JP2008525006A - 核酸変異の検出 - Google Patents
核酸変異の検出 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2008525006A JP2008525006A JP2007547646A JP2007547646A JP2008525006A JP 2008525006 A JP2008525006 A JP 2008525006A JP 2007547646 A JP2007547646 A JP 2007547646A JP 2007547646 A JP2007547646 A JP 2007547646A JP 2008525006 A JP2008525006 A JP 2008525006A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- primer
- detection primer
- sequence
- dna strand
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000035772 mutation Effects 0.000 title claims abstract description 169
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 155
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 140
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 98
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 98
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 71
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 56
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 56
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 51
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 238000000137 annealing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 claims description 34
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 32
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 13
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 claims description 9
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 9
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 8
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 8
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 6
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 claims description 5
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 claims description 4
- 240000001817 Cereus hexagonus Species 0.000 claims description 4
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 claims description 4
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 claims description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 4
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 50
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 9
- 101150013110 katG gene Proteins 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N isoniazide Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 6
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N rifampicin Chemical compound O([C@](C1=O)(C)O/C=C/[C@@H]([C@H]([C@@H](OC(C)=O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)\C=C\C=C(C)/C(=O)NC=2C(O)=C3C([O-])=C4C)C)OC)C4=C1C3=C(O)C=2\C=N\N1CC[NH+](C)CC1 JQXXHWHPUNPDRT-WLSIYKJHSA-N 0.000 description 5
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108010054814 DNA Gyrase Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 101150090202 rpoB gene Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150005343 INHA gene Proteins 0.000 description 2
- 101100038261 Methanococcus vannielii (strain ATCC 35089 / DSM 1224 / JCM 13029 / OCM 148 / SB) rpo2C gene Proteins 0.000 description 2
- 101100509674 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) katG3 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150024831 ahpC gene Proteins 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 101150070420 gyrA gene Proteins 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960001225 rifampicin Drugs 0.000 description 2
- 101150085857 rpo2 gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- 108030002440 Catalase peroxidases Proteins 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101100305808 Methanosarcina acetivorans (strain ATCC 35395 / DSM 2834 / JCM 12185 / C2A) rnp2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100385662 Mus musculus Cul9 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700021469 Mycobacterium tuberculosis rpoB Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710183280 Topoisomerase Proteins 0.000 description 1
- KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N [(7S,9E,11S,12R,13S,14R,15R,16R,17S,18S,19E,21Z)-2,15,17,27,29-pentahydroxy-11-methoxy-3,7,12,14,16,18,22-heptamethyl-26-[(E)-(4-methylpiperazin-1-yl)iminomethyl]-6,23-dioxo-8,30-dioxa-24-azatetracyclo[23.3.1.14,7.05,28]triaconta-1(29),2,4,9,19,21,25,27-octaen-13-yl] acetate pyridine-4-carbohydrazide Chemical compound NNC(=O)c1ccncc1.CO[C@H]1\C=C\O[C@@]2(C)Oc3c(C2=O)c2c(O)c(\C=N\N4CCN(C)CC4)c(NC(=O)\C(C)=C/C=C/[C@H](C)[C@H](O)[C@@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1C)c(O)c2c(O)c3C KGTSLTYUUFWZNW-PPJQWWMSSA-N 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940072185 drug for treatment of tuberculosis Drugs 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229940124307 fluoroquinolone Drugs 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N quinolin-2-ol Chemical compound C1=CC=C2NC(=O)C=CC2=C1 LISFMEBWQUVKPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
試料中の標的核酸配列における変異の検出方法であって、該標的核酸配列が、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法は、（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および（ｄ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程、を含む。
Description
本発明は、核酸配列における１以上の公知の核酸変異を検出するための方法、およびそのための試薬およびキットに関する。
核酸配列変異（例えば、多型）は、ＰＣＲ増幅およびそれに続くＤＮＡ配列分析を用いることによって検出され得る。核酸配列は、市販の利用可能な配列決定装置を用いてピロ配列決定（pyro-sequencing）によって決定され得るが、この方法の不利点は、標識された（特に、蛍光標識された）プライマーを必要とすることである。したがって、核酸変異の配列分析のための種々の代替方法が、当該技術分野で用いられてきた。
核酸配列変異の検出のための公知の方法は、２つのカテゴリーに入る−（１）これまでに未知の変異を発見するためのスキャンニング方法；および（２）公知の変異を検出するための診断方法。
公知の変異の検出のための公知の診断方法としては、マススペクトロメトリー、ＲＦＬＰ（制限酵素断片長多型）、ＰＦＧＥ（パルスフィールドゲル電気泳動法）、ＦＡＦＬＰ（蛍光増幅断片長多型）、ＲｎａｓｅＡ切断、ＡＳＯ（アレル特異的オリゴヌクレオチド）、５’ヌクレアーゼアッセイ（リアルタイムＰＣＲ「ＴａｑＭａｎ」アッセイ）、プライマー伸長（ＳｎａＰｓｈｏｔおよびＳＮＰ−ＩＴ技術を含む）、および分子ビーコン（リアルタイムＰＣＲ）が挙げられる。
例として、公知の配列多型を検出するための１つの技法は、融解曲線分析である。所定の配列における異なる変異は、LightCycler（Roche）のようなリアルタイムＰＣＲ装置を用いて特徴的な融解曲線を生じる。ＰＣＲ産物の変異はまた、蛍光プローブを用いて同定され得る。
配列分析のさらなる方法は、リバースハイブリダイゼーションである。目的の変異を含む標識されたＰＣＲ産物が生成され、そしてこれを用いて、固体支持体上に固定化された一連のプローブを問い合わせする。例として、Mycobacterium tuberculosis rpoB遺伝子の変異を検出するためのシステムが市販されている（INNO-LiPA Rif.TB, Innogenetics, Gent, Belgium）。しかし、この技法は、比較的高いコストによって制限される。
配列分析の他の方法は、アガロースゲル電気泳動であり、これは、変異特異的増幅を必要とする。ゲル中で得られたＰＣＲ産物のサイズは、所定の変異の存在を示す。
未知の配列変異を発見するためのスキャンニング方法としては、ＳＳＣＰ（一本鎖高次構造多型分析）が挙げられ、これは、増幅したＰＣＲ産物を変性し、そして得られた一本鎖ＤＮＡをアクリルアミドゲルに下方へ流し、多型が存在すれば代表的な移動パターンが見られる。
変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）も、ＰＣＲ増幅産物間のこれまで未知の差異（例えば、変異）を発見するために当該技術分野で用いられてきた。これらの配列の差異の検出は、ＤＮＡへテロ二重鎖の存在または不在の検出に依存する。
より詳細には、この公知の方法は、２つのＰＣＲ反応の産物（例えば、野生型参照試料「試料Ａ」、および変異を含み得るかまたは同様に野生型であり得る目的の試料「試料Ｂ」）を混合する工程、および混合したＰＣＲ産物を９４℃まで５分間加熱する工程を含む。このＰＣＲ産物が２５℃まで非常に緩やかに冷却されるにつれて、分離した鎖はアニールして二重鎖を形成する。「試料Ｂ」が変異を含まない（すなわち、野生型である）ならば、ホモ二重鎖のみが形成する−すなわち、二重鎖は、２つの試料において野生型核酸に対応する。しかし、「試料Ｂ」が変異を含むならば、図１に示すように、形成し得る４つの可能な異なる二重鎖がある。２つの異なるホモ二重鎖が形成され、「試料Ａ」における野生型核酸、および「試料Ｂ」における変異した核酸に対応する。さらに、２つの異なるヘテロ二重鎖が形成され、それぞれ「試料Ａ」の野生型核酸に由来する１つの鎖および「試料Ｂ」の変異した核酸に由来する１つの鎖に対応する。変異した部位で、ヘテロ二重鎖はミスマッチを含む。
ヘテロ二重鎖は、対応するホモ二重鎖とは異なるそれらの移動パターンを検出することによって検出される。より詳細には、ホモ二重鎖のみを含む試料は、ｄＨＰＬＣカラムから単一ピークの溶出プロフィールを生じる。逆に、ヘテロ二重鎖が存在する場合、３ピークのプロフィールが見られる。
したがって、この技法は、核酸配列におけるこれまでに未知の変異を発見するための技術分野で用いられ、野生型参照試料を用いて、変異が目的の試料中に存在するならばヘテロ二重鎖が形成し、一方へテロ二重鎖が存在しないことは、目的の試料が野生型であることを示す。
この技法の変更も、目的の特異的な公知の変異の検出に用いられ得、この場合、参照試料ＰＣＲ産物は公知の変異を含む。ヘテロ二重鎖は、目的の試料が野生型核酸のみを含むならば検出されるが、目的の試料が参照試料に存在する特異的変異を含むならばヘテロ二重鎖は検出されない。
この公知の方法の不利点は、大きな労働力を要することである。ヘテロ二重鎖の形成の前に、目的の試料のＰＣＲ産物を第２の「参照」試料のＰＣＲ産物と混合することを必要とするからである。したがって、この方法は、目的の試料における公知の変異を検出するために、その特異的な公知の変異も含む参照試料が利用可能である場合にのみ用いられ得る。この公知の方法はまた、多重変異が検出される限界を有する。
したがって、従来技術の方法に関連する１つ以上の問題を克服または少なくとも改良する、核酸配列における特異的変異を検出するための代替および／または改良された方法が、当該技術分野で必要である。
本発明は、試料中の標的核酸配列における変異の検出方法を提供し、該標的核酸配列は、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法は、（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および（ｄ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程；を含む。
したがって、本発明の方法は、参照試料の必要なしに、ＰＣＲ中にヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖を得ることによって、公知の核酸配列変異（例えば、多型）の検出を可能にする。
工程ａ）からｄ）は、連続的にまたは実質的に同時に行われ得る。あるいは、工程ａ）およびｃ）のみが実質的に同時に行われて、次いで工程ｂ）およびｄ）が続き得る。工程ｂ）およびｄ）が実質的に同時に行われることも選択肢である。
例えば、試料は、食物、下水、または臨床試料であり得る。
本発明によって検出可能な変異（例えば、多型）は、核酸欠失、挿入、または置換であり得る。１つの実施態様では、核酸欠失、挿入、および置換からなる群より選択される多重変異が検出され得る。これらの変異は、同じまたは異なる標的核酸にあり得る。
したがって、標的核酸における変異部位は、核酸欠失、挿入、または置換を含み得るかまたは含み得ない部位である。欠失、挿入、または置換が変異部位に存在するならば、標的核酸は「変異」標的核酸である。一方、多型部位が核酸欠失、挿入、または置換を含まないならば、標的核酸は「野生型」標的核酸である。これに関して、用語「変異部位」および「多型部位」は、同じ意味を有し、そしてこれらは交換可能であることが意図される。
検出プライマーは、標的核酸において変異部位に結合し、そして欠失、挿入、または置換のような核酸変異がその変異部位に存在するか否かを検出することを可能にするので、このように命名されている。検出プライマーは、変異部位に変異があるか否かにかかわらず、標的核酸に結合し得る。
検出プライマーは、「野生型検出プライマー」であり得る。野生型検出プライマーは、変異部位に野生型残基に相補的である核酸残基を含むので、このように命名されている。野生型検出プライマーが本発明の方法で用いられる場合、ヘテロ二重鎖の存在は、試料が変異部位に変異残基を有する標的核酸、すなわち、変異標的核酸、を含むことを示す。
あるいは、検出プライマーは、「変異検出プライマー」であり得る。変異検出プライマーは、変異部位に変異残基に相補的である核酸残基を含むので、このように命名されている。変異検出プライマーが本発明の方法で用いられる場合、ヘテロ二重鎖の存在は、試料が変異部位に野生型残基を有する標的核酸、すなわち、野生型標的核酸、を含むことを示す。
増幅プライマーは、変異部位から離れた位置で、第２のＤＮＡ鎖および／または相補ＤＮＡ鎖に結合する。増幅プライマーは、選択された検出プライマーがフォワードプライマーまたはリバースプライマーのいずれであるかに依存して、フォワードプライマーまたはリバースプライマーであり得る。「変異部位から離れた位置」とは、増幅プライマーが、変異部位に結合しない、そして好ましくは、変異部位から少なくとも５、好ましくは少なくとも１０、より好ましくは少なくとも２０、最も好ましくは少なくとも５０残基離れた部位に結合することを意味する。
フォワードプライマーは、標的核酸の非コード（アンチセンス）鎖に結合するプライマーであり、そしてリバースプライマーは、標的核酸のコード（センス）鎖に結合するプライマーである。これに関して、第１のＤＮＡ鎖は、標的核酸の非コード（アンチセンス）ＤＮＡ鎖またはコード（センス）ＤＮＡ鎖のいずれかであり得る。同様に、相補鎖は、第１のＤＮＡ鎖がコード鎖または非コード鎖のいずれであるかに依存して、標的核酸の非コード（アンチセンス）ＤＮＡ鎖またはコード（センス）ＤＮＡ鎖のいずれかであり得る。
より詳細には、１つの実施態様では、検出プライマーは、増幅プライマーがリバースプライマーである場合、フォワードプライマーであり得る。必要に応じて、この方法は、変異部位から離れた位置で第１のＤＮＡ鎖または第３のＤＮＡ鎖に結合するフォワード増幅プライマーであり得る第３のプライマーを添加する工程を含み得る。したがって、この実施態様では、この方法は、２つの異なるタイプのフォワードプライマーを添加する工程を含み得る。好ましくは、フォワード増幅プライマーは、検出プライマーよりも低いアニーリング温度を有し、そしてより好ましくは、フォワード増幅プライマーは、検出プライマーよりも短い。
他の実施態様では、検出プライマーは、増幅プライマーがフォワードプライマーである場合、リバースプライマーであり得る。必要に応じて、この方法は、第３のプライマーを添加する工程を含み得、この第３のプライマーは、変異部位から離れた位置で、第１のＤＮＡ鎖または第３のＤＮＡ鎖に結合するリバース増幅プライマーであり得る。したがって、この実施態様では、この方法は、２つの異なるタイプのリバースプライマーを添加する工程を含み得る。好ましくは、リバース増幅プライマーは、検出プライマーよりも低いアニーリング温度を有し、そしてより好ましくは、リバース増幅プライマーは、検出プライマーよりも短い。
１つの実施態様では、この方法は、少なくとも１５ヌクレオチド長である検出プライマーを使用する。検出プライマーが、少なくとも２０核酸長、より好ましくは少なくとも２５核酸長、最も好ましくは約２５から３０核酸長であることが好ましい。
増幅プライマーは、代表的には１から５０ヌクレオチド長、好ましくは１０から４０ヌクレオチド長、より好ましくは１５から２５ヌクレオチド長である。短いプライマーを使用することが一般的には有利である。これは、標的核酸により迅速に結合できるからである。１つの実施態様では、増幅プライマーは、検出プライマーよりも短い。
本発明の増幅プライマーおよび検出プライマーは、Primer Express（Applied Biosystems）のような従来のソフトウエアを用いて、所望のパラメータの選択に基づいて標的核酸配列に結合するように設計される。プライマーは、好ましくは、スクリーニングされて、自己相補性およびプライマーとプライマーとの結合を最小にする。
プライマー結合条件が、高いレベルの特異性が提供されるような条件であることが好ましい。増幅プライマーおよび検出プライマーの融解温度（Ｔｍ）は５０℃以上、好ましくは約６０℃であり得る。検出プライマーが、増幅プライマーよりも高い融解温度を有することが好ましい。
プライマーは、好ましくは、工程ｂ）およびｄ）においてそれらの３’末端から、すなわち、５’から３’方向に伸長される。好適な実施態様では、伸長工程ａ）は、高いアニーリング温度で行われ、この温度で、検出プライマーは、標的核酸に結合し得るが、増幅プライマーは、好ましくは標的核酸に結合し得ない。検出プライマーを用いる高いアニーリング温度での数ラウンドの伸長後、伸長工程ｃ）は、好ましくは、より低いアニーリング温度で行われ、この温度で、増幅プライマーは標的核酸に結合し得る。
伸長工程ｂ）およびｄ）は、任意の適切な方法によって行われ得、そして好適な実施態様では、伸長はＰＣＲによって行われる。増幅プライマーおよび検出プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＮＴＰを用いて伸長され、第１のＤＮＡ鎖およびその相補鎖、ならびに第２および第３のＤＮＡ鎖の多重コピーが生成される。
第２のＤＮＡ鎖は、検出プライマーの配列を組み込む−すなわち、変異部位での検出プライマーと標的核酸との間のあらゆる配列の差異が、第２のＤＮＡ鎖に組み込まれる。したがって、標的核酸が、第１のＤＮＡ鎖中の変異部位で野生型であるが、検出プライマーが変異部位で変異である場合、変異部位で変異である第２鎖が、伸長工程ｂ）で生成される。したがって、開始鋳型材料は純粋な野生型標的核酸であり得るが、本発明の方法は、いくつかの変異核酸鎖の生成を可能にする。これらの生成した変異鎖は、野生型鎖と組み合わせて、検出され得るヘテロ二重鎖を生成し得る。
あるいは、標的核酸が、第１のＤＮＡ鎖中の変異部位で変異であるが、検出プライマーが変異部位で野生型である場合、変異部位で野生型である第２の鎖が、工程ｂ）で生成される。したがって、開始鋳型材料は純粋な変異標的核酸であり得るが、本発明の方法は、いくつかの野生型核酸鎖の生成を可能にする。これらの生成した野生型鎖は、変異鎖と組み合わせて、検出され得るヘテロ二重鎖を生成し得る。
これらの鎖は、任意の公知の方法によって、例えば、増幅反応において温度を低下させることによって、アニールされて核酸二重鎖を形成し得る。これらの鎖は、好ましくは、相補塩基対合によってアニールする。これに関して、多くの配列ミスマッチが可能になる。したがって、変異部位で野生型である鎖は、変異部位で変異である鎖とアニールし得、変異部位でミスマッチした残基、したがってヘテロ二重鎖を生じる。
ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖は、任意の公知の手段によって検出され得、そして好適な実施態様では、検出は、変性高速液体クロマトグラフィー（ｄＨＰＬＣ）によって行われる。ヘテロ二重鎖が存在する場合、ｄＨＰＬＣカラムからの特徴的な「３ピーク」溶出プロフィールが見られる。しかし、すべての二重鎖が単一ピークで溶出する場合、これは、ヘテロ二重鎖が存在しない、すなわち、二重鎖がすべてホモ二重鎖であることを示す。
標的核酸試料は、純粋な試料であり得る（すなわち、試料中の核酸はすべて野生型またはすべて変異である）。あるいは、標的核酸試料は、変異および野生型核酸の両方を含む混合された試料であり得る。これらの２つのタイプの試料間を区別するために、本発明の方法の工程ａ）からｅ）は、この方法の第１ラウンドで用いられるのとは異なるタイプの検出プライマーを用いて繰り返され得る。
より詳細には、１つの実施態様では、まず、野生型検出プライマーを用いて本発明の方法の工程ａ）からｅ）が行われ、次いで変異検出プライマーを用いて本発明の方法の工程ａ）からｅ）が引き続き繰り返される。第１およびその後の稼動でヘテロ二重鎖が検出されるならば、これは、試料が野生型および変異の標的核酸の混合物を含むことを示す。
しかし、この方法が、最初に野生型検出プライマーを用いて行われる場合にヘテロ二重鎖が検出されるが、変異検出プライマーを用いるこの方法の続いてのラウンド後にヘテロ二重鎖が検出されないならば、これは、試料が変異標的核酸のみを含むことを示す。同様に、この方法が、最初に変異検出プライマーを用いて行われる場合にヘテロ二重鎖が検出されるが、野生型検出プライマーを用いるこの方法の続いてのラウンド後にヘテロ二重鎖が検出されないならば、これは、試料が野生型標的核酸のみを含むことを示す。
したがって、この方法の第１ラウンドが野生型検出プライマーを用いそしてヘテロ二重鎖を検出したならば、試料が変異標的核酸のみを含むか、または変異および野生型核酸の混合物を含むかを同定するために、工程ａ）からｅ）を、変異検出プライマーを用いて繰り返すべきである。変異検出プライマーを用いる続いてのラウンド後にヘテロ二重鎖がまた検出されるならば、これは、試料が、変異および野生型標的核酸の混合物を含むことを示す。
あるいは、この方法の第１ラウンドが変異検出プライマーを用いそしてヘテロ二重鎖を検出したならば、試料が野生型標的核酸のみを含むか、または野生型および変異核酸の混合物を含むかを同定するために、工程ａ）からｅ）を、野生型検出プライマーを用いて繰り返すべきである。野生型検出プライマーを用いる続いてのラウンド後にヘテロ二重鎖がまた検出されるならば、これは、試料が、野生型および変異標的核酸の混合物を含むことを示す。
１つの実施態様では、標的核酸は一本鎖である。１つの実施態様では、標的核酸はＲＮＡであり、これは、アニーリング工程（ａ）の前にｃＤＮＡに変換される。
本発明の配列に「少なくとも８０％の配列同一性」を有する配列という場合、これは、本発明の配列に、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を包含する。
本発明の配列に、少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列（例えば、プライマー配列）は、従来のソフトウエア（例えば、オンラインによって自由に入手可能なBioeditTMパッケージ、およびSequencher Gene Codes Corporation, 640 Avis Drive Suite 310, Ann Arbor MI 48108によって提供されるSequencherTMパッケージ）を用いて配列アラインメントによって同定され得る。
本発明のプライマー配列に相同であるプライマー配列を定義するための他の手段は、相同配列と本発明の配列との間で異なるヌクレオチドの数を定義することによる。これに関して、本発明は、６を超えないヌクレオチド、好ましくは５を超えないヌクレオチド、好ましくは４を超えないヌクレオチド、より好ましくは３を超えないヌクレオチド、さらにより好ましくは２を超えないヌクレオチド、および最も好ましくは１を超えないヌクレオチドが本発明のプライマー配列とは異なるプローブ配列を包含する。
１つの実施態様では、本発明の方法は、細菌またはウイルスの核酸配列（例えば、病原性細菌またはウイルスの核酸配列）における変異を検出するために用いられ得る。変異は、細菌またはウイルスにおいて１以上の薬物に対する耐性を付与し得る。細菌の核酸配列に関して、変異は、１以上の抗生物質に対する耐性を付与し得る。
核酸配列は、好気性細菌（例えば、バチラス種、マイコバクテリウム種、またはナイセリア種）に由来し得るか、または嫌気性細菌もしくは通性嫌気性細菌（例えば、サルモネラ種）に由来し得る。
核酸配列は、グラム陽性細菌種（例えば、バチラスまたはマイコバクテリウム）に由来し得るか、グラム陰性細菌種（例えば、サルモネラ種）に由来し得る。
核酸配列は、腸内細菌（例えば、サルモネラ種）に由来し得る。
したがって、本発明の方法は、サルモネラ種（例えば、Salmonella enterica）；バチラス種（例えば、B. cereusまたはB. subtilis）；ナイセリア種（例えば、N. meningitides）；またはマイコバクテリウム種（例えば、Mycobacterium tuberculosis（M. tuberculosis））の核酸配列における変異の検出を可能にする。変異は、感染（例えば、M. tuberculosis感染）を治療するために用いられる１以上の抗生物質（例えば、リファンピンまたはイソニアジド）に対する耐性を付与し得る。変異はまた、異なる細菌種および／または株の間を区別し得る。
M. tuberculosisに関して、少なくとも１１の遺伝子が、主な抗ＴＢ薬に対する耐性の発現に関連することが報告されている。リファンピン耐性（ＲＩＦ耐性）またはイソニアジド耐性（ＩＮＨ耐性）を付与する変異の存在を検出することは、臨床的におよび公衆衛生ＴＢコントロールに重要である。
リファンピンおよびイソニアジドに対する耐性は、３つのM. tuberculosis遺伝子における変異によって付与される。ＲＩＦ耐性は、一般的に、単一ヌクレオチド置換に関連する。ｒｐｏＢ遺伝子（ＲＮＡポリメラーゼのβサブユニットをコードする）の８１ｂｐコア領域における変異は、ＲＩＦ耐性の９０％以上に関与することが知られている。
２つの異なる遺伝子における変異が、イソニアジドに対する耐性に関与することが知られている。７５％を超える症例において、ＩＮＨ耐性が、ｋａｔＧ遺伝子（カタラーゼペルオキシダーゼをコードする）における置換により生じる。ｋａｔＧにおける最も通常の置換の１つは、翻訳されたポリペプチドのＳｅｒ３１５での変異を生じる。より稀には、ＩＮＨ耐性は、ｉｎｈＡ遺伝子およびａｈｐＣ遺伝子における変異による。
したがって、本発明は、M. tuberculosis遺伝子（例えば、ｒｐｏＢ、ｋａｔＧ、ｉｎｈＡ、およびａｈｐＣ遺伝子）における変異の検出を可能にする。
例として、本発明の方法は、臨床試料において変異マイコバクテリウム種を検出するために使用され得る。臨床試料としては、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＳ）、誘発喀痰、口腔咽頭洗浄物、血液または他の体液試料が挙げられ得る。
したがって、１つの実施態様では、本発明の方法は、配列番号１の核酸配列を含む、マイコバクテリウム種核酸配列における１以上の変異の検出用である。これに関して、M. tuberculosisのｋａｔＧ遺伝子は、ヌクレオチド残基９４４（翻訳されたポリペプチドにおけるコドン３１５に対応する）に変異部位を含む。配列番号１で示されるｋａｔＧ遺伝子の野生型においては、ヌクレオチド残基９４４は、グアニンであり（コドン３１５でセリンを生じる）、そして配列番号５で示されるｋａｔＧ遺伝子の変異型では、ヌクレオチド残基９４４はシトシンである（コドン３１５でトレオニンを生じる）。したがって、本発明の方法は、M. tuberculosisのｋａｔＧ遺伝子のヌクレオチド残基９４４でのＧ−Ｃ変異の検出に用いられ得る。
配列番号１の野生型核酸配列における１以上の変異を検出するための検出プライマーは、好ましくは、配列番号２に少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む配列番号１の領域、またはその相補物に結合する。これに関して、配列番号２は、配列番号１内の２８ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号１の残基９４４を含む。
同様に、配列番号５の変異核酸配列を検出するための検出プライマーは、好ましくは、配列番号６に少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む配列番号５の領域、またはその相補物に結合する。これに関して、配列番号６は、配列番号５内の２８ヌクレオチド配列を示し、そして配列番号５の残基９４４を含む。
検出プライマーは、配列番号３の核酸配列、またはそれに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり得、ただし、配列番号３内の下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。あるいは、野生型検出プライマーは、配列番号３の相補物（または、それに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列）を含み得、ただし、配列番号３内の下線を付した残基の相補物は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。
あるいは、検出プライマーは、配列番号４の核酸配列、またはそれに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり得、ただし、配列番号４内の下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。他の実施態様では、変異検出プライマーは、配列番号４の相補物（または、それに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列）を含み得、ただし、配列番号４内の下線を付した残基の相補物は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。
したがって、本発明はまた、配列番号２に少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む配列番号１の領域、またはその相補物；あるいは、配列番号６に少なくとも８０％同一、好ましくは少なくとも８５％同一、より好ましくは少なくとも９０％同一、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む配列番号５の領域、またはその相補物に結合する、検出プライマーを提供する。
検出プライマーは、配列番号３の核酸配列、またはそれに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり得、ただし、配列番号３内の下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。あるいは、野生型検出プライマーは、配列番号３の相補物（または、それに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列）を含み得、ただし、配列番号３内の下線を付した残基の相補物は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。
あるいは、検出プライマーは、配列番号４の核酸配列、またはそれに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり得、ただし、配列番号４内の下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。他の実施態様では、変異検出プライマーは、配列番号４の相補物（または、それに少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列）を含み得、ただし、配列番号４内の下線を付した残基の相補物は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない。
本発明はまた、特定の標的核酸配列における変異部位での特異的変異の検出のためのキットを提供し、このキットは、ａ）第１のＤＮＡ鎖に存在する変異部位に結合する検出プライマー；ｂ）変異部位から離れた位置で、第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖、および／または相補鎖に結合する増幅プライマー；ｃ）ポリメラーゼ；およびｄ）少なくとも１つのヌクレオチド；を含む。
このキットは、検出および増幅プライマーの配列に依存して、任意の核酸における変異を検出するために用いられ得る。したがって、１つの実施態様では、このキットは、マイコバクテリウム種標的核酸配列（例えば、M. tuberculosis標的核酸配列）における変異を検出するためであり得る。特に、このキットは、配列番号１における変異を検出するため、または配列番号５を検出するためであり得、この場合、キットは、上で定義した検出プライマーを含み得る。
いくらかの区別が難しい細菌種の核酸が、特異的多型部位で種間で異なることが知られている。したがって、本発明は、これらの多型の検出を可能にし、それによってこれらの群の細菌種を区別する。例として、本発明は、２群のバチラス種、B. cereusおよびB. subtilisを、これらの種間で異なるＧｙｒＡ、ｒｎｐＢ、およびｒｐｏＢ遺伝子におけるいくつかの多型を検出することによって、区別することを可能にする。
本発明の方法はまた、病原性細菌またはウイルスのような細菌またはウイルス（例えば、ナイセリア（例えば、N. meningitides）のような好気性種）をタイピングするために用いられ得る。これに関して、７つのハウスキーピング遺伝子における変異が、N. meningitides株間を区別するために有用であることが知られている（Maidenら, Proc Natl Acad Sci U S A. 1998年3月17日;95(6):3140-5）。
本発明の方法を用いるタイピングの他の例は、Ｃ型肝炎の遺伝子グループ分けである。混合した感染が存在し、そして疾患の治療が遺伝子型のより広い知見とともにより良好に知らされる（いくつかの遺伝子型は、他よりも治療に対してより耐性である）。特定の特異的変異を検出することによって、本発明の方法は、マイナーな遺伝子型の検出を可能にする。
本発明を、以下に記載の実施例および添付の図面によって、より詳細に説明する。
より詳細には、図１は、野生型参照核酸試料の増幅から得られたＰＣＲ産物（１）を示す。ＰＣＲ産物は、野生型である変異部位（２）を含み、したがってコード鎖（３）上にアデニン残基および相補鎖（４）上にチミン残基を有する。ＰＣＲ産物（１）は、目的の核酸試料の増幅から得られたＰＣＲ産物（５）と混合される。ＰＣＲ産物（５）は、変異部位（６）に変異を有し、そしてコード鎖（７）上に（アデニンの代わりに）シチジン残基および相補鎖（８）上に（チミンの代わりに）グアニン残基を有する。ＰＣＲ産物（１）および（５）の鎖は、加熱されると分離し、そして徐々に冷却されると再度アニールする。結果として、４つの異なる二重鎖が形成され、これらは反応における４つの鎖の異なる可能な組み合わせに対応する。元のＰＣＲ産物（１）および（５）に対応する２つの二重鎖は、再アニールする。これらはホモ二重鎖であり、すなわち、変異部位にミスマッチ残基を有さない。しかし、新しい二重鎖（９）が形成し、それぞれがＰＣＲ産物（１）のコード鎖（３）およびＰＣＲ産物（５）からの相補鎖（８）を含む。他の新しい二重鎖（１０）が形成し、それぞれがＰＣＲ産物（５）のコード鎖（７）およびＰＣＲ産物（１）の相補鎖（４）を含む。新しい二重鎖（９）および（１０）はヘテロ二重鎖であり、すなわち、変異部位にミスマッチ残基を有する。次いで、ヘテロ二重鎖（９）および（１０）は検出され得、ヘテロ二重鎖の存在が、目的の試料が変異標的核酸を含むことを示す。
図２は、本発明の検出方法を示す。工程ＡおよびＢにおいて、第１のＤＮＡ鎖（１２０）およびその相補鎖（１２５）を含みそして変異部位（１０５−黒の点によって示す）を有する標的二本鎖野生型ＤＮＡ（１００）は、高いアニーリング温度でリバース検出プライマー（１１０）と混合される。リバース検出プライマー（１１０）は、変異検出プライマーであり、すなわち、鋳型における変異部位（１０５）に対応する検出プライマー（１１０）における残基（１１５）が、変異である。第１のＤＮＡ鎖（１２０）およびその相補鎖（１２５）は、高温での加熱によって分離され、次いで検出プライマー（１１０）が第１のＤＮＡ鎖（１２０）に結合する。検出プライマー（１１０）は、第１のＤＮＡ鎖（１２０）に沿って伸長され、したがって第２のＤＮＡ鎖（１３０）を生成する。さらなる増幅サイクルＣにおいて、第１のＤＮＡ鎖（１２０）および第２のＤＮＡ鎖（１３０）は分離され、そして別のラウンドの増幅が、検出プライマー（１１０）を用いて行われ、したがってより多くの第２のＤＮＡ鎖（１３０）を生成する。さらなる増幅サイクルＤおよびＥが、より低いアニーリング温度で行われ、この温度で、フォワードおよびリバース増幅プライマー（示していない）は、変異部位（１０５）から離れた位置で標的核酸に結合する。フォワード増幅プライマーは、第２のＤＮＡ鎖（１３０）および相補鎖（１２５）に結合し、そして伸長されて第２のＤＮＡ鎖（１３０）に相補的である第３のＤＮＡ鎖（１３５）および第１のＤＮＡ鎖（１２０）の追加コピーを形成する。リバース増幅プライマーは第１のＤＮＡ鎖および第３のＤＮＡ鎖に結合し、そして伸長されて相補鎖（１２５）の追加コピーおよび第２のＤＮＡ鎖（１３０）を形成する。したがって、検出プライマー（１１０）ならびにフォワードおよびリバース増幅プライマーを用いる数ラウンドの増幅後、鎖（１２０、１２５、１３０および１３５）の多重コピーが、反応容器中に生成される。
図３は、本発明の１つの実施態様の検出方法の結果を示す。試料Ａ〜Ｊは、ｋａｔＧ３１５変異部位で野生型（試料Ａ〜Ｅ）またはｋａｔＧ３１５変異部位で変異（試料Ｆ〜Ｊ）のいずれかである。試料を、変異検出プライマーを用いて実施例１に記載のように増幅し、二重鎖を形成させ、そして二重鎖産物をｄＨＰＬＣカラムにかけて、図３の溶出プロフィールを生じた。試料Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪはすべて、１ピークの溶出プロフィールを生じた。すなわち、ヘテロ二重鎖が存在せず、したがってこれらが変異試料であることを確認した。試料Ａ〜Ｅはすべて、３ピークの溶出プロフィールを生じた。すなわち、ヘテロ二重鎖が存在し、したがってこれらが野生型試料であることを確認した。
図４は、従来技術の検出方法により、二重鎖を生成するように混合したＰＣＲ産物（増幅したｋａｔＧ３１５変異および野生型試料）Ａ〜Ｊから得られた溶出プロフィールを示す。ヘテロ二重鎖の存在（３ピークパターン）は、一方の鎖が野生型試料由来でありそしてもう一方が変異試料由来であること（例えば、Ａ＋Ｈ）を示す。ヘテロ二重鎖の不在（１ピークパターン）は、両方の鎖が野生型試料由来であること（例えば、Ａ＋Ｂ）または変異試料由来であること（例えば、Ｆ＋Ｈ）を示す。
図５は、Ｓｅｒ３１５変異部位の周囲の野生型ＫａｔＧ遺伝子の領域を示す。フォワード増幅プライマーＡが結合するＫａｔＧ内の２０ヌクレオチド配列を、薄い字体およびイタリックで示す。リバース増幅プライマーＢが結合するＫａｔＧ内の１８ヌクレオチド配列も、薄い字体およびイタリックで示す。リバース検出プライマーＣが結合するより長い２８ヌクレオチド配列を下に示す（変異型で）。リバース検出プライマーが結合する配列は、リバース増幅プライマーが結合する配列と重複する。これに関して、検出プライマーは変異部位での残基（ＫａｔＧ配列および検出プライマー結合配列において下線を付した）に結合するが、増幅プライマーは結合しない。変異部位でのヌクレオチド残基は野生型ＫａｔＧ遺伝子配列においてはグアニンであり、そして変異ＫａｔＧ遺伝子においてはシトシンであることに留意のこと。
実施例１−M. tuberculosisのｋａｔＧ遺伝子における変異の検出
以下の比較を示す例は、M. tuberculosis株にイソニアジド耐性を付与するｋａｔＧ遺伝子における変異の検出に関して、新しい検出方法と公知の検出方法とを詳細に比較する。１０のＤＮＡを検査し、５つは変異を有し、５つは変異がなかった。
以下の比較を示す例は、M. tuberculosis株にイソニアジド耐性を付与するｋａｔＧ遺伝子における変異の検出に関して、新しい検出方法と公知の検出方法とを詳細に比較する。１０のＤＮＡを検査し、５つは変異を有し、５つは変異がなかった。
材料および方法
材料
ＰＣＲ機械：GeneAmp7 PCR System 9700（Applied Biosystems, Perkin Elmer UK, Beaconsfield, Bucks, UK）
GeneAmp7 PCR System 9700用のＰＣＲチューブ（Applied Biosystems, Perkin Elmer UK, Beaconsfield, Bucks, UK）
変性高速液体クロマトグラフィー／ＷＡＶＥシステム（Transgenomic7, Ltd）
材料
ＰＣＲ機械：GeneAmp7 PCR System 9700（Applied Biosystems, Perkin Elmer UK, Beaconsfield, Bucks, UK）
GeneAmp7 PCR System 9700用のＰＣＲチューブ（Applied Biosystems, Perkin Elmer UK, Beaconsfield, Bucks, UK）
変性高速液体クロマトグラフィー／ＷＡＶＥシステム（Transgenomic7, Ltd）
試薬
ＤＮＡ鋳型：野生型ｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝を含む５つの単離物および変異したｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５｛Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ｝を含む５つの単離物
Transgenomicオプチマーゼ７ポリメラーゼ（Transgenomic7, Ltd）
1.5mM MgSO4を含む１０×反応緩衝液（Transgenomic7, Ltd）
ｄＮＴＰ
ＰＣＲプライマー（表１）
高純度水（Sigma）
WAVE最適化J緩衝液A、WAVE最適化J緩衝液B、WAVE最適化Jシリンジ洗浄溶液およびWAVE最適化J溶液D（Transgenomic7 BioconsumablesJ, Ltd）
ＤＮＡ鋳型：野生型ｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５｛Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥ｝を含む５つの単離物および変異したｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５｛Ｆ、Ｇ、Ｈ、ＩおよびＪ｝を含む５つの単離物
Transgenomicオプチマーゼ７ポリメラーゼ（Transgenomic7, Ltd）
1.5mM MgSO4を含む１０×反応緩衝液（Transgenomic7, Ltd）
ｄＮＴＰ
ＰＣＲプライマー（表１）
高純度水（Sigma）
WAVE最適化J緩衝液A、WAVE最適化J緩衝液B、WAVE最適化Jシリンジ洗浄溶液およびWAVE最適化J溶液D（Transgenomic7 BioconsumablesJ, Ltd）
方法
ｄＨＰＬＣ：
５μｌのＰＣＲ産物を、ｄＨＰＬＣにかけた。
５μｌのＰＣＲ産物を、ｄＨＰＬＣにかけた。
結果
本発明の検出方法を用いるＰＣＲの間に得られた主な産物は、約３．０〜４．０分に溶出した（図３）。この保持時間は、古い方法によって得られた主な産物の保持時間と相関する（図４）。
本発明の検出方法を用いるＰＣＲの間に得られた主な産物は、約３．０〜４．０分に溶出した（図３）。この保持時間は、古い方法によって得られた主な産物の保持時間と相関する（図４）。
配列決定データによれば、試料Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは、ｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５変異部位で野生型であり、したがってヘテロ二重鎖を形成すべきである。なぜなら、ＳＮＰをカバーする検出プライマーは、ｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５変異部位に変異した塩基を有するからである。試料Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪは、変異したｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５を有し、したがってヘテロ二重鎖を形成すべきでは「ない」。なぜなら、検出プライマーも変異した塩基を有するからである。
試料Ｆ、Ｈ、ＩおよびＪは、約３．０〜４．０分に１つのメインピークを有し、これは、試料が変異したｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５を有することを示唆する；一方のＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥは３ピークのパターンを有し、これは、試料が野生型ｋａｔＧ−Ｓｅｒ３１５を有することを示唆する。これは、配列決定データと相関する。
以下のパターンが同一であることに留意のこと：変異検出プライマーを用いる本発明の検出方法に従って増幅した野生型ｋａｔＧ３１５試料は、ｄＨＰＬＣグラフにおいて３ピークのパターンを生成し、そしてこのピークパターンは、２つのＰＣＲ産物、１つの変異したｋａｔＧ３１５および１つの野生型ｋａｔＧ３１５を混合することによって得られるヘテロ二重鎖と同じである（すなわち、古い方法）。
同様に、変異検出プライマーを用いる本発明の検出方法に従って増幅した変異ｋａｔＧ３１５試料は、ｄＨＰＬＣグラフにおいて１つのメインピークを生成し、そしてこのピークパターンは、２つのＰＣＲ産物、両方とも変異したｋａｔＧ３１５または両方とも野生型ｋａｔＧ３１５のいずれかを混合することによって得られるパターンと同一である（すなわち、古い方法）。
結論および議論
本発明の検出方法は、別の鋳型ＤＮＡについてＰＣＲ産物を定量することまたは多くのＳＮＰを見ることを必要とせずに、ヘテロ二重鎖、したがって公知の変異の検出を可能にする。この方法は、試料あたりほんの８．７分しかかからず、そして試料は多重化され得るようである（すなわち、チューブあたり１より多くの反応）。さらに、本発明の方法は、特別な標識されたプライマーの使用を必要とせず、そしてＰＣＲ産物が即座にｄＨＰＬＣにかけられ得るので、ＰＣＲ後の処理がない。
本発明の検出方法は、別の鋳型ＤＮＡについてＰＣＲ産物を定量することまたは多くのＳＮＰを見ることを必要とせずに、ヘテロ二重鎖、したがって公知の変異の検出を可能にする。この方法は、試料あたりほんの８．７分しかかからず、そして試料は多重化され得るようである（すなわち、チューブあたり１より多くの反応）。さらに、本発明の方法は、特別な標識されたプライマーの使用を必要とせず、そしてＰＣＲ産物が即座にｄＨＰＬＣにかけられ得るので、ＰＣＲ後の処理がない。
実施例２−サルモネラ変異の検出
ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢ、ＰａｒＣおよびＰａｒＥトポイソメラーゼ遺伝子における変異は、サルモネラにおいてフルオロキノロン耐性を付与することが知られている（Randallら、J. Antimicrob. Chemother. 2005; 56: 619-623）。以下の表は、関連する変異を示し、これらは、キノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）に位置する。ｇｙｒＡにおける最も普通の置換は、翻訳されたポリペプチドのＡｓｐ８７またはＳｅｒ８３での変異を生じる。
ＧｙｒＡ、ＧｙｒＢ、ＰａｒＣおよびＰａｒＥトポイソメラーゼ遺伝子における変異は、サルモネラにおいてフルオロキノロン耐性を付与することが知られている（Randallら、J. Antimicrob. Chemother. 2005; 56: 619-623）。以下の表は、関連する変異を示し、これらは、キノロン耐性決定領域（ＱＲＤＲ）に位置する。ｇｙｒＡにおける最も普通の置換は、翻訳されたポリペプチドのＡｓｐ８７またはＳｅｒ８３での変異を生じる。
（Ａ）S. enterica gyrAのＱＲＤＲのアミノ酸およびヌクレオチド配列。
（Ｂ）ＱＲＤＲ配列を同定するために使用されるプローブの配列。
（Ｂ）ＱＲＤＲ配列を同定するために使用されるプローブの配列。
本発明に従って設計したプライマーを用いて、実施例１に上述したように変異を検出する。
５μｌのＰＣＲ産物を、実施例１のようにｄＨＰＬＣにかける。一旦アッセイが稼動していると（使用したプライマーおよび検出されている特定の変異に依存して）稼動時間が最適化されるが、他の例は以下のとおりである。
Claims (46)
- 試料中の標的核酸配列における変異の検出方法であって、該標的核酸配列が、第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含み、該方法が、
（ａ）該核酸に検出プライマーを添加する工程であって、該検出プライマーが、該変異部位を含むＤＮＡ配列で該第１のＤＮＡ鎖に結合する、工程；
（ｂ）該検出プライマーを伸長して、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖を形成する工程；
（ｃ）該核酸に増幅プライマーを添加する工程であって、該増幅プライマーが、該変異部位から離れた位置で該第２のＤＮＡ鎖および／または該相補鎖に結合する、工程；
（ｄ）該増幅プライマーを伸長して、該第２のＤＮＡ鎖に相補的である第３のＤＮＡ鎖、および／または該第１のＤＮＡ鎖の追加コピーを形成する工程；
（ｅ）相補塩基対合によって該ＤＮＡ鎖をアニールして、核酸二重鎖を形成する工程であって、該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有するならば、該二重鎖がヘテロ二重鎖であり、そして該二重鎖の２本の鎖が該変異部位でミスマッチした残基を有しないならば、該二重鎖がホモ二重鎖である、工程；および
（ｄ）ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の存在を検出する工程；
を含む、方法。 - 前記工程ａ）からｄ）が連続的に行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記工程ａ）およびｃ）が実質的に同時に行われる、請求項１に記載の方法。
- 前記工程ｂ）およびｄ）が実質的に同時に行われる、請求項３に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で野生型残基に相補的な核酸残基を含む野生型検出プライマーであり、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が該変異部位に変異残基を有する標的核酸を含むことを示す、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で変異残基に相補的な核酸残基を含む変異検出プライマーであり、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が該変異部位に野生型残基を有する標的核酸を含むことを示す、請求項１から４のいずれかの項に記載の方法。
- 前記検出プライマーがリバースプライマーであり、そして前記増幅プライマーがフォワードプライマーである、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 第３のプライマーが添加され、そして該第３のプライマーが、前記変異部位から離れた位置で前記第１のＤＮＡ鎖および／または該第３のＤＮＡ鎖に結合するリバース増幅プライマーである、請求項７に記載の方法。
- 前記検出プライマーがフォワードプライマーであり、そして前記増幅プライマーがリバースプライマーである、請求項１から６のいずれかの項に記載の方法。
- 第３のプライマーが添加され、そして該第３のプライマーが、前記変異部位から離れた位置で前記第１のＤＮＡ鎖および／または該第３のＤＮＡ鎖に結合するフォワード増幅プライマーである、請求項９に記載の方法。
- 前記変異が核酸置換である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記変異が核酸欠失または挿入である、請求項１から１０のいずれかの項に記載の方法。
- 核酸置換、欠失、および挿入からなる群より選択される核酸配列における多重変異の検出のための、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記伸長工程がＰＣＲによって行われる、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記ヘテロ二重鎖および／またはホモ二重鎖の検出が、変性高速液体クロマトグラフィーによって行われる、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記検出プライマーが少なくとも１５ヌクレオチド長である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、少なくとも２０核酸長、好ましくは少なくとも２５核酸長、最も好ましくは約２５から３０核酸長である、請求項１６に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、前記増幅プライマーよりも高い融解温度を有する、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記工程ａ）が高いアニーリング温度で行われ、該温度で、前記検出プライマーが前記標的核酸に結合し得るが、前記増幅プライマーが該標的核酸に結合し得ない、請求項１８に記載の方法。
- 前記工程ｃ）が前記工程ａ）よりも低いアニーリング温度で行われ、該より低い温度で、前記増幅プライマーが前記標的核酸に結合し得る、請求項１９に記載の方法。
- 変異検出プライマーを用いて工程ａ）からｅ）を繰り返す工程を含み、該変異検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で変異残基に相補的である核酸残基を含み、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が野生型および変異標的核酸の混合物を含むことを示す、請求項５に記載の方法。
- 野生型検出プライマーを用いて工程ａ）からｅ）を繰り返す工程を含み、該野生型検出プライマーが、前記第１のＤＮＡ鎖における前記変異部位で野生型残基に相補的である核酸残基を含み、そして前記へテロ二重鎖の存在が、前記試料が野生型および変異標的核酸の混合物を含むことを示す、請求項６に記載の方法。
- 前記標的核酸が一本鎖である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記標的核酸がＲＮＡであり、そして工程ａ）の前にｃＤＮＡに変換される、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記試料が臨床試料である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、マイコバクテリウム種、好ましくはM. tuberculosis由来である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２６に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、配列番号２と少なくとも８０％同一である配列を含む配列番号１の領域、またはその相補物に結合する、請求項２７に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項２７または２８に記載の方法。
- 前記検出プライマーが、配列番号４の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項２７または２８に記載の方法。
- 配列番号２と少なくとも８０％同一である配列を含む配列番号１の領域、またはその相補物に結合する、検出プライマー。
- 配列番号２と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％同一である配列、またはその相補物を含む、請求項３１に記載の検出プライマー。
- 前記検出プライマーが、配列番号３の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む野生型検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項３１または３２に記載の検出プライマー。
- 前記検出プライマーが、配列番号３の配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項３３に記載の野生型検出プライマー。
- 前記検出プライマーが、配列番号４の配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む変異検出プライマーであり、ただし、下線を付した残基は必須であり、そして任意の他のヌクレオチドで置換され得ない、請求項３１または３２に記載の検出プライマー。
- 前記検出プライマーが、配列番号４の配列と少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項３５に記載の変異検出プライマー。
- 第１のＤＮＡ鎖および必要に応じてその相補鎖を含む標的核酸配列における変異の検出用のキットであって、該キットが、
（ａ）該第１のＤＮＡ鎖に存在する変異部位に結合する検出プライマー；
（ｂ）該変異部位から離れた位置で、該第１のＤＮＡ鎖に相補的である第２のＤＮＡ鎖、および／または該相補鎖に結合する増幅プライマー；
（ｃ）ポリメラーゼ；
（ｄ）少なくとも１つのヌクレオチド；
を含む、キット。 - 前記標的核酸配列が、マイコバクテリウム種、好ましくはM. tuberculosis由来であり、そして検出プライマーが、請求項３１から３６のいずれかの項で定義されている、請求項３７に記載のキット。
- 前記標的核酸が、好気性細菌、例えば、バチラス種またはナイセリア種、好ましくはB. cereus、B. subtilis、またはN. meningitidesに由来する、請求項１から２５のいずれかの項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、通性嫌気性細菌、例えば、サルモネラ種、好ましくはS. entericaに由来する、請求項１から２５のいずれかの項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、グラム陽性細菌、例えば、バチラス種、好ましくはB. cereusまたはB. subtilisに由来する、請求項１から２５のいずれかの項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、グラム陰性細菌、例えば、サルモネラ種、好ましくはS. entericaに由来する、請求項１から２５のいずれかの項に記載の方法。
- 前記標的核酸が、腸内細菌、例えば、サルモネラ種、好ましくはS. entericaに由来する、請求項１から２５のいずれかの項に記載の方法。
- 詳細な説明を参照して、および／または図２から５の１つ以上に示されるような、実質的に本明細書に記載された、試料中の標的核酸配列における変異の検出方法。
- 詳細な説明を参照して、および／または図２および５の１つ以上に示されるような、実質的に本明細書に記載された、検出プライマー。
- 詳細な説明を参照して、および／または図２または５の１つ以上に示されるような、実質的に本明細書に記載された、標的核酸配列における変異の検出用のキット。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB0428255.4A GB0428255D0 (en) | 2004-12-23 | 2004-12-23 | Detection of nucleic acid mutations |
| GB0428255.4 | 2004-12-23 | ||
| PCT/GB2005/004996 WO2006067454A1 (en) | 2004-12-23 | 2005-12-23 | Detection of nucleic acid mutations |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2008525006A true JP2008525006A (ja) | 2008-07-17 |
| JP2008525006A5 JP2008525006A5 (ja) | 2009-02-19 |
| JP4982380B2 JP4982380B2 (ja) | 2012-07-25 |
Family
ID=34113183
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007547646A Expired - Fee Related JP4982380B2 (ja) | 2004-12-23 | 2005-12-23 | 核酸変異の検出 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7935480B2 (ja) |
| EP (1) | EP1828409B1 (ja) |
| JP (1) | JP4982380B2 (ja) |
| AT (1) | ATE456675T1 (ja) |
| AU (1) | AU2005317878B2 (ja) |
| CA (1) | CA2591418C (ja) |
| DE (1) | DE602005019201D1 (ja) |
| GB (1) | GB0428255D0 (ja) |
| HK (1) | HK1107834A1 (ja) |
| WO (1) | WO2006067454A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009017902A2 (en) * | 2007-06-22 | 2009-02-05 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions and methods for identification of subspecies characteristics of mycobacterium tuberculosis |
| CN108026581A (zh) * | 2015-06-19 | 2018-05-11 | 剑桥企业有限公司 | 感染性疾病的诊断与治疗 |
| WO2019099420A1 (en) * | 2017-11-15 | 2019-05-23 | Yan Wang | A method for detecting multiple dna mutations and copy number variations |
| BE1026457B1 (fr) * | 2018-07-04 | 2020-02-06 | Coris Bioconcept | Procédé et dispositif pour la détection et différenciation de mutations ponctuelles chez des microorganismes par oligochromatographie |
| CN117230222A (zh) * | 2023-10-18 | 2023-12-15 | 鲲鹏基因（北京）科技有限责任公司 | 检测结核分枝杆菌喹诺酮耐药的组合物、试剂盒及方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050585A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | MUTATIONS IN THE katG GENE USEFUL FOR DETECTION OF $i(M. TUBERCULOSIS) |
| JP2003204795A (ja) * | 2001-11-12 | 2003-07-22 | Japan Science & Technology Corp | 拡張型心筋症の原因となる新規点突然変異を有するデスミン遺伝子 |
| WO2004011908A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Becton, Dickinson And Company | Methods for detecting nucleic acid sequence variations |
| JP2004275115A (ja) * | 2003-03-18 | 2004-10-07 | Institute Of Physical & Chemical Research | 重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんにおけるｓｃｎ２ａ遺伝子の変異 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE61148B1 (en) | 1988-03-10 | 1994-10-05 | Ici Plc | Method of detecting nucleotide sequences |
| AU5645690A (en) | 1989-05-05 | 1990-11-29 | Lifecodes Corporation | Method for genetic analysis of a nucleic acid sample |
| WO1995001453A1 (en) | 1993-07-01 | 1995-01-12 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | A heteroduplex mobility assay for the analysis of nucleic acid sequence diversity |
| US5658733A (en) * | 1994-04-18 | 1997-08-19 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | Detection of isoniazid resistant strains of M. tuberculosis |
| GB9808145D0 (en) * | 1998-04-17 | 1998-06-17 | Zeneca Ltd | Assay |
| US20030235855A1 (en) * | 1999-05-20 | 2003-12-25 | Fernando Cabral | Assay for the detection of paclitaxel resistant cells in human tumors |
| GB0021286D0 (en) | 2000-08-30 | 2000-10-18 | Gemini Genomics Ab | Identification of drug metabolic capacity |
| EP1343869B1 (en) | 2000-12-01 | 2009-01-28 | Cornell Research Foundation, Inc. | Detection of nucleic acid differences using combined endonuclease cleavage and ligation reactions |
| WO2003014398A2 (en) | 2001-01-03 | 2003-02-20 | Transgenomic, Inc. | Methods and compositions for mutation detection by liquid chromatography |
| US20040038283A1 (en) * | 2001-04-30 | 2004-02-26 | Lynx Therapeutics, Inc. | Method of screening for genetic polymorphism |
-
2004
- 2004-12-23 GB GBGB0428255.4A patent/GB0428255D0/en not_active Ceased
-
2005
- 2005-12-23 WO PCT/GB2005/004996 patent/WO2006067454A1/en active Application Filing
- 2005-12-23 DE DE602005019201T patent/DE602005019201D1/de active Active
- 2005-12-23 AU AU2005317878A patent/AU2005317878B2/en not_active Ceased
- 2005-12-23 AT AT05804986T patent/ATE456675T1/de not_active IP Right Cessation
- 2005-12-23 CA CA2591418A patent/CA2591418C/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-23 US US11/722,703 patent/US7935480B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2005-12-23 EP EP05804986A patent/EP1828409B1/en not_active Not-in-force
- 2005-12-23 JP JP2007547646A patent/JP4982380B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2008
- 2008-02-05 HK HK08101433.5A patent/HK1107834A1/xx not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998050585A1 (en) * | 1997-05-07 | 1998-11-12 | Mayo Foundation For Medical Education And Research | MUTATIONS IN THE katG GENE USEFUL FOR DETECTION OF $i(M. TUBERCULOSIS) |
| JP2003204795A (ja) * | 2001-11-12 | 2003-07-22 | Japan Science & Technology Corp | 拡張型心筋症の原因となる新規点突然変異を有するデスミン遺伝子 |
| WO2004011908A2 (en) * | 2002-07-26 | 2004-02-05 | Becton, Dickinson And Company | Methods for detecting nucleic acid sequence variations |
| JP2004275115A (ja) * | 2003-03-18 | 2004-10-07 | Institute Of Physical & Chemical Research | 重篤な知的能力の退行を伴う難治小児てんかんにおけるｓｃｎ２ａ遺伝子の変異 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7935480B2 (en) | 2011-05-03 |
| CA2591418A1 (en) | 2006-06-29 |
| WO2006067454A1 (en) | 2006-06-29 |
| US20080261200A1 (en) | 2008-10-23 |
| EP1828409A1 (en) | 2007-09-05 |
| DE602005019201D1 (de) | 2010-03-18 |
| EP1828409B1 (en) | 2010-01-27 |
| GB0428255D0 (en) | 2005-01-26 |
| JP4982380B2 (ja) | 2012-07-25 |
| AU2005317878A1 (en) | 2006-06-29 |
| ATE456675T1 (de) | 2010-02-15 |
| AU2005317878B2 (en) | 2010-10-28 |
| HK1107834A1 (en) | 2008-04-18 |
| CA2591418C (en) | 2013-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0843735B2 (en) | Glycosylase mediated detection of known nucleotide sequences | |
| JP2019004914A (ja) | ブロッキングオリゴヌクレオチドを用いたｄｎａ増幅の方法 | |
| US7638310B2 (en) | Method to determine single nucleotide polymorphisms and mutations in nucleic acid sequence | |
| JP4417723B2 (ja) | ヘッドループｄｎａの増幅 | |
| JP4982380B2 (ja) | 核酸変異の検出 | |
| JP2004248635A (ja) | イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用 | |
| CA2491563A1 (en) | Method for detecting mutated polynucleotides within a large population of wild-type polynucleotides | |
| JP2004033221A (ja) | ヒトグルコキナーゼ遺伝子の増幅用多重ｐｃｒプライマーセット | |
| JP2016533171A (ja) | 融解温度およびユニバーサル塩基を用いた変異解析 | |
| JPWO2008066164A1 (ja) | 肥満遺伝子増幅用プライマーセット、それを含む肥満遺伝子増幅用試薬およびその用途 | |
| JP2011062143A (ja) | ピロリ菌の２３ＳｒＲＮＡ遺伝子増幅用プライマー試薬およびその用途 | |
| KR20120038333A (ko) | 양극성 장애 진단용 ｅｇｒ2 유전자 ｓｎｐ, 그를 포함하는 마이크로어레이 및 키트 | |
| CN109477139B (zh) | 使用长ssDNA多核苷酸作为PCR测定中的引物的方法 | |
| JPWO2006070666A1 (ja) | 遺伝子多型の同時検出方法 | |
| Rahaman et al. | Genetic Disorders, Genotyping Techniques and the Emerging Role of Tetra-ARMS-PCR as a Diagnostic Tool | |
| WO2022202728A1 (ja) | プライマー対、塩基配列変異の判定方法及び塩基配列の変異判定用キット | |
| JP3005668B2 (ja) | 遺伝子型の判定方法 | |
| WO2003066870A2 (en) | Method for detecting polymorphisms in nucleic acids | |
| JP2018533943A (ja) | 一塩基多型検出用キット及び方法 | |
| RU2652895C2 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидных проб для определения генотипа митохондриальной днк человека | |
| CN116064757A (zh) | 一种提高TaqMan探针特异性的探针设计方法 | |
| JP2013022003A (ja) | Ｓｎｐ判別方法 | |
| JP2009219445A (ja) | Ｖｋｏｒｃ１遺伝子上の１塩基多型を検出する方法およびプライマーセット | |
| JP2005168309A (ja) | イグサ品種「ひのみどり」の識別マーカー |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20081222 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20081222 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20101126 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20110705 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20111003 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20111115 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120309 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20120316 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20120410 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20120423 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150427 Year of fee payment: 3 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R360 | Written notification for declining of transfer of rights |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R360 |
|
| R371 | Transfer withdrawn |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R371 |
|
| S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313113 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |