JP2008529518A - 新規制御エレメントを含むベクター - Google Patents

Abstract

本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に関し、そして具体的には、組換えタンパク質の発現のためのベクターの開発に関する。異種遺伝子の真核生物細胞における発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写を必要とする。ＲＮＡポリメラーゼＩＩは、プロモーターおよびエンハンサーとして知られるｃｉｓに作用する遺伝的エレメントによって駆動される。本発明は、組換えタンパク質の高レベレの発現を得るために有用な、モルモットサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサーに由来するプロモーターを提供する。そのようなプロモーターを含む真核生物発現ベクターであって、多くの細胞型中にて、ヒトサイトメガロウイルスまたはマウスサイトメガロウイルスのエンハンサー／プロモーターエレメントから得られるものよりも増加されたレベルの発現を提供する能力を有する発現ベクターも、開示される。

Description

本発明は、組換えＤＮＡ技術の分野に関し、そして具体的には、組換えタンパク質の発現のためのベクターの開発に関する。

異種遺伝子の真核生物細胞における発現は、多くの学術的用途および商業的用途を有する、生物工学の根本的な局面である。そのような遺伝子の発現は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩ）による転写を必要とする。Ｐｏｌ ＩＩは、プロモーターおよびエンハンサーとして知られる、ｃｉｓに作用する遺伝的エレメントによって駆動される。

単純な用語において、プロモーターは、１００未満（通常は、５０未満）のヌクレオチド塩基対（ｂｐ）下流に位置する配列の転写を開始するように作用する指向性エレメントである。プロモーターは、転写の開始、および開始前（ｐｒｅ−ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）複合体として公知のマルチサブユニット複合体のアセンブリに関与する種々のタンパク質のための結合部位として作用する、多数の短いコンセンサスヌクレオチド配列を含有する（非特許文献１）。ほとんどの遺伝子において、これは、ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡ）として公知の非常に広範に保存された配列において起こる。このＴＡＴＡボックスに対して、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ、一般的な転写因子であるＴＦＩＩＤのサブユニット）が結合する。１０を超えるさらなる転写因子の定序アセンブリが続き、最終的にＰｏｌ ＩＩホロ酵素複合体を形成する。ＲＮＡ転写は、実際には、約２５〜３０ベース下流の開始部位において開始する（非特許文献２）。この開始部位にも、ＴＢＰは結合する。

ほとんどの機能的プロモーターは、さらに上流プロモーターエレメント（ＵＰＳ）を含有する。このＵＰＳの中で、最も高度に保存されているのは、約７０ｂｐ〜２００ｂｐ上流のＣＡＡＴボックス（ＣＣＡＡＴ、転写因子ＣＢＦ、Ｃ／ＥＢＰおよびＮＦ−１に対する結合部位）、および類似の距離だけ上流のＧＣボックス（ＧＧＧＣＧＧ、一般的な転写因子であるＳｐ−１に対する結合部位）である。基本的なレベルの転写はＴＡＴＡボックスのみから起こるが、ほとんどのプロモーターについて、少なくともＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスが、最適なレベルの転写のために必要とされる。

エンハンサーは、非指向性に作用し、局所的に位置しているが必ずしも直接隣接するわけではない（数キロベース離れている）プロモーターからの転写を増加させる配列である（非特許文献３）。エンハンサーは、広範な転写活性化因子タンパク質に対する結合部位を代表する短い（８〜１２ｂｐ）コンセンサス配列を含む（非特許文献４）。この転写活性化因子タンパク質は、プロモーターエレメントとも結合する、ＮＦ−１およびＳＰ−１のようなものを含む。これらの配列は、しばしばタンデムの繰り返しまたは逆向きの繰り返しにおいて複製される。

サイトメガロウイルスのような多くのＤＮＡウイルスにおける非常に活性な前初期遺伝子転写単位を含む、いくつかの天然の転写単位では、エンハンサーエレメントおよびプロモーターエレメントは、効果的な１つの拡張された上流エレメントに、機能的に合わされ得る。

プロモーターは、制御され得、細胞型、温度、金属イオンまたは他の因子に応答性であり得るか；または構成的であり得、そのような因子に応答しない転写を与え得る。多くの目的のため、全てではないにしても多くの細胞型において一貫した高い転写レベルを与える、強力で構成的なプロモーターは、非常に有利である。何年もの間、ヒトサイトメガロウイルスにおける前初期遺伝子発現を駆動するエンハンサー／プロモーターエレメントは、真核生物の発現ベクターにおける異種遺伝子のそのような発現を駆動するため、非常に広範に用いられてきた（非特許文献５）。

ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、ベータヘルペスウイルス科のメンバーであり、かつ、胃腸感染および呼吸感染、肝炎、ならびに網膜炎の原因である。他のヘルペスウイルスと同様に、ＣＭＶは、潜伏感染中に存続し得、そして、免疫無防御状態の個体内で再活性化され得る。細胞培養において、ヒトＣＭＶは、繊維芽細胞、上皮細胞および内皮細胞のような最終的に分化された細胞、ならびに単球由来のマクロファージ中で増殖的に複製する（非特許文献６およびそれらの参考文献）。

増殖性感染の間、前初期（ＩＥ）、初期または後期と呼ばれている、ＣＭＶ遺伝子セットの定序発現が存在する。ヒトＣＭＶ ＩＥ遺伝子は、複製の効率性において必須の役割を果たすと考えられている（非特許文献７に総説されている）。

ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーターの上流領域は、三つの領域である調節領域、特有領域、およびエンハンサーに分けられる。上記エンハンサーはまた、遠位エンハンサーおよび近位エンハンサーに分けられる。上記の遠位プロモーターは、効率的なＩＥ遺伝子の発現および低いＭＯＩでのウイルス複製に必要である。ヒトＣＭＶは、ＩＥ遺伝子の発現のための非常に強力なエンハンサーを有する。上記ヒトＣＭＶは、ＮＦ-κＢ結合部位またはｒｅｌ結合部位を含む１８ｂｐの４回繰り返しエレメント、ＣＲＥＢ結合部位またはＡＴＦ結合部位、二つのＡＰ−１結合部位、および複数のＳＰ−１部位を含む１９ｂｐの５回繰り返しエレメントを有する（非特許文献８；非特許文献９）。上記のマウスＣＭＶエンハンサーは、６つのＮＦ-κＢ結合部位またはｒｅｌ結合部位、１つのＣＲＥＢ結合部位またはＡＴＦ結合部位、および少なくとも7つのＡＰ−１結合部位を含む（非特許文献１０）。上記の異なるｃｉｓに作用するエレメントは、個別的または相乗的に作用して、上記プロモーター上の上記ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写開始複合体を安定化する。

多くの場合、正確な分類および交差種の血縁の程度は、暫定的であるが、主に異種宿主に感染する多数のサイトメガロウイルスが、公知である。多数の霊長類動物種（アフリカミドリザル、アカゲザルおよびピグミーチンパンジーを含む）ならびに齧歯類動物（マウス、ラットおよびモルモットを含む）に感染するサイトメガロウイルス様ウイルスが、認識されている。上記サイトメガロウイルス様ウイルスのうちで、マウスプロモーターおよびラットプロモーターのみが、詳細な機能解析を受けている。それらの種とヒトＣＭＶとの比較は、おそらくは、認識されていないｃｉｓに作用するエレメントであって、異種の細胞中の下流の転写に寄与するエレメントの存在のため、上記ＩＥプロモーター−エンハンサーの機能が、直接比較できないことを示す（非特許文献１１）。

しかしながら、ヒトＣＭＶ ＩＥプロモーター−エンハンサーとマウスＣＭＶ ＩＥプロモーター−エンハンサーの両者は、真核生物発現ベクターにおいて異種遺伝子の高レベルの構成的発現を生じ、そして、生物工学において広く用いられる。上記ヒトＣＭＶプロモーターのそのような使用は、特許文献１（Ｓｔｉｎｓｋｉ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｉｏｗａ）に開示された。上記プロモーター、エンハンサー、および機能的に完全な５’（上流）非翻訳領域であって、上記ヒトサイトメガロウイルスの主要な前初期遺伝子における第１イントロンを含む非翻訳領域の使用が、特許文献２により特許請求されている（Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ／Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）。ここで、上記非翻訳領域は、その天然のＤＮＡをコードする配列と直接的に連結していない。上記マウスＣＭＶ ＩＥエンハンサーの使用は、特許文献３（Ｋｏｓｚｉｎｏｗｓｋｉら）により開示されている。

モルモットＣＭＶ（ＧＰＣＭＶ）は、ヒトＣＭＶ感染の病理との多くの類似点を有するモルモットにおける疾患を生じる。ＧＰＣＭＶのゲノムを特徴づける試み（非特許文献１２；非特許文献１３）は、上記ゲノムの構成機構が、ヘルペスウイルスの間で特有であることを示唆した。ヒトＣＭＶとマウスＣＭＶとの類似したサイズにも関わらず、上記のＧＰＣＭＶのゲノムは、ヒトＣＭＶのゲノムよりもはるかに単純であって、かつ、マウスＣＭＶのゲノムと最もよく似ていた。しかしながら、上記のＧＰＣＭＶのゲノムは、特にその末端領域の構造において、いくつかの珍しい特徴を有していた。ＩＥ遺伝子発現の最新の研究は、ヒトＣＭＶとの配列の比較によりＩＥ領域を同定し（非特許文献１４）、そして、ＩＥ転写産物の発現およびプロセシングが、解析された。しかしながら、異種遺伝子の発現のためのＩＥプロモーター−エンハンサーの有用性の解析は、存在しなかった。

ＩＥ１コード配列の５’末端および上記上流プロモーター／エンハンサー領域を含む、ＧＰＣＭＶゲノムの「ＨＲｖ」（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＶ）前初期上流フラグメントの配列は、配列決定され（非特許文献１５）、そして、ＣＭＶ ＩＥ制御領域に典型的な繰り返し配列の領域を含むことが示された。三つの短い繰り返しであるＧＰ−１、ＧＰ−２およびＧＰ−３が、同定された。ＧＰ−１は、９回存在し、ＮＦ-κＢ結合部位を含み、そしてＨＣＭＶの１８ｂｐの繰り返しに対応している、１８ｂｐの繰り返し（ＧＧＣＣＣＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡコンセンサスに７３〜１００％類似する）である。ＧＰ−２は、１０回存在し、共通のＳＲＥ（血清応答エレメント）に類似するコア配列を含む、１７ｂｐの繰り返し（ＴＧＴＣＣＴＴＴＴＴＧＧＣＡＡＡコンセンサスに８６〜１００％類似する）である。ＧＰ−３は、その近位上流領域内で４回繰り返され、そしてｃ−ｊｕｎまたはＧＣＮ４のための結合部位として同定された配列であるＧＴＧＡＣＴＴＴを含む（非特許文献１６）。

この研究は上記ＧＰＣＭＶ ＩＥ上流領域が強力なプロモーターを含むことを示唆したが、レポーター構築物が作成される方法に起因して、特定のの人工物が除去され得なかった。第一に、上記ＨＲｖフラグメントは、上記ＩＥ１遺伝子の第１エキソン、および第１イントロンの一部を含む。このイントロンは、３コピーの推定ＮＦ-１結合部位を含み、このことが、上記プロモーターの見かけの強度を人工的に押し上げ得る。第二に、上記ＧＰＣＭＶフラグメントを試験するために用いられるレポーター構築物は、ＳＶ４０プロモーター（それ自体が、強力なウイルス性プロモーターである）を含んでいた。その結果、レポーターの発現は、二重のＧＰＣＭＶ／ＳＶ４０プロモーターの効果の結果であった。結果として、一般的に、上記ＧＰＣＭＶエンハンサー／プロモーター単独と他の強力なプロモーターとの比較、または上記ＧＰＣＭＶエンハンサー／プロモーター単独と他のＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターとの比較ですら、行うことが不可能である。

本明細書中に参考として援用される、本出願人の同時係属特許出願であるＰＣＴ／ＧＢ９９／０２３５７（特許文献４）は、天然のクロマチンの状況において、普遍的に発現されるハウスキーピング遺伝子から排他的に構成される位置にわたって開いたクロマチン構造を確立する役割を担うエレメントについて説明する。これらのエレメントは、遺伝子座制御領域（Ｌｏｃｕｓ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｇｉｏｎ）（ＬＣＲ）に由来せず、かつ、広範なメチル化していないＣｐＧアイランドを含む。用語「普遍的クロマチンオープンエレメント（Ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｏｐｅｎｉｎｇ Ｅｌｅｍｅｎｔ）（ＵＣＯＥ）」は、そのようなエレメントを説明するために用いられている。

哺乳動物のＤＮＡにおいて、ジヌクレオチドＣｐＧは、シトシンを５−メチルシトシンにメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素により認識される。しかしながら、５−メチルシトシンは不安定であり、チミンへ変換される。結果として、ＣｐＧジヌクレオチドは、偶然に予期するよりも極めて低頻度でしか存在しない。それにも拘らず、ゲノムＤＮＡのうちのいくつかの部分は、予期されるものにより近い頻度のＣｐＧを有し、これらの配列は、「ＣｐＧアイランド」として公知である。本明細書中に用いられる場合、「ＣｐＧアイランド」は、少なくとも２００ｂｐの、少なくとも５０％のＧＣ含量および少なくとも０．６の観察／予期ＣｐＧ含量比率（すなわち、偶然に予期されるもののうちの少なくとも６０％のＣｐＧジヌクレオチド含量）を有するＤＮＡ配列として定義される（非特許文献１７；非特許文献１８）。

メチル化していないＣｐＧアイランドは、当該分野において周知であり（非特許文献１９、非特許文献２０）、そのシトシン残基の相当量がメチル化しておらず、通常二つの近くに位置した（０．１〜３ｋｂ）分岐転写される（ｄｉｖｅｒｇｅｎｔｌｙ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）遺伝子の５’末端にわたり広がる、メチル化していないＣｐＧアイランドとして定義され得る。ＤＮＡのこれらの領域は、発達を通じて全組織において低メチル化されたままであることが報告されている（非特許文献２１）。上記のメチル化していないＣｐＧアイランドは、しばしば、普遍的に発現される遺伝子、ならびに組織限定的発現プロファイルを示す遺伝子のうちの推定４０％の遺伝子の５’末端に結合される（非特許文献２２；非特許文献２３）。そして、上記のメチル化していないＣｐＧアイランドは、活性化クロマチンの領域に局在されることが公知である（非特許文献２４）。

「広範な」メチル化していないＣｐＧアイランドは、１より多い転写開始部位を含む領域にわたり広がり、かつ／または３００ｂｐより多く、そして好ましくは、５００ｂｐより多くに広がる、メチル化していないＣｐＧアイランドである。上記広範なメチル化していないＣｐＧアイランドの境界は、上記領域にわたり、エンドヌクレアーゼ制限酵素と組み合わせてＰＣＲを使用することにより、機能的に規定される。上記エンドヌクレアーゼ制限酵素がそれらの認識配列でＤＮＡを消化（切断）する能力は、存在する任意のＣｐＧアイランドのメチル化状態に対して感受性である。そのような一つの酵素は、ＨｐａＩＩである。ＨｐａＩＩは、ＣｐＧアイランド内でよく見出されるＣＣＧＧ部位を認識および切断するが、上記部位の中央のＣＧ残基がメチル化されていない場合に限られる。従って、ＨｐａＩＩで消化されたＤＮＡを用いて、ＨｐａＩＩ部位を有する領域にわたり行われたＰＣＲは、そのＤＮＡがメチル化されていない場合、ＨｐａＩＩ消化に起因して増幅産物を生じない。ＤＮＡがメチル化されている場合にのみ、ＰＣＲは増幅産物を生じ得る。従って、ＨｐａＩＩがＤＮＡを消化しないメチル化していない領域を超えて、ＰＣＲ増幅産物が観察され得、それによって、上記の「広範なメチル化していないＣｐＧアイランド」の境界を規定し得る。

国際出願で特許文献４は、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソーム構成成分−Ｂ１（ＰＳＭＢＩ）およびヘテロ核リボ核タンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質１Ｈｓγ（ＨＰ１^Ｈｓγ）遺伝子座由来の、二重の分岐転写されるプロモーターを含む、メチル化していないＣｐＧアイランドにわたる領域が、増加されたレベルの遺伝子発現を作動可能に連結された遺伝子に与えることを実証する。活性的に転写されるプロモーターと結合されたメチル化していないＣｐＧアイランドは、クロマチンを再構築する能力を所有し、それゆえ、ハウスキーピング遺伝子座でのオープンドメインを確立および維持する主要な決定因子と考えられている。

ＵＣＯＥは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性における改良を含む、生産的な遺伝子の組込み事象の割合の増加を与える。このことは、トランスジェニック動物および培養細胞における組換えタンパク質産物の生成を含む、重要な研究および生物工学的適用を有する。

特許文献４は、およそ４．０ｋｂの機能的ＵＣＯＥフラグメント、特に、図２１のヌクレオチド４１０２〜８２８６により規定される（第１１頁の第６行および第７行に開示されている通りの）「５．５ＲＮＰ」フラグメントを開示する。同じ出願が、「１．５ＲＮＰ」フラグメント（図２２および図２９、第５１頁の第１〜５行に記載されている誘導体）を開示する。しかしながら、この「１．５ＲＮＰ」フラグメントは、実際には、上記出願の図２１のヌクレオチド４１０２〜６２６７からなる、上記の「５．５ＲＮＰ」フラグメントの２１６５ｂｐのＢａｍＨＩ−Ｔｔｈ１１１Ｉフラグメントである。

さらなる出願（特許文献５）は、人工的に構築された、天然に存在するＣｐＧアイランドのフラグメントから構成されているＵＣＯＥを開示する。第三の出願（特許文献６）は、ＵＣＯＥの小さな機能的フラグメントを含むポリヌクレオチドを開示する。そのようなポリヌクレオチドは、わずかおよそ２ｋｂのメチル化されていないＣｐＧアイランド、またはより大きなそのようなアイランドのせいぜいおよそ２ｋｂのフラグメントを含む。
米国特許第５，１６８，０６２号明細書 米国特許第５，５９１，６３９号明細書 米国特許第４，９６８，６１５号明細書 国際公開第００／０５３９３号パンフレット 国際公開第０２／２４９３０号パンフレット 国際公開第０４／０６７７０１号パンフレット ＭＣＫｎｉｇｈｔ ａｎｄ Ｔｊｉａｎ，Ｃｅｌｌ，１９８７年，４６，ｐ．７９５−８０５ Ｂｒｅａｔｈｎａｃｈ ａｎｄ Ｃｈａｍｂｏｎ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８１年，５０：ｐ．３４９−３９３ Ｋａｄｏｎａｇａ著、Ｃｅｌｌ、２００４年、第１１６巻、ｐ．２４７−２５７ Ｏｎｄｅｋら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８年、第２３６巻、ｐ．１２３７−１２４４ Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ａｎｄ Ｈｏｆｆｓｔｅｔｔｅｒ、Ｇｅｎｅ、１９８６年、第４５巻、ｐ．１０１−１０５ ＩｓｏｍｕｒａおよびＳｔｉｎｓｋｉ著、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００３年、第７７巻、ｐ．３６０２−３６１４ ＣａｓｔｉｌｌｏおよびＫｏｗａｌｉｋ著、Ｇｅｎｅ、２００２年、第２９０巻、ｐ．１９−３４ Ｔｈｏｍｓｅｎら著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８４年、第８１巻、ｐ．６５９−６６３ ＭｅｉｅｒおよびＳｔｉｎｓｋｉ著、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９９６年、第３９巻、ｐ．３３１−３４２ Ｄｏｒｓｃｈ−Ｈａｓｌｅｒら著、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、１９８５年、第８２巻、ｐ．８３２５−８３２９ ＩｓｏｍｕｒａおよびＳｔｉｎｓｋｉ著、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、２００３年、第７７巻、ｐ．３６０２−３６１４ Ｉｓｏｍら著、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８４年、第４９巻、ｐ．４２６−４３６ ＧａｏおよびＩｓｏｍ著、Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１９８４年、第５２巻、ｐ．４３６−４４７ Ｙｉｎら著、Ｊ Ｖｉｒｏｌ、１９９０年、第６４巻、ｐ．１５３７− １５４８ Ｙｉｎ著、「Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＰｈＤ ｔｈｅｓｉｓ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ＵＳＡ、１９９１年 Ｈｉｌｌら著、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８４年、第２３４巻、ｐ．４５１−４５７ Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇｒｅｅｎ ＭおよびＦｒｏｍｍｅｒ Ｍ．著、Ｊ ＭｏＩ Ｂｉｏｌ、１９８７年、第１９６巻、ｐ．２６１−２８２ Ｒｉｃｅ Ｐ、Ｌｏｎｇｄｅｎ ＩおよびＢｌｅａｓｂｙ Ａ著、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ、２０００年、第１６巻、ｐ．２７６−２７７ Ｂｉｒｄら著、Ｃｅｌｌ、１９８５年、第４０巻、ｐ．９１−９９ ＴａｚｉおよびＢｉｒｄ著、Ｃｅｌｌ、１９９０年、第６０巻、ｐ．９０９−９２０ ＷｉｓｅおよびＰｒａｖｔｃｈｅｖａ著、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、１９９９年、第６０巻、ｐ．２５８−２７１ Ａｎｔｅｑｕｅｒａ、Ｆ． ａｎｄ Ｂｉｒｄ，Ａ．著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９３年、第９０巻、ｐ．１１９５−１１９９９ Ｃｒｏｓｓ，Ｓ．Ｈ． ａｎｄ Ｂｉｒｄ，Ａ．Ｐ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、１９９５年、第５巻、ｐ．３０９−３１４ Ｔａｚｉ，Ｊ． ａｎｄ Ｂｉｒｄ,Ａ．、Ｃｅｌｌ、１９９０年、第６０巻、ｐ．９０９−９２０

生物工学における組換えタンパク質発現の重要性を考慮すると、新規のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを含む、改良された発現ベクターが、依然として必要である。

（発明の要旨）
本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」および上記用語の改変（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、「を含むが、これに限定されない」ことを意味し、他の部分、付加物、構成要素、整数または工程を除外することを意図されていない（そして除外しない）。

本明細書の内容がそうでないことを必要としない限り、単数形は、本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、複数形を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、本明細書の内容がそうでないことを必要としない限り、本明細書は、単数形だけでなく複数形も企図するものとして理解されるべきである。

本発明の特定の局面、実施形態または実施例と関連して記載される図、整数、特徴、化合物、化学部分または化学基は、それらと適合しない場合を除いて、本明細書中に記載される任意の他の局面、実施形態または実施例に適用可能であると理解される。

本明細書中に用いられる場合、用語「作動可能に連結されている」は、本発明のポリヌクレオチドにおけるエレメント間の作動可能性の関係を指す。「作動可能に連結されている」は、当業者に周知の、ｃｉｓに作用するＤＮＡ配列間の機能的関係を説明する用語である。正確な構造関係は、関連があることもあるし、ないこともあり、異なる型のエレメントについて相違する。プロモーターに関して、プロモーターは、そのプロモーターが駆動するオープンリーディングフレームに対して５’の、本質的に隣接した（通常、１００ｂｐ未満内の）位置を包含する。広範なメチル化していないＣｐＧアイランドの場合、クロマチン構造における領域的な効果は、遺伝子発現のレベルおよび一貫性の増加を担う。例として、広範なメチル化していないＣｐＧアイランドを包含するエレメントは、上記の遺伝子の転写を制御する発現性エンハンサー／発現性プロモーターの５’位に位置し得る。しかしながら「作動可能に連結される」は、明確な機能的効果が示されている限り、それ以外の場所に位置する可能性を包含する。

「機能的ホモログ」により、開示されている配列に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする能力を有し、かつ、二つ以上の組織中にて作動可能に連結されている発現性オープンリーディングフレームの増加された発現を与える類似の性質を有する配列が、意味される。ストリンジェントなハイブリダイゼーション／洗浄条件は、当該分野において周知である。例えば、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて６０℃で洗浄の後に安定である核酸ハイブリッド。上記核酸の配列が公知である場合、最適なハイブリダイゼーション条件が計算され得ることは、当該分野において周知である。例えば、ハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーションに供される核酸のＧＣ含量により決定され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら著（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｐｐｒｏａｃｈを参照のこと。特定のホモロジーの核酸分子間のハイブリダイゼーションを達成するために必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための一般式は、以下：

である。

本発明の目的は、真核細胞において作動可能に連結された発現性核酸配列の非常に高レベルの発現を提供する転写エンハンサーを含む、新規のＤＮＡ分子およびベクターを提供することである。有利に、上記エンハンサーは、転写を増加させる、それらの天然に関連しているプロモーターおよび／または他の遺伝的エレメントと組み合わせて用いられ得る。

本発明は、特に、組換えタンパク質の高レベルの発現を得るための、モルモットサイトメガロウイルス前初期プロモーター／エンハンサーおよび発現ベクターにおけるその使用に関する。本発明は、ヒトまたはマウスのＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターエレメントから入手可能なものよりも増加されたレベルの発現を多数の細胞型において提供する能力を有する真核生物の発現ベクターを提供する。

モルモットサイトメガロウイルス前初期上流制御領域は、Ｅ１遺伝子のおよそ１５００ｂｐ上流および、より具体的には、図１および配列番号１により開示されている配列からなる。この制御領域は、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントの双方を含む。「プロモーター」により、少なくとも図１（配列番号１）のヌクレオチド７７９〜８８０を含むフラグメントまたはその機能的ホモログである、転写開始部位（ＴＡＴＡボックスおよびＣＡＡＴボックス）が意味される。

従って、本発明は、図１および配列番号１に記載されるモルモットＣＭＶ前初期制御領域のうちの少なくとも１００個、好ましくは２００個、そしてより好ましくは少なくとも５００個の連続したポリヌクレオチドを含む単離されたポリヌクレオチド、ならびに発現性ポリヌクレオチドの配列を提供する。該発現性ポリヌクレオチド配列の転写は、エンハンサーと遺伝子または他の発現性配列との間に位置するプロモーターによって駆動される。このプロモーターは、内因性のモルモットＣＭＶ前初期プロモーターまたは天然には上記エンハンサーと結合していない他の異種プロモーターであり得る。上記の発現性ポリヌクレオチド配列は、モルモットＣＭＶ前初期遺伝子ではなく、かつ、上記プロモーターと天然には作動可能に連結していない。環状の単離されたポリヌクレオチド（プラスミドベクターのような）の場合、「間」によって、直接的に作動可能に連結されているポリヌクレオチド配列の上流（そのセンス鎖に対して５’）および作動可能に連結されているエンハンサーの下流（３’）が意味されていることが、当業者によって理解され得る。そのような単離されたポリヌクレオチドが、（選択マーカーの発現に必要な配列または他のエレメントに関連する配列のような）目的の挿入された発現性配列の発現と関連していない他のプロモーターを含み得ることが、理解される。

よって、上記の単離されたポリヌクレオチドは、以下
ａ） 配列番号１の少なくとも２００個、好ましくは少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含むエレメント、ならびに
ｂ） 発現性ポリヌクレオチド配列を含むエレメント、を含み；
上記の単離されたポリヌクレオチドは、上記発現性ポリヌクレオチドのセンス鎖に対して５’から３’の方向で、エンハンサー、単一のプロモーター、および上記発現性ポリヌクレオチド配列を含み、ここで上記エンハンサーは、上記プロモーターに作動可能に連結され、上記エンハンサーは、上記発現性ポリヌクレオチド配列に直接的に作動可能に連結され、ここで上記プロモーターは、天然には上記発現性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていないことによって特徴づけられる。

好ましくは、上記の単離されたポリヌクレオチドは、ヌクレオチド５０〜５５０を含む前初期制御領域の５’フラグメント、または代替的に、ヌクレオチド２７５〜７７５を含む３’フラグメントを含む。そのようなフラグメントは、内因性プロモーターを含ずに、機能的エンハンサーフラグメントを含む。

従って、一実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、少なくとも、発現性ヌクレオチド配列に直接的に作動可能に連結されている（天然には作動可能に連結されていない）モルモットＣＭＶ前初期制御領域由来のプロモーターを含む。この該プロモーターは、好ましくは、配列番号１のヌクレオチド７７９〜８８０を含む。「直接的に作動可能に連結されている」によって、上記遺伝子または他の発現性核酸は上記プロモーターにより直接的に駆動されることが、意味されている。

好ましくは、上記の単離されたポリヌクレオチドは、モルモットＣＭＶの主要前初期制御領域をさらに含み、より好ましくは、配列番号１のヌクレオチド１〜８８７を含む。

一つの好ましい実施形態では、上記の単離されたポリヌクレオチドは、記発現性核酸配列に作動可能に連結されている広範なメチル化していないＣｐＧアイランドをさらに含む。より好ましくは、上記の広範なメチル化していないＣｐＧアイランドは、一つ以上のさらなるプロモーター、特に分岐して転写する二重プロモーターまたは二指向性プロモーターを含む。よって、本発明は、上記発現性ポリヌクレオチドに作動可能に連結している、図１（配列番号１）の少なくとも２００個の連続するヌクレオチドを含み、さらに上記発現性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されている広範なメチル化していないＣｐＧアイランドを含む、単離されたポリヌクレオチドを提供する。そのような広範なメチル化していないＣｐＧアイランドは、簡便に、上記エンハンサー配列の隣に、および上流に位置され得る。好ましくは、そのような単離されたポリヌクレオチドは、図１（配列番号１）の少なくとも５００個の連続するポリヌクレオチド、より好ましくは、ヌクレオチド５０〜５５０を含む前初期制御領域の５’フラグメント、または、代替的に、ヌクレオチド２７５〜７７５を含む３’フラグメントを含む。最もより好ましくは、そのような単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド１〜８８７を含む。

一実施形態では、上記の広範なメチル化していないＣｐＧアイランドは、ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質遺伝子ならびに５’隣接配列および３’隣接配列の各１２ｋｂ、またはそれらの機能的フラグメントにわたる４４ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、上記の機能的フラグメントは、１ｋｂの５’隣接配列および５ｋｂの３’隣接配列を有するヒトＴＡＴＡ結合性タンパク質遺伝子、またはそれらの機能的フラグメントにわたる２５ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。より好ましくは、ＴＡＴＡ結合タンパク質遺伝子関連の広範なメチル化していないＣｐＧアイランドの機能的フラグメントは、多くても２ｋｂであり、さらに好ましくはわずか１ｋｂであり、最も好ましくは、９８７ｂｐのＢｓｐＥ１−Ｅｓｐ３１制限フラグメントを含む。

第二の実施形態では、上記の広範なメチル化していないＣｐＧアイランドは、３０ｋｂの５’隣接配列および２０ｋｂの３’隣接配列を有するヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子、またはそれらの機能的フラグメントにわたる６０ｋｂのＤＮＡフラグメントを含む。好ましくは、上記の機能的フラグメントは、５ｋｂの５’隣接配列および１．５ｋｂの３’隣接配列を有するヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子にわたる１６ｋｂのＤＮＡフラグメント、より好ましくは、わずか２ｋｂの、より好ましくはわずか１．６ｋｂの、１５４６ｂｐのＥｓｐ３Ｉ制限酵素フラグメントを含むヒトｈｎＲＮＰ Ａ２遺伝子のフラグメントを含む。好ましくは、そのフラグメントは、フォワード方向を向いている。

第三の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、好ましくはヒト起源の、βアクチン ＣｐＧアイランド／プロモーター領域のフラグメント、より好ましくは、上記のヒトβアクチン ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。

第四の実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、好ましくはヒト起源の、ＰＤＣＤ２ ＣｐＧアイランド／プロモーター領域のフラグメント、より好ましくは、上記のヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む。

最後の代替的実施形態では、上記の広範なＣｐＧリッチのメチル化していないＣｐＧアイランドは、ヒトβアクチン ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜１．９ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメント、およびヒトＰＤＣＤ２ ＣｐＧアイランド／プロモーター領域にわたる１００ｂｐ〜２ｋｂの範囲内のＤＮＡフラグメントを含む、天然には存在しない人工配列である。好ましくは、上記のフラグメントは、多方向に向けられたそれらのプロモーターに直接的に隣接している。

さらなる局面では、本発明は、上述の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。上記ベクターは、ＤＮＡを細胞へ移す能力を有する任意のベクターであり得る。好ましくは、上記ベクターは、真核生物の発現ベクターである。そのようなベクターは、真核細胞において転写を指向および促進する能力を有するプロモーターおよびエンハンサーのようなエレメントを含む。上記エレメントはまた、好ましくは、それらの機能を促進または最適化する他の特徴も含む。そのような特徴としては、上記の適切な真核生物宿主細胞中、および上記ベクター自体を製造するために用いられる原核細胞中でも複製を可能にするために選択される複製起点、いずれかの細胞型において上記ベクターを含む細胞を選択することを可能にする一つ以上の選択マーカー（しばしば、抗生物質または毒素に対する耐性を与える）、上記ベクターまたはその組み込まれたフラグメントの複製を可能にするエレメント、ならびに所望のポリペプチド産物をコードする発現性ポリヌクレオチド配列（一般的に、「インサート」と呼ばれる）の簡単な挿入を可能にするための、主要なエンハンサー／プロモーターの下流に簡便に位置されるポリリンカーまたはマルチクローニング部位が挙げられる。そのような改良は、当該分野において周知である。

好ましくは、上記ベクターは、組込み型ベクターまたはエピソームベクターである。

好ましい組込み型ベクターとしては、組換えレトロウイルスベクターが挙げられる。組換えレトロウイルスベクターは、レトロウイルスゲノムの少なくとも一部のＤＮＡを含み、この部分は、その標的細胞に感染する能力を有する。用語「感染」は、ウイルスが遺伝的物質をその宿主細胞または標的細胞へ移すプロセスを意味するために用いられる。好ましくは、本発明のベクターの構築に用いられるレトロウイルスはまた、上記標的細胞におけるウイルス複製の影響を除去するために複製欠損にされる。そのような場合、上記複製欠損ウイルスのゲノムは、慣習的な技術に従ってヘルパーウイルスによってパッケージングされ得る。一般的に、感染性および機能遺伝子伝達能という上記の基準を満たす任意のレトロウイルスが、本発明の実施において採用され得る。

適切なレトロウイルスベクターとしては、当業者に周知のｐＬＪ、ｐＺｉｐ、ｐＷｅおよびｐＥＭが挙げられるが、これらに限定されない。複製欠損レトロウイルスのための適切なパッケージングウイルス株としては、例えば、ΨＣｒｉｐ、ΨＣｒｅ、Ψ２およびΨＡｍが挙げられる。

本発明に有用な他のベクターとしては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０ウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＳＶおよびポックスウイルスが挙げられる。好ましいベクターは、上記アデノウイルスである。アデノウイルスベクターは、当業者に周知であり、そして、気道上皮、骨格筋、肝臓、脳および皮膚を含む多数の細胞型への遺伝子を送達するために用いられてきた（Ｈｉｔｔら著，１９９７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９８）。

さらに好ましいベクターは、上記アデノ随伴（ＡＡＶ）ベクターである。ＡＡＶベクターは、当業者に周知であり、そして、ヒトＴリンパ球、繊維芽細胞、鼻ポリープ、骨格筋、脳、赤血球および遺伝子治療適用の造血幹細胞を安定的に伝達するために用いられてきた。国際特許出願である、国際公開９１／１８０８８号パンフレットは、特定のＡＡＶに基づくベクターを開示している。

好ましいエピソームベクターは、一過性の複製しないエピソームベクター、およびＥＢＶ、ヒトパポバウイルス（ＢＫ）およびＢＰＶ−１由来のもののようなウイルス性複製起点に由来する機能を有する自己複製するエピソームベクターを含む。そのような組込み型ベクターおよびエピソームベクターは、当業者に周知であり、かつ、当業者に周知の文献本体中に十分に説明されている。特に、適切なエピソームベクターは、国際公開９８／０７８７６号パンフレットに開示されている。

哺乳動物の人工的染色体も、本発明におけるベクターとして用いられ得る。哺乳動物の人工的染色体は、Ｃａｌｏｓ（１９９６）によって議論されている。

好ましい実施形態では、本発明のベクターは、プラスミドである。上記プラスミドは、非複製、非組込み型プラスミドであり得る。

本明細書中に用いられる場合、用語「プラスミド」は、発現性遺伝子をコードする任意の核酸を指し、そして、線状の核酸または環状の核酸、および二本鎖核酸または一本鎖核酸を含む。上記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡあり得、改変されたヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含み得、そしてメチル化、あるいは保護基またはキャップ構造もしくはテイル構造を含めるような方法により化学的に改変され得る。

非複製の、非組込み型プラスミドは、宿主細胞に形質導入されるときに、複製せず、かつ上記宿主細胞ゲノムに特異的に組込みをしない（すなわち、高頻度で組込みをせず、かつ特定の部位で組込みをしない）核酸である。

本発明のベクターの極めて好ましい実施形態は、配列番号２のヌクレオチド１〜１００３および１７４７〜５７４９；配列番号３のヌクレオチド１〜９３２８および１００７２〜１４１１９；または配列番号４のヌクレオチド１〜２５９２および３３３６〜７３８３を含み、この実施形態は、全長配列によってコードされた例示的な強化緑色蛍光タンパク質レポーターの代わりに、発現性配列を挿入するために適切な発現ベクターである。

本発明はまた、本発明のベクターで形質導入された宿主細胞も提供する。上記宿主細胞は、任意の真核細胞であり得る。好ましくは、上記宿主細胞は、哺乳動物細胞、より好ましくはヒト細胞または齧歯類細胞である。

核酸濃縮剤の使用、エレクトロポレーション、アスベスト、ポリブレン、ＤＥＡＥセルロース、デキストラン、リポソーム、陽イオン性リポソーム、リポポリアミン、ポリオルニチンとの複合化、粒子線照射、および直接的なマイクロインジェクションを含む多数の技術が公知であり、かつ、本発明に従って、本明細書中に記載されているベクターを細胞へ送達するために有用である。

本発明のベクターは、宿主細胞へ非特異的または特異的に（すなわち、宿主細胞の指定されたサブセットへ）、ウイルス性または非ウイルス性の送達手段を介して輸送され得る。ウイルス起源の好ましい送達方法としては、本発明のベクターの形質導入レシピエントとしてのウイルス粒子生成パッケージング細胞株が挙げられる。上記パッケージング細胞株には、アデノウイルス、ヘルペスウイルスまたはパポバウイルスのもののようなウイルス性パッケージングシグナルが組み込まれている。好ましい非ウイルス性ベースの遺伝子送達手段または方法もまた、本発明において用いられ得、かつ、直接的な裸の核酸の注入、核酸濃縮ぺプチドおよび非ペプチド、カチオン性リポソームならびにリポソームにおける被包化を含み得る。

本発明によるベクターの送達は、核酸濃縮ペプチドを用いることが企図される。上記ベクターを濃縮し、かつ上記ベクターを細胞に輸送するために特に有用な、核酸濃縮ペプチドは、国際特許出願である国際公開第９６／４１６０６号パンフレットに開示されている。国際公開第９６／４１６０６号パンフレットに記載されている通り、官能基は、ベクターの送達に有用なペプチドに結合され得る。これらの官能基は、モノクローナル抗体、インスリン、トランスフェリン、アシアログリコプロテインまたは糖のような、特定の細胞型を標的とするリガンドを含み得る。従って、上記リガンドは、非特異的な様式で細胞を標的としてもよいし、細胞型に制限された特異的様式で細胞を標的としてもよい。

上記官能基はまた、パルミトイル、オレイルまたはステアロイルのような脂質；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）のような中性親水性ポリマー；インフルエンザウイルスのＨＡペプチドのような融合性（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）ペプチド；またはリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含み得る。上記官能基は、核局在配列（ＮＬＳ）のような細胞内輸送タンパク質、膜破壊性ペプチドのようなエンドソーム離脱シグナル、またはタンパク質を直接的にその細胞質へ方向付けるシグナルも含み得る。

本発明はさらに、本明細書中に記載されている単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、上記細胞は、真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞、さらに好ましくは、ヒト細胞または齧歯類細胞である。

さらなる局面では、本発明は、発現性ポリヌクレオチド、好ましくは、ポリペプチドをコードする発現性ポリヌクレオチドを発現する方法を提供する。この方法は、本発明による単離されたポリヌクレオチドを、本明細書中に記載されている適切な発現ベクターに挿入する工程、およびさらに上記ベクターを本明細書中に記載されている適切な宿主細胞に挿入する工程、および上記宿主細胞を発現させるのに適した条件において培養する工程を包含する。

好ましくは、上記ポリペプチドは、治療上有用なポリペプチドであり、好ましくは、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの機能的エピトープ結合性フラグメント、増殖因子、受容体またはその溶解性フラグメント、および血液凝固因子からなる群から選択される。

本発明によるポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、緩衝液または媒体とを含む薬学的調製物もまた、提供される。

（実施例１）
（ｈＣＭＶプロモーターまたはｇｐＣＭＶプロモーターのいずれかを含むベクターを用いて安定的に形質転換した、ＣＨＯ−Ｋ１細胞の生成）
上記プラスミド構築物を、以下の通り生成した。アンピシリン耐性遺伝子を、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からＰＣＲにより、プライマー

の各末端にＮｒｕＩ部位を組み込みながら単離した。ＰＣＲ産物を、ｐＭａｅＩＩ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１ ２９：Ｅ２６）のＰｖｕＩＩ部位に挿入し、ｐＣＡ１を生成した。以下のオリゴヌクレオチド：

をアニーリングさせ（１と２；３と４；５と６；そしてその後、これらの三つの二量体を一緒にアニーリングさせた）、そして、上記オリゴヌクレオチドを、ｐＣＡ１のＸｈｏＩ部位とＮｏｔＩ部位の間のマルチクローニング部位を置換するために用い、これらの部位を構築の間に破壊した。これにより、ｐＣＡ１ＭＣＳを生成した。ＡｇｅＩ部位を、ＡｇｅＩ制限酵素切断し、次いでＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼを用いて平滑末端化（ｂｌｕｎｔｉｎｇ）し、再ライゲーションすることにより、ｐＰＧＫ−Ｐｕｒｏ−ｂｇｈ内のＰＧＫプロモーターから欠失させた。上記ＰＧＫのピューロマイシンｐＡカセットを、ＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩフラグメントとしてこのベクターから除去し、そして、同様にＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＣＡ１ＭＣＳにライゲーションさせた。このベクターをｐＣＩＡ−Ｐｕｒｏ（ＣＥＴ １０００）と命名した。ｐＣＩＡ−Ｐｕｒｏ内のｂｇｈｐＡを、ＨＳＶのＴｋｐＡで置換した。上記のＨＳＶのＴｋ ｐｏｌｙＡを、ＢｓｔＢＩ−Ｅｃｏ１０９１フラグメントとしてｐＥＧＦＰ−Ｎ１から除去し、Ｔ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑末端化し、そして、ＳａｃＩで消化してＴ４ ＤＮＡ ポリメラーゼで平滑末端化したｐＣＩＡ−Ｐｕｒｏにライゲーションした。このベクターを、ＣＥＴ １００５と命名した。

ｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰを構築するために、１．５ｋｂ ｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥフラグメントを、ＢｓｍＢＩを用いて（上記のように）ＰＣＥＴ２０から切除し、Ｔ４ ポリメラーゼで平滑末端化し、そしてｐＥＧＦＰ−Ｎ１の平滑末端ＸｈｏＩ部位（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）にクローニングして、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ １．５ｋｂ−ＥＧＦＰを生成した。その後ＮｈｅＩ（平滑末端）／ＮｏｔＩを用いて、２．４ｋｂの「ｈｎＲＮＰ−ＥＧＦＰ」カセットを、このプラスミドから切除し、そして、ＳｗａＩ／ＮｏｔＩで消化したｐＣＥＴ１００５−ＥＧＦＰの骨格にサブクローニングして、ｐＣＥＴ１００５１．５ｋｂ−ＥＧＦＰを生成した。その後、ＧＰＣＭＶプロモーターを、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩを用いてｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔ ＧＰＣＭＶ（Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙにより合成された）から切除し、平滑末端化し、そして、このプラスミドの平滑末端ＢａｍＨＩにサブクローニングして、ｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ− ＥＧＦＰを生成した。ＰｍｅＩ／ＳａｃＩを用いて１．５ｋｂ ｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥを切除し、平滑末端化し、そしてその骨格を再ライゲーションすることにより、ｐＣＥＴ１００５ ＧＰＣＭＶ− ＥＧＦＰを生成した。

ｐＣＥＴ１００５ ８ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰを構築するために、ｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰの５．３ｋｂのＳａｃＩ（平滑末端）／ＰａｃＩフラグメントを、ＡｓｃＩ（平滑末端）／ＰａｃＩで消化したｐＣＥＴ１００５骨格にサブクローニングした。ｐＣＥＴ２０由来の平滑末端化した１．５ｋｂ ｈｎＲＮＰ ＢｓｍＢＩフラグメントをｐＣＥＴ１００５−ＥＧＦＰの平滑末端ＣｌａＩ部位にサブクローニングすることにより、プラスミドｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＨＣＭＶ−ＥＧＦＰを構築した。

ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、１０％のＦｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅ，ＵＫ）ならびに５Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンの混合物（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ)を補充したＦ１２（ＨＡＭ）栄養混合物（Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）中にて維持した。ＣＨＯ−Ｋ１の安定した形質導入のため、プラスミドを、ＰｃｉＩで線状化し、フェノール；クロロホルム；イソアミルアルコールおよびクロロホルム中に抽出し、エタノール中に沈殿させ、そして、滅菌水中に０．２５μｇ／μｌの濃度で再懸濁した。滅菌エレクトロポレーションキュベットにおいてて、線状化した等モル量のプラスミドを、滅菌水中にて希釈して２５μｌとし（ｐＣＥＴ１００５−ＥＧＦＰ １．３９μｇ、ｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＨＣＭＶ−ＥＧＦＰ １．７８μｇ、ｐＣＥＴ１００５ ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰ １．４５μｇ、ｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰ １．８５μｇ）、そして２５０μｌの増殖倍地中にて５×１０^６個のＣＨＯ−Ｋ１細胞と混合した。１５分間の氷上でのインキュベーションの後、上記細胞を、２５０Ｖ／９７５μＦ（ＢｉｏＲａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ^ＴＭ）でエレクトロポレーションし、そして室温でさらに１０分間インキュベートした。細胞を１０ｍｌの増殖培地に移し、遠心分離により回収し、そして、計５０ｍｌの増殖培地で２２５ｃｍ^２組織培養フラスコへ移した。ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ)を１２．５μｇ／ｍｌの濃度まで添加する前に、細胞を、２４時間３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした。安定な形質導入株を回収し、（選択を維持するための）６ウェルの組織培養ディッシュ内にて継代培養し、そして、ＥＧＦＰを可視化するためのＦＬ１チャネルを用いた蛍光活性化細胞選別により解析する前に、細胞を（４日後に選択培地を交換しながら）８日間培養した。図２は、ｇｐＣＭＶを含む二つの構築物であるｐＣＥＴ１００５ ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰ（図３）およびｐＣＥＴ１００５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰ（図５）が、それぞれｈＣＭＶプロモーターを用いる構築物であるｐＣＥＴ１００５−ＥＧＦＰおよびｐＣＥＴ１００５−１．５ｋｂ−ＨＣＭＶ−ＥＧＦＰよりも高いレベルまでトランスジーンを発現するプールを生成することを明確に示す。

（実施例２）
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％のＦｏｅｔａｌ Ｃａｌｆ Ｓｅｒｕｍならびに５Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび５Ｕ／ｍｌのストレプトマイシンの混合物（Ｓｉｇｍａ，ＵＫ)を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ，ＵＫ）中にて維持した。安定した形質導入のため、ＨＥＫ２９３細胞を、６ウェルディッシュ内にて１×１０^６個の細胞／ウェルの密度で播種し、そして、２４時間３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター内でインキュベートした。その後、細胞を、（ＰｃｉＩで線形化した）４μｇの上記に示されたプラスミド（ｐＣＥＴ１００５−ＥＧＦＰまたはｐＣＥＴ１００５−ｇｐＣＭＶ−ＥＧＦＰ）で、１０μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＫ）を用いて形質導入した。上記ＤＮＡおよびＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００を、別々に２５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ，ＵＫ）中にて希釈し、室温での５分間のインキュベーションの後、一緒に混合し、そしてさらに２０分間インキュベートした。増殖培地を、１５％のＦＣＳを補充した１ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉで交換し、その後、上記のＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００混合物を添加した。１０％のＦＣＳを補充した３．５ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ Ｉを添加する前に、細胞を、３７℃で５％ＣＯ_２インキュベーター内で５時間インキュベートした。細胞を、次いで３７℃にて５％ＣＯ_２インキュベーター内で２４時間インキュベートし、その後、細胞を回収し、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した全５０ｍｌのＤＭＥＭ増殖培地において２２５ｃｍ^２組織培養フラスコへ移した。安定な形質導入株を遠心分離により回収し、（選択を維持するための）６ウェルの組織培養ディッシュ内にて継代培養し、そして、ＥＧＦＰを可視化するためのＦＬ１チャネルを用いた蛍光活性化細胞選別により解析する前に、細胞を、（３〜４日毎に選択培地を交換しながら）約１４日間増殖させた。図６は、ｇｐＣＭＶ構築物で生成したプールが、ｈＣＭＶ構築物で生成したプールよりも３倍〜４倍高いＥＧＦＰの発現レベルを与えることを示す。

（実施例３）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、実施例１に記載の通りに培養した。１．５×１０^５個のＣＨＯ−Ｋ１細胞を、形質導入の１２時間前に１２ウェルへ播種した。２４時間後に、細胞を、１．５μｌのＦＵＧＥＮＥ（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ）を用いて１μｇのルシフェラーゼレポータープラスミド（ｐｈＣＭＶ−ＬｕｃまたはｐｇｐＣＭＶ−Ｌｕｃ）で形質導入した。形質導入のために、ＦＵＧＥＮＥおよびＤＮＡの双方を、別々にＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にて希釈し、一緒に混合し、そして、上記細胞に添加する前に３０分室温でインキュベートした。ルシフェラーゼの発現を、２４時間後に、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｗｉｌｄｂａｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて解析した。一般的に、細胞の溶解およびルシフェラーゼレポーターアッセイを、上述（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら著，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，２００１（８）：２７４−２８１）のように行った。形質導入は三連で行い、一つの代表的な実験結果の平均値および標準偏差を示している（図７）。明らかに、ｇｐＣＭＶベクターは、ｈＣＭＶプラスミドよりも少なくとも２倍活性のルシフェラーゼであった。

プラスミドｈＣＭＶ−Ｌｕｃは、上述されている（Ｌｉｐｉｎｓｋｉら著，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，（２００１）８：２７４−２８１）。プラスミドｇｐＣＭＶ−Ｌｕｃを、ｐＣＲＳｃｒｉｐｔ／ｇｐＣＭＶ（ｃｕｓｔｏｍｅｒ ｇｅｎｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｍｐａｎｙ：Ｇｅｎｅａｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来のＮｄｅＩ／ＥｃｏＲＩフラグメントを調製することにより生成し、そして、このｇｐＣＭＶプロモーターフラグメントをＰＧＬ３ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の平滑末端ＸｈｏＩ部位にクローニングした。

図１は、ＧＰＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーター（配列番号１）のヌクレオチド配列を示す。転写因子ＡＰ−１、ＮＦ-κＢ、ＳＲＦおよびＧＣＮ４の潜在的結合部位が、ＣＡＡＴボックスおよびＴＡＴＡボックス、ＣＲＳ開始部位および転写開始（矢印）と共に示されている。 図２は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞において多数のＥＧＦＰレポーター構築物で得られた発現レベルを示す。この発現レベルは、ＦＡＣＳにより測定された場合の蛍光のメジアンとして表されている。結果は、１．５ｋｂのｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥエレメントを含む、および含まない、ヒトＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターとモルモットＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターとを比較する。 図３は、強化緑色蛍光タンパク質レポーター遺伝子（ＥＧＦＰ）の発現を駆動するＧＰＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターを含むレポータープラスミドＣＥＴ １００５ ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰのマップを示す。上記の真核生物の選択マーカーは、マウスのホスホグリセレートキナーゼプロモーターから発現されるピューロマイシン耐性遺伝子である。上記の原核生物の選択マーカーは、アンピシリン耐性である。 図４は、レポータープラスミドＣＥＴ １０１５ ８ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰのマップを示す。これは、ＣＥＴ １０１５ ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰと類似しており、ＧＰＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターの上流に８ｋｂのｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥエレメントが付加されている。 図５は、レポータープラスミドＣＥＴ １０１５ １．５ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰのマップを示す。これは、ＣＥＴ １０１５ ８ｋｂ−ＧＰＣＭＶ−ＥＧＦＰと類似しており、８ｋｂのｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥエレメントが１．５ｋｂのｈｎＲＮＰ ＵＣＯＥエレメントで置換されている。 図６は、ＨＥＫ２９３細胞（せん断されたアデノウイルス５型ＤＮＡで形質転換されたヒト胚性腎細胞）におけるヒトＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターエレメントにより駆動されるＥＧＦＰの発現と、モルモットＣＭＶ ＩＥエンハンサー／プロモーターにより駆動されるＥＧＦＰの発現とを比較する。 図７は、ルシフェラーゼに基づいたレポーター構築物を用いた同様の比較を示す。

Claims (18)

1. 単離されたポリヌクレオチドであって、以下
   ａ．配列番号１の少なくとも２００個の連続するヌクレオチドを含むエレメントであって該２００個の連続するヌクレオチドは、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントを含む、エレメント、ならびに
   ｂ．発現性ポリヌクレオチド配列を含むエレメント
   を含み、該単離されたポリヌクレオチドは、該発現性ポリヌクレオチドのセンス鎖に対して５’から３’の方向で、エンハンサー、単一のプロモーター、および該発現性ポリヌクレオチド配列を含み、ここで該エンハンサーは該プロモーターに作動可能に連結され、該プロモーターは該発現性ポリヌクレオチド配列に直接的に作動可能に連結され、ここで該プロモーターは、天然には該発現性ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結されていない、単離されたポリヌクレオチド。
2. 配列番号１の少なくとも５００個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１に記載の単離されたポリヌクレオチド。
3. 配列番号１のヌクレオチド５０〜５５０を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
4. 配列番号１のヌクレオチド２７５〜７７５を含む、請求項１または２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
5. 発現性核酸配列に直接的に作動可能に連結されたモルモットＣＭＶの前初期制御領域由来のプロモーターを含み、該プロモーターは、天然には該発現性核酸配列に作動可能に連結されていない、請求項１または２のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
6. 配列番号１のヌクレオチド６７９〜８８０を含む、請求項５に記載の単離されたポリヌクレオチド。
7. 配列番号１のヌクレオチド１〜８８７を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
8. 前記発現性核酸配列に作動可能に連結された、広範なメチル化していないＣｐＧアイランドをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
10. 請求項９に記載の、真核生物発現ベクター。
11. 配列番号２のヌクレオチド１〜１００３、および１７４７〜５７４９のポリヌクレオチド配列を含む、請求項９または請求項１０のいずれか１項に記載のベクター。
12. 配列番号３のヌクレオチド１〜９３２８、および１００７２〜１４１１９を含む、請求項９または請求項１０のいずれか１項に記載のベクター。
13. 配列番号４のヌクレオチド１〜２５９２、および３３３６〜７３８３を含む、請求項９または請求項１０のいずれか１項に記載のベクター。
14. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
15. ポリペプチドを発現させる方法であって、該ポリペプチドをコードする発現性核酸配列を請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の発現ベクターに挿入し、該ベクターを適切な宿主細胞に挿入する工程、および該宿主細胞を、発現を可能にする適した条件において培養する工程、を包含する、方法。
16. 前記ポリペプチドは、治療的に有用なポリペプチドである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記ポリペプチドは、免疫グロブリン、免疫グロブリンの機能的エピトープ結合フラグメント、成長因子、可溶性レセプターおよび血液凝固因子からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のベクター、または請求項１４に記載の宿主細胞と、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、緩衝液または媒体とを含む、薬学的調製物。

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