えばデンプン、ゼラチンあるいはアカシア；および潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクであることもある。この錠剤はコーティングされていないこともあり、あるいはよく知られた方法でコーティングされていることもある。このようなコーティングは、消化管内での崩壊と吸収を遅らせるためによく知られた方法で調製され、それによってより長時間にわたる持続性作用をもたらす場合がある。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような作用時間遅延剤が使用されることもある。

経口投与用の剤形はさらに、原薬が、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンのような不活性の固体希釈剤と混合されるゼラチン硬カプセルとして、あるいは原薬が例えばピーナッツオイル、液体パラフィンまたはオリーブオイルのような油性媒質と混合されるゼラチン軟カプセルとしての特徴を示すこともある。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した添加物との混合物中に主成分を含む。このような添加物は、懸濁剤（例えばカルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴムおよびアラビアゴム）である；分散剤または湿潤剤は、自然に発生したホスファチド（例えばレシチン）、あるいは脂肪酸を有する酸化アルキレンの圧縮製剤（例えばステアリン酸ポリオキシエチレン）、あるいは長鎖脂肪族アルコールを有するエチレンオキサイドの圧縮製剤（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、あるいは脂肪酸とモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトールのようなヘキシトール由来の部分エステルを有するエチレンオキサイドの圧縮製剤、あるいは脂肪酸とヘキシトール無水物（例えばモノオレイン酸ポリエチレンソルビトール）由来の部分エステルを有するエチレンオキサイドの圧縮製剤であることもある。水性懸濁液はさらに１つ以上の防腐剤（例えばエチル-p-ヒドロキシベンゾエート、またはn-プロピル-p-ヒドロキシベンゾエート）、１つ以上の色素剤、１つ以上の香味料およびショ糖またはサッカリンのような１つ以上の甘味料を含むこともある。

油性懸濁液は、植物油中（例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）、あるいは液体パラフィンのような鉱油中に原薬を懸濁することによって製剤化できる。油性懸濁液は増粘剤（例えばビーズワックス、硬パラフィンあるいはセチルアルコール）を含むこともある。風味がよい経口製剤を供給するために甘味料と香味料が加えられることもある。これらの組成物はアスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって防腐処理できる。

水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性散剤および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つ以上の防腐剤と混合した原薬を提供する。適切な分散剤または湿潤剤または懸濁剤は、前記によって例証される。他の添加物（例えば甘味料、香味料、および色素剤）も存在する。

本発明の製剤学的組成物はさらに、水中油型乳剤の形にできる。油相は植物油あるいは鉱油あるいはこれらの混合物であることもある。適した乳化剤は、自然に発生したゴム（例えばアラビアゴムまたはトラガカントゴム）、自然に発生したホスファチド（例えばダイズ、レシチン）、および脂肪酸とヘキシトール無水物由来のエステルまたは部分エステル（例えばモノオレイン酸ソルビタン）、およびエチレンオキサイドを有する前記の部分エステルの圧縮製剤であることもある。乳剤はさらに甘味料および香味料を含む。

シロップおよびエリキシルは、甘味料（例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、ブドウ糖あるいはショ糖）を用いて製剤化できる。このような製剤はさらに、粘滑剤、防腐剤および香味料と色素剤を含むこともある。製剤学的組成物は滅菌した注射用の水性または油性懸濁液の形であることもある。注射用滅菌製剤はさらに非毒性の非経口的に許容できる希釈剤もしくは溶媒（例えば1,3-ブタネジオール）中の注射用滅菌溶液または懸濁液であることもある。利用可能な許容できる賦形剤および溶媒は、水、リンゲル液および塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌した不揮発油は通常溶媒あるいは懸濁剤として利用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセライドを含めて、あらゆる有名銘柄の不揮発油を利用することができる。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は注射用剤の調製に用途がある。

本発明の核酸分子はさらに坐薬（例えば薬剤の直腸投与用）の形で投与できる。これらの組成物は、核酸を通常の温度で固体である適切な非刺激性の添加物と混合することによって調製できるが、直腸の温度では液体であり、そのため直腸内で溶解し核酸を放出する。このような材料にはココアバターおよびポリエチレングリコールが含まれる。

本発明の核酸分子はさらに滅菌培養液中で非経口的に投与できる。この核酸は、賦形剤と用いられた濃度によって決まり、賦形剤中で懸濁されるか溶解されるかのいずれかが可能である。好都合なことに、局所麻酔剤のような補助薬、防腐剤および緩衝剤は賦形剤に溶解できる。

あらゆる個々の被験者に対する個々の用量レベルは年齢、体重、全身の健康状態、投与時期、投与経路、および排出の割合、薬剤の併用および治療を受けた個々の疾患の重症度によって決まることが理解される。

ヒト以外の動物に対する投与について、この組成物はさらに動物の飼料あるいは飲料水に加えることができる。動物が食餌と一緒に治療的に適切な量のこの組成物を摂取するように、動物の飼料と飲料水の組成物を製剤化することが便利である。さらに飼料または飲料水に添加するためのプレミックスとしてこの組成物を提供することが便利である。

本発明の核酸分子はさらに全体の治療的効果を増大させるために他の治療的化合物と併用して被験者に投与できる。適応症の治療に複数の化合物を投与することは有益な作用を増大させ、一方で副作用の存在を減少させることができる。

本発明の様々な組成物がさらに個々の細胞型に対する本発明の核酸分子の投与用に製剤化できる。例えばアシアロ糖タンパク受容体のような受容体は、肝細胞に対して特有であり、アシアロオロソムコイドのような枝分かれしたガラクトース末端糖タンパクに結合する。あるいは、葉酸受容体のような一部の受容体は多くの癌細胞において過剰発現する。細胞膜を通して外因性化合物を輸送するためのガラクトース、ガラクトサミン、もしくは葉酸を基にした抱合体を投与することによって、例えば肝疾患、肝臓の癌、あるいは他の癌の治療に対する標的となる送達方法を可能にする。

本発明の核酸分子はさらにB型肝炎ウイルスまたはLエンベロープタンパクのようなナノ粒子と複合体を形成し、あるいは共有結合で結合する可能性がある。

あるいは、本発明の核酸分子のうちのいくらかは、先に論じたような真核プロモーターから細胞内に発現することもある。

本発明の核酸を発現したウイルスベクターは、例えばアデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、もしくはアルファウイルスを基にして構成されることもある。このウイルスベクターは細胞内に核酸を導入するために用いることができるか、あるいはこのウイルスベクターは細胞に本発明の核酸を導入するために用いられる容器に入れられた病原体であることもある。このウイルスベクターは核酸分子の一過性の発現あるいは安定した発現を可能にする。

生物分子の治療的送達は一般的にBladon, C. (2002) “Pharmaceutical Chemistry:
Therapeutic Aspects of Biomolecules” John Wiley & Sons Ltd.に記載された通りである。

ウイルスおよび遺伝子治療法は一般的に “Viral Vectors for Gene Therapy: Methods
and Protocols” Edited by Jules G Constant, Curtis A Machida (2003) Humana Press
Inc., “Gene Delivery to Mammalian Cells: Viral Gene Transfer Techniques” Edited
by William C Heiser (2004) Humana Press Inc., “Viruses in Human Gene Therapy”
Edited by J.H. Vos (1995) Carolina Academic Press, and “Viral Therapy Of Human
Cancers” Edited by J.G. Sinkovics and J.C. Horwath (2005) Marcel Dekkerに記載された通りである。

本発明はさらに癌細胞あるいは前癌細胞における核酸の濃度を調節するために適している。

この場合には、癌細胞におけるマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が変化することによって、核酸内にマイクロRNA結合の標的部位が含まれることにより細胞内の核酸の濃度を調節できるようになる。理解されるであろうが、核酸の濃度の調節は、マイクロRNAの活性および／もしくは発現の変化しない同様の細胞と類似している。

例えば、癌細胞のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下によって、核酸内にマイクロRNA結合の標的部位が含まれることにより細胞内核酸濃度の調節が可能になる。

したがって、本発明はさらに、癌細胞において発現した核酸の濃度を調節する方法を可能にするものであって、この癌細胞は同様の癌細胞と比較して、マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が変化し、この方法は細胞に発現することになる核酸内にマイクロRNA結合の標的部位を導入する段階を含む。

細胞内に核酸をクローニングし導入する方法は先に論じた通りである。核酸の濃度の測定はノーザン分析、RT-PCRあるいはRNase防御のような、当業者にはよく知られた適切な方法で行なうことができる。

本発明はさらにin vitroにおける癌細胞あるいは動物またはヒトの癌細胞あるいは前癌細胞のような、癌細胞あるいは前癌細胞におけるマイクロRNAの活性および／もしくは濃度の変化を確認するのに適している。この場合に癌細胞および非癌細胞は共にマイクロRNA結合の標的部位を含むリポーター核酸を発現し、癌細胞および非癌細胞におけるリポーター核酸の発現のレベルを測定することによって、また癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルと比較して癌細胞において癌細胞のリポーター核酸の発現の変化による癌細胞のRNA活性の変化を確認することによって、マイクロRNAの活性の変化が確認される可能性がある。

例えば、本発明は、癌細胞あるいは前癌細胞におけるマイクロRNA活性および／もしくは濃度の低下を確認するために適している。癌細胞および非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定することによって、また非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルと比較して癌細胞におけるリポーター核酸の発現の増加による癌細胞のマイクロRNA活性の低下を確認することによって、癌細胞におけるマイクロRNA活性の低下が確認される可能性がある。

したがって、他の形態において、本発明はさらに癌細胞あるいは前癌細胞におけるマイクロRNA活性および／もしくは濃度の変化を確認する方法を可能にするものであって、この方法は：
癌細胞あるいは前癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定すること、また非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定すること；そして
非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルに比較して、癌細胞におけるリポーター核酸の発現の増大による癌細胞におけるマイクロRNA活性の低下を確認すること
の段階を含む。

1つの形態において、癌細胞は動物あるいはヒト被験者に存在する。

非癌細胞は同一のまたは類似した細胞であってもよい。１つの具体例として、癌細胞（または前癌細胞）および非癌細胞は共に動物あるいはヒト被験者に存在する。

１つの形態において、この方法は、非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルと比較して癌細胞におけるリポーター核酸の発現の増加を確認することによってマイクロRNA活性の低下を確認するために用いることができる。

癌細胞（または前癌細胞）におけるリポーター核酸は非癌細胞に存在するものと同一のあるいは類似したリポーター核酸である。

適したリポーター核酸は当業者にはよく知られている。例えば、このリポーター核酸はLacZまたはGFPのような検出可能な生成物を産生する可能性がある。あるいは、このリポーター核酸は、リポーター核酸によってコードされたタンパクに対して生じた抗体を使用することによって、免疫学的検出法によって確認することができる。リポーター核酸を確認する他の方法は、検出できるように標識された相補的核酸プローブを用いたハイブリッド形成の利用によるものである。

最後に、組み換えDNA法、オリゴヌクレオチド合成法、組織培養および形質導入（例えば、電気穿孔法、リポフェクション）については標準的な方法が用いられる。酵素反応および精製法は、製造業者の仕様書に従って、あるいは一般に当業者によって達成されるように、あるいはこの文書の中に記載されたように行なうことができる。前記の方法および手順は一般的に当業者にはよく知られた従来の方法に従って、また本明細書全体にわたって記載され論じられている様々な一般的かつより明確である参考文献に記載されているように実施してもよい。Sambrook, J, Fritsch, E. F. およびManiatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク（1989）およびAusubel, F.M. (1989) Current Protocols in
Molecular Biology, John Wiley & Sons, ニューヨーク, ニューヨーク州を参照のこと。

（好ましい実施例の説明）
参考文献は本発明の前記の一般的原則を実施する実験に対して作成されるであろう。しかしながら、以下の記載内容は前記の記載の一般的原則を限定するものではないということを理解すべきである。

（例１）
（組織検体および細胞系からのRNA分離）
細胞系は適切な培養液内で維持できる。結腸直腸腫瘍およびそれに一致する正常な粘膜は、患者からのインフォームドコンセントに従って新鮮な外科的切除標本から入手し、その後標準的な組織病理学的分類法に従って分類することができる。

RNAは、製造業者の仕様書に従ってトリゾール試薬（Invitrogen、カールズバッド、カリフォルニア州）を用いて細胞系から分離することができる。RNAはChomczynski,
P..sacchi, N. (1987). Anal Biochem. 162: 156-159の手法を用いて直腸結腸組織から精製することができる。

（例２）
（マイクロRNAのクローニング）
miRNAは、本質的にElbashiraら(2001) Genes Dev. 15: 188-200によって報告されたとおりクローン化できるが、例外として核酸がBiotrapシステム（SchleicherおよびSchnell GmbH,
Dassel, ドイツ）を用いてアクリルアミドゲルスライスから電気的に溶出される可能性がある。簡潔に言えば、塩基18と26の間の小さなRNAフラクションが、変性したポリアクリルアミドゲル上で大きさが選定される可能性がある。アダプターであるEcoRI制限部位を含むオリゴヌクレオチドはRNA分子と指向性をもって結合される可能性がある。その後アダプターが結合したRNAはRT-PCRによって増幅することができる。200 bpと650bpの間に、再結合しEcoRIで蒸解されたPCR産物の多量体を含むコンカタマーとなったフラグメントは、アガロースゲル上に大きさが選択され電気的溶出によって回復した。その後コンカタマーは末端修復され、Taq DNAポリメラーゼによってdAが末端につながれ、製造業者の指示に従ってpGEM T-easy（Promega、マディソン、ウィスコンシン州）あるいはpTOPO (Invitrogen)内にクローン化された。選択された挿入断片の核酸配列はその後ExoSAP-ITプロトコール（USB社、クリーブランド、オハイオ州）に従って、Esonuclease IとShrimp
Alkaline Phosphataseを用いてPCR産物の処理後確認された。この手法によって作成されたクローンはPCR産物のコンカタマーを含み、一般的に２つから５つまでの独立した小さなRNAを表すと考えられる。

（例３）
（ノーザン分析）
15％の変性したポリアクリルアミドゲル上に全量のRNA(20μg)を分解して取り出した。ローディングが臭化エチジウム染色によって視覚化される。その後RNAは半乾きのブロッティングによって、Hybond
N+ナイロン膜に移入することができる（OWL Separation Systems、ポーツマス、ニューハンプシャー州）。プローブはT4ポリヌクレオチドキナーゼ（New
England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州）が関与する[γ-32P]ATPを有するDNAオリゴヌクレオチドの末端標識によって作成することができる。このプローブの特異的作用を増大させるために、miRNA配列は直接反復の三量体としてコンカタマーとなる可能性があり、その後M13 forwardプライマーおよびreverseプライマーを有するPCRを用いて増幅されたpGEM T-easyとこの挿入断片内にクローン化した。その後アンチセンスプローブは、Taqpolymeraseを生成した線状増幅を用いてSephadex
G-50精製PCR産物から合成され、複数の[γ-32P]dCTP塩基を組み込んだ。

フィルターハイブリダイゼーションは、製造業者の推奨に従って、洗浄と共に、10⁶ cpm/ml のプローブを含むQuikHyb溶液（Stratagene、ラ・ホーヤ、カリフォルニア州）中で維持間実施できる。フィルターはFujifilm-BAS 2500 phoshorimagerを用いて分析し、またシグナル強度はAnalytical Imaging Station (version 3.0) ソフトウェア（Imaging Research社、Brock大学、オンタリオ、カナダ）を用いて定量した（光刺激蛍光強度／mm²）。

miRNA配列はGenbankおよびEMBL公設ヌクレオチドデータベースと比較して、BLAST（Altschulら (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410）を用いて確認できる。マイクロRNAはさらにmiRNA記録一覧表のデータベースと比較することによって確認できる。推定pre-miRNAヘアピン構造の二次構造をMfold 3.1アルゴリズム（Mathewsら (1999) J.Mol. Biol. 288: 911-940）を用いて測定できる。可能性のあるmRNA標的配列は、BLASTおよびFASTAアルゴリズムを用いてGenbank非重複およびdbESTデータベースを検索することによって確認できる（Pearson, W.R. およびLipman,
D.J. (1988) Proc, Natl. Acad. Sci. USA, 85: 2444-2448に報告されたとおり）。

（例４）
（結腸直腸マイクロRNAの確認）
結腸腺癌およびそれと一致した正常な粘膜から共に精製された、RNA全体の小さいRNAフラグメント（塩基18から27まで）を大きさによって分画し、クローン化することができる。その後癌由来の検体から得られたクローンおよび正常な粘膜を示すクローンの配列を決定できる。配列分析と比較は、多くのクローンの同定と転写のための可能なゲノム開始点に対する割付を可能にする。

（例５）
（結腸直腸組織および癌細胞系におけるマイクロRNAの蓄積）
様々な配列がmiRNAとして蓄積されることを確認するために、またmiRNAの安定状態のレベルにおける変化が腫瘍上皮に関連があるかどうか検討するために、ノーザンブロット解析法が一致した結腸直腸癌と正常な粘膜標本由来のRNAのパネルに対して実施できる。

ノーザンブロット解析は、様々なヒト癌細胞由来の細胞系における成熟miRNAと前駆体ヘアピン分子のレベルを測定するために用いてもよい。

（例６）
（miR145標的配列のGFP内へのクローニング）
哺乳動物のEnhanced Green Fluorescence Protein (EGFP) 発現カセット（pMM043; 図２）は、BamHI/NotI線状 pcDNA3.1(+)
(Invitrogen)内に、BglII/NotI としてpEGFP1 (Clontech) からEGFPコーディング配列を指向性を有して挿入することによって作成される。miRNA相補性標的配列およびin vivoにおける予測された標的配列の挿入の便宜的な部位を提供された、リポーター遺伝子3’非翻訳領域における、この独自のNotIとXbaI部位はオリゴヌクレオチド#527（5’-CTAGCAGATCCTGGGAAAACTGGAC-3’;
SEQ ID NO.1）と#528（5’-CTAGGTCCAGTTTTCCCAGGATCTG-3’;
SEQ ID NO.2）をアニーリングすることによって作成され、その後pMMo43のXbal部位に、予測されたRICS遺伝子miR145標的配列を含むハイブリッドに結合する。pMM095のヌクレオチド配列は配列一覧表に記載されSEQ ID NO.153と表される。

（例7）
（miR145前駆体分子を過剰発現する細胞においてmiR145標的配列によるGFPの発現が抑制される）
（i）Pri-miR145発現コントラクト：
Pri-miR145転写のフラグメントは、cDNAクローンFLJ36638 fis（Genbank ID : 21752921）の184と734の位置に一致した配列のPCR増幅によってクローン化された。循環条件：94℃ 3分；40増幅サイクル94℃ 30秒 , 55℃ 30秒 , 72℃1分 , 72℃ 10分と最終的な延長72℃ 10分で、鋳型として50ngのHeLaゲノムDNAを用いた標準的PCR反応において、用いられたオリゴヌクレオチドは#556（5’-TCCGGTACTTTTCAGGGCAA-3’;SEQ
ID NO.4）および（5’-CAAGAAACGCATGCCTGACG-3’;SEQ ID NO.5）であった。550bp産物は、プラスミドpMM105を作るために精製されpGEMT-easy
(Promega) 内にクローン化されたアガロースゲルであった。その後pMM105（SEQ ID NO.154）のEcoRI挿入断片はEcoRI線状pcDNA3.1（+）（Invitrogen）に結合し発現コンストラクト：pMM109（1本鎖センス挿入断片；図8）,pMM106（1本鎖アンチセンス挿入断片；図6）,およびpMM107（縦列センス挿入断片；図7）を作る。pMM106のヌクレオチド配列は配列一覧表に記載され、SEQ ID NO.155と表されている。pMM107のヌクレオチド配列は配列一覧表に記載され、SEQ ID NO.157と表されている。pMM109のヌクレオチド配列は配列一覧表に記載されSEQ ID NO.157と表される。

（ii）トランスフェクション：
HeLa細胞のコトランスフェクションには、標準FuGene6（Roche）プロトコールを用いて、24ウェル培養プレートにおいて0.1μgから1μgまでのpri-miR145発現ベクター（pMM107、pMM106、pMM107）を用いた0.1μgのpMM095のFuGene6（Roche）が関与するトランスフェクションが含まれる。EGFP活性は、生きた細胞の直接の蛍光として、トランスフェクションの3日後に、Typhoon fluorimager（Amersham Biosciences）上に検出され、Imagequantソフトウェアを用いて定量した。

このmiRNAであるmiR145はHeLa（子宮頸癌）細胞において非常に低レベルまで蓄積するにすぎない。miR145標的配列（RICS転写から）を含む増強されたGreen Fluorescence Protein（EGFP）リポーター遺伝子コンストラクトはトランスフェクトされた細胞の蛍光によって検出されたように、標的配列のないEGFPコンストラクトと同じ程度にこれらの細胞内で活性を示す。

しかしながら、図2に示したように、細胞がmiR145前駆体分子であるpri-miR145と過剰発現するコンストラクトによってコトランスフェクトされる場合、EGFP活性は、用量反応試験法で起こった抑制によって強く抑制される。

（例8）
（miRNA標的配列をリポーターおよび細胞毒性遺伝子に組み込むこと）
構成的発現ベクター内のリポーター遺伝子（EGFP、LacZ、Renillaルシフェラーゼ）の3UTRにおいてmiR143とmiR145に対する相補性標的配列の組み合わせを含むよう一連のコンストラクトが作られるであろう。これらのベクターにはプラスミド（リポソームが関与するトランスフェクションおよびマウス形質転換）およびレンチウイルス系が含まれるであろう。

転写の抑制に対する無関係の標的配列（もしくはmiRNA反応エレメント：MRE）の寄与が蓄積的であることがわかっているため、個々のMREの4つの複製までを含む組み合わせも作られるであろう。

前記のEGFPコンストラクトは、3’UTRのNotI部位にクローン化された種々の配列（miR145およびmiR143相補性配列の4つの複製まで）を含むクローンと併用して用いられるであろう。LacZコンストラクトはAnsonおよびLimberis（2004）J . Biotechnology 108:
17-30 によって報告された合成のコドンによって最適化されたβ-ガラクトシダーゼ配列に基づいているであろう

LacZプラスミドベクターはpcDNA3.1（＋）発現バックボーンに基づいており、その標的配列は3’UTRのNotI部位にも挿入されるであろう

ルシフェラーゼコンストラクトは、合成Renillaルシフェラーゼ遺伝子の3’UTRにおいて複数のクローニング領域への標的配列の挿入によってpsiCHECK^TM-2ベクター（Promega）を用いて作成されるであろう。psiCHECK^TM-2ベクターはさらにトランスフェクションの効率を標準化するために内部対照としてホタルルシフェラーゼを提供する。トランスフェクトされた、形質導入された（レンチウィルス誘導体の場合には）細胞のルシフェラーゼ活性はDual Luciferase（商標） Assayシステム（Promega）を用いて製造業者の指示に従って検出されるであろう。

（例9）
（培養された細胞におけるmiRNA標的配列の効果）
miR143とmiR145によってもたらされた抑制機能の欠如した疾患（癌）細胞によって、我々がこれらの細胞における治療用遺伝子の発現を制御するこの現象を利用できる可能性が検討できるようになる。

EGFPコンストラクトにおいてRICS MREを用いた実験から得られた結果は、miR145の存在が異質の遺伝子（相補性3’UTR配列を含む）の発現を制限するであろうということを示している。

かなりのレベルの成熟miR143またはmiR145を蓄積する哺乳動物の細胞系は、依然として確認されていない。細胞系におけるmiR143の欠如は他の研究者によっても報告されており、これらのmiRNAによって基礎となるプロセス（増殖のような）の制御の結果であると仮定される。

「正常な」細胞の状態をまねてこれらのmiRNAを誘発できるシステムを作るために、dox-誘発性miR145HeLa細胞系が作成され、miR145レベルと標的配列との間の化学量論および遺伝子発現を抑える能力についての研究が可能になるであろう。このことによって、細胞質miR145の閾値レベルが、リポーター遺伝子（EGFP,
LacZ , ルシフェラーゼ）活性および細胞毒性遺伝子（単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ）機能を抑制するために必要であるかどうかin vitroにおいて確認できるようになるであろう。

ドキシサイクリン-誘発性pri-miR145発現コンストラクトは、非反復AscI（平滑）とPmlI部位の間のTet誘発性発現カセットpMM060においてEGFPを置換するためにpMM106（前記のpri-miR145サブフラグメントを含み）からPmeI挿入断片を組み入れることによって作成された。pMM060は、ネズミの構成的ホスホグリセレートキナーゼ制御配列の制御下でトランスプレッサーを用いて、Rossiら（1998）Nat Genet . 20(4): 389-93によって報告されたTet-反応性プロモーターとtTR修飾を共に利用する。 550bP pri-miR145部分配列の1本鎖センス複製を有するコンストラクトはpMM110と呼ばれる。

HeLa Tet-On細胞（Clontech）はFuGene 6が関与するトランスフェクションを用いてpMM110コンストラクトによって形質転換され安定であり、ゲンチシンおよびプロマイシンに対する選別に続いて、クローナル系が分離されている。異なるHeLa Tet-On/pMM110系は、１μgのドキシサイクリン／mLの成長促進剤に曝露した２４時間後にpri-miR145導入および成熟miR145蓄積の様々なレベルを示す。

（例１０）
（初代結腸細胞におけるmiRNA標的配列の効果）
哺乳動物の組織において、miR143およびmiR145 MREが移植遺伝子の疾患特異性発現を可能にするかどうか確認することが必要である。結腸上皮と腺癌におけるmiR143／miR145遅延遺伝子発現の迅速検定法を開発するために、また腫瘍細胞における発現と比較するために、結腸粘膜におけるLacZ（+/−多発性3’UTRにおけるmiR145 MRE）の発現が検討されるであろう。

正常なネズミの腸組織と、アゾキシメタン（AOM）で処理したp53-ノックアウトマウス（Huら(2005) Int. J. Cancer 115: 561-567）由来の腫瘍が、本試験を確立するために、またこのプロセスとベクターを改良するために、培養液中で維持されるであろう。

培養条件は本質的にWhiteheadら(1999)
Gastroenterology 117: 858-65によって報告された通りである。

正常な腸粘膜、アデノーマと癌の組織はさらに同意が得られた癌患者の切除標本から得られ、前記のように培養されるであろう。

リポーター遺伝子コンストラクトはAnson およびFuller (2003) J. Gene.
Med. 5: 829-838、およびFullerおよび Anson (2001) Human
Gene Therapy 12: 2081-2093に報告されたようにレンチウイルスベクターシステムに挿入され、培養された移植体を感染させるために用いられる。

すべてのコンストラクトはさらに検体間のレンチウイルス感染のレベルを定め正常化するために構成的EYFP発現カセットを組み込むであろう。最初の実験では、このシステムを構築するために、レンチウイルス内の構成的EYFPのみが用いられるであろう。二重ルシフェラーゼ検定法（psi CHECK^TM2; Promega）が、このシステムにおけるLacZマーカーに比較して、より多くの情報を提供するかどうかが確認されるであろう。

この方法がうまくいく場合には、LacZリポーター遺伝子は条件細胞毒性遺伝子であるチミジンキナーゼに取って代わり、MRE由来の組織特異性が腫瘍細胞を選択的に除去するのに十分かどうか決定されるであろう。もちろん、このことは疾患特異性を高めるために組織特異性プロモーターを有したコンストラクトの発生を引き起こすであろう。

（例１１）
（in vivoにおける遺伝子発現に対するmiRNA標的配列の効果）
構成的プロモーター（CMV）の制御下で、3’UTRの複数のmiR145およびmiR143相補性配列を含む、LacZリポーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスが作成されるであろう。移植遺伝子コンストラクトはさらにこのような標的配列を含まず、同じプロモーターを用いるセカンドリポーター遺伝子（EGFP）から成るであろう。LacZ活性に対して染色される細胞群はマイクロRNAが関与するサイレンシングによって影響されない細胞群を示しているものの、直接蛍光法（あるいはEGFP免疫組織学的検定法）によって移植遺伝子発現の組織分布が決定されるであろう。

蛍光法では、倒立蛍光顕微鏡を用いた、新鮮なまたはパラホルムアルデヒド固定した組織の直接的観察が必要となるであろう。固定された組織は0.1%ボロヒドライドナトリウムで前処置し、自然蛍光発光を低下させた。GFP特異性抗体（Living Colurs（商標）Peptide
Antibody: Contech）は免疫組織化学的検出法のために用いられるであろう。

トランスジェニックマウス全体が評価される間、結腸直腸組織に個々の注意が払われるであろう。

好ましいトランスジェニックマウス系は、最近Youngのグループによって用いられ、発がん性物質アゾキシメタンの投与後結腸直腸癌のメズミモデルを作成した（Huら (2005) Int. J.
Cancer 115: 561-567) p53ノックアウトマウス株を用いて交配させるであろう。この交雑種の子孫は、周囲の上皮に関連のある主要細胞におけるLacZ発現の促進について検討されるであろう。

トランスジェニックマウスを作成するために、妊娠した、過剰排卵するC57ｂl/6の雌のマウスから分離した胚とGenSA施設（IMVS、アデレード）という企業で再移植された胚にコンストラクト（発現カセットを含む線状DNAフラグメント）の前核性注射を行った。結果として生じた系はRulicker T. Hubscher U. (2000) Exp.Physiol. 85:
589-601に報告されているように、注射された配列の適切なゲノム挿入に対して遺伝子型が決定されるであろう（PCRによって）。

導入された始原細胞系は完全な導入された発現カセットの少ない複製数の挿入について評価され、リアルタイムRT-PCRを用いた移植遺伝子の適切な発現について選別されるであろう。相対的複製数の定量はゲノムDNAのPCRおよび／もしくはサザンブロット分析法を用いて行なわれるであろう。リアルタイムRT-PCRには１x SYBR green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
反応において移入遺伝子mRNA特異性プライマーとcDNA鋳型が利用されるであろう。PCR増幅および検出のためにCorbett Rotorgene 2000 (Corbett Research Pty.社、オーストラリア) が用いられるであろう。

最終的なハイブリッド系は、p53突然変異マウス系および癌とポリポーシスの他のネズミモデルを用いた異種交配の前に、移植遺伝子に対するホモ接合性を確実にするために同系交配されるであろう。

（例１２）
（幹細胞における遺伝子発現に対するmiRNA標的配列とその誘導体の作用）
リポーターと治療用遺伝子の3’UTRにおけるマイクロRNA標的配列は定められた細胞系と組織に対する移入遺伝子発現を制限するために組織（あるいは細胞系）特異性マイクロRNAを利用する可能性を評価するために用いられるであろう。

例えば、神経特異性のmiRNAであるmiR124aおよびmiR9に対する標的配列は、EGFPもしくはLacZリポーター遺伝子の3’UTRに挿入されるであろう。その後レンチウイルスの送達システムは、ネズミ胚性幹細胞のゲノム内に合成遺伝子を送達するであろう。その後神経始原細胞を含めた様々な細胞型に分化するために形質導入された胚性幹細胞が導入されるであろう（Kawasakiら (2000) Neuron 28:
31-40の間質細胞由来の導入法を用いて）。リポーター遺伝子活性は、細胞系によって導入された遺伝子が発現できる、またmiR9/124aの関与するサイレンシングを示す分子マーカーの発現に相関するであろう。あるいは、形質導入されたネズミES細胞は、安定したトランスジェニック細菌系が作成されるキメラマウスを作成するために胞胚内に運搬される（Pheifer(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:
2140-2145）。リポーター遺伝子の空間的広がりのある発現は直接検出法（EGFP蛍光法またはβガラクトシダーゼ染色法）あるいは免疫組織化学法を用いて測定されるであろう。

他の実験では、形質転換した成熟した幹細胞由来の細胞においてmiRNAが関与する職遺伝子制御について検討する予定である。これらには、in vitroおよびin vivoにおける、形質導入された骨髄由来の幹細胞、あるいは包埋されたmiRNA標的配列を有したリポーター遺伝子（または治療用遺伝子）を含む造血性始原細胞についての試験が含まれるであろう。標的配列はmiR142-3pのような造血性系特異性のmiRNAと結合するであろう。例えば、この方法はBrownら(2006)Nature Medicine
12: 585-591に報告された通り実施できる。

（例１３）
（移植遺伝子の3’UTRにおけるmiRNA標的配列の増加の影響）
安定したpMM 110トランスジェニックHela Tet On細胞系の細胞であるHTO 110eは２μgのドキシサイクリン／mL培養液の存在下であるいは非存在下で成長し、塗布の１日後に80μgのプラスミドによってFuGen6を移入した。トランスフェクションに用いられたプラスミドはすべてpMM043由来であり、EGFP 3’UTRNotI部位に挿入された様々な数のmiR145標的配列を有していた。プラスミドは：pMM043（標的はなし）、pMM095（1つの標的）、pMM117（2つの標的）、pMM119（８つの標的）。この細胞系におぃて、ドキシサイクリンはHeLa細胞に存在する低いバックグラウンドを超えて成熟miR145の発現を誘発する。示された値は、トランスフェクションの46時間後の平均蛍光強度（n=3）である。

このデータは図12に示されている。このデータは、EGFPの3’UTRに存在するmiR145標的配列の数と相関するサイレンシングの程度で、一過性に移入された細胞系HTO 110eにおけるEGFP蛍光のDox誘発性miR145サイレンシングを示している。

最後に、この明細書に記載された本発明の方法および組成物の様々な修飾とバリエーションは、本発明の範囲および精神から離れることなしに当業者には明らかであろう。本発明は個々の好ましい実施例と関連付けて記載されているが、請求されているような本発明はこのような個々の実施例にむやみに限定すべきでない。実際に当業者には明らかな本発明を実施するための前記のモデルの様々な修飾は、本発明の範囲内であることを意図している。

図1は一番上のパネルにおいてhas-miR-143前駆体のステムループ構造および成熟hsa-miR-143マイクロRNAのヌクレオチド配列を示している。一番下のパネルは、hsa -miR-145前駆体のステムループ構造および成熟hsa-miR-145マイクロRNAのヌクレオチド配列を示している。図2は0.1μg のEGFP/RICS-miR145標的配列発現ベクター（pMM095）とpri-miR145（シングル-PMM109、およびタンデム-pMM107）発現プラスミドの変異レベル、アーチセンス（A/S;pMM106）およびエンプティーバクターコントロール（pcDNA3.1）を用いてトランスフェクトされたHeLa細胞から得られたEGFP蛍光（トランスフェクションの3日後）を示している。2つの実験のデータを示す。図3はプラスミドpMM043に関するマップを示している。図4はプラスミドpMM095に関するマップを示している。pMM095のヌクレオチド配列は配列表に記載され、SEQ ID NO. 153と示されている。図5はプラスミドpMM105に関するマップを示している。pMM105のヌクレオチド配列は配列表に記載され、SEQ ID NO. 154と示されている。図6はプラスミドpMM105に関するマップを示している。pMM105のヌクレオチド配列は配列表に記載され、SEQ ID NO. 155と示されている。図7はプラスミドpMM107に関するマップを示している。pMM107のヌクレオチド配列は配列表に記載され、SEQ ID NO. 156と示されている。図8はプラスミドpMM109に関するマップを示している。pMM109のヌクレオチド配列は配列表に記載され、SEQ ID NO. 157と示されている。図9はプラスミドpMM-TK/miRTargに関するマップを示す。PMM-TK/miRTargは配列表に記載され、SEQ ID NO. 158と示されている。図10はプラスミドpMM-CD/miRTargに関するマップを示す。PMM-CD/miRTargは配列表に記載されSEQ ID NO. 159と示されている。図11は一番上のパネルにDox導入の24時間後相対的pri-miR145レベルのリアルタイムRT-PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）定量法について示している。下のパネルは、ノーザン分析により1μg/mlのドキシサイクリン中で24時間インキュベートした後、HeLa Tet On/pMM110d系の成熟miR145の蓄積を示している：20μg総RNA／検体、15%変性 PAGEミニゲル。検体のローディングを比較するために臭化エチジウム染色されたゲルが示されている。図12は導入遺伝子の3’UTRにおけるmiRNA標的配列の増加の効果を示している。安定なpMM110トランスジュニックHeLa Tet On細胞系の細胞である、HTO 110eを2μg/mLのドキシサイクリン培養液の存在下で、あるいは非存在下で成長させ、80μgのプラスミドを用いて塗布後1回FuGene6を用いてトランスフェクトさせた。トランスフェクションに用いられたプラスミドはすべてPMM043由来であり、様々な数のmiR145標的配列をEGFR 3’UTR NotI部位に挿入した。プラズマはpMM043（標的なし）、pMM095（１つの標的）、pMM117（２つの標的）、pMM119（８個の標的）であった。示された値はトランスフェクションの46時間後の平均蛍光強度（n=3）であった。

Claims

細胞内のマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が、結果として細胞の発現を調節するのに十分な細胞内の核酸の活性および／もしくは濃度のレベルに至る、細胞の発現を調節する方法であって、この方法は細胞の発現を調節する能力を有した核酸を細胞内に導入する段階を含み、この核酸はマイクロRNAの結合の標的部位を含む方法。
核酸が細胞の発現を阻害する能力を有する、請求項１記載の方法。
核酸が細胞毒性を有する、あるいは細胞増殖抑制作用を有する請求項２記載の方法。
核酸が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、E. coliシトシンデアミナーゼ、E. coliニトロリダクターゼ、P. aeruginosaカルボキシペプチダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびE. coliプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、あるいはこれらの遺伝子のいずれかの活性を示すフラグメントまたは変異体からなる群から選択される遺伝子をコードする、請求項３記載の方法。
細胞が、癌細胞、前癌細胞、胚性幹細胞、成熟幹細胞、造血性前駆体細胞を含む造血細胞、脂肪細胞、ニューロン細胞、精子細胞または精子産生細胞、膵臓のランゲルハンス島細胞、およびウイルスにより感染した細胞からなる群から選択される、請求項１から４のいずれか１つに記載の方法。
癌細胞が結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、胸腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞あるいは癌性B細胞である請求項５記載の方法。
方法が、マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した細胞の発現を阻害するために用いられる請求項２から７のいずれかに記載の方法。
方法が、細胞を除去するために用いられる請求項７記載の方法。
マイクロRNAがhsa-let-7a-1,
hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b,
hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20,
hsa-miR-21, hsa-miR-22, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24,
hsa-miR-26, hsa-miR-26b, hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p,
hsa-miR-141, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145,
hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c,
hsa-miR-320, hsa-miR-321, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b,
hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-126*, hsa-miR-126,
hsa-miR-188, hsa-miR-331, hsa-miR-155, hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する前記のオルソログからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
核酸が細胞の発現を促進する能力を有する、請求項１記載の方法。
核酸がサイトカイン、治療用タンパク、あるいは前記の活性を示すフラグメントまたは変異体をコードする核酸である、請求項２記載の方法。
マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した細胞の発現を促進するために用いられる請求項１０または１１記載の方法。
核酸が同一のあるいは異なる２つ以上のマイクロRNA結合の標的部位を含む、請求項１から１２記載の方法。
細胞が動物あるいはヒト被験者の細胞である、請求項１から１３記載の方法。
方法が動物あるいはヒト被験者の疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）を予防および／もしくは治療するために用いられる、請求項１から１４のいずれか１つに記載の方法。
細胞の発現を調節する能力を有する核酸であって、この核酸はマイクロRNAの結合部位を含む核酸。
核酸が細胞の発現を阻害する能力を有する、請求項１６記載の核酸。
核酸が細胞毒性あるいは細胞増殖抑制作用を有する、請求項１７記載の核酸。
核酸が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、E. coliシトシンデアミナーゼ、E. coliニトロリダクターゼ、P. aeruginosaカルボキシペプチダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびE. coliプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、あるいはこれらの遺伝子のいずれかの活性を示すフラグメントまたは変異体からなる群から選択される遺伝子をコードする、請求項１８記載の核酸。
結合部位がhsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3,
hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b, hsa-miR-15a, hsa-miR-15b,
hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-22,
hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24, hsa-miR-26, hsa-miR-26b,
hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-141,
hsa-miR-142-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145, hsa-miR-192,
hsa-miR-194, hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-320,
hsa-miR-321, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b, hsa-miR-125b,
hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-126*, hsa-miR-126, hsa-miR-188,
hsa-miR-331, hsa-miR-155, hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する前記のマイクロRNAのオルソログから成る群から選択されるマイクロRNAの結合部位である、請求項１６から１９までのいずれか１つに記載の核酸
核酸が同一のあるいは異なる２つ以上のマイクロRNA結合の標的部位を含む、請求項１６から２０記載の核酸。
核酸が細胞の発現を促進する能力を有する、請求項１６記載の核酸。
核酸がサイトカイン、治療用タンパク、あるいは前記の活性を示すフラグメントまたは変異体をコードする核酸である、請求項２２記載の核酸。
結合部位が他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なって活性を示すマイクロRNAの結合部位である、請求項１６から２３のいずれか１つに記載の核酸。
請求項１６から２４のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
ベクターがウイルスベクターである、請求項２５記載のベクター。
動物あるいはヒト被験者に対する投与のための組成物であって、この組成物は請求項１６から２６のいずれか１つに記載の核酸を含む組成物。
請求項１６から２６のいずれか１つに記載の核酸を含む細胞。
請求項２８に記載の細胞を含む動物。
核酸が動物あるいはヒト被験者の細胞の発現を阻害するために用いられる核酸である、請求項１６から２６のいずれか１つに記載の核酸。
核酸が動物あるいはヒト被験者の細胞を除去するために用いられる核酸である、請求項３０に記載の核酸。
他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なって活性を示す人工的に発生したマイクロRNAの結合部位を含む核酸。
同様の非癌細胞に比較して、癌細胞において、結合部位が他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なって活性を示すマイクロRNAの結合部位である、請求項３２に記載の核酸。
結合部位が、非癌細胞に比較して、癌細胞においてダウンレギュレートされるマイクロRNAの結合部位である、請求項３２または３３記載の核酸。
結合部位がhsa-let-7a-1, hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3,
hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b, hsa-miR-15a, hsa-miR-15b,
hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20, hsa-miR-21, hsa-miR-22,
hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24, hsa-miR-26, hsa-miR-26b,
hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-141, hsa-miR-142-5p,
hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145, hsa-miR-192, hsa-miR-194,
hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-320, hsa-miR-321,
hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b, hsa-miR-125b, hsa-miR-125a,
hsa-miR-125b, hsa-miR-126*, hsa-miR-126, hsa-miR-188, hsa-miR-331, hsa-miR-155,
hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する前記のマイクロRNAのオルソログから成る群から選択されるマイクロRNAの結合部位である、請求項３２から３４までのいずれか１つに記載の核酸。
拡散が、他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なって活性を示す、同一のあるいは異なるマイクロRNA結合の２つ以上の結合部位を含む、請求項３２から３５のいずれか１つに記載の核酸。
核酸が細胞の発現を阻害する能力を有する、請求項３２から３６のいずれか１つに記載の核酸。
核酸が細胞毒性あるいは細胞増殖抑制作用を有する、請求項３７記載の核酸。
核酸が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、E. coliシトシンデアミナーゼ、E. coliニトロリダクターゼ、P. aeruginosaカルボキシペプチダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびE. coliプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、あるいはこれらの遺伝子のいずれかの活性を示すフラグメントまたは変異体からなる群から選択される遺伝子をコードする、請求項３７または３８記載の核酸。
核酸が細胞の発現を促進する能力を有する、請求項３２記載の核酸。
核酸がサイトカイン、治療用タンパク、あるいは前記の活性を示すフラグメントまたは変異体をコードする核酸である、請求項４０記載の核酸。
請求項３２から４１のいずれか１つに記載の核酸を含むベクター。
ベクターがウイルスベクターである請求項４２記載のベクター。
動物あるいはヒト被験者に対する投与のための組成物であって、この組成物は請求項３２から４３のいずれか１つに記載の核酸を含む組成物。
請求項３２から４３のいずれか１つに記載の核酸を含む細胞。
請求項４５記載の細胞を含む動物。
核酸が、動物あるいはヒト被験者の細胞の発現を調節するために用いられる請求項３２から４３のいずれか１つに記載の核酸。
核酸が、動物あるいはヒト被験者の細胞の発現を阻害するために用いられる請求項４７記載の核酸。
核酸が、動物あるいはヒト被験者の細胞を除去するために用いられる請求項４７記載の核酸。
癌細胞において、同様の非癌細胞に比較して、マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した、マイクロRNAの結合部位を含む外因性核酸を含む癌細胞。
癌細胞が結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、胸腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞あるいは癌性B細胞である請求項５０記載の方法。
マイクロRNAがhsa-let-7a-1,
hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b,
hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20,
hsa-miR-21, hsa-miR-22, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24,
hsa-miR-26, hsa-miR-26b, hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p,
hsa-miR-141, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145,
hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c,
hsa-miR-320, hsa-miR-321, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b,
hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-126*, hsa-miR-126,
hsa-miR-188, hsa-miR-331, hsa-miR-155, hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する前記のマイクロRNAのオルソログから成る群から選択される、請求項５０から５１までに記載の癌細胞。
外因性核酸が、癌細胞において他と異なって発現されるおよび／もしくは他と異なって活性を示す同一のあるいは異なる２つ以上のマイクロRNA結合の標的部位を含む、請求項５０から５２のいずれか１つに記載の癌細胞。
外因性核酸が、細胞の発現を阻害する能力を有する請求項５０から５３のいずれか１つに記載の癌細胞。
核酸が細胞毒性あるいは細胞増殖抑制作用を有する、請求項５４記載の癌細胞。
外因性核酸が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、E. coliシトシンデアミナーゼ、E. coliニトロリダクターゼ、P. aeruginosaカルボキシペプチダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびE. coliプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、あるいはこれらの遺伝子のいずれかの活性を示すフラグメントまたは変異体からなる群から選択される遺伝子をコードする、請求項５５記載の癌細胞。
請求項５０から５６のいずれか１つに記載の癌細胞を含む動物。
動物が形質転換した動物である、請求項５７記載の動物。
癌細胞と非癌細胞の間に他と異なって発現したマイクロRNAを確認するために用いられる、請求項５７または５８記載の動物。
標的細胞におけるマイクロRNAの活性が被験者の標的細胞発現を調節するのに十分な核酸の活性レベルに至る、被験者の標的細胞に関連した疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）を予防するかつ／もしくは治療する方法であって、前記の方法は細胞の発現を調節する能力を有する核酸を被験者の細胞に導入する段階を含むものであって、前記の核酸がマイクロRNA結合の標的部位を含む方法。
疾患（disease）、異常（condition）あるいは状態（state）が、結腸直腸癌、肺癌、胸腺癌、膀胱癌、乳癌および前立腺癌のような癌；ヒトB細胞慢性リンパ球性白血病；B細胞（Burkitt）リンパ腫；糖尿病のような膵内分泌細胞の障害；EBV、HIV、肝炎およびヘルペス感染細胞のような細胞のウイルス性感染に関連した疾患（disease）および異常（condition）；5q-骨髄異形成症候群（大赤血球性貧血症）；造血機能不全に関連した疾患（disease）および異常（condition）；自己免疫疾患および炎症性疾患（例えばクローン病）；fragileX精神遅滞；Di George症候群・ウイルス腫瘍；脂肪細胞機能不全に関連した疾患（disease）あるいは異常（condition）；胚性または成人幹細胞を用いた治療が可能な疾患（disease）；および精子産生細胞に関連した疾患（disease）および異常（condition）から成る群から選択される請求項６０記載の方法。
疾患が癌である、請求項６１記載の方法。
標的細胞が癌細胞あるいは前癌細胞である、請求項６２記載の方法。
癌細胞あるいは前癌細胞が、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、胸腺癌細胞、膀胱癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞あるいは癌性B細胞である請求項６３記載の方法。
核酸が細胞の発現を阻害する能力を有する、請求項６０から６４のいずれか１つに記載の方法。
核酸が細胞毒性あるいは細胞増殖抑制作用を有する、請求項６５記載の方法。
核酸が、単純ヘルペスチミジンキナーゼ、E. coliシトシンデアミナーゼ、E. coliニトロリダクターゼ、P. aeruginosaカルボキシペプチダーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、およびE. coliプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、あるいはこれらの遺伝子のいずれかの活性を示すフラグメントまたは変異体からなる群から選択される遺伝子をコードする、請求項６６記載の方法。
標的細胞において、マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した、請求項６０から６７のいずれか１つに記載の方法。
被験者の標的細胞を除去するために用いられる請求項６０から６８のいずれか１つに記載の方法。
マイクロRNAがhsa-let-7a-1,
hsa-let-7a-2, hsa-let-7a-3, hsa-let-7b, hsa-let-7c, hsa-let-7f, hsa-miR-10b,
hsa-miR-15a, hsa-miR-15b, hsa-miR-16, hsa-miR-19b mature miRNA, hsa-miR-20,
hsa-miR-21, hsa-miR-22, hsa-miR-23a, hsa-miR-24, hsa-miR-189, hsa-miR-24,
hsa-miR-26, hsa-miR-26b, hsa-miR-26a, hsa-miR-27b, hsa-miR-29a, hsa-miR-30a-3p,
hsa-miR-141, hsa-miR-142-5p, hsa-miR-142-3p, hsa-miR-143, hsa-miR-145,
hsa-miR-192, hsa-miR-194, hsa-miR-199b, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c,
hsa-miR-320, hsa-miR-321, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-29b,
hsa-miR-125b, hsa-miR-125a, hsa-miR-125b, hsa-miR-126^*, hsa-miR-126,
hsa-miR-188, hsa-miR-331, hsa-miR-155, hsa-miR-181b-1, hsa-miR-124a, hsa-miR-9およびこれらに対応する前記のマイクロRNAのオルソログから成る群から選択される、請求項６０から６９のいずれかに記載の方法。
核酸が細胞の発現を促進する能力を有する、請求項６０記載の方法。
核酸がサイトカイン、治療用タンパク、あるいは前記の活性を示すフラグメントまたは変異体をコードする核酸である、請求項７１記載の方法。
方法が、マイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した細胞の発現を促進するために用いられる、請求項７１から７２のいずれか１つに記載の方法。
マイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下が、細胞の発現を阻害するのに十分な細胞内核酸の活性および／もしくは濃度に至る、細胞の発現を阻害する方法であって、この細胞はマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した細胞であって、この方法は細胞の発現を阻害する能力を有する核酸を細胞内に導入する段階を含む方法であって、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位をふくむ核酸。
マイクロRNAの活性および／もしくは濃度の低下が、細胞の発現を促進するのに十分な細胞内核酸の活性および／もしくは濃度に至る、細胞の発現を阻害する方法であって、この細胞はマイクロRNAの活性および／もしくは濃度が低下した細胞であって、この方法は細胞の発現を阻害する能力を有する核酸を細胞内に導入する段階を含む方法であって、この核酸はマイクロRNA結合の標的部位をふくむ核酸。
本発明は、癌細胞あるいは前癌細胞におけるマイクロRNA活性および／もしくは濃度の変化を確認する方法であって、この方法は：
癌細胞あるいは前癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定すること、また非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルを測定する段階；そして
非癌細胞におけるリポーター核酸の発現レベルに比較して、癌細胞におけるリポーター核酸の発現の増大によって癌細胞におけるマイクロRNA活性の低下を確認する段階、
の段階を含む方法。
癌細胞において発現した核酸の濃度を調節する方法であって、この癌細胞は同様の非癌細胞に比較して、マイクロRNA活性および／もしくは濃度の変化した癌細胞であって、この方法は細胞内に発現するはずの核酸に対するマイクロRNA結合の標的部位を導入する段階を含む方法。