JPH09509494A

JPH09509494A - 粒子の検出および画像化の為の方法と装置

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Publication number: JPH09509494A
Application number: JP7522366A
Authority: JP
Inventors: エッガーズ・ミッチェル・ディー; ホーガン・ミッチェル・イー; エーリック・ダニエル・ジェー; ホリス・マーク・エー; コシキ・バーナード・ビー; レイヒ・ロバート; バーケ・バリィ・イー
Original assignee: Baylor College of Medicine; Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Baylor College of Medicine; Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 1994-02-25
Filing date: 1995-02-09
Publication date: 1997-09-22
Also published as: CA2183978A1; EP0746778A1; WO1995023348A1

Abstract

(57)【要約】検出された粒子の空間分布の大きなフォーマットの高解像度のデジタル画像を形成して、放射源からの粒子放射を超高感度で検出し定量化するための方法および装置について記述する。第１の実施例では、検出装置は、放射源と検出器の間にレンズを必要とせず、比較的大きなフォーマットのデジタル画像を形成するために、ある程度放射源に近接して配置される荷電結合素子のアレーのような、複数のソリッドステート画像化装置からなる。

Description

【発明の詳細な説明】粒子の検出および画像化の為の方法と装置発明の背景本発明は、診療の外、例えば分子の画像化のような科学的な分野に直接用いることが出来る。診療に関しては、従来のＸ線写真技術をコンピュータトモグラフィ（ＣＴ）および磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）のようなディジタルイメージングシステムにより置き換えようとする今までの試みには、極めて高い検出感度が必要とされる為に、或る程度の限界があった。ＣＴおよびＭＲＩディジタル画像化技術の出現によってさえ、診療に於ける画像診断の症例の９０％以上は、従来のＸ線写真術によっても可能であったと推定されている。従って、医療上の放射線学に於いては、感度を高める為の必要性が生まれることになる，何故ならば、内臓の運動によるブレを防止し（通常1/100秒以下），また放射線被曝に伴う危険を抑制する為に、患者に対して許される画像化時間は極めて短時間にならざるを得ないからである。感度の向上はまた、Ｘ線結晶学，電子顕微鏡技術および標識化された分子の画像化のような科学的な分野に於いて見い出すことの出来る多くの利点を提供する。感度の向上により、複雑な分子構造も従来のシンチレーションカウンティングよりも遥かに迅速にＸ線回析画像化により分析されることが可能となる。更に感度の向上することにより、必要な線源の強さは大幅に低下し、これにより電子ビームによりサンプルを損なうことなしに透過電子顕微鏡技術が可能となる。即ち、有機物結晶およびバイオポリマは、電子顕微鏡技術により分析されている間に破壊されることがなく、従って電子顕微鏡の理論上の解像度を実用上利用することが出来る。分子の画像化では、試片中の一つ又は以上の分子の構造を迅速に検出し、そして定量化することがしばしば必要となる。分子構造は通常、細胞，抗体および抗抗体のような配位子を含む。配位子は、特定の受容器により受け入れられる分子である。配位子には、下記に限定されることはないが、細胞膜受容体に対する作用物質および拮抗物質，毒素，毒物，少糖類，蛋白質，バクテリアおよびモノクロナール抗体が含まれることが可能である。例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ塩基配列分析は、発生学上および疫病上の診断，毒物学的テスト，発生学的研究，農業および製薬上の開発に極めて有用である。同様に細胞および抗体検出は、疾病の診断上重要である。Ａ．ゲル電気泳動このような多くの分子構造の分析は、しばしばゲル電気泳動によって行われる；これにより蛋白および核酸のような生物分子は、１）電荷極性を本質的に備えているサンプルを適切なゲルに配列し，２）ゲル中に間隔を隔てた電極対間に電気ポテンシャルを印加し、および３）サンプルの電荷を持つ分子成分を印加された電界の影響下で、ゲルを通って移動させることにより分離される。分離は分子成分の示す移行速度の差異により簡単に行われる。分離されるとサンプル内の分子成分は、標識化された分子成分から発せられる電荷を持つ粒子を検出して定量化することにより、識別されることが出来る。Ｂ．オートラジオグラフィこのような分子サンプルの空間粒子放射分布を検出し、そして定量化する為の幾つかの画像化手順が開発された。最も古くから用いられている画像技術は、オートラジオグラフィであり、これによると、構成分子は³²Ｐおよび³⁵Ｓのような放射性同位元素のタグにより標識化され、次に写真フィルムを感光させる。オートラジオグラフィは、比較的大きいフォーマット領域に中程度の解像度を持つ画像を作り出すことが出来るが、これには幾つかの短所が伴う。β粒子に対して写真フィルムの感度が比較的低い為に、露出に必要な時間は何時間から何日単位に及ぶ。露出時間は、増感スクリーンを用いることにより加速されるが、然しこれにより空間解像度は大幅に低下する。オートラジオグラフィに対する典型的な空間解像度は、１から１０ミリメートルのオーダである。更に得られた写真画像は、オートメーションの為にディジタルスキャナで読み取られねばならない。Ｃ．ガス相イオン化β粒子検出ガス相イオン化β検出は、下記の特許により開示された放射性標識化された分子の画像化の為の別の手順である；［１］Bolon，放射性核種を発射する電荷を持つ粒子の表面分布を測定する為のプロセス、および装置，米国特許番号：4,670,656, 1987年６月２日，（本文中には参照により挿入されている）。この技法では、β粒子は２つの異なった相に於いて検出され、そしてβ線の放射源は、検出板からβ線源までの逆伝播により算出される。β粒子は、表面の水平面からあらゆる角度で放射されるから、逆伝播はブレ効果を生じ、これが解像度を制限し、そして検出器とサンプルとの間の距離に対する依存性を生み出す。この場合には、空間解像度は０．１から１ミリメートルのオーダ（フィルムより１０倍良好）であり、また定量化されたディジタル画像を提供する。感度はフィルムより約１０から１００倍高く、またフィルムより少なくとも１０倍の速さで定量的ディジタル画像が得られる（何分から何時間のオーダ）。Ｄ．ストレージ蛍光スクリーンテクノロジー放射性標識を持つ分子の定量的な検出および画像化の別の方法は、ストレージ蛍光スクリーンテクノロジー又は蛍光イメージャーである。この場合には燐のスクリーンは、放射性標識を施されたサンプルに対して露出される時に、準安定状態下でセットされる。露出後にスクリーンは、燐をレーザにより励起し、そして電子が基本状態に戻る時に放射される光子を画像化することにより読み取られる。強力な³²Ｐおよび弱い（¹⁴Ｃおよび³⁵Ｓ）β粒子の両者が画像化されることが出来る。空間解像度および感度は、ガス相β検出器と同等であり多くの利点をもたらす。先ず同位元素の走査の数を制限する変数は、イメージャープレートの数である。つまり多くのサンプルを、多数のイメージングプレート上に置くことが出来る。β粒子放射に対するストレージ蛍光マトリックスの露出に必要な時間（何十分から何時間のオーダ）に比較して、読み取りプロセスは極めて短い（約５分）である為に装置は効率的に利用できる。第２に、低エネルギーのβ粒子の定量化は、蛍光イメージャーにとって有利である。トリチウム（³Ｈ）は、蛍光イメージャーに画像化されることが出来るが、然しこの場合には、イメージングプレートは再利用することが出来ない。従って、³Ｈを蛍光イメージャーで検出することは極めて高くつく。別の短所は、光学的な自己減衰であり、そしてこの現象はスクリーンの厚みの関数である。Ｅ．蛍光検出システム放射性標識を用いた上記の検出および画像化法の短所を改善する為に、幾つかの蛍光検出システムが開発された。この場合には、放射帯域の識別の可能な蛍光染料により、分子成分は標識化される。例えば、ＤＮＡの配列を定めるには４つのディデオキシシーケンシング反応の各々を標識化する為に、４つの蛍光物質が用いられる。ゲル電気泳動法に従ってサンプルはレーザにより照射され、そして画像は光増殖管（ＰＭＴ）により得られた信号から作り出される。識別の可能な構成分子に対応する波長の選択性は、ＰＭＴの正面に在る帯域相フィルタの位置決めにより得られる。１回に幾つかのサンプルを多重化することにより更に自動化することも可能であり、またApplied Bio-systems，Inc．ＤＮＡ塩基配列の特徴であるベースの呼び出しを、コンピュータアルゴリズムにより自動化することも可能である。最近には、下記に挙げた特許（本文中には参照により挿入されている）に記載されたように、ゲル電気泳動に組み合わされた荷電結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いた幾つかの蛍光検出および画像化技術が開示された：［２］Mackay，荷電結合素子を用いた電気泳動によるサンプルの分析，米国特許番号：4,874,492，1989年10月17日［３］Yamamotoおよびその他，発生学的物質の為の電気泳動パターン分析，米国特許番号：5,061,067，1991年10月29日［４］Pentoney，Jr．およびその他，毛細管中の放射性同位元素による標識化された成分の検出，米国特許番号：5,143,850，1992年９月１日何れの場合に於いても、冷却されたＣＣＤカメラが、ゲル中の蛍光的にタグを施された構成分子を画像化する為に用いられる。ＣＣＤを用いる検出および定量的画像化アプローチの持つ利点は次の通りである：１）突然変異を誘発する放射性標識の回避，２）高い感度（ＰＭＴに比較して），３）短い露出時間（秒単位），４）広いダイナミックレンジにわたりレスポンスは線型的である（５桁の大きさ），５）ノイズの少ないこと，６）高い量子効率，および７）データが迅速に得られる（メガピクセル／秒）。下記のものを含む（本文には参照により挿入されている）電気泳動の用途に対するＣＣＤカメラの用法を記載する幾つかの文献が発表された：［５］P．Jackson，V.E.Urwin，C.D.Mackey，Flurophore 2-Methoxy-2，4-Diphe nyl-3（2H）Furanoneを用い、First Dimensional Isoelectric Focusing Gelsに於いて蛋白質の標識により作り出されるFluorescent Two-Dimensional Polyacry lamide Gelsの冷却された荷電結合素子を用いた迅速画像化，Electrophoresis 9 (7)，330-339，1988。［６］K.C．Chan，L.B.Koutny,およびE.S．Yeung,荷電結合素子画像化システムを用いたＵＶ吸収によるゲル電気泳動でのＤＮＡのオンライン検出，Anal．Chem.，63，746-750，1991。この場合にはゲルは、ＵＶレーザにより照射され、そしてＤＮＡ成分の吸収はオンライン検出および画像化を可能にするＣＣＤカメラによりディジタル的に記録される，［７］D.A．McGregorおよびE.S.Yeung，リアルタイムモニタリングによるパルス化された場に於けるゲル電気泳動の相互作用的制御，Anal．Chem.，64，1-6，19 92。この場合には、パルス化された場でのゲル電気泳動に対してＣＣＤカメラが用いられ、そしてこの場合に電界は相互作用的に交番することにより、ＤＮＡ断片はゲルの中で従来の電気泳動に比較して約１０倍速くスネーク運動を行う，［８］Y.F.Cheng，R.D.Piccard，およびT.Vo-Dinh，Appl．Spectrose 44:755-76 5，1990。［９］J.V.Sweedler，J.B.Shear，H.A.Fishman，R.N.ZareおよびR.H.Scheller，時間遅延積分を伴う荷電結合素子を用いた毛細管領域電気泳動に於ける蛍光検出，Anal Chem.，63，496-502，1991。［10］A.J.Kostichka，M.L.Marchabanks，R.L.Brumley，Jr.，H.Drossmanおよび L.M．Smith，極薄スラブゲルに於ける高速自動ＤＮＡ塩基配列決定，Biotechnol ogy，10:78-81，1992。［11］A.E.Karger，J.M.HarrisおよびR.F.Gesteland，毛細管電気泳動を用いたＤＮＡ塩基配列決定に対する多重波長蛍光検出，Nuc．Acids Res.，19:4955-496 2，1991。この中では、ＣＣＤカメラの存在が毛細管ゲル電気泳動の用途に記載されており、またこの場合に極めて細い融合したシリコン毛細管が変性されたポリアクリルアミドゲルを充填されており、そしてこれが小径の毛細管の持つ効率的な伝熱性の故に、充分大きい電界をもたらすことが出来る。従ってゲル内の分子の速い分子運動（移動は２６倍速い），複数波長の蛍光物質およびオンライン平行ＣＣＤカメラ画像化の組み合わせ効果の故に、能力は大きさの桁数だけ向上する。またフィルタホイールのように作動する部品が必要とされない，何故ならばＣＣＤカメラ画像化の為の識別し得る放射帯域を作り出すのにウエッジプリズムアセンブリが用いられるからである。或は上記に代わり、多重波長放射は、バンドパスフィルタを用いることなく状態番号を計算することにより判別することが可能である。以上を総合した場合には、これらのＣＣＤカメラをベースとした分子サンプルからの粒子放射の検出および定量的画像化の為のアプローチは、オートラジオグラフィ，ガス相イオン化β検出，蛍光画像化およびＰＭＴ蛍光検出の持つ制約の多くを回避することが出来る。然しサンプル（放射源）から検出器までの長い焦点距離（約75cm）を持つＣＣＤ技術に特有の低いコレクション効率，ＣＣＤ暗電流を抑制するのに必要な低温技術および長い焦点距離の為に必要な光学レンズのコストを含む制約が尚存在する。Ｆ．ＣＣＤのレンズをベースとする文書画像化文書を画像化する為に、光学レンズを利用したＣＣＤテクノロジーは、下記の特許（この中に参照されることにより挿入されている）に開示されているように、記載され、そして従来の文書スキャナ，複写器およびファクシミリ器に用いられている：［12］Suzuki，画像読取装置，米国特許番号：4,772,958，1988年９月20日。［13］Suzuki，画像読取器，米国特許番号：4,675,745，1987年６月23日。［14］Hirota，多数のラインイメージセンサチップを持つ画像読取装置，米国特許番号：5,003,380，1991年３月26日。［15］III Hornbakerおよびその他，マルチプルＣＣＤアレーを用いる走査装置およびその方法，米国特許番号：5,144,448，1992年９月１日。［16］Suzukiおよびその他，多数のＣＣＤｓを用いた画像読取装置，米国特許番号：4,849,820，1989年７月18日。［17］Suzukiおよびその他，多数のＣＣＤｓを用いた画像読取装置，米国特許番号：4,774,592，1988年９月27日。これらのレンズを用いるＣＣＤアプローチは、しばしば大きいフォーマットの画像化センサを用いるが、これらは放射性同位元素，化学発光または蛍光により標識化された分子サンプルから放射された電荷を持つ粒子の画像化には使用することが出来ない。発明の概要本発明は、比較的大きなフォーマットのサンプルからの粒子放射の空間分布の高解像度ディジタル画像を最低の必要時間とコストを以って作り出す超高感度検出，定量画像化および分光分析の方法および装置を提供する。装置は、ＣＣＤｓアレー，電荷注入装置（ＣＩＤｓ），フォトダイオードアレー，アモルファスシリコンセンサ等の多数のソリッドステート画像化装置を用いたレンズを使用しない画像化アレーを以って構成される。アレーはサンプルに近接して設置され、そしてそのサイズは画像化される可きサンプルの面積と同等である。この方法によれば、サンプルの放射または吸収の空間分布の比較的大きいフォーマットのディジタル画像が、サンプルと画像化アレーとの間に一つ又は以上のレンズを使用することを必要とされずに作り出すことが出来る。装置は、１）高い感度（写真フィルムよりも１０³から１０⁴倍，ガス相イオン化検出および蛍光イメージャーよりも１０から１００倍高い），２）大きい処理量（ガス相イオン化検出器および蛍光イメージャーの何分から何時間のオーダ，写真フィルムの何時間から何日のオーダに比して秒単位である），３）広いダイナミックレンジにわたりレスポンスの線型性（４−５桁の大きさ），４）低ノイズ，５）高い量子効率および６）迅速なデータ化を可能にする。更に画像化アレーをサンプルに近付けることにより、コレクション効率は従来のＣＣＤカメラに見られるようにレンズを使用する技法に比較して、少なくとも係数において１０は改善される。即ちサンプル（放射源又は吸収体）は、検出器（画像化アレー）に接触するほど近い位置に在り、レンズおよびミラーのような従来の画像化の光学装置の必要性は解消する。本発明の装置は、放射性同位元素，蛍光，および化学発光により、標識化された分子の検出および定量的な画像化に用いることが出来る，何故ならば、レンズ無しＣＣＤアレー装置は、光子およびＸ線粒子の何れに対しても極めて敏感であるからである。従って単独の画像化器具が、放射性同位元素から蛍光染料に及ぶ多数の分子標識化技術に用いることが出来る。本発明の実施例は、２つの種類に於いて開示される。第１の実施例は、固定台を使用し、多数の画像化装置はサンプルとサイズがほぼ同等の比較的大きいフォーマット面積に配置される。本発明の第２の実施例は、移動台を使用し、この場合には画像化装置のアレー又はサンプルの何れかを相対的に動かすことにより、比較的フォーマットの大きいサンプルを画像化することが、画像化装置一式が比較的小さくても可能となる。本発明の移動の実施例は、一般に比較的大きなフォーマットのサンプルから／による粒子の放射又は吸収の空間的および／又は時間的分布の超高感度的な検出，高解像度定量的ディジタル画像化および分光分析の為の方法と装置に関するものである。本発明の装置に含まれるものは次の通りである：ａ）光学レンズを用いることなく検出された空間分布の、比較的大型の画像を作り出す為の大面積検出器アレー；ｂ）効率的な画像化の為に、センサアレー又はサンプルの何れかを動かす為のスキャナ；そしてｃ）サンプルを励起し又はサンプルによる吸収を誘発する為のエネルギー源。検出器アレーサイズのサンプル画像に対する最適比は、固定フォーマットに対しては１であり、また移動フォーマットに対しては１以下である。図面の簡単な説明図１Ａは、本発明の固定の実施例の一部の模式断面図である。図１Ｂは、４行のＣＣＤチップを示す固定の実施例の平面図である。図１Ｃは、４行および５列のＣＣＤチップを持つ固定の実施例の平面図である。図２Ａは、公知のレンズを用いた検出装置システムの形態を示す模式図である。図２Ｂは、本発明のレンズなしの検出器システムの形態を示す模式図である。図３は、本発明の移動の実施例の模式図である。図４は、本発明の代案実施例の模式図である。図５は、本発明の装置に使用される従来のワイヤボンド技術の断面図である。図６は、本発明の検出装置システムのワイヤボンディングを可能にする為の、図５の改造を示す断面図である。図７は、本発明の低断面形状ワイヤボンドの断面図である。図８は、図７のボンディングシステムを用いた検出器／サンプルの断面図である。図９は、移動台での低断面形状ボンドと、隔離画像化を行う検出器／サンプルの断面図である。図１０は、背面照射アプローチの為の検出器／サンプルの断面図である。発明の詳細な説明センサシステム本発明のセンサシステム１０の好ましい実施例は、図１Ａ−１Ｃに示されたような大型フォーマットモジュールにアセンブルされた多数のＣＣＤアレーＣＣＤ１... ＣＣＤＮから成る。個々のＣＣＤアレーは、特別の形状で、密に並べられ、そして相互に接合されることにより、図１Ｂおよび１Ｃにそれぞれ示されている線型アレータイプ１０Ｂ、または２次元行列タイプ１０Ｃの比較的大きい（１ cm²以上の）フォーマットの画像化センサを形成する。各ＣＣＤアレーＣＣＤ１....ＣＣＤＮは、シリコンウエハ／基板１２上に各種の酸化物層１４を成長させ、そしてパターンを形成させることにより従来の方法で形成される。次に、ＣＣＤゲート電極１６がゲート絶緑体または電界酸化物１４上にポリシリコンまたは他の透明ゲート材料を施すことにより形成される。誘電体またはポリマー層１８が、好ましくはシリコンナイトライドまたはガラス， SiO2またはポリアミドのような透光性材料を用いて電極１６上に形成される。標識化された分子の実施例では、アルミニウムまたはタングステン金属格子，または誘電体多層干渉フィルタ、または吸収フィルタを用いることの出来る点線１７に示されているフィルタが、表面と金属電極１６との間の誘電体層１８の中に形成されるのが好ましい。フィルタは励起放射を阻止し、そしてサンプル２０からの２次放射を通すように設計されている。固定台の実施例に於いては、センサモジュールはサンプルに関して固定されたままである。従って、比較的大きい画像化フォーマットを作成する為に、図１Ｂおよび１Ｃに示されているように、一つのモジュールに多数の画像化装置ＣＣＤ１... ＣＣＤＮが配列されねばならない。モジュールは、特定の用途毎に応じて、複数のモジュールの取り付けを容易にする為に、パッケージ化されている。下記の文献には、各種のタイル張り（tiling）の方策がすでに報告されており、装置の間に生じる不連続性を最小にする為に用いることができる：［18］Burkeおよびその他，“An Abuttable CCD Imager for Visible and X-Ray Focal Plane Arrays,”IEEE Trans，on Electron Devices，38(5):1069（1991 年５月）図１Ａに示されているように、サンプル２０はＣＣＤアレーセンサ１０の近くに設置されている。例えば、サンプルは臨床放射線が適用される際の患者の胸、または分析の為の標識化された構成分子を持つゲルの場合が考えられる。サンプルは、外部エネルギー源により励起されるか、またはエネルギー粒子を放射する放射性同位元素により内部に標識化されるか、または蛍光および化学発光物質により標識化された時には、光子がサンプルから放射され得る。逆にそれらの存在を確定する為に、直接吸収を用いることが出来る。この場合には、検出器上に発光放射が存在しない時には、特定の構成分子の存在を意味する。出来ればサンプルは、放射される粒子にとって透明なガラスまたは石英のような（オプションの）薄い隔離プレート２２によりＣＣＤ検出器から物理的に分離されることが出来る。サンプルから生じた又はサンプルにより伝達された“星印”３２により示された電荷を持つ粒子、またはエネルギーの放射ｈυが、ＣＣＤゲート１６に入射（矢印３０）する時に、ＣＣＤ検出および画像化アレーＣＣＤ１... ＣＣＤＮは、シリコン１２に電子孔の対を生じさせる。上記の代わりにＣＣＤｓは、背面照射形の構造を持つことが可能であり、そしてこれにより電荷を持つ粒子はバルクシリコン１２に入射することにより感度を高めることが出来る。遊離された光電子３４は、次に隣接のＣＣＤゲート１６の下に集められ、そしてディスプレイ（図示されず）上にディスプレイモジュール３６により公知の方法で順次読み出される。シリコンをベースとするＣＣＤ’ｓは、何よりも１から10,000Åまでの波長の広い波長域にわたり装置の感度が高い為に、ソリッドステート検出および画像化センサとして好まれる。即ち、シリコンは可視スペクトルから軟Ｘ線までの電磁波照射に対して極めて高い応答性を備えている。特にシリコンに対しては、3000から11000Åまでの波長域で、電子孔対を作り出すのに必要なエネルギーは1.1eVに過ぎない。従って可視光線の場合には、ＣＣＤゲート１６に入射する唯一つの光子は、ゲートの下に唯一つの電子電荷パケットを生じるのに対して、軟Ｘ線に対しては唯一つのβ粒子（通常KeVからMeVの範囲）は、何千から何万の電子を生じさせる。従ってシリコンＣＣＤ装置は、高エネルギーのαまたはβ 放射性同位元素（³²Ｐ，¹²⁵Ｉ）に対するのと同様に、低エネルギーのαまたは β放射性同位元素（³Ｈ，¹⁴Ｃ，³⁵Ｓ）に対して、超高感度の検出および画像化を可能にする。従ってＣＣＤは、可視画像化装置（蛍光および化学発光により標識化された分子サンプルに適用される）、並びに粒子スペクトロメータ（放射性同位元素により標識化されたサンプルおよび外部からＸ線を照射されたサンプルに適用される）の両者である。事実ＣＣＤは、同じ画像に於いて画像化と分光分析を同時に行うことの出来る唯一つのセンサである。高い感度の他にＣＣＤｓは、広いダイナミックレンジを提供する（５桁の大きさ），何故ならば各ピクセルまたはゲート１６の下に集められる電荷パケットは、数個から百万個の電子を形成することが出来るからである。更に検出レスポンスは、広いダイナミックレンジにわたり線型的であり、そしてこの事は分光分析にとって有利である，何故ならば集められた電荷の量は、入射光子エネルギーに正比例するからである。従ってＣＣＤｓには、写真フィルムで良く知られている可逆性ブレークダウンは起きることはない。ＳＮＲの計算比較的大きいフォーマットのサンプルの超高感度検出および画像化に対する好ましいレンズなしＣＣＤの実施例の持つ利点が、下記に於いて幾つかの信号対ノイズ比（ＳＮＲ）の形で紹介される。・Ｘ線励起最初のアプローチは、外部からのＸ線によるサンプル励起、または放射性標識をサンプル構造に取り付けることを必要とする。ここでＣＣＤアレーのピクセル（ゲート）１６は、サンプルから吸収された放射性生成物に比例する電荷を集める。従って電荷粒子は、自動的に電荷をアドレスし、そして読み取ることにより殆ど瞬間的に検出される。Ｘ線励起を利用するレンズなしＣＣＤアプローチに対するＳＮＲは、積分時間が決まれば表されることが出来る。仮にサンプルが³²Ｐにより標識化されるとする。Ｎ_t＝サンプルの標識化密度（１０¹¹標識化分子／cm²）；Ｔ＝³²Ｐの半減期（１８日）；Ａ_p＝ピクセル領域（２７μｍ）²；Ａ_L＝分子成分当たりの有効標識化面積；Ａ＝単独分子成分側の全面積（ガードピクセルを含む）；ｔ＝積分時間(sec)；Ｉｄ＝暗電流（１ｎＡ／cm²）；ｑ＝電子の電荷（1.6×10^-19coul）およびσ_r ²＝読み取りノイズ（１０電子／ピクセル）とする。積分時間ｔ中に、有効面積Ａ_Lに於いて起きる放射性現象（events）の数Ｎ_e（t）は次の式で表される。そして、ｔ＜＜Ｔの場合には高い確率の検出を果たす為には、少なくとも１０回の現象が必要であり、概略の(100μm)²標識面積Ａ_L＝１６Ａ_pに対する正味積分時間は下記の値となる。ピクセル間のクロストークを回避する為のアレーの設計には注意が必要である，何故ならば、β粒子は数ピクセルにわたり集められる光電荷の足跡を残すからである。クロストークを回避する為のガードピクセルを用いて計算されたＳＮＲ（Ａ＝２０²Ａ_p）は次の形となる。但しＳ＝β粒子当たり生じた電子（１回の現象）であり、実験の結果では1.7 Me V β粒子に対してＳは90,000電子であった。ノイズに対する暗電流の影響は、τ<<tの短い積分時間を用いて極めて迅速にＣＣＤにフレームを設定することにより減少し、またクロストークも抑制される。迅速なフレーム設定により、ＣＣＤピクセルは単一現象検出器となる，何故ならば、ピクセルに集められた光電子の数は暗電流または読み取りノイズの何れよりも大きく、そして一つ又は以上の現象の起きる確率はτ秒の時間中では小さい。読み取りノイズは増加するが、単一ピクセル読み取りに付属する電荷対電圧ノイズは、１０電子以下の場合がある。またピクセルは、β粒子現象当たりに集められる電子の数の変動を最小にするように設計されることが出来る。上記の技法は、Ｘ線励起モードには良く適合する，何故ならばβ粒子現象は比較的頻度が低く、そしてノイズフレームとは容易に識別することが出来るからである。その上にクロストークは、この技法により更に抑制される，何故ならば隣のサンプル成分の場所に同時に起きるβ現象の確率は、積分時間の減少と共に低下するからである。低エネルギーβ粒子（³⁵Ｓ）の使用もまたクロストークを抑制する。従って標識化の密度は、単一現象検出を用いる時には単一サンプルでの何千の識別し得る分子成分を容れる為に高めることが出来る。従って³²Ｐにより標識化されたサンプルは、室温下で使用される大型フォーマットＣＣＤ画像化モジュール上の何千の場所にわたり、秒単位の時間で、充分なＳＮＲを以って検出されることが出来る。類似の分析は、画像化モジュールに入射した放射エネルギーレベルを信号電子密度に置き換えることにより、Ｘ線源により外部から励起されたサンプルに対して実施することが出来る。・蛍光励起分析された第２のアプローチは、サンプル成分に付着した蛍光により標識化された受容器の使用を含む。蛍光標識は、共有結合的に又は介在により施すことが出来る。蛍光標識を用いる為の検出手順は、選ばれた標識の光学吸収スペクトルを分析することにより始まる。吸収度の高いスペクトルの領域は、発光源波長を選ぶ為に用いることが出来る。標識の多くに対してＵＶ光源は最大の吸収をもたらすのに対し、放射は赤色スペクトル(例えば630nm)に在る。これらの励起および検出の領域はＳＮＲを増大させる，何故ならば、ＣＣＤ基板のポリシリコンゲートは、ＵＶ光を吸収する性質を持ち、そしてチップ上に加工されたライン格子は630n m領域の近くでの光学フィルタリングを可能にすることが出来るからである。従って蛍光マーカーを用い、最適励起波長およびＣＣＤチップ上に直接施された適切の検出フィルタを選ぶことにより、感度は改善されることが可能である。最後に、ピクセルに蓄えられた電荷は、サンプルの構成分子の蛍光から検出された光子の数に比例する。蛍光モードオペレーションでのレンズなしＣＣＤアプローチに対するＳＮＲは、下記の式で表される。但し、ｐ＝ポンプパワー（レーザまたはバルブ）（光子／cm²秒）；σ＝染料の吸収断面積（２０×１０^-16cm²）； η_d＝検出量子効率（４電子／１０光子，但し、700nm放射の場合）； η_f＝蛍光量子収率（１）； η＝ＣＣＤコレクション効率（50％）；Ｉ_d＝暗電流ノイズ（１ｎＡ／cm² 但し室温に於いて）；ｈ＝Plankの定数（6.6×10^-27erg sec）。このように高い検出確率を保証する為に、ＳＮＲ＝１００を得るには１秒の積分時間中に発光源に要求される出力密度は、次の式で表される：但し α＝σＮ_t η_d η_f η 特に、３０８nmＵＶ光源に対して必要な出力密度は、次の値となる。従って、検出感度を保障する為に必要な励起は、理論上61μＷ／cm²ＵＶ光源を使用することにより果たされる。これはフィルター処理を施された水銀アーク、または比較的廉価なＵＶレーザ線源の一つにより可能となる。・化学発光励起化学発光とは、化学エネルギーの電磁波の放射への変換である。この種の反応に於いては、電子は化学反応により励起され、そして光は励起された電子が基本状態に戻る時に発せられる。他の化学発光の場合と異なり、酵素を触媒とする１，２−ダイオキシエタン誘導体は、何時間から何日の間、光の信号を発することが出来る。発射光の波長は約４７７nmであり、また発光はｐＨをコントロールすることにより制御されることが出来る。放射による被曝の問題がないことに加え、感度は化学発光法の方が放射性の方法に比較して高い。またこの方法は、実施が比較的簡単である（試薬および機器は比較的廉価である）。最後にこの方法には、パックグラウンドノイズレベルが低く、またダイナミックレンジが広い。化学発光法の場合の１秒積分時間中のレンズなしＣＣＤアプローチに対するＳＮＲは、蛍光アプローチの場合と同じ形の式で表され、そしてその値は下記の通りである（読み取りノイズは無視することが出来ると仮定して）但し、Ｐe＝酵素反応の反復率（３０００反応／酵素秒）； σ＝酵素と分子の結合比（１０酵素／分子成分）； η_d＝検出量子効率（１３電子／100光子＠ 477nm放射）； η_c＝化学発光量子収率（５光子／1000反応）； η＝ＣＣＤコレクション効率（５０％）。酵素反応反復率および化学発光量子収率に対する値は、ダイオキシエタン試薬に対する典型的なものである。従って上記の定数を用いる場合、化学発光アプローチは、室温下でのＣＣＤ画像化モジュールの近傍でのサンプル内に於ける何千の構成分子の検出が可能であると考えられる。・レンズなしの効果従来のＣＣＤカメラを用いた画像化アプローチに比して、本発明に見られる検出感度の改善は、検出器（ＣＣＤアレー）を放射源（分子サンプル２０）に結合したことによるものである。従って、従来の光学要素（レンズ，ミラー）の使用を廃止することにより、提案されるシステムのコレクション効率は大幅に改善される。コレクション効率ηは、電磁波の放射を捕捉する為の計器の能力の尺度であり、主として形態の関数である。レンズを用いた計器（エピフロレッセントマイクロスコープ，コンフォーカルマイクロスコープ，ＣＣＤカメラ等）およびレンズなしのＣＣＤ画像化モジュールの形態は、図２Ａと２Ｂにそれぞれ示されている。コレクション効率は、通常立体角の比として表される。但しであり、Ψは、表面に鉛直なベクトルと位置ベクトルとの間の角度である。レンズを用いる場合（Ψ＝０）には、但し、Φ₀＝レンズに入る光の円錐の半角である。従って、レンズを用いるシステムのコレクション効率は下記の式で表される。上記に反し近接レンズなしＣＣＤアプローチの半角は、最大（Φ₀＝９０°）となり、コレクション効率は次の値となる。これらの２つのタイプの間の差異は、開口数が使用されると明白となる。例えば、開口数ＮＡ＝０．３の高性能のレンズが用いられるとする。ＮＡ＝nsinФ₀ である為にが成り立つが、これはレンズなしのＣＣＤアプローチにより得られる５０％に比較して大幅に低いことが判る。更に開口数が、１Ｍバイトメモリチップを作り出す為の＄１００Ｋフォトリソグラフィーレンズに一般的に用いられている０．４に高められても、コレクション効率は４．２％に高まるに過ぎない。従って積分ＣＣＤアプローチは、レンズを使用するシステムに比較して、少なくとも×１０のコレクション上の利点を持ち、また放射線により標識化されたサンプルを画像することをも可能にする。計装の為の台上記の検出および画像化センサを容れる為の２つの実施例の一つが図３に模式的に示されている。図３の実施例は、下記のものから成っている：ａ）多数の小さい画像化装置ＣＣＤ１... ＣＣＤＮを用いているＣＣＤモジュール１１０を以って構成される比較的大きいフォーマットの画像化センサ１００，しかも各装置は多数の感光性ピクセル１０２を持つ；ｂ）画像化を効率的にする為の方法による分子サンプル１０６を基準としたモジュール１１０の相対運動の為のスキャナ装置１０４；ｃ）分子サンプルを励起する為の光源１０８；ｄ）フロック動作およびバイアス動作、およびＣＣＤ１... ＣＣＤＮのピクセル電極の電子ゲート動作を含むセンサアレー１１０を駆動する為のアレードライバー回路１２０；ｅ）センサアレー１１０からのディジタル画像を得る為の受信回路１２２，この中には予備増巾，増巾，アナログ／ディジタル変換，フィルタリング，マルチプレクシング，サンプリングおよび保持機能が含まれる；ｆ）コントラスト増巾およびパラメータの推定の機能を含む画像化データを処理する為のデータプロセッサ；およびｇ）ディジタル画像を表示し、そして格納する為のディスプレイ手段１２６。サンプル如何により各種の励起線源１０８を計器に用いることが出来る。従来の放射線術に使用される外部Ｘ線源が、医療用のＸ線画像化に使用することが出来る。また、サンプルの上または下に取り付けられたランプまたはレーザによりＵＶ励起も可能である。最後に、放射性同位元素および化学発光により標識化されたサンプルに対しては励起線源は不要である。図３の移動台の実施例に於いては、画像化モジュールまたはサンプルは台１３０に機械的に結合されたステップモータのような走査機構を用いて動かすことが出来る。このような走査によれば、この中に示されたような小型のセンサモジュールによって、比較的大きいフォーマットの画像化が可能となる。多数の画像化装置１１０が、コラムのモジュールに配置されることにより不連続点の生じることを回避することが出来る。また、走査を意識的にオーバーラップさせることにより大きなフォーマットのサンプル領域にわたり、連続高解像度画像化が可能となる。補足的な励起法が図４に示されており、この場合にはレーザ２００は、円柱レンズシステム２０２を通して照射されることにより、サンプル２０６上の励起の為の光線２０４がBrewster角で形成される。これにより反射損失は最小に抑えられる。線状に集中した励起の反射２０８が、次に傍のセンサモジュール２１０により図のように画像化される。画像化アレーと分析される可き基板サンプルとの間には、物理的な接触が起きるので、ピクセル電極をドライバー回路および受像回路，例えば図３の１２０，１２２に接続する為に、画像化装置に接触するボンドワイヤを防護すべく対策が講じられなければならない。これらはフレーム格納アレーを持つ装置が使用される時には、画像化アレーの隣接位置から外される；これはBurkeおよびその他の1 991年の参考文献に示されている。画像化アレーと同じサイズか又は小さいサイズの基板の画像化は、標準ワイヤボンディング、およびワイヤボンドの近傍の装置に基板が接触する為の何らかの手段を用いて行うことが出来る。然し、基板のサイズ制約が取り払われ、そして２×Ｎ画像化アレーのサイズより大きいサイズを持つ基板が許される時には、ワイヤボンドの取り付けおよび防護の特殊手段を使用することが必要である。図５は、接点への接合の為に装置の表面の上でループを形成する従来のワイヤボンド６００を示し、そしてこれによりワイヤの装置の縁６０４との接触，従って短絡を回避することが出来る。図６は、大きいサンプル基板７００が、画像化アレーに接触することにより高い解像度を可能にする為に如何に曲げられるのみならず、エポキシによりカプセル化されて装置の表面から通常１５ミル突き出ているボンドワイヤ６００’を避けねばならないかを示す。図７は、ボンドワイヤ６００''が、装置６０２’の表面にほぼ平行に引き出される接合の新しい方法を示す。ボンドワイヤが装置６０２''の縁に短絡するおそれが最小となる為には、先ずエポキシビード７０１が装置の縁に沿って流され、そしてワイヤに接触する前に硬化させられる。また、装置が接合される回路基板上のランド７０２は、装置の縁から或る距離Ｄ（正しい距離）を隔てて位置決めされることにより、ワイヤ６００''は装置の表面にほぼ平坦となり、その上への突き出し量は５ミル以下となり、また応力の伝わることを防止する為のループを備える。図８は、画像化される可き基板７００とエポキシカプセルを施されたワイヤ６０'''を示し、図６に比較して基板７００の湾曲度は遥かに少ない。上記に代わり、図９に示されたように、走査または移動モードのオペレーションに於いて、サンプル８００が装置７０１のセンサアレーよりもかなり大きい場合には、サンプル又はセンサはサンプル全体を画像化するには動かされねばならない。この場合にはセンサ７０１は、相対運動を可能にしながらレンズなしの画像化の近接性の要求を守ることの出来る方法で、サンプル８００から隔離されねばならない。図９は、以前に図７に示された低断面形状ボンディング技術に関連して、透明な隔離プレート２２を利用する方法を示す。距離Ｄ_iは、歪みを最小にしたレンズなし画像化を可能にする為に最小に抑えられている。逆に、図１０に示された背面照射センサアプローチを用いることが出来るが、これは装置パッケージ７０２からセンサ装置７０１への電気接続９００を装置の反対側にサンプル８００’から充分離して施すことを可能にする。従って上記のレンズなし画像化を保障する為の最小の距離Ｄ_bが、サンプルと画像化センサ装置７０１との間に実現される。背面照射センサアプローチはまた、感度を高めることが出来る，何故ならば、量子効率は装置７０１のセンサアレーのポリシリコンゲートを通る光電子の透過を回避することにより大巾に改善されるからである。本発明は、その好ましい実施例を参照して詳述されそして図示されたが、この分野の熟練者によっては、形式および詳細に関して各種の変更が、添付の請求項により限定される本発明の精神と範囲から逸脱することなく、この明細書の開示から可能であることが了解されるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人ヒューストン・アドバンスト・リサーチ・センターアメリカ合衆国，テキサス州 77381，ザウッドランズ，リサーチフォレストドライブ 4800 (72)発明者エッガーズ・ミッチェル・ディーアメリカ合衆国，テキサス州 77381，ザウッドランズ，プラムカバーコート 10 (72)発明者ホーガン・ミッチェル・イーアメリカ合衆国，テキサス州 77381，ザウッドランズ，ゴールデンシャドウサークル 103 (72)発明者エーリック・ダニエル・ジェーアメリカ合衆国，マサチューセッツ州 02173，レキシントン，グラントプレイス 11 (72)発明者ホリス・マーク・エーアメリカ合衆国，マサチューセッツ州 01742，コンコード，レキシントンロード 77 (72)発明者コシキ・バーナード・ビーアメリカ合衆国，マサチューセッツ州 01720，アクトン，フォートポンドロード 39 (72)発明者レイヒ・ロバートアメリカ合衆国，マサチューセッツ州 01863，ノースチェルムスフォード，ウエルマンアベニュー 146 (72)発明者バーケ・バリィ・イーアメリカ合衆国，マサチューセッツ州 02173，レキシントン，シャーバーンロード 17

Claims

【特許請求の範囲】１．サンプルの成る領域に於ける粒子放射を検出し、画像を形成する為の方法であって、ａ）画像化される可きサンプルの領域に対応したサイズの粒子検出器面積を持つ粒子検出器のアレーを形成するステップと、ｂ）上記の検出器の中に於いて、上記のサンプルから直接発せられる粒子放射を光電子に変換するステップと、ｃ）上記の光電子を上記の検出器の中に於いて集めるステップと、ｄ）上記の集められた電子の画像を形成するステップとを備えた方法。２．請求項１に於いて、上記のアレーが上記のサンプルに近接する位置に配置されるような方法。３．請求項２に於いて、サンプルとアレーとの間にはレンズ構造が介入しないような方法。４．請求項１に於いて、アレーは荷電結合素子を以って構成されるような方法。５．請求項１に於いて、粒子検出器のアレーは、フラットパネルを備え、その中にチャージカプルド装置のアレーが構成され、上記のパネルは上記のサンプルに近接した位置に配置されるような方法。６．請求項１に於いて、パネルがサンプルに接触するような方法。７．請求項１に於いて、サンプルは放射性同位元素，蛍光性または化学発光性分子から成るグループに属する物質で標識化されるような方法。８．請求項１に於いて、サンプルがアレーに対して動かされるような方法。９．請求項１に於いて、粒子検出器はＣＣＤ，電荷注入器，アモルファスシリコンセンサおよびフォトダイオードから成るグループに属するものが使用される方法。１０．サンプルの或る領域に於ける粒子放射を検出し、画像を形成する為の方法であって、ａ）サンプルを粒子検出器のアレーに接触させるステップと、ｂ）上記の検出器の中に於いて、上記のサンプルから直接発せられる粒子放射を光電子に変換するステップと、ｃ）上記の光電子を上記の検出器の中に於いて集めるステップと、ｄ）上記の集められた電子の画像を形成するステップとを備えた方法。１１．請求項１０に於いて、上記のアレーがＣＣＤ，ＣＩＤアモルファスシリコンセンサ，およびフォトダイオードから成るグループに属する装置を以って構成されるような方法。１２．請求項１０に於いて、サンプルおよびアレーが相対的に移動するような方法。１３．請求項１０に於いて、サンプルが放射性同位元素，蛍光性または化学発光性分子から成るグループに属する材料を用いて標識化されるような方法。１４．サンプルの或る領域の粒子放射を表す画像を作る為の装置であって、画像化される可きサンプルの領域に近接して配置され、レンズを通ることなく隣接のサンプル部分から直接入射する粒子放射を光電子に変換し、上記の光電子を集める粒子検出器と、上記の集められた光電子から、上記の検出された粒子の画像を形成する為のディスプレイとを備えた装置。１５．請求項１４に於いて、画像が空間画像であるような装置。１６．請求項１４に於いて、画像が時間的な画像であるような装置。１７．請求項１４に於いて、粒子検出器がソリッドステート荷電結合素子であるような装置。１８．請求項１４に於いて、検出器アレー又はサンプルを相対的に動かす為のスキャナを含むような装置。１９．サンプルの或る領域の粒子放射を表す画像を作る為の装置であって、サンプルを励起して放射性粒子を発生させる為の励起線源と、画像化される可きサンプルの領域に対応するサイズの領域内に配置され、隣接のサンプル部分から直接入射する粒子放射を光電子に変化し、上記の光電子を集める粒子検出器と、上記の集められた光電子の画像を形成する為のディスプレイとを備えた装置。２０．請求項１９に於いて、サンプルが検出器に接触しているような装置。２１．請求項１９に於いて、励起線源がＵＶ光源であり、検出器がポリシリコンゲートおよび光学フィルタを持つＣＣＤであるような装置。２２．請求項１９に於いて、粒子検出器はソリッドステート荷電結合素子であるような装置。２３．請求項１９に於いて、検出器アレーまたはサンプルを相対的に動かす為のスキャナを含むような装置。２４．検出された粒子のディジタル表示をして、サンプルから放射された粒子を検出および定量化する為の装置であって、上記のサンプルからの放射を、約１から10,000Åの波長領域にわたり少なくとも５桁の大きさのダイナミックレンジの電気信号に変換する為の検出器のアレーを備え、上記のアレーは、レンズを介入させることなく放射の進路中に於いて、上記のサンプルに近接した位置に配置されているような装置。