JP2008521795A - レプチン拮抗薬 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明はレプチン拮抗薬、特にレプチン変異体及びそれらを含んでいる医薬組成物類に関する。
ob遺伝子の産物であるレプチンはOB−Rとよばれる受容体を通して脳の満腹中枢の活性を制御して食欲を抑制し、体重に影響を及ぼすと言われている(Friedman and Halaas,1998)。しかしながら、更なる研究ではレプチン受容体類は多くの他の組織類で発現されることを示し(Cioffi et al.,1996;Emilsson et al.,1997;Hoggard et al 1997;Glasow et al.,1998;Briscoe et al.,2001)、そしてレプチンは以前予想されたより異なる生物的機能に関与していることを示唆していた。
我々は今回、本発明により位置39〜42の哺乳類レプチン−結合部位の疎水性を低下させることによりレプチン拮抗薬であるレプチン変異体が得られることを見出した。
当該レプチンの三次元構造解析は長鎖サイトカインスーパーファミリーへのその関連性を示した(Zhang et al.,1997)。当該レプチン受容体の三次元構造は決定されたが、そのアミノ酸配列分析は、成長ホルモン(GH)、顆粒コロニー刺激因子(G−CSF)、インターロイキン−6(IL−6)及びエリスロポエチン(EPO)受容体のようなクラスI型サイトカイン受容体ファミリーの受容体に極めて類似することを示した。このファミリーから得た受容体はそれらの細胞外部分にC2、CK及びF3のような複数の同様な領域を共有している。当該G−CSFRのように、レプチン受容体はCK−F3領域の2回繰返しを有し、それはリガンド結合部位であることを示唆した(Wells and de Vos,1996;Livnah et al.,1999;Aritomi et al.,1999)。Fong及び共同研究者はレプチン結合領域(LBD)を当該レプチン受容体細胞外領域(ECD)中の膜隣接CK−F3領域(〜200アミノ酸)と突き止めた(Fong et al.,1999)。しかしながら、最近のデータは、レプチンのその受容体への結合はIL−6のその受容体への相互作用により似ており(Boulanger et al.,2003;Muller−Newen 2003)、先端及び隣接CK−F3間に位置している免疫グロブリン様領域(IGD)が当該レプチン受容体の増殖的二量体化に不可欠なものであることを示している(Zabeau et al.,2004)。
(i)材料。ヒツジ及びヒトのレプチンは我々の研究室で以前記述したように調製した(Gertler et al.,1998、Raver et al.,2002)。組換えニワトリレプチン結合領域(chLBD)をヒトLBDの調製と同様に調製した(Sandowski et al.,2002、Raver et al.,2003)。分子生物実験で使用した制限酵素類はFermentas(Vilnius,Lithuania)及びNew England Biolabs(Beverly,MA)からのものである。高純度DNAプライマーはSigma Co.(Rehovot Israel)から得られた。RPMI−1640培地、インターロイキン−3(IL−3)、ナリジクス酸及び臭化3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−2,5−ジフェニルテトラゾリウム(チアゾリルブルー、MTT)はSigma Chemical Co.(St.Louis,MO)から購入し、牛胎仔血清(FCS)はBiolab Co.(Jerusalem,Islael)から、そしてpTrc 99A発現ベクター、Superdex75 HR 10/30カラム、Q−SepharoseはPharmacia LKB Biotechnology AB(Uppsala,Sweden)から得た。研究級CM5センサーチップ、N−ヒドロキシスクシイミド(NHS)、塩酸N−エチル−N'(3−ジメチルアミノプロピル)−カルボジイミド(EDC)、エタノールアミン−HCl及びHBS−EPランニング緩衝液(10mM Hepes,150mM NaCl、3.4mM EDTA及び0.005%(v/v)の界面活性剤P20をpH7.4にて)はBiacore,AB(Uppsala,Sweden)から購入した。全てのほかの試薬類は分析級のものである。
本発明のレプチン変異体を調製する際に、出発原料として野生型(WT)ヒツジ又はヒトレプチンをコードしたpMon3401発現プラスミドを用いた。当該レプチン挿入断片を製造業者の取扱説明書に従い2つの相補プライマーを用いてStratagene QuickChange 突然変異キット(La Jolla,CA)で改変した(表1)。当該プライマー群は塩基変化(太字で記した)を含み、各突然変異を獲得するが適切なアミノ酸配列を保持し、コロニー選別用に特定のBshTI制限部位(下線部)を改変するように設計されていた。当該手順にはPfuポリメラーゼを用いる12PCR周期が含まれていた。当該鋳型を消化し、合成DNAを含む突然変異を選別するために、当該突然変異した構造はそののちメチル化又は半メチル化DNA(目標配列:5'−Gm6ATC−3')に特異的なDpnI制限酵素で消化した。当該プラスミド類をそののちXL1形質転換受容性細胞群に形質移入した。設計した特異的制限部位を使用して各変異体の5個のコロニーを突然変異用に選別したが、少なくとも効率は80%を示した。各変異体の2つのコロニーを配列決定し、当該突然変異が含まれていることを確認したが、不要なヌクレオチド類の誤取り込みはなかった。XL−1形質転換受容性細胞は突然変異プラスミドで形質転換され、5〜10mLのLB培地中で成長させ、当該プラスミドを単離した。Mon105形質転換受容性細胞群はそののち当該プラスミドで形質転換され、発現に用いられた。
組換え野生型(WT)又はN−末端での追加のメチオニン−アラニンを伴う突然変異ヒトレプチンを、MON105細胞の2.5l培養中でナリジクス酸誘導(50μg/ml)で発現させ、適した発現プラスミドで形質転換させた。形質転換した細菌を最初にTerrific Broth(TB)培地を入れた5×500mlの2.5リットルフラスコ中で200rpmの一定振盪にてA600が0.9になるまで増殖させた。ナリジクス酸の添加後4時間で、当該細胞は10分間の10,000gの遠心分離で回収し、−20℃で凍結させた。2.5lの細菌培養からの細菌ペレットを氷上で解凍し、細胞溶解緩衝液(10mM Tris−HCl、10mM EDTA,pH8)中に再懸濁した。封入体(IBs)をそののち前記(Gertler et al.,1998;Raver etal.,2002)のように調製し、凍結した。そののち、2.5lの細菌培養から得たIBsについて10mMシステインを含む4.5M尿素、40mM Trisの300mlに溶解した。ヒツジレプチン又はその変異体の場合、1.0lの細菌培養から得たIBsを同じやり方で200mlに溶解した。当該溶液のpHはNaOHで11.5に調整した。4℃で2時間攪拌した後、最終濃度が0.5Mになるまで0.67Mアルギニンの3分量を加え、一夜攪拌した。翌日当該溶液を透析管に移し、pH9の10mM Tris−HCl(ヒトレプチン変異体の場合)又はpH8の10mM Tris−HCl(ヒツジレプチン変異体の場合)5×10lに対して60時間透析したが、外部の溶液交換は6〜10時間毎であった。
実施例2のヒトレプチン変異体の再折りたたみ及び透析した画分をpH9の10mMTris−HCl緩衝液で平衡とし、最大流速(400〜500ml/時間)のQ−セファローズアニオン交換カラム(30mlビーズ容積)にて、非連続的NaCl勾配(10mMTris−HCl中でNaCl50、100,150及び400mM)で精製した。画分50mlを集め、タンパク質濃度を吸光度280nmで測定した。
ヒト又はヒツジレプチン又はそれらの変異体とchLBDとの間の結合化学量論の特性を明らかにするために、それぞれのリガンド及びchLBDを異なるモル比で混合し、分析用Superdex 75カラムを用いるゲルろ過で分離し、非変性条件下における結合複合体の分子量を測定した。当該実験はそれぞれのリガンドは5μMの一定濃度、chLBDは2.5、5又は10μMを用いて行った。chLBD:WTレプチン相互作用の結果は図2に示す。当該結果はレプチンの両種がchLBDと1:1のモル比で結合することを示している。この化学量論は当該成分を同じモル比で混合するときに単一ピークが出現し、1つを過剰にすると他のピークが出現することのいずれかにより決定された。ピーク保持時間に基づいた当該複合体の分子量計算は全ての場合で予想値40.5kDaに近い約41kDaであった。殆ど同一の相互作用パターンが全ての8変異体(示されていない)につき観察され、突然変異が当該変異体のchLBDと1:1複合体形成の能力に影響を与えないことを示した。
chLBD又はその変異体とレプチン間の相互作用の表面プラズモン共鳴(SPR)測定
chLBDのヒト又はヒツジレプチン及びそれらの変異体との結合能の特性をさらに明らかにするために、可溶化chLBDのアミン結合法及び結合によりセンサーチップ上に固定化したそれぞれのレプチン(又はレプチン変異体)を用いた表面プラズモン共鳴(SPR)手法を使用した。結果ではχ2分析法を用いての1:1理論モデルとの比較から最も条件を満たした相互作用が得られたことを示している。当該算出したデータ(2回の実験の平均)を表3に示した。最大3倍までの差の速度定数が観測されたが、各Kd値はより小さな変化をし、当該差異は統計的に有意ではなかった。
全ての競合的実験においてヨウ素化ヒトレプチンは当該リガンドとして、個々の野生型(WT)ヒトとヒツジレプチン及びそれらのアラニン変異体は競合体として供された。安定的にヒトレプチン受容体のロングフォームを形質移入されたBAF/3細胞類の新しく調製されたホモジネートは受容体の源として供された。1試験管当たり1.75×106細胞群から得たホモジネートを使いると、6〜7%の特異結合を生じた。当該抑制曲線(2回の実験の平均)を図3に示し、これらの曲線から算出したWTヒトレプチン及びL39A/D40A(SEQ ID NO.1)、F41A/I42A(SEQ ID NO.2)、L39A/D40A/F41A(SEQ ID NO.5)及びL39A/D40A/F41A/I42A(SEQ ID NO.7)変異体についての各IC50値は、5.33、4.16、6.82、5.21及び5.43nMであった。WTヒツジの個々の変異体についての対応するIC50値は、1.47、1.83、3.44、2.20及び1.83nMであった。当該レプチン及びそれら個々の変異体間の僅かな違いは、僅かに低い親和性(統計的に有意の境界線にある)を有したF41A/I42A(SEQ ID NO.2)変異体を除いては有意(P>0.05)ではない。
ヒト及びヒツジのレプチンはBaf/3生物的検定において以前発表された(Raver et al.,2000;Raver et al.,2002)結果と同様に、それらの個々のEC50値22と37pMという殆ど同じ活性を示した。これに対して全ての4種のヒト又はヒツジレプチン変異体はいかなる作動性活性にも欠けていた。拮抗性活性を測定するのに、各々の変異体の存在(1〜125nM)又は非存在下で62.5pMのヒト又はヒツジレプチンでBAF/3細胞群を刺激した。当該実験は2〜7回繰返して平均IC50を計算した(表4)。8種類の変異体全てが拮抗活性を示し、ヒト及びヒツジレプチン変異体の間では有意な差は見られなかった。L39A/D40A/F41A(SEQ ID NO.5)及びL39A/D40A/F41A/I42A(SEQ ID NO.7)変異体はL39A/D40A(SEQ ID NO.1)及びF41A/I42A(SEQ ID NO.2)と比べると、より強力であった。抑制の特異性を確かめるために、Baf/3細胞群の増殖をヒト及びヒツジレプチン変異体の非存在又は存在においてIL−3(55pM)で刺激した。8種類の全ての場合において、当該変異体の濃度125μMでも抑制は認められなかった。幾種類かのレプチン変異体は同じようにSH−SY5Yヒト神経芽腫細胞生物検定法及びレプチン受容体を一時的に形質移入したCHO細胞におけるルシフェラーゼレポーティング遺伝子のトランス活性化により試験を行った。図4Aで示したようにヒトL39A/D40A/F41A/I42A(SEQ ID No.7)レプチン拮抗薬での前処理は、次なるMAPKのレプチン誘導活性化を完全に阻止し、ヒトL39A/D40A/F41A/I42A(SEQ ID No.7)レプチン変異体はルシフェラーゼのレプチン誘導活性化を徐々に低減させた(図4B)。50パーセント抑制は作動薬に対して約10倍の拮抗薬過剰で達成された。
インビボにおけるいずれか個々のタンパク質の生物効果を引き出す能力はその受容体に対する親和性だけでなく、それが血液から排除される速度を含む多くの因子に依存する。例えば心房性ナトリウム利尿ペプチドのような幾つかのホルモンはプロテアーゼ介在の事象で非常に速く(t0.5=0.5分)排除されるが、レプチン(未発表の観察)、成長ホルモン(GH),プロラクチン及びPLsのような15〜25kDaの分子量を有する他のものは主に腎臓を経由して(Johnson et al.1979;Haffner et al 1994)よりゆっくり排除される(t0.5=8〜30分)。腎臓介在の排除は主に分子量に依存し、70〜80kDaより大きなタンパク質類は相当低い速度で排除されるので、当該効果についてはその大きさを増してホルモンの生体半減期の延長を目指すべきである。これはペグ化でその活性に影響しないで当該ホルモンの大きさを増大させて達成できる。幾つかのポリエチレングリコール(PEG)分子の付着は当該タンパク質の流体力学的容積を増し、それによりその排除を遅らせる(Abuchowski et al.;1977)。ペグ化したヒト成長ホルモン(hGH)について最も驚いた結果の1つは、500分の1まで親和性及びインビトロ活性の低下にもかかわらず、当該ペグ化hGHのインビボでの有効性が主に血液での半減期が最大25倍増加することで顕著に増加したことである。そこで、向上した血液での半減期が受容体結合親和性の損失を補うことができると結論された(Clark et al.,1996)。
ヒトレプチン変異体−29アミノ酸結合剤及びSP1植物タンパク質からなるキメラタンパク質を調製した(Dgany et al.,2004)。当該コンストラクトをpET29aベクターにサブクローンし、IPTGによる誘導で封入体(IBs)として不溶タンパク質を発現させる。当該主なるタンパク質バンドは理論値31402Daに近い約32kDaを有していた。当該キメラタンパク質を溶解させ、再折りたたみさせ、そして精製して均一性とした。Superdex75及びSepharose6Bにおけるゲルろ過実験では分子量は少なくとも100kDa及びそれ以上らしいことを示唆した。キメラタンパク質のchLBDに結合する可能性を評価するために、当該2種類のタンパク質を異なるモル比で前温置(LBDの濃度は一定)し、そののちSuperdexカラムで分離した。chLBDピークの消失は複合体形成の目印として役立った。当該結果は3:1の比でのchLBDの全消失及び2:1比での殆ど全部の消失を示し、これは1個のキメラタンパク質が4〜6個のchLBDに結合することを示している。
I型サイトカインは保存結合部位(部位I及びII)を通してそれらの受容体と相互作用する。IL−6を含むgp130ファミリーのG−CSF及びサイトカインは更なる結合部位(部位III)を有しており、それは最近IL−6−gp130複合体の結晶構造が受容体のIg様領域(IGD)と2:2配置で相互作用することが示された(Chow et al.,2001;Boulanger et al.,2003)。複合体形成の同じような型は、配列の類似性及び当該2種の相互作用同士がホルモン及びG−CSFの受容体類やサイトカイン類のgp130ファミリーと分かち合う全体構造によればレプチン/レプチン受容体相互作用でも予期される。我々はそこでgp130IGD構造(pdb code 1i1r;Chow et al.,2001)に基づいてレプチン受容体IGD領域をモデル化し、当該モデルをgp130−vIL−6複合体に合わせた。単離されたもの(pdb code lax8;Zhang et al.,1997)を観察したように、レプチンの実験的構造はα−ヘリックスに対応する4つの保存ブロックに基づいてvIL−6構造に合わせた。
Claims (21)
- レプチンのポリペプチド配列の位置39〜42における疎水性結合部位の配列LDFI/Sの少なくとも2つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換され、当該部位がより低い疎水性となる合成レプチン拮抗薬及び前記レプチン拮抗薬の断片。
- 位置39〜42のアミノ酸残基の少なくとも2つが、アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、リシン及びセリンからなる群より選ばれる1つ以上のアミノ酸残基で置換されている、請求項1のレプチン拮抗薬。
- 前記アミノ酸残基がアラニンである、請求項2のレプチン拮抗薬。
- 哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置39〜42のいずれかにおけるアミノ酸残基の2つがアラニンで置換されている、請求項1のレプチン拮抗薬。
- 前記哺乳類レプチンがヒトレプチンである、請求項4のレプチン拮抗薬。
- 前記ヒトレプチン拮抗薬がSEQ ID NO:1又はSEQ ID NO:2の配列である、請求項5のレプチン拮抗薬。
- 前記哺乳類レプチンがヒツジレプチンである、請求項4のレプチン拮抗薬。
- 前記ヒツジレプチン拮抗薬がSEQ ID NO:3又はSEQ ID NO:4の配列である、請求項7のレプチン拮抗薬。
- 哺乳類レプチンポリペプチド配列の位置39〜42のいずれかにおけるアミノ酸残基の3つがアラニンで置換されている、請求項1のレプチン拮抗薬。
- 前記哺乳類レプチンがヒトレプチンである、請求項9のレプチン拮抗薬。
- SEQ ID NO:5のポリペプチドからなる、請求項10のレプチン拮抗薬。
- 前記哺乳類レプチンがヒツジレプチンである、請求項9のレプチン拮抗薬。
- SEQ ID NO:6のポリペプチドからなる、請求項12のレプチン拮抗薬。
- 当該ヒトレプチンポリペプチド配列の位置39〜42における4つのアミノ酸残基がアラニンで置換され、前記レプチン拮抗薬はSEQ ID NO:7のポリペプチドからなる、請求項1のレプチン拮抗薬。
- 当該ヒツジレプチンポリペプチド配列の位置39〜42における4つのアミノ酸残基がアラニンで置換され、前記レプチン拮抗薬はSEQ ID NO:8のポリペプチドからなる、請求項1のレプチン拮抗薬。
- 請求項1のレプチン拮抗薬をコードしている単離されたDNA分子。
- SEQ ID NOs:9、10、11,12,13,14,15及び16のDNA配列からなる群より選ばれる請求項16のDNA分子。
- レプチンポリペプチド配列の位置39〜42における疎水性結合部位の配列LDFI/Sの少なくとも2つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸残基で置換されて当該部位がより低い疎水性となる、前記断片がレプチン拮抗薬である、請求項1の合成レプチン断片。
- ペグ化された形態である請求項1の合成レプチン拮抗薬。
- 請求項1の合成レプチン拮抗薬又はその断片及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
- ペグ化された形態である合成レプチン拮抗薬を含む請求項20の医薬組成物。
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