JP2008522609A - 反芻動物の腸へ生物活性化合物を供給するための細菌の培養方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、第一胃中での不活性化に本質的に耐性のある生物活性化合物を、反芻動物の胃腸へ供給するのに有用な微生物の同定方法、さらに、第一胃中での不活性化に一層耐性のある、不活性化耐性が低くて有用な微生物の培養方法に関する。前記微生物は、反芻動物に経口投与されると、胃腸に細胞を丸ごと供給することが可能であり、反芻動物への栄養物および生物活性化合物が前記細胞中に含まれる。本発明はまた、反芻動物の胃腸へ生物活性化合物を供給するのに有用であって、第一胃中での不活性化により耐性を有するように培養した微生物、およびそれと共に反芻動物の飼料に栄養補給する方法も含む。
乳酸菌、プロピオン酸菌、および乳酸菌に根差すプロバイオティクス培養物が、単胃の家畜およびヒトの、腸機能の維持のために益々利用されている。主張される利益は、消化率の増加、免疫機能の改善、および胃腸不調の軽減を含む。プロバイオティクス、主要例として酵母および菌類のプロバイオティクスは、反芻動物に用いられるが、プロバイオティクスが第一胃を通過し、そして小腸および大腸に入ることが確実には行われづらい点において、反芻動物の胃腸に機能するプロバイオティクスの利益は制限されている。
今回開示する方法は、第一胃中での不活性化に耐性であって、生物活性化合物を反芻動物の胃腸へ供給するために有用な、グラム陽性細菌の菌株を同定する方法である。本開示の別の方法は、細菌株が第一胃での不活性化にどんなに本質的に耐性でありえるとしても、生物活性化合物を反芻動物の胃腸へ供給するために有用な、培養された細菌株の、第一胃での不活性化に対する耐性を増加させる方法である。
天然または合成による第一胃流動物を含む栄養培地中での、生物活性化合物を反芻動物の胃腸へ供給するために有用なグラム陽性細菌株の、インビトロでの培養方法;および
時間の関数として、細菌培地中のタンパク質分解を測定する方法。
原生動物による捕食に耐性のある、細菌の細胞壁の成長を促す効果のある、一定量のリゾチームを含む成長培地中で、細菌株の培養物を少なくとも1代継代培養する段階;および
リゾチーム含有培地から細菌株を回収する段階。
第一胃での分解に対する耐性を付与するために、有用な細菌がリゾチーム存在下の栄養培地中で培養される。好ましくは、特定の生物を大量に培養するために理想的な発酵条件下、かつ有益な生物活性化合物の合成のために最適化された発酵条件下で培養される。適した栄養培地の例は、レノックス培地(Kumagai et al.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,69,2051−2056(2005))、CGXII培地(Keilhauer et al.1993.J Bacteriol 175:5595−5603)、ルリア・ベルタニ培養液(Lennox,E.S.1955.Virology 1:190−206)、ならびにブロエルおよびクラメルによって記載された複合培地(J.Bacteriol.1990,172,7241−7248)を含む。
実施例1 原生動物による捕食を経る第一胃での分解に対する、C.グルタミカム菌株の感受性
C.グルタミカムおよびS.ルミナンチウム(“平均的な”第一胃の細菌を表す)の分解は、ワラス(Wallace et al.)によって記載された方法(Br.J.Nutr.,58,313−323(1987))によって、第一胃流動物により決定された。
有効な分解性は、以下の方程式に従い、選択された第一胃の継代の速度から決定された。
結果を図1に示す。C.グルタミカムの両菌株はS.ルミナンチウムZ108と比べて早い分解を示した。3時間を超える培養時間が無いと、S.ルミナンチウムZ108が21.9%であるのに比べ、菌株10336および13869は71.2%および83.1%を示した。第一胃での代謝回転速度0.07hr−1での有効な分解性は、菌株13761および13869がそれぞれ71.2%および53.8%であった。
ワラス−マックフェーソンの非C14標識培地を調製し(24×7ml)、ろ過滅菌したリゾチーム(0.1;1.0;10;100;または1000μg/ml)0.5mlを各々4本ずつ試験管に加えた。最後の4本の試験管にはコールマンD培地0.5mlを加えた(対照)。試験管にC.グルタミカム菌株ATCC13761を植菌し、39℃で48時間培養した後、24、48時間後の各々の生物についてOD(650nm)を測定した。
実施例1と同様にまたはリゾチームの存在下で(0.25μg/mlのリゾチーム0.5ml;最終濃度16.7μg/ml)培養したC.グルタミカム菌株ATCC13761およびATCC13869からなる処理を除いて、本質的な方法論は実施例1と同様である。実施例1と同様に、S.ルミナンチウムZ108を対照生物として用いた。
C.グルタミカム菌株13869、700239および31269をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)から得た。ATCCの取扱説明書にあるように培養物を栄養寒天上で蘇生し、栄養培養液へ移した。健全な培養が観察された場合(39℃の栄養培養液中で3×24時間継代の後)には培養物を鶏卵白リゾチーム±20μg/mlの39℃の栄養培養液中でさらに3×24時間培養した。あらかじめ羊の第一胃からS.ボビスES1を採取し、アベリストウィスのウェールズ大学の農業化学研究所の菌株保存施設内で保存している。
培養時間:本実施例においてC.グルタミカムをリゾチームと共に計96時間培養した(栄養培養液中の20μg/mlを経た24時間3代継代に加え、細胞を標識するために用いたワラス−マックフェーソン培地中に1代継代)。不適当な時間を培養物に与えたので、リゾチームへの応答中に細胞構造が変化した可能性がある。
C.グルタミカムの他に、7つの異なる潜在的なプロバイオティクス生物における、第一胃流動物中の分解の効果を、インビトロでのリゾチーム存在下で培養することによって調査した。実施例1−6と同様にストレプトコッカス・ボビスを典型的な第一胃の細菌の対照とした。
Claims (32)
- リジン産生グラム陽性細菌の、第一胃での分解に対する耐性を増加させる方法であって、以下の段階:
原生動物による捕食に耐性を有する細菌の細胞壁の成長を促進するのに効果的なリゾチーム量を含む成長培地中で、細菌株の培養物を少なくとも1代継代培養する段階と、
リゾチーム含有培地から、細菌株を回収する段階と、
を含む方法。 - 当該細菌株が、コリネバクテリア・グルタミカム菌株である、請求項1に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が、13058,13825,14066,14067,14068,21127および700239からなる群から選択されるATCC菌株である、請求項2に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が、リジンを過剰生産する、請求項2に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が、リジンを過剰生産するように遺伝子組み換えされる、請求項4に記載の方法。
- 当該成長培地中のリゾチーム濃度が、約0.01〜約100ug/mlである、請求項1に記載の方法。
- 当該リゾチーム濃度が、約0.1〜約10ug/mlである、請求項6に記載の方法。
- リゾチーム含有成長培地中に、複数の継代を採用する、請求項1に記載の方法。
- 約2〜約10代継代を採用する、請求項8に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法によって培養されたリジン産生細菌株を含む、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該細菌株がコリネバクテリア・グルタミカム菌株である、請求項10に記載の第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が、リジンを過剰生産する、請求項11に記載の、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株がリジンを過剰生産するように遺伝子組み換えされる、請求項12に記載の、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該細菌株が、ワラス(Wallace et al.)の方法によってC14で標識されたロイシンを放出することにより測定される際、1時間当たり約8%未満の第一胃での分解速度を有する、請求項10に記載の第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該分解速度が1時間当たり約6%未満である、請求項14に記載の第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該細菌株が、ワラス(Wallace et al.)の方法によってC14で標識されたロイシンを放出することにより測定される際、1時間当たり約8%未満の第一胃での分解速度を有する、リジン産生細菌株を含む、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 1日当たり反芻動物に与えられる細菌の投与量の20%を上回る量が、そのまま反芻胃を通って供給されるような第一胃での分解速度である、請求項14または16に記載の、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 当該細菌株が、コリネバクテリア・グルタミカムATCC菌株13058,13825,14066,14067,14068,21127および700239からなる群から選択される、請求項14または16に記載の第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤。
- 請求項10または16に記載の、第一胃から保護されるリジンの飼料用栄養補助剤について効果的な量を反芻動物の飼料の割当量に添加することを含む、当該飼料の割当量に含まれる、代謝に利用可能なリジンの含有量を増加させる方法。
- 反芻動物の体重のkg当たりの代謝に利用可能なリジン量である、約5〜約150mgを供給するために効果的な量となるように、当該飼料用栄養補助剤を当該飼料の割当量に添加する、請求項19に記載の方法。
- 当該反芻動物が乳牛である、請求項19に記載の方法。
- インビボの第一胃での不活性化に対する、リジン産生細菌株の耐性を評価するインビトロでの方法であって、以下の段階:
天然または合成の反芻胃の流動物を含む栄養培地中での、グラム陽性リジン産生細菌株をインビトロで培養する段階;および
細菌培養中でのタンパク質分解を時間の関数として測定する段階、
を含む方法。 - 当該細菌株はコリネバクテリア・グルタミカム菌株である、請求項22に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が13058,13825,14066,14067,14068,21127および700239からなる群から選択されるATCC菌株である、請求項23に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株がリジンを過剰生産する、請求項23に記載の方法。
- 当該コリネバクテリア・グルタミカム菌株が、リジンを過剰生産するように遺伝子組み換えされる、請求項25に記載の方法。
- 当該タンパク質の分解を測定する段階が、ワラス(Wallace et al.)の方法により、C14で標識されたロイシンの放出の測定を含む、請求項22に記載の方法。
- 1時間当たり8%未満の分解速度を有する、第一胃で不活性な細菌株に耐性を有することを同定する段階をさらに含む、請求項22に記載の方法
- 当該第一胃流動物が天然の第一胃流動物である、請求項22に記載の方法。
- 当該第一胃流動物が合成の第一胃流動物である、請求項22に記載の方法
- 当該方法が、1日当たり反芻動物に与えられる微生物の投与量の20%より多くが、そのまま反芻胃を通って供給されるような、第一胃での分解速度を持つ、第一胃での不活性化に耐性のある細菌株を同定する段階をさらに含む、請求項28に記載の方法。
- 同定された菌株が、当該投与量の50%より多くがそのまま供給されるような分解速度を持つ、請求項31に記載の方法。
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