BR102016008664A2 - Processo para produção de anticorpo igy contra streptococcus bovis e o uso do mesmo como aditivo alimentar natural funcional, em substituição ao uso de antibióticos em dietas para ruminantes - Google Patents

Abstract

processo para produção de anticorpo igy contra streptococcus bovis e o uso do mesmo como aditivo alimentar natural funcional, em substituição ao uso de antibióticos em dietas para ruminantes. o objetivo da invenção é produzir igy contra s bovis para substituir os antibióticos, em dietas para ruminantes. as igy possuem a mesma função que os antibióticos em controlar microrganismos indesejáveis no rúmen, com a vantagem de ser mais específico contra o s bovis, ao invés de eliminarem bactérias gram-positivas de forma generalizada como os antibióticos. os testes foram realizados em novilhos nelore alimentados com 85% de ração concentrada e 15% de bagaço de cana de açúcar. os animais alimentados com 232 mg/dia de igy tiveram maior ganho de peso médio (1,329 vs 1,285 kg/dia) e nos últimos 42 dias de confinamento (1,690 vs 1,285 kg/dia) e menor concentração molar ruminal de ácido lático (0,164 vs 0,222 mm) no dia do abate, quando comparados aos animais alimentados com dietas contendo antibióticos, além de ausência de resíduos de antibióticos e de abcessos no fígado. a pesquisa foi conduzida em animais do rebanho bovino brasileiro alimentados com dietas usualmente utilizadas pelo setor produtivo brasileiro, de forma que os conhecimentos gerados possuem reais e imediatas possibilidades de adoção pela atividade pecuária brasileira

Description

(54) Título: PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO IGY CONTRA STREPTOCOCCUS BOVIS E O USO DO MESMO COMO ADITIVO ALIMENTAR NATURAL FUNCIONAL, EM SUBSTITUIÇÃO AO USO DE ANTIBIÓTICOS EM DIETAS PARA RUMINANTES (51) Int. Cl.: A61K 39/395; C07K 16/12; A61P 31/04 (73) Titular(es): GERALDO BALIEIRO NETO, AGÊNCIA PAULISTA DE TECNOLOGIA DOS AGRONEGÓCIOS (72) Inventor(es): GERALDO BALIEIRO NETO (57) Resumo: PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO IGY CONTRA STREPTOCOCCUS BOVIS E O USO DO MESMO COMO ADITIVO ALIMENTAR NATURAL FUNCIONAL, EM SUBSTITUIÇÃO AO USO DE ANTIBIÓTICOS EM DIETAS PARA RUMINANTES. O objetivo da invenção é produzir IgY contra S bovis para substituir os antibióticos, em dietas para ruminantes. As IgY possuem a mesma função que os antibióticos em controlar microrganismos indesejáveis no rúmen, com a vantagem de ser mais específico contra o S bovis, ao invés de eliminarem bactérias gram-positivas de forma generalizada como os antibióticos. Os testes foram realizados em novilhos Nelore alimentados com 85% de ração concentrada e 15% de bagaço de cana de açúcar. Os animais alimentados com 232 mg/dia de IgY tiveram maior ganho de peso médio (1,329 vs 1,285 kg/dia) e nos últimos 42 dias de confinamento (1,690 vs 1,285 kg/dia) e menor concentração molar ruminal de ácido lático (0,164 vs 0,222 mM) no dia do abate, quando comparados aos animais alimentados com dietas contendo antibióticos, além de ausência de resíduos de antibióticos e de abcessos no fígado. A pesquisa foi conduzida em animais do rebanho bovino brasilÇ..)

2/8 tamponantes como bicarbonatos e óxidos, óleos essenciais e outras não têm sido suficientes para evitar queda no pH ruminal seguido por distúrbios metabólicos ocasionados por dietas altamente energéticas praticadas pela pecuária. No futuro talvez possamos utilizar bactérias transgênicas desejáveis que possam sobreviver em diferentes faixas de pH ruminal. Atualmente, na ausência de alternativas para controle da fermentação ruminal, vem sendo comumente utilizados antibióticos que eliminam indiscriminadamente bactérias gram-positivas, dentre as quais, a Streptococcus bovis, grande responsável por problemas metabólicos. O S bovis é uma bactéria produtora de ácido lático, fermentadora de carboidratos não estruturais, principalmente amido e açúcares, anaeróbica facultativa de curto tempo de geração (máximo 24 minutos), que se torna dominante quando grandes quantidades de carboidratos solúveis são adicionadas à dieta e o pH ruminal é reduzido, ocasionando distúrbios metabólicos que resultam em quadros de acidose, reduzindo o desempenho animal, podendo levar os animais a morte. O controle da S bovis contribui para manter um ambiente ruminal mais estável, evitando acidose e melhorando a eficiência alimentar. Além disso, a redução no crescimento da S bovis no ambiente ruminal, promove o desenvolvimento das Bacteroides ruminicola, Selenomonas ruminantum e protozoários, resultando em produção de diferentes metabólitos, diminuindo a concentração ruminal de lactato e distúrbios metabólicos. Contudo, embora os antibióticos como aditivos alimentares eliminem as S bovis e incrementem ganho e eficiência, seu uso vem sendo mundialmente questionado nos últimos anos em função da insegurança alimentar, representando uma barreira para exportação de produtos, sendo iminente a proibição também no Brasil. Como alternativa aos antibióticos podem ser utilizados anticorpos policlonais para reduzir o crescimento do S bovis no rúmen. A terapia contra doenças infecciosas baseada na utilização de anticorpos foi desenvolvida primeiramente em 1890 e além do uso terapêutico, bastante reduzido após o surgimento dos antibióticos em 1935, vem sendo utilizada para diagnósticos em saúde humana, pecuária e agricultura através de kits de imunoensaios utilizados para a detecção de doenças. Em 1893, Klemperer descreveu um experimento no qual demonstrou que a imunização de uma galinha resulta na transferência de anticorpos específicos para a gema do ovo. Por

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3/8 um longo período não existiu aplicação científica para esse conhecimento, mas quando o bem-estar animal se tornou uma séria questão de preocupação ética para a comunidade científica, esses resultados ganharam interesse. A partir de 1959 vários trabalhos começaram a ser publicados relacionando o uso da IgY como anticorpo secundário para kits de diagnóstico. Na década de 1990, a tecnologia de IgY teve reconhecimento internacional e foi oficialmente aprovado pela comunidade européia como método alternativo para o bem-estar animal. O uso de galinhas traz um grande número de vantagens, pois o método de coleta não é invasivo, causando menos estresse por não haver coleta de sangue após a imunização, ou eutanásia no caso de ratos e coelhos, e é maior a quantidade de anticorpos encontrados na gema do ovo quando comparada com a quantidade produzida por cobaias convencionais, reduzindo a necessidade de animais de laboratório, já que uma galinha produz em média 5 a 7 ovos por semana. Além disso, as IgY presentes nas gemas de ovos não possuem reações cruzadas com imunoglobulinas de mamíferos e possuem características fundamentais para atuação no ambiente ruminal, como resistência a pH até 4,5, temperatura até 120oC, à proteólise e, mesmo após sua quebra, não perdem o sítio de ligação. Dessa forma, a produção de anticorpos em galinhas e a extração de anticorpos específicos na gema do ovo são incrivelmente atrativas e interessantes para a comunidade científica. Contudo, os anticorpos da gema do ovo jamais foram explorados comercialmente no Brasil como aditivo alimentar funcional em dietas para ruminantes. Tendo em vista a proibição do uso de antibióticos em estados americanos, um produto com o objetivo de reduzir o crescimento do S bovis no rúmen na forma de ovo integral seco foi desenvolvido em Minnesota EUA pela empresa Camas Incorporation®, mas não pode ser comercializado no Brasil, sendo liberado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA, apenas para pesquisa. O mecanismo de ação dos anticorpos policlonais aplicados a produção animal e segurança alimentar baseia-se no mesmo princípio da utilização dos mesmos contra microrganismos específicos para diagnósticos de doenças, pois o reconhecimento do antígeno pelos anticorpos adsorvidos na placa ELISA, ocorre da mesma forma em que o anticorpo presente no aditivo alimentar reconhece o S bovis no rumen, no entanto, acrescenta-se a esse último

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4/8 a função de reconhecer e precipitar, visando inibir o crescimento do S bovis no rumen. DEFICIÊNCIA DO ESTADO DA TÉCNICA [003] Na ausência de alternativas para controle da fermentação ruminal têm sido comumente utilizados antibióticos, eliminando de forma generalizada bactérias grampositivas, tais como o S bovis, com intuito de evitar problemas metabólicos e obter maior ganho de peso diário pelo controle de microrganismos produtores de ácido lático que resultam em quadros de acidose. Contudo, o uso de antibióticos como aditivos alimentares vem sendo mundialmente questionado nos últimos anos em função a insegurança alimentar, representando uma barreira para exportação de produtos, sendo iminente a proibição no Brasil. A resistência dos microrganismos aos antibióticos, observado na medicina humana, e o aumento de mortes causadas por superbactérias na última década, resultou em proibição da utilização de antibióticos e coccidiostáticos como aditivos alimentares para bovinos, pela Comunidade Européia, através do regulamento (EC) No 1831/2003 (EUROPA 2003). A “Food and Agriculture Organization of the United Nations”, proibiu a utilização de antibióticos em ração animal na Califórnia-USA. A resistência das bactérias aos antibióticos torna-se evidente em ensaios de longo período nos quais os efeitos da utilização dos antibióticos são reduzidos. Contudo, o produto a base de ovo integral seco contendo anticorpos policlonais desenvolvido em Minnesota pela empresa Camas Incorporation, não pode ser comercializado no Brasil, sendo liberado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA apenas para pesquisa. A comercialização e uso do produto da Camas Incorporation no Brasil sofrem conflito com a proibição do uso de ingredientes de origem animal para alimentação animal, vigente desde a ocorrência do príon causador da encefalopatia espongiforme, conhecido como doença da vaca louca. Além disso, a cepa de S bovis e microrganismos responsáveis pela fermentação ruminal em animais Bos taurus criados em clima temperado e alimentados com dietas praticadas nos EUA, são distintas da microbiota encontrada no sistema digestivo do Bos indicus criados em condições brasileiras, uma vez que a mesma é fortemente influenciada pela dieta e clima.

OBJETIVO DA INVENÇÃO

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PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO IGY CONTRA STREPTOCOCCUS BOVIS E O USO DO MESMO COMO ADITIVO ALIMENTAR NATURAL FUNCIONAL, EM SUBSTITUIÇÃO AO USO DE ANTIBIÓTICOS EM DIETAS PARA RUMINANTES.

[001] O presente relatório descritivo de patente de invenção destina-se ao setor técnico de nutrição e alimentação animal voltado a pecuária de corte bovina, contribuindo com a redução de custos, produtividade, qualidade do produto e segurança alimentar, representando uma alternativa natural funcional ao uso de antibióticos como aditivos na nutrição de animais de produção. O objeto do pedido de patente trata-se de um processo que permite obter anticorpos da gema do ovo de galinhas, utilizados como aditivo alimentar natural funcional em dietas para ruminantes, efetivo em controlar a proliferação de Streptococcus bovis no rúmen. O S bovis ocasiona uma série de problemas metabólicos relacionados a alta concentração ruminal de ácido lático em animais alimentados com altas quantidades de ingredientes ricos em carboidratos facilmente fermentescíveis no rúmen, como o milho, o que frequentemente tem sido resolvido com a inclusão de antibióticos na dieta. A invenção aborda problemas de relevância global para a saúde humana e animal, disponibilizando uma tecnologia inovadora em manipular a fermentação ruminal com custo reduzido, evitando o uso de antibióticos como aditivos alimentares, sem perda de produtividade na atividade pecuária. A invenção refere-se a produção de vacina para imunização de galinhas poedeiras, defini a dose e intervalo entre as imunizações baseado na velocidade de resposta do sistema imune das aves e quantificação da produção de anticorpos na gema do ovo e processo de produção do aditivo alimentar natural funcional a base de anticorpos IgY contra S bovis, incluindo coleta, separação, liofilização, delipidação, extração de proteínas, filtragem qualitativas e adição de conservantes para comercialização.

ESTADO DA TÉCNICA [002] A manipulação da fermentação ruminal visando evitar distúrbios metabólicos que podem ser causados pelo aumento da proporção de alimentos prontamente fermentescíveis presentes na dieta é um grande desafio aos nutricionistas. Substâncias

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5/8 [004] O objetivo dessa invenção é produzir IgY contra S bovis, produto natural, para substituir o uso de antibióticos, em dietas para ruminantes, tendo em vista a iminente proibição de uso dos antibióticos. O IgY possui a mesma função que os antibióticos em controlar microrganismos indesejáveis no rúmen, com a vantagem de ser mais específico contra o S bovis, ao invés de eliminar bactérias gram-positivas de forma generalizada como os antibióticos. O produto atende à crescente demanda do mercado consumidor por alimentos saudáveis e naturais, que provem de criações conduzidas com menor utilização de substâncias sintéticas, evitando riscos para a saúde pública como resíduos de antibióticos nos alimentos e resistência bacteriana aos antibióticos. O processo de produção e extração dos IgY da gema do ovo evita impedimentos legais de comercialização quanto a proibição do uso de produtos de origem animal para alimentação animal no Brasil, devido ao problema da vaca louca. A produção de IgY, com uso de antígeno S bovis BJ1 brasileiro, aumenta a eficiência do produto uma vez que foi criado e testado em condições brasileiras. Os testes por hora apresentados foram realizados em animais da raça Nelore alimentados com 85% de ração concentrada e 15% de bagaço de cana de açúcar, dieta representativa e exclusiva das condições brasileiras. O produto criado resulta em melhor desempenho animal, ganho em produtividade com custo reduzido, segurança alimentar e mercadológica (por evitar barreiras comerciais para exportação). Não existe produto similar no Brasil. A pesquisa científica que deu origem, desenvolveu, testou e validou as IgY, demonstrou que no último mês do confinamento com duração de 118 dias, animais da raça Nelore recebendo 232 mg/dia de IgY, quando comparado aos animais alimentados com dietas contendo antibióticos, tiveram maior consumo de matéria seca e maior ganho de peso no período final de 42 dias, (1,690 vs 1,285 kg/dia), tiveram menor concentração molar ruminal de ácido lático (0,164 vs 0,222 mM), ausência de resíduos de antibióticos e de abcessos no fígado. O trabalho foi conduzido em ambiente tropical utilizando-se animais e dieta representativos do setor produtivo brasileiro, de forma que os conhecimentos gerados possuem reais e imediatas possibilidades de adoção pela atividade pecuária brasileira, bastando que o IgY seja produzido em escala comercial e disponibilizado aos produtores.

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8/8 seja, 1 g de gema de ovo na matéria original possui 6,19 mg de IgY. Uma gema pesou em média 20 g totalizando 123,8 mg IgY por gema de ovo. Considerando que as galinhas produzem 5 ovos por semana, teremos 260 gemas de ovos por ano, totalizando uma produção de 32 g de IgY por galinha por ano, das quais neste caso, até 30 dias após a imunização, ao redor de 33% específico para o antígeno S bovis. Foram utilizados ensaios microbiológicos de ativação do S bovis na presença ou ausência das IgY produzidas, com vistas a validação do efeito inibidor das IgY sobre o crescimento do S bovis. A IgY produzida se ligou ao S bovis levando a alterações estruturais e diminuindo seu crescimento.

[008] Para testes de saúde e desempenho animal o delineamento escolhido foi o inteiramente ao acaso. Foram utilizados 24 bovinos da raça Nelore inteiros com peso vivo inicial médio de 392 kg e ao redor de 24 meses de idade. Os animais foram pareados de acordo com peso e distribuídos aleatoriamente aos tratamentos: dieta controle, contendo 161 mg/dia de monensina e 172,5 mg/dia de virginiamicina por animal (n = 12), ou dieta teste, substituindo-se a monensina e a virginiamicina por 232 mg/dia de IgY por animal. Com exceção dos tratamentos a dieta foi idêntica e formulada de acordo com a estimativa de exigência de nutrientes para bovinos de corte em crescimento do NRC (1996), contendo 15% de bagaço de cana de açúcar e 85% de ingredientes concentrados. A ração concentrada foi composta por milho, farelo de soja, caroço de algodão e sal mineral. As pesagens dos animais foram precedidas por jejum hídrico e solido de 12 h. Os animais alimentados com 232 mg/dia de IgY tiveram maior ganho de peso médio (1,329 vs 1,285 kg/dia) e nos últimos 42 dias de confinamento (1,690 vs 1,285 kg/dia) e menor concentração molar ruminal de ácido lático (0,164 vs 0,222 mM) no dia do abate, quando comparados aos animais alimentados com dietas contendo antibióticos, além de ausência de resíduos de antibióticos e de abcessos no fígado. A pesquisa demonstrou que a IgY contra S bovis é uma alternativa viável ao uso de antibióticos e foi conduzida em animais do rebanho bovino brasileiro, alimentados com dietas usualmente utilizadas pelo setor produtivo brasileiro, de forma que os conhecimentos gerados possuem reais e imediatas possibilidades de adoção pela atividade pecuária brasileira.

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6/8 [005] O desenvolvimento do PAP-APTA foi realizado no Polo Regional de Desenvolvimento do Centro Leste da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegócios, APTA-SAASP. As partes experimentais envolvendo as galinhas e bovinos foram conduzidas de acordo com os protocolos e condições experimentais aprovadas pelo Comitê de Ética no Uso de Animais do Instituto de Zootecnia CEUA/IZ/APTA/SAA, Parecer No 223-15. A seguir relataremos como a pesquisa foi conduzida e como o produto foi desenvolvido, de forma que se possa atestar a consistência dos resultados apresentados e replicar o processo de produção em escala industrial.

[006] Foram utilizadas 100 galinhas das quais 80 foram imunizadas via intramuscular contra a cepa S bovis JB1 isolada do rúmen de bovinos, e 20 receberam vacina apenas com os adjuvantes (sem antígeno), isolando os efeitos da resposta humoral do adjuvante e do antígeno S bovis. As galinhas foram mantidas em gaiolas de 1,00 x 0,40 x 0,45 m, sendo alojadas no máximo três galinhas por gaiola, em galpão coberto com ventilação natural e ambiente diariamente limpo e desinfetado com cresóis, não havendo contato com excretas ou partículas em suspensão, garantindo o bem-estar das aves. Os dejetos acumulados abaixo das gaiolas foram raspados e retirados do ambiente diariamente. As aves receberam água de poço artesiano tratada com hipoclorito e reposta continuamente e a ração foi balanceada de acordo com a fase de postura. O S bovis foi mantido em 292 mg de KH2PO4, 480 mg de (NH4)SO4, 480 mg de NaCl, 100 mg de MgSO4.7H2O, 64 mg de CaCl2.2H2O, 500 mg de cisteína-HCl, 1 g de Trypticase®, 0,5 g de extrato de levedura, 4 g de Na2CO3 e 4 g de glicose. O meio foi preparado em anaerobiose, sob um fluxo de dióxido de carbono livre de oxigênio. O pH final foi ajustado para 6,5 com NaOH (1 mol-1). A solução de carbonato e glicose foram preparadas em anaerobiose e adicionada separadamente dos demais ingredientes. A autoclavagem ocorreu por 20 min a 121oC. A vacina foi preparada com 35 mL de PBS em água destilada, 175 mg de Al(OH)3 e 2,5 mL da cultura ativada de S bovis JB1. A adsorção do antígeno foi realizada pela adição de Al(OH)3, de forma lenta e gradual, por um período de 4 horas com agitação constante, obtendo-se a concentração final de 5 mg de Al(OH)3 / mL de vacina, sendo aplicado 0,5 mL no peito da ave (2 x 107 UFC/dose). A contagem das

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7/8 bactérias S bovis foi realizada de acordo com McFarland Equivalence Turbidity Standards. Como controle negativo, um grupo de 20 galinhas poedeiras recebeu vacina apenas com PBS estéril e adjuvante de hidróxido de alumínio Al(OH)3.

[007] A casca do ovo foi cuidadosamente quebrada e transferida para separador de gema e clara. As gemas foram separadas das claras, congeladas, liofilizadas e moída. Foram pesadas 1 g de gema liofilizada em pó em um tubo Falcon de 15 mL (volume equivalente a 3 mL) e posteriormente acrescentado PBS na quantidade do dobro de volume (6 mL). Em seguida foi utilizado 3,5% de PEG6000 do volume total (6mL x 3,5% = 0,210 g de PEG6000). O volume total foi agitado em vortex por 1 min e seguiu para incubadora a 4oC com agitação por 10 min. Posteriormente, todo o volume foi centrifugado a 10.000 rpm por 20 min. Esse processo de extração separa a amostra e três fases. A fase precipitada consiste em sólidos e gordura, uma fração de gordura amarela da gema permanece acima do sobrenadante e o sobrenadante claro contém proteínas IgY. Após a centrifugação o sobrenadante passa por um filtro de papel qualitativo com velocidade de passagem de 20 a 25 s ficam retidas as partículas de gordura amarela. Esse processo deu origem a cerca de 4 ml de amostras com IgY. Essas amostras seguiram para análise quantitativa de IgY, através de teste ELISA e para análise de efeito inibidor de crescimento do S bovis, em placas de cultura. Para análise quantitativa de IgY foi utilizado o “Chicken IgY ELISA KIT” IRKTAH1109, comercializado pela SINAPSE BIOTECNOLOGIA. A curva de calibração obtida através do controle positivo foi Y = 134,67x2 - 193,94x + 58,561 (R2=0,98). As concentrações de IgY nas amostras extraídas de ovos cuja postura ocorreu 1, 5, 10, 15 e 30 dias após aplicação da vacina contendo S bovis como antígeno, foram de 306, 211, 321, 206 e 248 ng/mL, e após aplicação da vacina contendo apenas adjuvantes, foram de 153, 124, 195, 168 e 223 ng/mL. Os resultados demonstraram que o sistema imune das aves imunizadas reagiu produzindo anticorpos específicos (IgY) contra S bovis. A concentração média de IgY em 1 g de gema de ovo liofilizado foi de 258 ng e 172 ng, para o grupo imunizado com S bovis e somente adjuvantes, respectivamente, sendo a diferença de produção de IgY de 33%. Como a amostra foi diluída 1:50.000, 1 g de gema liofilizada contem 12,9 mg de IgY. A matéria seca do liofilizado foi de 52%, ou

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Claims (1)

1. REIVINDICAÇÃO

   1) PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO IGY CONTRA STREPTOCOCCUS BOVIS E O USO DO MESMO COMO ADITIVO ALIMENTAR NATURAL FUNCIONAL, EM SUBSTITUIÇÃO AO USO DE ANTIBIÓTICOS EM DIETAS PARA RUMINANTES, caracterizado por imunoglobulinas IgY contra a bactéria Streptococcus bovis.

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