JP2008522195A - 光電子検出システム - Google Patents
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Description
本出願は、2001年2月7日に出願された米国仮出願第60/266,977号の利益を主張する2002年2月6日に出願され英語で公開された国際出願番号PCT/US02/03606の米国国内段階である、2004年1月16日に出願された米国出願第10/467,242号の一部継続出願である、2004年12月1日に出願された米国出願第11/001,583号の優先権を主張する。
本発明は米国空軍契約番号F19628-00-C-0002からの政府資金により作り出された。政府は本発明における一定の権利を有する。
環境を長期間監視できる小型で高速で感度のよい、生物因子の検出器の必要性は、貧者の核兵器である生物兵器および化学兵器の拡散によって強調されている。戦場条件下では、有用な検出器は、特定の生物因子または化学因子が検出される場合に迅速に兵士に警告し、対抗手段が素早く実行され得る。
本明細書に記載される本発明は、米国特許第6,087,114号および米国特許第6,248,542号に記載される装置を一部変更し発展させて、可溶性抗原の検出方法を提供する。特に、該方法は可溶性のタンパク質および化学物質の検出を提供する。また本明細書に記載される本発明は、試料中の核酸配列の検出方法を提供する。さらに、本明細書はまた、試料中の標的微粒子を検出するためのFcレセプターおよびエミッター分子を含むエミッター細胞を提供するが、ここで検出される標的微粒子とは一つ以上の抗体に結合される。光子検出器を用いる複数の試料において標的微粒子を検出するための光電子センサー装置もまた提供する。
本明細書に記載される本発明は可溶性抗原を検出する方法を提供する。例えば、可溶性抗原は可溶性タンパク質または化学物質であり得る。一つの態様において、可溶性抗原は一つまたは二つのみの抗原エピトープを含む。細胞の表面で発現される抗体を用いた可溶性抗原の検出により、抗原への抗体の結合はカルシウム濃度の増大を引き起こし、そのことがエミッター分子を活性化して、抗原が細胞表面上の抗体に架橋する(または凝集することにより、細胞表面上の抗体を固定する)ことで細胞内カルシウムの増加を促進する能力に依存して、細胞内カルシウムの増加に応じて光子を放出する。可溶性抗原は細胞の表面上で発現される抗体を架橋するのに非効率であり得、そのために細胞内カルシウムの増加を促進するのに非効率である。本明細書は、細胞内カルシウムの増加を促進してカルシウム濃度の増加に応答するエミッター分子から光子の放出を引き起こす、記載される方法により、抗体の架橋が達成される可溶性抗原の検出方法を記載する。
エミッター細胞(本明細書中でセンサー細胞またはCANARY細胞とも言われる)は、天然に、遺伝子的に作り変えられて、または化学的付加によってのいずれかで、適切なレセプター、シグナル伝達経路、シグナル出力法を有する任意の原核または真核細胞であり得る。該細胞は、機能的レセプター、シグナル伝達経路およびシグナル出力法を有するものとして規定される人工または非生体的ユニットであり得る。抗体等の抗原レセプターの結合の際に、該細胞はカルシウムイオンを細胞質ゾルに動員させる。本発明の装置(device)および方法に有用な細胞の例は、遺伝的に作り変えられて一つ以上の表面結合モノクローナル抗体を発現し得るB細胞(すなわち、骨性の顎を有する冷血または温血脊椎動物由来のB細胞)である。該装置に有用な細胞の別の例は、細胞表面にFcレセプターを発現する、ヒト細胞株U937等のマクロファージ細胞である。抗体の標的への付加により抗原は抗体に結合し得、この抗原抗体複合体は細胞上のFcレセプターに結合し、細胞内カルシウムの増加を生じさせるシグナル伝達を刺激する。
もともとの細胞の型が何であったとしても、モノクローナル抗体の抗原結合可変領域は一般的な供給源由来のDNA配列として入手され得るか、またはハイブリドーマ細胞株からのRT-PCRによりクローニングされ得る。RT-PCRは、5末端で、可変領域のリーダー領域または枠組み領域のいずれかに、および3末端で定常領域にアニールするように設計されたプライマーの組を用いて達成される。
所望の物質の細胞表面レセプターへの結合により、細胞内部のシグナル伝達経路が誘発されるはずである。好ましいシグナル伝達経路は、B細胞、T細胞、マスト細胞、マクロファージ、または他の免疫細胞中に見られる二次的メッセンジャーカスケードであり、細胞表面レセプターの架橋により、チロシンキナーゼが活性化され、次いでそれによりホスホリパーゼCがリン酸化され、次いでそれによりホスファチジルイノシトール4,5-ビスホスファターゼ(PIP2)をイノシトール1,4,5-ホスファターゼ(IP3)とジアシルグリセロールに切断し、次いでIP3によりカルシウムチャネルが開いて、細胞質内小網等の細胞内貯蔵からカルシウムを放出させるか、または細胞外カルシウムを取り込み、それにより細胞の細胞質ゾル内のカルシウム濃度を上昇させる。レセプターの型、細胞の型、および所望のシグナル伝達方法に依存して、G-タンパク質-アデニリルサイクリック-cAMP-タンパク質キナーゼAカスケード等の選択的な二次的メッセンジャーカスケードが使用され得る。
1以上の抗原またはタグが分子に付加(本明細書中ではコンジュゲートとも言う)され、公知の抗原性エピトープを提供し得る。例えば、1以上の抗原がオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされ、公知の抗原性エピトープを有する抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを提供し得る。抗原コンジュゲート分子は、同一であるか異なる一つまたは複数の抗原を含み得る。例えば、限定されること無く、検出のための分子にコンジュゲートされる抗原またはタグとしては、(Corey, J Am Chem Soc , (1995) 117 9373-4に記載されるような)ジゴキシゲニン、ホスホコリン、フルオロセインまたは他のフルオロフォア、およびビオチン等の小抗原ならびにHIS、VSV-G、FLAG、およびC(AAKK)マルチマーが挙げられる。
従来のDNAおよびRNAプローブに加えて、種々の改変された核酸が、配列特異的様式で標的核酸配列にハイブリダイズすることが示されている。これらには、ペプチド核酸(PNA)(Nielsen et al , (1991) Science 254 1497-1500)、ビス-PNA(Griffith et al , (1995) J Am. Chem Soc 117 831-832)、テイル-クランプ(Tail-clamp)PNA(Bentin (2003) Biochemistry 42 13987-13995)、PDループ(Bukanov et al , (1998) PNAS 95 5516-5520)、偽相補的塩基を組み込んだPNA(Lohse et al , (1999) PNAS 96 (21) 11804-11808)、またはロックト核酸(Braasch and Corey (2001) Chem Biol 8 1-7)が含まれる。種々のこれらの改変された核酸は、ハイブリダイゼーション特性、安定性、親和性、および特異性に違いを有することが示されており、従来のDNAオリゴヌクレオチドの代わりに使用され得る(BeckおよびNielsen, Artificial DNA Methods and Applicationsのpp 91-114, CRC Press, Y E Khudyakov and H. A Fields編に概説される)。陽イオン性タンパク質、ペプチド、またはDNA結合タンパク質の結合は、ハイブリダイゼーション動態を改善するように示されている(Corey (1995) J Am Chem Soc 117. 9373-9374、Zhang et al , (2000) Nuc Ac Res 27 (17) 3332-3338)。
オリゴヌクレオチドは、特定の核酸配列を検出し得る唯一の分子ではない。タンパク質もかかる識別を行い得、エミッター細胞の表面に発現し得、結合の際にカルシウム応答を開始する細胞質ドメインに組換えにより結合し得る。これには、例えば抗体のFc部分に結合する核酸結合タンパク質が含まれる。エミッター細胞表面上の核酸結合タンパク質の発現は、オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの前の二重鎖核酸の変性の必要性を無くし得、さらに該系は、全ての必要とされる構成成分を生成し、外来的に合成されたオリゴヌクレオチドは必要ではない。DNA結合タンパク質に特異的な可能性のある配列としては、(1)DNA制限酵素(好ましくはDNA-切断触媒部位が除去されたか不活性化された、例えばL F Dorner & I Schildkraut (1994) Nucl Acids Res 22, 1068-1074);(2)転写因子または他のDNAもしくはRNA結合タンパク質、特に目的の病原体もしくは生物体に特有のDNAもしくはRNA配列を認識するもの(例えば、HIV TAT転写因子C Brigati et al (2003) FEMS Microbiology Letters 220, 57-65、ポックスウイルス転写因子S S Broyles (2003) Journal of General Virology 84, 2293-2303)が挙げられる。かかるレセプターを有するエミッター細胞が、特異的繰返し配列または択一的に二つ以上の特有の配列のいずれかを有する標的DNA/RNA上で架橋するように設計され得る。
検出に必要ではないが、沈降し得るか固形の支持体上の標的核酸配列の捕捉により、アッセイの感度が改善され得る。例えば、ストレプトアビジンコート化ポリスチレンまたは常磁性ビーズに結合したビオチン標識化捕捉オリゴヌクレオチドを使用して、一本鎖DNA標的も捕捉され得る。捕捉された物質は、適切なように、遠心分離または磁場への曝露により結合していない物質から分離され得る。オリゴヌクレオチドのビーズへの結合中の、中間結合反応体(アビジン-ビオチン)の使用は、オリゴヌクレオチドを固形支持体へと結合させる、直接コンジュゲートを含む任意の相互作用が使用される場合に必要でなくても良い。さらに、捕捉オリゴヌクレオチドが結合し得る任意の固形支持体で十分である。これは、特異的な捕捉オリゴヌクレオチドがアレイの特定の位置にあるような、二次元アレイの形状であり得る。あるいは、標的核酸配列が非特異的様式(例えば、イオン交換樹脂、沈降、ヒストンまたはプロタミン結合)で捕捉され得る。標的の捕捉によっても、標的核酸配列が濃縮され、および/またはアッセイ障害物が除去される。
エミッター細胞の刺激は、エミッター細胞に対して多価(multivalent)であるような抗原に依存している。一般的に、これは少なくとも二つの方法で達成され得る。第一に、例えば複数の抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの標的核酸配列へのハイブリダイズのように、抗原の複数のコピーが標的分子に結合し得る。第二に、各々が単一抗原に結合している標的核酸のいくつかのコピーは、互いに結合し得るか、または極めて近接に互いに結合し得る(例えば、ビーズに結合する)。この例において、個々の標的核酸配列は、多価性でなくても良いが、結合している複数のコピーの標的核酸配列が結合するビーズは、多価性の抗原を提示し得る。
本発明における使用に適している反応チャンバーは、エミッター細胞および候補粒子が混合されて互いに結合し得る任意の基材または容器であり得る。一態様において、反応容器は遠心分離チューブである(例えば、極小遠心分離チューブまたはエッペンドルフチューブ)。本明細書に記載のように、遠心分離は特に、他のものが第一ペレットに入り込む前に、第一に候補粒子およびエミッター細胞をペレット化するのに十分に適した手段である。粒子または細胞の両方のペレット化をさらに増加させるために、チューブの側壁は、ウシ血清アルブミン等の粘着性の無いキャリアタンパク質でコートされてエミッター細胞が側壁に貼り付くのを防ぎ得、チューブの底をポリ-L-リジンでコートして、標的粒子がチューブの底に接着したままになることを確実にし得る。細胞接着を妨害または促進する他のタンパク質または分子が細胞生物学の分野で公知であり、本発明における使用に適している。
異なる装置を使用して、例えば空気から試料を回収し得る。一般的に、空気サンプリング装置は、空気もしくは気体が通過する回収チャンバー中またはそれに並んで液体を含有するか、または空気もしくは気体が通過する場合に粒子(例えば標的粒子)を捕獲する多孔性フィルターを含有する回収チャンバーを有する。液体を含有する回収チャンバーについて、回収液は遠心分離または処理されて、粒子を液体から分離し得る。次いで、分離された粒子は反応チャンバー中に沈降する。フィルター(例えばニトロセルロース)を含有する回収チャンバーについて、フィルターまたはフィルターの孔が反応チャンバーとして作動し得る。あるいは、粒子をフィルターから洗い出すか、またはフィルターを粒子から溶解(dissolve)もしくは除去し得る。フィルター回収チャンバーも、フィルターを通して流れる液体(例えば、水供給試料または脳脊髄液)から粒子を回収するのに適している。さらに、上述のように、液体試料を遠心分離して液体試料中に存在する任意の粒子物を取り出し得る。種々の試料が公知であり、本発明による使用に利用可能である。SKC BioSampler(登録商標)を販売するSKC, Incおよび他のサンプリング装置を参照。
検体回収器または反応チャンバーの一部として、異なる機構(遠心分離以外)が実行されてエミッター細胞と候補粒子の間の接触が容易になり得る。例えば、生体電気的装置において、電気泳動、等電点電気泳動、二電気泳動(dielectrophoresis)、磁性タグ化粒子等の使用が本発明のシステムに一体化され得る。例えば、U S.特許番号6,017,696およびNanogen, Incに与えられた他の特許;Goater et al , Parasitology 117 S177-189, 1998、およびU.S.特許番号5,512,439および4,910,148およびDynal ASに与えられた他の特許を参照。
以下の各例において、特に記載の無い限り、以下のことが仮定される。試料は、短期間細胞生涯および機能に適合性のある水溶液であり、(以下の記載は粒子が存在すると仮定しているが)標的粒子を含む可能性がある。水性試料は、環境、臨床、空気から液体、洗ったモップまたは他の試料から入手し得る。空気試料は、流れる気流(driven air stream)(空気サンプラーまたは表面ピックアップ)、電気的捕捉、または定着した浮遊粒子から入手し得る。細胞についての参照は、生涯および機能に適合性がある水性培地中のエミッター細胞が意味されることが理解されよう。接触した粒子および細胞は、1以上の光子の放出を生じると仮定される。単一またはアレイの光子検出器は、試料および細胞を混合するチャンバーの外に存在し、放出された光子の捕捉および検出を容易にするさらなる光学要素(鏡、レンズ、光ガイド等)が、チャンバーの内側か外側のいずれかに存在し得る。チャンバーは部分的または全体的に透明であるか、または放出された光子が検出器に届き得るようにするための別の手段を有すると推定されるかのいずれかである。
試料は、粒子の沈降に十分な時間、チャンバー中で遠心分離され得る。細胞は、粒子を破壊することなくチャンバー内に導入され、簡易に遠心分離され粒子の上に沈降し得る。光子の検出は、回転の間に、より典型的には回転の後に行なわれ得る。
試料は、微小遠心分離チューブ、複数ウェルプレート、フィルターユニット、他の適切な装置に導入され得、ここで、試料との接触表面のいくらかの部分が改変されて、試料中に存在し得る粒子と特異的または非特異的相互作用により結合し、維持し得る。非特異的結合は、静電的/イオン交換相互作用、疎水性相互作用、親水性相互作用等を介して促進され得る。特異的結合は、成分を、基材または粒子と結合する表面(例えば、抗体、レセプター、糖タンパク質、タンパク質ペプチド、炭水化物、オリゴヌクレオチド等)に固定することにより、または粒子表面でレセプターに結合される成分を拘束することにより促進され得る。
表面上での親和性補足と同様ではあるが、粒子は、本明細書に記載される種々の方法により、粒子および/または細胞を移動および/または局在させる可動性基材(ポリマービーズ、細胞、帯電分子、磁性ビーズ、細菌等)に結合する。
エミッター細胞は、浅いフローセル(flow cell)へと導入され得、底表面への結合が可能となり、結合しなかった細胞はさらなる流れにより除去され得る。試料が導入され、大量の細胞培地が置き換えられ、粒子が結合した細胞上に沈降し得る。粒子が細胞に接触した際に光子が放出される。
フローセルと同様であり、エミッター細胞の明確な領域は異なる標的粒子に感受性である。画像検出器による光子検出によって、刺激される細胞の同定、およびそれにより標的粒子が試料中に存在することの同定が可能になる。
これはフローセルと同様である。適切な磁性ビーズを試料と混合し、標的粒子のビーズへの結合を可能にする。これらの修飾された(decorated)ビーズをフローセルに導入し得、強力に局在された磁場(永久磁石または電磁石により)により、粒子は接した細胞の表面上に捕捉される。混合は、磁力を除去し、ビーズを細胞に沈降させ得ること、または磁力を移動させ、細胞が結合する表面にビーズを引き付けさせることのいずれかにより開始され得る。
フローセルと同様であり、細胞が結合する表面、および表面に対して平行である別々の電極を伴う(少なくとも一つの電極が透明であり得る)。試料が導入され得、大量の細胞培地が置き換えられる。電極間に適切なDC電圧がかけられ、粒子は電気泳動により結合した細胞へと移動する。
標的粒子を含む可能性がある空気試料は、硬いかまたは柔軟性であり得るか(例えばテープ)、多孔性かまたは無孔性であり得る透明な表面に衝突し得る。吸着物質または芯は、衝突領域の周辺で結合し得るか、または孔の表面の場合は表面の反対側で結合し得る。細胞は衝突領域に位置し、芯のために余分な培地が吸収されて、細胞有する培地の容量と深さが減少し、細胞が粒子により近づき得る。表面が多孔性で、芯物質を背面に有する場合、衝突した粒子への細胞の沈降は、流れによりさらに粒子に引き付けられる。
標的粒子を含む可能性のある空気試料は、遠心分離に適した(固定され、最初は空である)チャンバーに衝突し得る。細胞は、粒子を乱すことなくチャンバーに導入され得、簡易に遠心分離され、細胞を粒子上に沈降させる。回転中、またはより典型的には回転後にではなく、光子検出が行なわれ得る。
フィルターに適したチャンバーおよびプランジャーからなる、改変された注射筒の無い(syringeless)フィルター装置(WhatmanTM、Mini-UniprepTMまたは同様物)に、チャンバーの底面に結合し得る細胞が充填され得、結合しない細胞は洗浄され得る。試料は、適切な親和性で磁性ビーズと共にチャンバーに導入され得る。適切な磁性挿入内部を有し、フィルターの背面付近で固定された、改変されたプランジャーは、捉えられた空気がフィルターを通して漏れる前にチャンバー内に導入され得る。この集合体は逆さにされ(ビーズをフィルターの表面に沈降させるための時間の後、可能なときに)、チャンバーはプランジャーまで押し下げられる。磁性ビーズおよび粒子は、濾過、沈降、および磁力によりフィルター表面に蓄積され得る。粒子は磁性ビーズに結合し得るか、または磁性ビーズ間に捕捉され得る。集合体を再び逆さにする際に、プランジャー内部の磁石で順次拘束される磁性ビーズにより、粒子は細胞から離される。磁石がビーズおよび粒子を放出することを解除(remove)することで、短い距離を通り細胞上に沈降する。
1以上の層の細胞が、チャンバーの底で、適切なフィルターまたは膜の表面に沈降し得る。試料は、チャンバーの細胞上に導入され得、(例えばプランジャーまたは外部ポンプにより)圧力がかけられ得る。試料が、密接に接触している細胞を通過して流れる場合、粒子は、細胞の狭い範囲に持ち込まれ、接触が可能となる。
1以上の層の細胞が、「セル」チャンバーの底で、適切なフィルターまたは膜の表面に沈降することが可能になり得る。試料は、いくつかのフローチャンネルでフィルターの下の一点でセルチャンバーに連結される分離試料チャンバー中に位置し得る。チャンバーはお互いに並んで配置されるので、遠心分離において試料チャンバーは回転軸の近くに存在し、試料チャンバー中の流体のレベルは、細胞チャンバー中の流体よりも回転軸の近くに存在する。この方法で、遠心分離の回転中に、流体は、回転軸の通常の距離を要するチャンバー間を流れる。このことによりいくらかの試料は、細胞を支持するフィルターの上を通過し、外側へ向かう遠心力による流れに対して維持される細胞を通過する。試料が細胞を通過して流れる場合、粒子は、細胞の狭い範囲に持ち込まれ、接触が可能となる。
試料は、サイズ排除に適した遠心分離チューブフィルターのフィルターバスケットに導入され得る。適切な遠心分離条件下で、試料はフィルターを通過させられ、フィルター表面で、フィルターの排除サイズよりも大きい粒子を蓄積させる。細胞をフィルターバスケットに加え、簡易な遠心分離をかけ、フィルター表面および粒子に細胞を導き得る。
フローセルと同様ではあるが、任意の表面上またはフローセル中に突き出している適切な電極を有する。連結され、外部電源により電気的に稼動する電極を通過する連続的な流れによって、試料は導入され得る。流速、頻度、波形、および振幅の適切な組合せについて、粒子は、陰極の二電気泳動によって、細胞の上の電界強度の最小限の領域に誘導および捕捉され得る。フローおよび(いくつかの電極間にDC電圧を含み、電気泳動力を生じる可能性のある)電極への電気的な稼動の変更後に、粒子は(電気泳動または陽極二電気泳動により)、結合される細胞へと沈降、または移動し得る。
浅い円筒状のチャンバー中で、適切な電極(おそらく透明)が、粒子を回収するための中心平面電極、周辺の電極、および一組の螺旋形電極を含む一つまたは両方の並行面上(中心電極の場合同一平面上、または反対表面上のいずれかで)に作られ得る。試料がチャンバーに導入され得、周辺および中心電極間にDC電位がかけられ、電気泳動により粒子を中心電極へとひきつけ得る。液体の交換により細胞をチャンバーに導入し得る。適切な位相シフトAC電圧を有する螺旋形電極に電圧をかけることで、進行波二電気泳動により細胞は中心へと押し流され、細胞が粒子上に沈降し得る。
電気作動型溶解性金の膜の使用がなされ、遠心分離沈降の際の標的粒子およびエミッター細胞間の分離が維持され得る。粒子が細胞の上方の膜に沈降され得る(図20に示される)か、または別のチャンバーの底に存在する(おそらくは挿入)膜によって細胞がチャンバーの底から離れて維持され得るかのいずれかである。いずれの場合においても、膜が電気的活性化により溶解された後、粒子および細胞が沈降、可能ならば遠心分離により混合され得る。
音波または超音波を使用して、粒子の濃縮がなされ得る。粒子は、サンディング波(sanding wave)パターンで節に蓄積するか、または進行波パターンで移動し得る。細胞も、この方法で移動し得るか、または上で議論される任意のいくつかの手段により送達され得る。
一価の抗原を検出するために、二つの一般的な戦略のうちの一つを使用して表面抗体の架橋を誘導することが必要である。まず、一つは細胞表面上に二つの独立した結合部位を発現し得るので、二つのレセプター分子が単一のリガンドに結合し得る。あるいは、細胞に対するリガンドが多価であるような様式で存在する場合、一つの結合部位が細胞表面上に発現され得る。以下は抗体-抗原認識のモデルを用いた具体的な例である。
標的粒子の架橋は任意の公知手段により達成され得る。例えば、架橋は1以上の中間体薬剤、またはペプチド、抗体、化合物、抗体、ビオチン、ストレプトアビジン等の分子を用いて達成され得、さらに、架橋は共有結合または非共有結合によってなされ得る。また、架橋の方法としては、沈降、または当該分野に公知のリガンド、抗体もしくは化学的官能基を介した固相への結合が挙げられる。
以下は、B細胞混合物をどのように使用して、チャンネル(チューブ等)の数を増やすことなく検出可能抗原数を増加させるかの記載である。複数の分析物を検出するための最も単純な方法は、検出チャンネル当りに一つのエミッター細胞を使用すること、および検出チャンネルの数を増加させることで細胞アッセイの数を増加させることである。このことは少数のアッセイには許容され得るが、大量の分析物が加えられる場合、該方法はより複雑になり、資源が集約的になる。しかしながら、異なるB細胞株が共に混合される場合、わずか5のチャンネルのシステムにおいて同時のネガティブコントロールを有する、31までの試験を行なうことが可能である。
例えば三つのB細胞株A、B、Cを有する場合
およびこれらを二つのチャンネルをこのように、二つの
チャンネル1 A、B チャンネル2 B、Cに混合する
細胞アッセイ数=2n-1(式中nはチャンネルの数である)
であり、各々のチャンネルを混合する必要のある細胞アッセイの数は、2(n-1)で定められる。
A 細胞操作方法
M12g3R細胞を、10%ウシ胎児血清、1mMピルビン酸ナトリウム、2mM L-グルタミン、100μM非必須アミノ酸、50μM 2-メルカプトエタノール、50μg/mlストレプトマイシン、および5OU/ml ペニシリン、250 ng/ml アンフォテリシンB (Life Technologies)を補ったRPMI 1640中で、5%CO2の加湿雰囲気内で37℃で維持した。エレクトロポレーション(270V, 950μF)によりpCMV AEQ IRES NEOで細胞をトランスフェクトし、1 mg/ml G418中で2週間選択した。G418耐性クローンを抗IgMへの応答についてスクリーニングした。表面IgMの架橋時、光子放出の最大増加を有するクローンを特定の病原体に特異的なB細胞株を作製するための次のトランスフェクションに使用した。操作された特異性を有する抗体の表面発現は、軽鎖および重鎖のための発現ベクター、ならびにプロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子をコードするものとのコトランスフェクション(エレクトロポレーションにより)によって達成される。プロマイシン耐性プールおよびクローンを、抗原に対するその応答に基づいて選択した。軽鎖発現ベクターVKExpressは、ヒト伸長因子-lα(EF-lα)プロモーターの制御下のマルチクローニング部位 (MCS)の下流にヒトκ遺伝子の定常領域を含む。重鎖ベクターはpDisplay (Invitrogen)を修飾し、サイトメガロウイルス(CMV)プロモーターおよびリーダー配列を保持するが、血小板由来増殖因子 (PDGF)レセプター膜貫通ドメインをマウスIgMの膜結合定常領域の遺伝子で置き換え、MCSの両側の両方のタグを除去することにより作製した。PCRを用いて適切な制限部位を抗体可変領域に付加し、発現構築物へのクローニング前に、すべてのPCR産物の配列を確認する。組換え抗体を作製するために使用する可変領域を、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーを用いた逆転写(RT)およびPCRを用いて、cDNAまたはハイブリドーマのいずれかからクローン化した。製造業者の推奨に従ってTrizol試薬(Life Technologies)を用いてRNAを抽出し、Retroscriptキット(Ambion)を用いて第1鎖合成を行なった。5'末端で軽鎖または重鎖 [S T Jones および M. M Bendig, Bio/Technology 9, 88 (1991)] のいずれかのリーダー配列および3'末端でマウスκまたはIgG2の定常領域にアニーリングするために設計されたプライマーの組を用いてPCRを行なった。
pCMV AEQ IRES NEOプラスミドおよびFMDVのA12株を認識する組換え抗体用の発現ベクターで安定してトランスフェクトしたM12g3R B細胞株を、以下のようにして発光(luminescence)アッセイのために調製した。細胞を第1日目に解凍した。解凍24時間後細胞の調製は、最大活性および信頼性に必須である。凍結/解凍工程は、100倍もB細胞の応答を増加させる。第2日目、50μM セレンテラジン (Molecular Probes, Eugene, Oreg.)を有するアッセイ培地 [CO2非依存培地、10%FBS、50μg/ml ストレプトマイシン、および50U/mil ペニシリン、250 ng/ml アンフォテリシンB (Life Technologies)]中で、106細胞を室温で2時間インキュベートし、ホイルで覆い、2回洗浄し、5 x105細胞/mlの最終濃度でアッセイ培地に再懸濁した。1 5 ml ミクロ遠心チューブ内で細胞を一晩室温で回転させ、15〜20時間後にアッセイした。アッセイでは、25μlの細胞を抗原(1 4 x 108 pfu/mlのwt A12pRMC35株5μl、7 5 x 107 pfu/mlのA12 バリアントB2PD 3 10μl)と混合し、照度計 (Lumat LB 9507, Perkin Elmer)で応答を測定した。
センサー素子および方法は、細菌ならびにウイルス病原体の迅速な検出に使用され得る。細菌、野兎病菌、野兎病の病因因子に応答するように細胞株を操作した。しかしながら、FMDおよびVEEウイルスと同じプロトコルを用いてアッセイした場合、シグナルは低速で、バックグラウンドとほとんど区別不可能であり、B細胞および抗原間の低い相互作用割合を示す (0秒予備回転/0秒回転)。抗原系擬似物を用いて行なった先の実験は、感度および速度が、抗原およびB細胞の濃度によって増大され得ることを示し(データ示さず)、そのため、照度計を光電子増倍管チューブ(PMT)の上部に配置される遠心機を含むように再構成した。薬剤および細胞が一緒に混合されると、次いで、5秒間の遠心分離によって濃縮され、シグナルが改善され、応答が速くなる(0秒予備回転/5秒回転)。細胞の添加前に、ゆっくり沈殿する野兎病菌を遠心分離した場合に、最適な結果が観察される (60秒予備回転/5秒回転)。この構成は、多数の細胞が短時間枠内で抗原と物理的に接触することを確実にし、それにより、感度および速度の大きな改善が提供される。アッセイプロトコルのさらなる最適化後、本発明者らは、現在、わずか60のコロニー形成単位(cfu)の野兎病菌を、薬剤の予備回転にかかる時間を含み3分未満で検出できるが、ペストを引き起こす細菌である不活性化されたペスト菌に対する応答は見られない。この検出限界は、不活性化された野兎病菌の2つの他の供給源および異なる1つの株を用いて確認した(データ示さず)。さらにまた、センサー素子は、広範囲の感度を示し、7桁以上わたる範囲の濃度を検出する。
ジゴキシゲニン抗体を発現するエミッター細胞の特性付け
ジゴキシゲニンに対する抗体(Daugherty et al (1998) Protein Engineering 11 (9) 825-832)をコードするプラスミドをエミッター細胞内に導入し、ジゴキシゲニンに化学的にコンジュゲートしたタンパク質(BSA)(Dig-BSA) を用いてこれらの細胞をスクリーニングした。12の独立したプールを選択し、12〜24の独立した細胞株を得た。第1実験では、これらの細胞が、DNAによって架橋されたジゴキシゲニン抗原(Dig-DNA)を検出し得るがどうかを試験した。3つの型の市販のDig-DNAをDig抗体発現CANARY細胞との反応性について(図26A〜C)、プラスミドDNAを、20塩基対毎に結合させたジゴキシゲニンとの反応性について (図26A)、DNA分子量マーカーを、200塩基毎に結合させたジゴキシゲニンとの反応性について (図26B)、およびDNA分子量マーカーを、各末端に結合させた1つのジゴキシゲニンとの反応性について(図26C) 試験した。これらの標準品の各々は、種々の程度にエミッター細胞を刺激し、最も感度のよい応答は、Dig標識プラスミドDNAに対するものであった。平均20塩基間隔を空けた抗原が、200塩基間隔を空けた抗原より100倍多く(ジゴキシゲニンあたりベースであって、DNA1マイクログラムあたりベースではない)細胞を刺激するという事実は、200塩基は理想的な応答を刺激するのに間隔が大きすぎることの現れである。カルシウム放出およびエクオリン発光をもたらす細胞内カスケードを刺激するため、隣接抗体は、細胞内の反応を開始させるために互いに充分近くに固定されていなければならない。
このアッセイは、標的DNAへのジゴキシゲニン標識(Dig標識)プローブのハイブリダイゼーションを検出するために設計された。これらの実験のための標的DNA は、ファージミドpBluescript II由来であった。この3100塩基対の長さの環状ファージミドは、二本鎖DNA(dsDNA)またはDNAの2つの単鎖のいずれか (ssDNA)を作製するように誘導され得る。これらの2つのssDNA鎖を(+)鎖または(-)鎖とよぶ。(+)鎖に特異的に結合する10のDig標識オリゴヌクレオチドプローブを設計した。
pBluescriptファージミドDNAに沿った位置の順に、オリゴヌクレオチドに番号をつける。各々について、オリゴヌクレオチドのDNA配列、配列のファージミド上の位置、およびオリゴヌクレオチドの融解温度 (Tm)(結合親和性の近似)を示す。これらのオリゴヌクレオチドのTmの小さい範囲はそれらの各々が同様の結合特性を有することを示す。
ビオチン標識オリゴヌクレオチドを、ストレプトアビジンコーティング磁気および非磁気ビーズの表面に結合させた。 これらの「捕捉」オリゴは、Dig標識オリゴヌクレオチドの位置から充分離れた位置の標的DNAに結合するように設計される。沈降し得る支持体への標的NAの結合は、エミッター細胞の添加前のDNAのより徹底的な洗浄を可能にし、アッセイの感度を改善する。標的NAの沈降のための1つのストラテジーを図33に示す。このスキームでは、ビオチン標識捕捉オリゴヌクレオチドは、ストレプトアビジンコーティングポリスチレンまたは磁気ビーズのいずれかに結合される。ジゴキシゲニン標識オリゴヌクレオチドを標的にハイブリダイズさせ、遠心分離または磁場の適用によって複合体を沈降させる。次いで、エミッター細胞を再懸濁し、ビーズで沈降させ、反応チューブを照度計内に配置する。標的DNAの検出に対する沈降の効果を図34に示す。この場合、LODは、DNAを沈降させない典型的な結果と比べて、高いアトモル範囲まで改善される。市販のブロッキング試薬(Roche Applied Science Cat # 1 096 176)の添加は、さらにシグナルを改善する。図35は、ハイブリダイゼーション/捕捉工程中での異なる濃度のブロッキング剤の添加の結果を示す。この実験では、1%〜10%のブロッキング試薬の添加により、試験した標的のすべての濃度で、バックグラウンドに対するシグナルの比が改善された。
Fcレセプターは、抗体または免疫複合体に結合する一群の膜発現タンパク質である。これらは、単球およびマクロファージを含むいくつかの造血細胞上に発現される。FcγI型レセプター (FcγRI) を含む、Fcレセプターのいくつかのサブクラスが存在し、可溶性抗体 FcγRIの高親和性結合体は、免疫グロブリンG (IgG)の定常領域 (Fc部分)に結合し、抗体の抗原結合領域を空いたままにする。特異的抗原による抗体結合レセプターの架橋は、カルシウム放出を刺激するシグナル伝達経路を開始させる。
多数の試料を測定する時間を縮小する(が、ハードウェア要件は最小限に維持される)新しいアプローチは、うまく試験された。単一の集光チャネルを用いて16個の試料の同時測定を可能にする実験的センサーを設計した。センサーは、その周囲に均等に分布され、垂直軸周囲の可変速度モーターによって駆動される16個の1 5-mlチューブを水平を保持するローターからなる(図39)。単一の固定光子検出器(この場合、PMT)を回転中のチューブの経路を少し越えた(just beyond)ローターの平面に配置する。このようにして、チューブの各々を順次および反復的にPMTに接近させ、各通過時のその光出力のサンプリングを可能にする。最後に、光源(赤外LED)および検出器(光トランジスタ)からなる光学的スイッチを用いて検出された光子のカウントおよび各々特定の試料と関連する16個の領域内へのデータの再編成を制御する。
1 個々の1 5-mlチューブ内での16個の試料 (および/または対照)の調製、
2 各チューブ内へのエミッター細胞のアリコートの導入;
3 暗色ボックス内に配置したローター内へのチューブの設置、
4 高RCF(約2000 g)で短時間(5秒間)遠心回転を用いたチューブ底部へのエミッター細胞の局在化、
5 各チューブが1秒ごとに1回サンプリングされる測定期間中 (1〜2分間)での60 rpmへのローター速度の減速、、および
6 評価のためのコンピュータアルゴリズムへの表示および/または入力のための各試料についての時系列の光子数の作成
からなる。
可溶性タンパク質の検出は、種々の方法を用いて達成され得る。例えば、1つの方法では、同じエミッター細胞で2種類の抗体を発現させ得、ここで、2種類の抗体は、各々、同じ分子の異なるエピトープに対するものである。次いで、単量体抗原によって抗体を架橋する (図48)。分泌経路における抗体の分類が図48の概略図において理想化されていることが指摘されるべきである。一例では、抗体はヘテロ機能性であり得る、すなわち、1つの抗体が2つの異なる機能性抗原結合部位を有し得る。別の例において、各抗体は1つだけの機能性抗原結合部位を有する。この方法は、2つの因子(1) 多数の機能性抗体が同じエミッター細胞によって発現されること、および (2) 2種類の関連するエピトープがエミッター細胞を刺激するのに充分である(ある細胞を刺激するために、これらの対の1つより多くが必要とされ得るが)ことに依存する。
化学物質検出は、軍事状況および臨床状況の両方において重要である。いくつかの化学物質は、抗体が独立して結合し得る2つのエピトープを有し得ることがあり得る。かかる場合において、化学物質検出の方法は、上記に概略を述べた毒素検出のものと同一であり得る。しかしながら、多くの場合、目的の化学物質に2つの独立したエピトープはない。かかる場合では、エミッター細胞を刺激できるように化学物質を修飾することが必要である。これらの修飾の4つを以下に概説する。
Claims (26)
- a) 試料を少なくとも1つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと、核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件下で合わせる工程、
b) エミッター細胞を添加する工程、ここで、前記エミッター細胞は、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する1つ以上のレセプター、および細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子を含み、抗原への1つ以上のレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらす、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の核酸配列を検出する工程
を含む、試料中の核酸配列を検出する方法。 - a) 試料を、複数の抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと、核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件下で合わせる工程、
b) エミッター細胞を添加する工程、ここで、前記エミッター細胞は、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する1つ以上のレセプター、および細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子を含み、抗原への1つ以上のレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらす、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の核酸配列を検出する工程
を含む、試料中の核酸配列を検出する方法。 - 試料中の核酸配列を検出する方法であって、
a) i) 試料、
ii) 該核酸配列に相補的な少なくとも1つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチド、および
iii) 該核酸配列に相補的な少なくとも1つのオリゴヌクレオチドが結合されている固相基材
を、該核酸配列へのハイブリダイズのために抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと、固相基材に結合されたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに適した条件下で合わせ、それにより少なくとも1つのハイブリダイズされた抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを有する該核酸配列を含む固相基材を作製する工程、
b) 少なくとも1つのハイブリダイズされた抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドを有する核酸配列を含む固相基材に、抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する1つ以上のレセプターを含むエミッター細胞を添加する工程、ここで、抗原への1つ以上のレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の核酸配列を検出する工程
を含む、試料中の核酸配列を検出する方法。 - a) 試料を少なくとも1つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドと、
核酸配列への抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより抗原コンジュゲートハイブリダイゼーション複合体が生成されるのに適した条件下で合わせる工程、
b) 抗原コンジュゲートハイブリダイゼーション複合体の抗原に特異的な抗体の1つ以上を添加する工程、
c) Fcレセプターを含むエミッター細胞を添加する工程、ここで、該1つ以上の抗体へのFcレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、および
d) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の標的粒子を検出する工程
を含む、試料中の核酸配列を検出する方法。 - a) 試料を、
i) 標的粒子に特異的な抗体、および
ii) Fcレセプターを含むエミッター細胞、ここで、該抗体へのFcレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
と合わせる工程
ならびに
b) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の標的粒子を検出する工程
を含む、試料中の標的粒子を検出する方法。 - a) 試料を、
i)可溶性抗原上の2つの異なるエピトープに結合する1つ以上の抗体、および
ii) Fcレセプターを含むエミッター細胞、ここで、該1つ以上の抗体へのFcレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
と合わせる工程、ならびに
b) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の標的粒子を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。 - a) 複数の試料を保持するための複数の位置を含むローター;
b) i) 標的粒子について試験される試料、および
ii) 標的粒子のレセプターを含む細胞、ここで、標的粒子へのレセプターの結合が、細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
の混合物を含む1つ以上の試料、ならびに
c) ローターの回転時に1つ以上の試料から放出される光子を検出する位置に配置された光子検出器
を備える光子検出器を用いて複数の試料中の標的粒子を検出するための光電子センサー装置。 - ローターが16個の試料を保持するための16個の位置を備える、請求項7記載の光電子センサー装置。
- a) 複数の試料を保持するための複数の位置を含むローター、
b) i) 標的粒子について試験される試料、
ii) 標的粒子に特異的な抗体、および
ii)エミッター細胞、ここで、前記エミッター細胞はFcレセプターを含み、該抗体へのFcレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
の混合物を含む1つ以上の試料、ならびに
c) ローターの回転時に1つ以上の試料から放出される光子を検出する位置に配置された光子検出器
を備える光子検出器を用いて、1つ以上の試料中の標的粒子を検出するための光電子センサー装置。 - ローターが、16個の試料を保持するための16個の位置を備える、請求項9記載の光電子センサー装置。
- a) 複数の試料を保持するための複数の位置を含むローター;
b) i) 該核酸配列について試験される試料、
ii) 該核酸配列にハイブリダイズされる少なくとも1つの抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチド、および
iii) 該核酸配列にハイブリダイズされる抗原コンジュゲートオリゴヌクレオチドの抗原に結合する1つ以上のレセプターを含むエミッター細胞、ここで、抗原への1つ以上のレセプターの結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、
の混合物を含む1つ以上の試料、ならびに
c) ローターの回転時に1つ以上の試料から放出される光子を検出する位置に配置された光子検出器
を備える光子検出器を用いて1つ以上の試料中の核酸配列を検出するための光電子センサー装置。 - ローターが、16個の試料を保持するための16個の位置を備える、請求項11記載の光電子センサー装置。
- a) 試料を、可溶性抗原上の2つの異なるエピトープに結合する1つ以上の抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程、ここで、
可溶性抗原への1つ以上の抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらにを含む、ならびに
b) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。 - 可溶性抗原がタンパク質である、請求項13記載の方法。
- 可溶性抗原が化学物質である、請求項13記載の方法。
- a) 可溶性抗原を架橋し、それにより、架橋された抗原を作製する工程;
b) 架橋された抗原を、架橋された抗原に結合する抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程、ここで、
架橋された抗原への抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。 - a) 可溶性抗原を固相基材に架橋させ、それにより、固相基材に結合された架橋された可溶性抗原を作製する工程、
b) 固相基材に結合された架橋された可溶性抗原にエミッター細胞を添加する工程、ここで、前記エミッター細胞は、可溶性抗原上のエピトープに結合する抗体を含み、固相支持体に結合された架橋された可溶性抗原への抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。 - 可溶性抗原がタンパク質である、請求項17記載の方法。
- 可溶性抗原が化学物質である、請求項17記載の方法。
- a) 試料を、可溶性抗原上の第1のエピトープに結合する第1の抗体を含む固相基材と合わせ、固相基材に結合された架橋された可溶性抗原を作製する工程、
b) 固相基材に結合された架橋された可溶性抗原にエミッター細胞を添加する工程、ここで、前記エミッター細胞は、可溶性抗原上の第2のエピトープに結合する第2の抗体を含み、固相支持体に結合された架橋された可溶性抗原への第2の抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、ならびに
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の可溶性抗原を検出する方法。 - 可溶性抗原がタンパク質である、請求項20記載の方法。
- 可溶性抗原が化学物質である、請求項20記載の方法。
- a) 化学物質をペプチドと合わせ、それにより、化学物質-ペプチド複合体を作製する工程;
b) 化学物質-ペプチド複合体上の2つの異なるエピトープに結合する1つ以上の抗体を含むエミッター細胞を添加する工程、ここで、化学物質-ペプチド複合体への1つ以上の抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、および
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の化学物質を検出する工程
を含む、試料中の化学物質を検出する方法。 - a) 化学物質をペプチドと合わせ、それにより、化学物質-ペプチド複合体を作製する工程、
b) 化学物質-ペプチド複合体を架橋させ、それにより、架橋された化学物質-ペプチドを含む複合体を作製する工程;
c) 架橋された化学物質-ペプチド複合体を、架橋された化学物質-ペプチド複合体に結合する抗体を含むエミッター細胞と合わせる工程、ここで、架橋された化学物質-ペプチド複合体への抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む;および
d) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の化学物質を検出する方法。 - a) 化学物質を抗原コンジュゲートペプチドと合わせ、それにより、化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を作製する工程、
b) 化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体上の2つの異なるエピトープに結合する1つ以上の抗体を含むエミッター細胞を添加する工程、ここで、化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体への1つ以上の抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、および
c) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の化学物質を検出する工程
を含む、試料中の化学物質を検出する方法。 - a) 化学物質を抗原コンジュゲートペプチドと合わせ、それにより化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を作製する工程、
b) 化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を架橋させ、それにより架橋された化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体を作製する工程、
c) 架橋された化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体に結合する抗体を含むエミッター細胞を添加する工程、ここで、化学物質-抗原コンジュゲートペプチド複合体への抗体の結合が細胞内カルシウムの増加をもたらし、前記エミッター細胞が、細胞内カルシウムの増加に応答して光子を放出するエミッター分子をさらに含む、および
d) エミッター細胞からの光子放出を測定し、それにより試料中の可溶性抗原を検出する工程
を含む、試料中の化学物質を検出する方法。
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