CN102958531A - 高亲和力瘦蛋白和瘦蛋白拮抗剂 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了对瘦蛋白受体具有提高的结合亲和力的瘦蛋白突变蛋白，特别是瘦蛋白拮抗剂。这些化合物以及包含所述化合物的药物组合物可用于治疗其中牵涉内生瘦蛋白的非期需或有害活性或经改变先天性免疫反应的任何病症。
Description
技术领域
本发明涉及对瘦蛋白(leptin)受体具有增加的结合亲和力的瘦蛋白突变蛋白，尤其是瘦蛋白拮抗剂，并涉及包含其的药物组合物。
背景技术
认为肥胖症是很多癌症的风险。在肥胖人中血清瘦蛋白水平通常升高。瘦蛋白在很多组织中作为有丝分裂剂起作用；因此，其可发挥作用以促进癌症细胞生长。事实上，在体外已显示瘦蛋白对前列腺癌细胞起生长因子的作用，诱导增加前列腺癌细胞的迁移和生长因子的表达，所述生长因子例如血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β1 (TGF-β1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，并且促进前列腺癌生长(Somasundar等, 2004；Frankenberry等, 2004)。
瘦蛋白除在调节食物摄取及脑能量消耗中起重要作用外，还在正常及瘤性乳腺癌细胞中起潜在的生长刺激剂的作用。最近在体外亦显示其诱导卵巢癌细胞的细胞增殖(Choi等, 2004)。
最近业已显示瘦蛋白促进T辅助1 (Th1)-细胞分化，并在若干动物疾病模型中调节自身免疫反应的开始和进展(La Cava和Matarese, 2004)。若在Th1-介导的自身免疫病或炎性疾病(例如炎性肠综合征)中瘦蛋白的作用是基本的，则可预期通过阻断外周瘦蛋白作用来起治疗作用(Matarese等, 2005)。亦业已显示瘦蛋白参与类风湿性关节炎的发病机理和实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的发展，EAE为多发性硬化症的小鼠模型(Peelman等, 2005)。
因此，瘦蛋白和瘦蛋白拮抗剂二者都具有治疗潜在性。过去已放弃将瘦蛋白作为治疗肥胖症的潜在药物，但最近报导其与糊精类似物(Turek等，2010)或化学蛋白伴侣(Ozcan等 2009)联合有效。同样业已显示瘦蛋白联合胰岛素导致1型糖尿病小鼠好转(Wang等 2010)。
国际申请PCT/IL2005/001250 (通过引用以其整体如同本文所全部公开一样并入本文)公开了合成的瘦蛋白拮抗剂，其中对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的疏水结合位点的序列LDFI的至少两个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，以致该位点的疏水性变弱。瘦蛋白拮抗剂可用于治疗例如以下疾病：代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症、自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎。
为了促进以低剂量有效治疗，有增加这些瘦蛋白拮抗剂和激动剂与其靶受体的亲和力的尚未满足的需要。
发明简述
我们现在业已发现，根据本发明，将某些突变引入如WO 2006/056987所公开的哺乳动物天然瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂，提高瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂与瘦蛋白受体的结合亲和力。
因此，在一方面，本发明涉及由以下组成的合成的瘦蛋白拮抗剂：对如WO 2006/056987所公开的经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽进行进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，所述进一步修饰如下进行：用不带负电荷的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白的23位位置的天冬氨酸(D23)，或用疏水的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白12位位置的苏氨酸(T12)；所述经进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或所述经进一步修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，用亮氨酸取代D23，具体而言，合成瘦蛋白拮抗剂由SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列组成。
在另一方面，本发明涉及合成的瘦蛋白激动剂，其包含以下：经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12；所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白激动剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。
在又一方面，本发明提供编码所述瘦蛋白拮抗剂或激动剂的分离的DNA分子。
在再一方面，本发明提供药物组合物，其包含所述合成的瘦蛋白拮抗剂或激动剂或其片段和药学上可接受载体。
可将包含拮抗剂的药物组合物用于治疗其中涉及过量瘦蛋白或瘦蛋白信号转导的病况，所述病况例如代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症或自发炎症和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎，同时可将包含激动剂的药物组合物用于治疗其中涉及异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况，所述疾病或病况选自肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化。
在又一方面，本发明提供转基因小鼠，其基因组包含这样的基因，其包含编码本发明合成瘦蛋白拮抗剂或具有D23和T12的合成瘦蛋白拮抗剂的DNA分子，所述DNA分子与诱导型启动子可操作地连接。
本发明转基因小鼠优选表现出胰岛素抗性和增加的血液胰岛素和血糖水平，因此可用于筛选对选自高血糖、高血脂2型糖尿病和胰岛素抗性的疾病或病况具有治疗活性的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将测试物质给予转基因小鼠；(2)确定在转基因小鼠中所述疾病或病况或所述疾病或病况的症状是否受到抑制；和(3)当转基因小鼠中的所述疾病或病况或所述疾病或病况的症状受到抑制时，选出测试物质作为对所述疾病或病况具有治疗活性的物质。
附图简述
图1描述在酵母细胞中表达瘦蛋白的质粒的示意性结构。Aga2代表Aga2蛋白；HA代表血凝素。
图2A-C显示小鼠瘦蛋白的酵母表面展示的流式细胞术分析。用缀合有FITC的山羊抗-小鼠抗体和小鼠单克隆抗体9e10(A)检测c-myc表位标签，用生物素化的可溶人瘦蛋白受体(hLBD)和链霉亲和素– 藻红蛋白(SA–PE)缀合物(B)检测表达的瘦蛋白，可用FACSARIA流式细胞术系统同时检测两个标记(C)。
图3A-B显示来自分选实验之一的代表性图。图3A显示与非标记的hLBD竞争之前的文库，图3B为竞争后的文库。收集未被竞争掉(competed-off)的酵母细胞用于两个另外的生长和选择循环。FL1-H和FL2-H指在流式细胞术实验中使用的2次发射滤光器(激发488nm)。
图4A-B描绘在第3轮筛选后的13个酵母克隆中对可溶性人瘦蛋白受体(hLBD)亲和力的测定。MFI，平均荧光强度；mlep wt，小鼠野生型瘦蛋白。
图5A-C显示在D23处突变的小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)的8个变体的SDS-PAGE，其在存在(+)或不存在(-) β-巯基乙醇时在15%凝胶中泳动。WT小鼠瘦蛋白(mlep wt)泳动作为对照。分子量标记大小(从顶部到底部，kDa)为：250、150、100、75、50、37、25、20、15和10。
图6A-H描绘在D23处突变的8个MLA变体的凝胶过滤分析，其在Superdex 75柱上在TN缓冲液, pH 8中以0.8 ml/分钟进行。
图7A-D显示小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)和强效(superactive) MLA(SMLA)(A, C)及聚乙二醇(PEG)-MLA和PEG-SMLA (B, D)的生物活性(A, B)和结合特性(C, D)的比较。FI，荧光强度。
图8A-B显示在用小鼠OBRb稳定转染的CHO细胞中比较SMLA和MLA抑制STAT3磷酸化的蛋白质印迹(A)。(B) (A)中由柱状图代表的条带的定量。FI，荧光强度；D23L, SMLA. P-STAT，磷酸化的STAT；t-STAT，总STAT。
图9A-B显示(A)在β-巯基乙醇存在(+)或不存在(-)时于12%凝胶中泳动的PEG-SMLA的SDS-PAGE (分子量标记(从顶部到底部，kDa)为：150、100、75、50、37、25和20)，和(B)在Superdex 200柱上于TN缓冲液, pH 8中以0.7 ml/分钟进行的PEG-SMLA凝胶过滤分析。
图10显示PEG-MLA和PEG-SMLA (标记为superANT)对小鼠增重的影响的比较。两种物质都每日一次以6.25 mg/kg注射。20天后停止注射，对小鼠重量再检查10天。
图11显示PEG-MLA和PEG-SMLA在剂量-反应实验中对小鼠增重的影响的比较。两种物质都每日一次以20、6.7、2.2和0.72 mg/kg注射17天的时间。结果为平均值± SEM, n = 8。
图12A-D显示HLA、SHLA、SMLA、PEG-HLA和PEG-SHLA的生物活性(A, B)和结合特性(C, D)的比较。FI，荧光强度。
图13A-B显示PEG-SMLA和PEG-SHLA对雌性小鼠增重影响的比较(A)。两种物质都从0时开始(箭头)每日一次以6.25 mg/kg注射17天。在(B)中我们看到食物和水摄取的平均值比较。在带*标记的所有点两种治疗都显著(p<0.05)不同于溶媒，但它们之间无显著差异。结果为平均值± SEM, n = 8。PEG-SMLA，PEG-强效(super)小鼠瘦蛋白拮抗剂；PEG-SHLA，PEG-强效人瘦蛋白拮抗剂。
图14描述小鼠瘦蛋白中结合位点II的分子模型。影响与CRH2结合的结合位点II中的残基为黄色。既影响与瘦蛋白受体的CRH2亚-结构域结合又影响瘦蛋白受体激活的结合位点II中的残基为橙色，D23为绿色。T12残基是结合结构域II的部分。来自Iserentant等(2005)。
图15A-B显示强效瘦蛋白拮抗剂通过抑制浸润单核细胞来诱导防护免于发生先天炎症。将PEG-SMLA (20mg/kg)或PEG-瘦蛋白(PEG-Lep；0.4mg/kg)腹膜内给予雌性C57bl小鼠4天。此后接着是诱导肝炎，这通过激活先天免疫反应来诱导，所述激活经由在0时给予脂多糖(LPS；10ug/kg)和D-半乳糖胺(DgalN；600mg/kg)进行。稳态，在给予LPS和DgalN前时间段的细胞群；1.5小时LPA/D-GalN，在给予LPS和DgalN后1.5小时时间段的细胞群；在门(gate)P4和门P5分别描绘肝炎CD45+CD11b+CD11-F4/80+浸润和驻留巨噬细胞群的群体；CD11b和F4/80为巨噬细胞标记。
发明详述
WO 2006/056987教导，用其它氨基酸取代野生型人或非-人哺乳动物瘦蛋白序列的39-42位的LDFI疏水结合位点的至少两个氨基酸，致使该位点疏水性减弱，使野生型瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂。所述拮抗剂对瘦蛋白受体具有与原始激动剂相同的亲和力。为通过利用对瘦蛋白受体具有与野生型激素相同亲和力的瘦蛋白拮抗剂在体内有效抑制瘦蛋白作用，需要10–100倍过量的拮抗剂。有两种方法来降低该高比率：(1)通过聚乙二醇化延长拮抗剂的半衰期；和(2)提高拮抗剂对瘦蛋白受体的亲和力，并随后联合这两种方法。在本申请中实施了后一方法。
在本发明工作中，我们使用了PCR易错随机诱变瘦蛋白(激动剂)基因，接着用酵母表面展示方法选择和鉴定高亲和力瘦蛋白突变体，随后制备作为大肠杆菌(Escherichia. coli)中的重组蛋白的高亲和力突变体。
筛选鉴定了具有单个突变的高亲和力突变蛋白和具有多个突变的突变蛋白。具有增加亲和力且具有很少突变的突变蛋白比具有多个突变的突变蛋白有优势，因为在将突变蛋白给予哺乳动物后，其免疫原性可能更弱，由此诱导中和抗体产生的可能性更低。在第三次筛选中，发现两种具单个突变的高亲和力突变蛋白，其如下文所示：具有用组氨酸取代的D23的突变蛋白和具有用异亮氨酸取代的T12的突变蛋白(参见实施例1)。
后来，将使瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂的突变引入到对瘦蛋白受体具有高亲和力的瘦蛋白突变体。用此种方式，产生了对瘦蛋白受体具有高亲和力的瘦蛋白激动剂和瘦蛋白拮抗剂二者。如以下实施例3所示，通过用不带负电荷的氨基酸残基合理诱变D23的取代，产生了最有效的瘦蛋白拮抗剂。
本文将WO 2006/056987的瘦蛋白激动剂称为MLA (小鼠瘦蛋白拮抗剂)或HLA (人瘦蛋白拮抗剂)，同时通过加上前缀“强效”来称呼本发明改良的瘦蛋白激动剂和拮抗剂；因此，例如，改良的小鼠瘦蛋白拮抗剂称为“SMLA”或强效的小鼠瘦蛋白拮抗剂，而改良的人瘦蛋白拮抗剂本文称为“SHLA”或强效的人瘦蛋白拮抗剂。
本文公开的蛋白质或其片段中的某些氨基酸残基位置按照SEQ ID NO: 2中所示的野生型人瘦蛋白的编号，其通过参考氨基酸残基的一个字母密码及其在野生型人瘦蛋白中的位置来命名。因此，例如，本文亦称作D23的对应于野生型人瘦蛋白23位位置的天冬氨酸，按照蛋白质化学领域熟知的比对算法，在瘦蛋白片段或在不同大小的同源哺乳动物瘦蛋白中可亦被称为D23。通过参考氨基酸残基的一个字母的编码及其如上所定义的位置和取代原始氨基酸残基的氨基酸残基的一个字母密码，来命名用另一氨基酸残基对某一位置氨基酸残基的取代。因此，例如，用甘氨酸取代D23将命名为D23G。
尽管13年前已报道3-D瘦蛋白结构(Zhang等 1997)，但至今未阐明瘦蛋白和瘦蛋白受体之间的结晶复合物。缺乏所述结构妨碍对本申请中报道的D23L或其它D23突变的有效结构阐释。因此，所提出的阐释基于过去多年报道的理论复合物模型(Peelman等 2004, Iserentant等 2005, Peelman等 2006)。这些报道提示瘦蛋白具有与瘦蛋白受体相互作用的3个结合位点。未很好地阐述位点I，其重要性与形成推定的六聚体复合物有关联，所述复合物由与4个瘦蛋白受体反应的2分子瘦蛋白组成。在螺旋A和C的表面发现结合位点II，其为主要结合位点，并且其与瘦蛋白受体的CRH2亚结构域结合。我们实验室已亚克隆该人瘦蛋白受体亚结构域，表达为称作瘦蛋白结合结构域(LBD)的可溶重组蛋白质，其能够与人或其它哺乳动物瘦蛋白形成高亲和力1:1复合物(Sandowski等 2002)。在本申请中将这种亦称为CHR2 (细胞因子同源区域II)的蛋白质，用作钓出在如上所述的酵母细胞表面表达的高亲和力瘦蛋白突变体的吊钩(hook)。推测位点III与LR的Ig-样结构域结合(Peelman等 2004, Zabeau等，2003)，并且其为激活瘦蛋白受体所必需。用分子建模和诱变方法(Peelman等 2004)，显示结构上相似并面对同一方向的位于螺旋A的D9、T12、K15、T16和R20及位于螺旋C的Q75、N82、D85和L86 (参见图14)，很可能参与与CHR2的相互作用。这些残基例如D9S、T12Q、K15S、T16N、R20N、Q75S、N82S、D85S和L86A、L86S、L86N和L86Q的突变，显著降低瘦蛋白对CRH2的亲和力，既影响与CRH2的结合又影响LR信号转导(Peelman等 2004, Iserentant等 2005)。迄今尚无关于D23的假定作用的报告发表，但本发明发现(参见表7)强烈表明，通过任何不携带负电荷的氨基酸取代D23，足以增加对人瘦蛋白结合结构域(hLBD；CHR2)的亲和力，并继而提高生物活性。在结合和细胞测定中观察到用D23L突变体的最大作用(表6和7和图7A-D)，并在小鼠体内增重实验中确证(图10和图11)。尽管通过结合测定测定的亲和力增加高达50倍，但在体外生物测定中的增加仅约13-14倍，很可能是因为在这些测定中所用的细胞具有过量的多余受体。体内实验中效力的提高更难计算，但如上所示其在9-27倍范围内。如所证明，在人和绵羊(ovine)瘦蛋白拮抗剂中的相同D23L突变得到相似结果。应该注意，小鼠和人序列的螺旋A的氨基酸序列相同。此外，在所有哺乳动物序列中保留D23，螺旋A的氨基酸序列几乎相同。
D23位于螺旋A的C-末端，其在与R20、T16、T12相同的方向定向(图14)。其被不带负电荷的氨基酸取代可能废除一些(但未确定的)排斥效应，因此，提高与LBD的相互作用。在拮抗剂和激动剂突变体二者中都出现亲和力增加，但与拮抗剂相反，体外基于细胞的测定中激动剂的生物活性未增加。该差异的原因可能与这一事实有关，即SMLA和SHLA的亲和力增加主要不是来源于kon的增加而是来源于koff (未显示)的降低，这导致延长受体占有。所述延长占有使得拮抗剂更有效但可能不增加激动剂活性。这与人生长激素的情况相似，其通过噬菌体展示选择的突变体亦展现对hGH受体的高达400倍的增加亲和力，但在细胞生物测定中却并未更活跃(Lowman和Wells 1993, Pearce等 1999 )。
本发明由此提供合成的瘦蛋白拮抗剂，其包含经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中：(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白的39-42或39-41位位置的LDFI疏水结合位点，以使所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，以致所述位点疏水性变弱，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽为瘦蛋白拮抗剂；和(ii)用不带负电荷的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白23位位置的天冬氨酸(D23)，或用疏水的不同氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白12位位置的苏氨酸(T12)；所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。
在某些实施方案中，用疏水或带正电荷的氨基酸残基取代D23，其中疏水氨基酸残基可为亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；带正电荷的氨基酸残基可为精氨酸或赖氨酸。具体而言，如下文实施例2所示，在所测试的突变蛋白中对瘦蛋白受体具有最高亲和力的突变蛋白中，D23被亮氨酸取代。因此，在某些实施方案中，D23被亮氨酸取代。
在其它实施方案中，T12被异亮氨酸取代。
亦已鉴定与野生型瘦蛋白比较对瘦蛋白受体具有增加的亲和力的突变蛋白，其中除用甘氨酸取代D23外，还引入进一步的突变。例如，在一种突变蛋白中，用其它氨基酸残基取代对应于野生型人瘦蛋白的L68、S97和S132位位置的氨基酸残基；在另一突变蛋白中，用另一氨基酸残基取代对应于野生型瘦蛋白的G112位位置的氨基酸残基；在又一突变蛋白中，用其它氨基酸残基取代对应于野生型瘦蛋白的T37和G44位位置的氨基酸残基。
因此，在某些实施方案中，除用疏水或带正电荷的氨基酸残基取代D23外，还如下取代另外的氨基酸残基：(a)用甲硫氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白68位位置的亮氨酸(L68)，用苯丙氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白97位位置的丝氨酸(S97)，用酪氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白132位位置的丝氨酸(S132)；(b)用丝氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白的112位位置的甘氨酸(G112)；或(c)用丙氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白37位位置的苏氨酸(T37)和用天冬氨酸取代对应于野生型人瘦蛋白44位位置的甘氨酸(G44)。
此外，合成的瘦蛋白拮抗剂可任选除D23取代外，还具有选自以下的至少一个取代：T12I、L68M、S97F、S132Y、G112S、T37A和G44D；和这些取代的两个或多个的任意组合。
如上所述，用其它氨基酸取代野生型人或非-人哺乳动物瘦蛋白序列的LDFI疏水结合位点的2-4个氨基酸以使该位点疏水性变弱，使野生型瘦蛋白激动剂转化为瘦蛋白拮抗剂。在某些实施方案中，2-4个氨基酸残基被选自以下的氨基酸取代：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸，尤其是丙氨酸。在下文提供的实施例中，瘦蛋白拮抗剂具有4个中3个被丙氨酸取代的氨基酸残基。因此，在某些实施方案中，4个氨基酸残基有3个被丙氨酸取代；尤其是L39A、D40A和F41A。
在这些测试中具有最高亲和力的瘦蛋白拮抗剂的D23被亮氨酸取代。因此，在某些实施方案中，合成的瘦蛋白拮抗剂是这样的突变蛋白，其中：(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，以使对应于野生型人瘦蛋白39位位置的亮氨酸被丙氨酸取代(D39A)；对应于野生型人瘦蛋白40位位置的天冬氨酸被丙氨酸取代(D40A)；和对应于野生型人瘦蛋白41位位置的苯丙组氨酸被丙氨酸取代(F41A)；和(ii) D23被亮氨酸取代(D23L)。
在某些实施方案中，携带突变D23L的人瘦蛋白拮抗剂具有在SEQ ID NO: 1中所示的氨基酸序列，携带突变D23L的小鼠瘦蛋白拮抗剂具有在SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列。
本文所述术语“哺乳动物”包括人哺乳动物以及非人哺乳动物。因此，根据本发明，天然瘦蛋白可为人瘦蛋白或非人哺乳动物瘦蛋白，所述非人哺乳动物瘦蛋白例如但不限于绵羊、大鼠、小鼠、马和猪瘦蛋白，并且LDFI序列代表人瘦蛋白或非人哺乳动物瘦蛋白的39-42位LDFI序列。在某些实施方案中，瘦蛋白为人、小鼠或绵羊瘦蛋白。
如下文表6中所见，在第一次筛选测定中鉴定的瘦蛋白激动剂和拮抗剂对瘦蛋白受体的亲和力，与野生型小鼠瘦蛋白比较介于约1.5倍-约35倍范围内。然后合理诱变瘦蛋白拮抗剂中的D23，显示具有对瘦蛋白受体亲和力范围介于约18-约64范围的突变蛋白(表7)。因此，在某些实施方案中，本发明合成瘦蛋白拮抗剂与具有以下亲和力的瘦蛋白受体结合：亲和力为经修饰的哺乳动物瘦蛋白的高达100倍、90倍、80倍、70倍、50倍、30倍或20倍，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白仅在对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点修饰，以使所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，由此使该位点疏水性变弱。
在又一实施方案中，本发明合成瘦蛋白拮抗剂呈聚乙二醇化形式，且具有连接在其上的不同数目的聚乙二醇(PEG)分子。分子量约20 kDa的PEG适合该目的。本发明瘦蛋白拮抗剂的聚乙二醇化提高了其稳定性、其血浆半衰期和药代动力学。
亦包括在本发明范围内的是本发明经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的盐。本文所述用术语“盐”指肽分子的羧基盐和肽分子氨基的酸加成盐二种。羧基盐可通过本领域已知手段来形成，包括无机盐，例如钠、钙、铵、铁或锌盐等等；和与有机碱形成的盐，例如与例如胺(例如三乙醇胺)、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等等形成的盐。酸加成盐包括例如：与无机酸的盐，例如盐酸或硫酸；和与有机酸的盐，例如乙酸或草酸。优选将所述盐用于改进牵涉到稳定性、溶解性等方面的多肽药物特性。
在另一方面，本发明涉及编码本发明瘦蛋白拮抗剂的分离的DNA分子。在某些实施方案中，拮抗剂具有通过以下取代来修饰的对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点：L39A、D40A和F41A及另外D23被亮氨酸取代。具体而言，DNA分子包含SEQ ID NO: 4的DNA序列，其可操作地连接能够驱动DNA分子表达的诱导型或组成型主动启动子。
在又一方面，本发明提供药物组合物，其包含本发明合成的瘦蛋白拮抗剂及药学上可接受载体，特别是如SEQ ID NO: 1中所描绘的氨基酸序列的合成瘦蛋白拮抗剂。在某些实施方案中，药物组合物包含呈聚乙二醇化形式的合成瘦蛋白拮抗剂。
此外，根据本发明，业已发现给予小鼠的强效瘦蛋白拮抗剂提供显著的保护作用，其中通过激活先天免疫反应诱导肝炎，所述保护作用通过抑制单核巨噬细胞浸润到发炎器官中来介导。认为先天免疫反应的改变是很多自发性炎性病症和代谢病症的初始发病机理的关键事件，所述病症实例包括炎性肠病和非酒精性脂肪性肝炎。假定代谢途径例如瘦蛋白途径通过多种机理与先天免疫武器(arm)互相作用并对其进行调节。
因此，包含本发明合成瘦蛋白拮抗剂的药物组合物可用于治疗以下任何病症，在所述病症中牵涉内源性瘦蛋白的非合乎需要或有害的活性或改变的先天免疫反应，所述病症例如代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症(通过提高罹患厌食症的对象的食欲来实施治疗)、恶病质、癌症、自发炎症和自身免疫病(例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎)。
因此，在某些实施方案中，本发明提供用于治疗人或非人哺乳动物的II型糖尿病和用于治疗胰岛素抗性(特别是与肥胖症有关的II型糖尿病和胰岛素抗性)的药物组合物。
在其它一些实施方案中，可将药物组合物用于抑制恶性细胞生长，由此可用于治疗癌症，例如但不限于乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和前列腺癌。
可以以常规方式用一种或多种生理上可接受载体或赋形剂来配制供本发明使用的药物组合物。载体应该在与组合物的其它成分相容及对其受者无害意义上为“可接受的”。
给予本发明药物组合物的方法包括但不限于：胃肠外给药，例如静脉内、腹膜内、肌肉内、皮下；粘膜给药(例如经口、鼻内、含服、阴道、直肠、眼内给药)；鞘内给药；局部和皮内给药。给药可为全身给药或局部给药。
在另一方面，本发明涉及用于治疗以下疾病的方法：代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症、自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的本发明合成瘦蛋白拮抗剂。
在又一方面，本发明涉及用于治疗以下疾病的本发明合成瘦蛋白拮抗剂：代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症或自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎。
除了其可能的药物用途外，本发明瘦蛋白拮抗剂还可用作研究瘦蛋白激素生物活性的研究工具。
本发明进一步提供合成瘦蛋白激动剂，其由经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽组成，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽具有完整未经修饰的对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，其中对瘦蛋白多肽进行修饰以改进其与瘦蛋白受体的结合亲和力，其如上文对合成瘦蛋白拮抗剂所述。换言之，本发明提供由以下组成的合成瘦蛋白激动剂：经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12；所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白激动剂；或经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽或其片段的药学上可接受的盐。改进经修饰的瘦蛋白多肽对瘦蛋白受体的亲和力的特定修饰选自D23L、D23G、D23A、D23T、D23H、D23F、D23R、D23K和T12I。任选除D23和/或T12取代外，还可将其它取代引入到瘦蛋白多肽中，例如L68M、S97F、 S132Y、G112S、T37A和G44D及这些取代的两个或多个的任意组合。
在其它方面，提供药物组合物，其包含药学上可接受载体和对瘦蛋白受体具改进的结合亲和力的本发明合成瘦蛋白激动剂。迄今为止，在有限的其中已鉴定瘦蛋白遗传缺陷的病例中使用瘦蛋白治疗(Bluher等 2009)，或基于实验在人脂肪萎缩中使用(Chong等 2010)。然而，利用瘦蛋白作为抗肥胖症药物的持续努力一直在继续，尽管失败了，但目前出版了阐述成功联合瘦蛋白和糊精治疗的报告(Turek等 2010)。另一报告显示用化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(biphenyl, 4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)预先治疗小鼠提高了瘦蛋白的敏感性(Ozcan等, 2009)。
此外，最近的报道显示，用与胰岛素联合的瘦蛋白治疗I型糖尿病小鼠，与单用胰岛素治疗I型糖尿病小鼠相比，降低了血糖波动，胆固醇水平更低，体脂肪沉积更少(Wang等, 2010)，鉴于该最近的报道，高亲和力瘦蛋白激动剂可与胰岛素或其它介导葡萄糖稳态的药剂联合用于治疗I型糖尿病。
因此，药物组合物可包含一种或多种另外的活性药剂。例如，为了治疗I型糖尿病，药物组合物除瘦蛋白激动剂外还可包含胰岛素；为了治疗肥胖症，药物组合物除瘦蛋白激动剂外还可包含糊精激动剂，例如SYMLIN? (乙酸普兰林肽)或化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)。
在另外方面，本发明涉及用于治疗选自以下的其中牵涉异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况的方法：肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化，所述方法包括给予需要治疗的患者有效量的本发明合成瘦蛋白拮抗剂。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗肥胖症，并进一步包括给予所述患者糊精类似物例如SYMLIN? (乙酸普兰林肽)或化学蛋白伴侣例如苯丁酸钠制剂(4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)。
在某些实施方案中，所述方法用于治疗I型糖尿病，并进一步包括给予所述患者胰岛素。
同样，本发明合成瘦蛋白激动剂用于治疗其中牵涉异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况，所述疾病或病况选自肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化。合成瘦蛋白激动剂可与给予糊精类似物或化学蛋白伴侣联合用于治疗肥胖症，或与给予胰岛素联合用于治疗I型糖尿病。
根据本发明，业已发现在雄性和雌性两种小鼠中注射聚乙二醇化的瘦蛋白拮抗剂(PEG-MLA或PEG-SMLA)诱导极强的开胃作用，即对食欲的刺激作用，这导致极快速的增重，其主要起因于脂肪积累(参见实施例4和7)。这种增重可在停止PEG-MLA或PEG-SMLA注射时逆转。本文亦显示，与对照比较，用PEG-MLA长期注射雄性小鼠逐渐出现胰岛素抗性，并逐渐出现胰岛素水平及稳态模型评估(HOMA)记分方面的显著差异(HOMA是用于定量胰岛素抗性和β-细胞功能的方法)。亦观察到显著增加血糖、血液甘油三酯和总胆固醇-这是出现糖尿病前代谢综合征的指征。
这种与高血糖、高血脂和胰岛素抗性有关的可逆性瘦蛋白拮抗剂-诱导的肥胖症，可用作小鼠的可快速逆转2型糖尿病模型。可通过注射PEG-SMLA，或通过产生条件性表达编码SMLA的DNA序列的转基因小鼠，来获得所述模型。
因此，在另一方面，本发明提供转基因小鼠，其基因组包含这样的基因，其包含编码本发明合成瘦蛋白拮抗剂的DNA分子，所述基因可操作地连接诱导型启动子。
在某些实施方案中，DNA分子编码由具有SEQ ID NO: 1(并且优选为SEQ ID NO: 4)氨基酸序列的多肽组成的合成瘦蛋白拮抗剂。
如WO 2006/056987所指出，为了产生功能性瘦蛋白拮抗剂，野生型哺乳动物瘦蛋白的39-42位的至少两个氨基酸残基可被选自以下的一个或多个氨基酸残基取代：丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸。因此，本发明转基因小鼠基因组可包含编码这些瘦蛋白拮抗剂的基因，其另外具有如上所定义的D23或T12突变。
当然，亦可将编码WO 2006/056987的瘦蛋白拮抗剂的基因引入到转基因小鼠。因此，瘦蛋白拮抗剂中的哺乳动物瘦蛋白多肽序列的39-42位的任何位置处的任何两个氨基酸残基被丙氨酸取代，例如，在39、40或39、41或39、42或40、41或40、42或41、42位置处。
在某些实施方案中，分离的DNA分子编码源自人瘦蛋白的瘦蛋白拮抗剂。具体而言，DNA分子为SEQ ID NO: 5，其编码双重人瘦蛋白突变体L39A/D40A。在另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 6，其编码双重人瘦蛋白突变体F41A/I42A。
在另一实施方案中，分离的DNA分子编码源自绵羊瘦蛋白的瘦蛋白拮抗剂。具体而言，DNA分子为SEQ ID NO: 7，其编码绵羊瘦蛋白的双重突变体L39A/D40A。或者，DNA分子为SEQ ID NO: 8，其编码羊瘦蛋白的双重突变体F41A/I42A。
在本发明另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 9，其编码人瘦蛋白的三重突变体L39A/D40A/F41A。在另一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 10，其编码绵羊瘦蛋白的三重突变体L39A/D40A/F41A。
在又一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 11，其编码人瘦蛋白的四重突变体L39A/D40A/F41A/I42A。
在又一实施方案中，DNA分子为SEQ ID NO: 12，其编码绵羊瘦蛋白的四重突变体L39A/D40A/F41A/I42A。
为了允许时空调控，很重要的是，控制瘦蛋白拮抗剂基因表达的启动子为诱导型的。例如，期需基因仅在发育的成年阶段开启，并且可在实现某一作用后关闭。
迄今为止，在转基因小鼠中成功使用了两种主要系统，即四环素-诱导型系统和Cre/loxP重组酶系统(为组成型或诱导型)。为了在体内使用这些系统，有必要产生两组转基因动物。一种小鼠系在所挑选的基因或组织特异性启动子调控下表达激活因子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达“受体”构建体，其中在tTA/rtTA反式激活因子靶序列调控下(或其侧翼为loxP序列)表达瘦蛋白拮抗剂转基因。让两种小鼠品系交配使得可时空调控转基因的表达。
业已阐述其它诱导型系统，例如，包含合成的类固醇激素结合结构域的启动子，并且其可用于本发明。
因此，在某些实施方案中，诱导型启动子为四环素-调控的反式激活因子依赖性启动子，转基因小鼠的基因组进一步包含四环素-调控反式激活因子。反式激活因子可选自两类反式激活因子；一类使其仅在四环素不存在时能转录，或一类使其仅在四环素存在时转录。
用于产生转基因小鼠的方法是常识，可选择任何合适的方法用于产生本发明转基因小鼠，例如，其如在“Transgenic animal technology: a laboratory handbook, 第2版(Carl A. Pinkert编辑，Gulf Professional Publishing, 2002)中教导，该书在此以其整体并入。
如上所述，本发明转基因小鼠优选表现出胰岛素抗性和增加的血液胰岛素和血糖水平。
因此，在另外方面，本发明提供筛选对选自以下的疾病或病症具有治疗活性的物质的方法：高血糖、高血脂、2型糖尿病和胰岛素抗性，所述方法包括以下步骤：(1)将测试物质给予转基因小鼠；(2)确定转基因小鼠中所述疾病或病症是否受到抑制；和(3)当转基因小鼠中的所述疾病或病症受到抑制时，选择所述测试物质作为对所述疾病或病症具有治疗活性的物质。
本发明现在将通过以下非限制性的实施例来阐明：
实施例。
材料和方法
材料–我们实验室制备了重组人瘦蛋白结合结构域(hLBD)(Sandowski等，2002)以及小鼠和瘦蛋白，和小鼠和人瘦蛋白拮抗剂，如前所述的(Salmon等，2006, Niv-Spector等，2005)。由Entelechon Co. Rensberg, Germany (Salomon等 2006)合成优化用于在大肠杆菌中表达的合成小鼠瘦蛋白野生型(WT) cDNA。人瘦蛋白和小鼠白介素-3 (mIL3)购自蛋白质实验室 Rehovot (Rehovot, Israel)。在分子生物学实验中使用的限制性酶来自Fermentas (Vilnius, Lithuania)。自Syntezza (Jerusalem, Israel)订购高纯DNA引物。裂解缓冲液、萘啶酸、3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑 
(噻唑蓝, MTT)、嘌呤霉素(puromycin)和卡那霉素(kanamycin)购自Sigma (Sigma, Israel)。Superdex 75 HR 10/30, 26/60和Superdex 200 HR 10/30柱和Q-Sepharose和SP-Sepharose来自Pharmacia LKB Biotechnology AB (Uppsala, Sweden)。用于SDS-凝胶电泳和Bradford蛋白质测定的分子标记购自Bio-Rad (Bio-Rad, Israel)。细菌用蛋白胨来自Laboratories Conda (Madrid, Spain)。细菌用酵母提取物和细菌用酪蛋白氨基酸(-Trp, -Ura)来自Difco (Becton Dickinson, Maryland, USA)。磺基-NHS-LC-生物素购自Pierce (Rockford, IL, USA)。质粒pCT302和酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的EBY100菌株由Dr. E.T. Boder (来自University of Tennessee Knoxville, TN, USA)惠赠。单克隆Ab 9e10购自(Covance, Emeryville,CA)，FITC-标记的F(ab')2山羊抗小鼠IgG来自(Chemicon)，链霉亲和素–藻红蛋白(SA–PE)缀合物来自(BD PharMingen, San Jose, CA)。p-STAT-3 (Tyr705)和STAT-3抗体来自(Cell Signaling Danvers, MA, USA)，mPEG-丙酰基-ALD 20 kDa购自Jenkem Technology USA Inc. (Allen, TX)。胎牛血清(FBS)、青霉素-链霉素(‘pen-strep’；10,000单位/ml和10,000 mg/ml)和加强化学发光试剂(ECL)来自Biological Industries Ltd. (Beit Haemek, Israel)。RPMI-1640和DMEM培养基来自GIBCO(Invitrogen – Carlsbad, CA.)，PelletPaint共沉淀剂来自(Novagen, EMD Biosciences, Darmstadt, Germany)。荧光素酶测定试剂来自Promega (Madison, WI, USA)，缀合过氧化物酶的链霉亲和素来自Jackson Immuno Research实验室(West Grove, PA, USA)，TMB来自Dako (DakoCytomation, Denmark)。其它试剂例如Tris、半胱氨酸、精氨酸、NaOH、HCl、硼酸、吐温20、超纯尿素、脱脂奶皆为分析级。
购买以下试剂盒：Stratagene GeneMorph?试剂盒、Stratagene QuickChange诱变试剂盒和XL-1 Blue细胞(Stratagene - La Jolla, CA, USA)。Qiagen小量制备和Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Valencia, CA)。Zymoprep II酵母质粒小量制备试剂盒(Zymo Research, Orange, CA)。
在我们实验室制备以下试剂：LB (10 g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物、10 g/L NaCl，无菌)；TB (80 g/L胰蛋白胨、160 g/L酵母提取物、33.3 g/L甘油，无菌)；YPD培养基(10 g/L酵母提取物、20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖，无菌)；SD-CAA培养基(20 g/L葡萄糖、6.7 g/L Difco酵母氮源、5 g/L细菌用酪蛋白氨基酸、5.4 g/L Na2HPO4和8.56 g/L NaH2PO4，无菌)；SG-CAA培养基(如SD-CAA，只是用20 g/L半乳糖代替葡萄糖)；FACS缓冲液- PBS缓冲液(8 g/L NaCl、0.2 g/L KCl、1.44 g/L Na2HPO4、0.24 g/L KH2PO4)调整pH至7.4，补充5 %牛血清白蛋白和0.05%叠氮化物；用于荧光素酶活性的裂解缓冲液( 25 mM Tris-磷酸、2mM DTT、2mM CDTA、10%甘油、1% Triton-100，pH 7.8)；用于凝胶过滤实验的TN缓冲液(含有300 mM NaCl 的25 mM Tris-HCl，pH 8或9)。
hLBD的生物素化–让hLBD(0.12 mg/ml)对PBS (pH 7.5)透析，并在室温与10倍摩尔过量的生物素化试剂磺基-NHS-LC-生物素孵育40分钟。通过对PBS缓冲液透析去掉过量的未反应的生物素。生物素化的LBD能够与瘦蛋白或瘦蛋白拮抗剂形成1:1复合物，其与非生物素化的LBD相似(未显示)。
小鼠瘦蛋白的酵母表面展示- 通过PCR修饰小鼠瘦蛋白野生型(WT) cDNA，以分别在5'和3'末端引入NheI和BamHI限制性位点，这使得能随后亚克隆到用NheI和BamHI线性化的受者载体pCT302中。在PCR中使用的引物：对于5'末端为5'- GTACGCAAGCTAGCGCTGTTCCGATCCAGAAAGTTCAGG - 3' (SEQ ID NO: 5)，对于3'末端为5'- CGTAGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAACTG - 3' (SEQ ID NO: 6)。用NheI和BamHI消化小鼠瘦蛋白的PCR产物，提取并连接到线性化pCT302表达载体中。用新的质粒转化XL-1 Blue细胞，铺板在含有100 μg/ml氨苄西林的LB-琼脂板上。分离4个大肠杆菌菌落，通过用NheI和BamHI限制性酶消化确证含有小鼠瘦蛋白cDNA。所有菌落都是阳性，对其中之一进行测序。
通过在含有半乳糖的培养基中诱导酵母酿酒酵母EBY100菌株，小鼠瘦蛋白表达为Aga2p蛋白融合物(Boder ET, Wittrup KD, 1997.)。在编码瘦蛋白的DNA的5'上游表达血凝素(HA)表位标签，而c-myc表位标签与Aga2p -瘦蛋白融合构建体的3'连接，示意结构呈现在图1中。可用缀合FITC的山羊抗小鼠抗体和小鼠mAb 9e10检测c-myc表位标签。在Aga2p-瘦蛋白融合物C-末端检测到c-myc表位标签，表明在酵母细胞表面上展示全长瘦蛋白融合物。
让用pCT302/小鼠瘦蛋白wt转化的酵母细胞在3 ml选择葡萄糖培养基SD-CAA中在30℃过夜振荡生长。约18–20小时后，在30℃于5 ml选择半乳糖培养基(SG-CAA，其中2%半乳糖代替SD-CAA中的葡萄糖)中振荡诱导Aga1p (膜酵母蛋白质)+ Aga2p-瘦蛋白的表达。在约20–24小时(1–2次加倍)后通过离心收获培养物，用含有5%牛血清白蛋白和0.05%叠氮化物(FACS缓冲液)的PBS洗涤，与抗c-myc mAb 9e10 (1:100稀释)和生物素化的-hLBD (终浓度为约50 nM)在冰上孵育60分钟，用PBS洗涤，与FITC-标记的F(ab')2山羊抗小鼠IgG (1:50)或链霉亲和素–藻红蛋白(SA–PE)缀合物(1:50)或二者一起在冰上孵育30分钟。在Weizmann Institute的流式细胞术中心的Beckton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪上分析标记的酵母细胞。
小鼠瘦蛋白文库的构建 -用Stratagene GeneMorph?试剂盒随机诱变野生型小鼠瘦蛋白wt基因，以获得高诱变率。如Raymond等(1999)研究中所述，为获得最好的转化效率，设计同源重组引物以便插入物可在每一末端将与切割的受者载体具有约50 bp重叠。为使插入物与切割载体5'同源而使用的引物为5'- GTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGCGCTGT TCCGATCCAGAAAGTTC- 3' (SEQ ID NO: 7)，为使插入物与切割载体3'同源而使用的引物为5'-GATCTCGAGCTATTACAAGTCCTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCGGATCCGCATTCCGGAGAAACGTCCAACTG-3' (SEQ ID NO: 8)。凝胶纯化PCR产物，用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)提取。用随机诱变试剂盒进一步扩增所获得的PCR产物，再次提取。将最终的PCR产物连同线性化pCT-小鼠瘦蛋白一起转化到酵母中。PCR产物的5'和3'侧翼的50个碱基对与有缺口的质粒之间在酵母中的体内同源重组，产生大约5x105小鼠瘦蛋白变体文库。用Pellet Paint (Novagen)浓缩41 μg的诱变DNA插入物和8.2 μg限制性酶线性化的pCT302载体骨架，并通过5次电穿孔(Meilhoc等，1990)将其转化到EBY100感受态酵母细胞(Boder和Bittrup，1997)中。获得5x105酵母转化株文库，其通过对等分试样文库铺板及菌落计数来估测。对于所有转化，总插入片段与切割受者载体的比率保持在5:1。
制备用于同源重组的电感受态酵母-酵母制备方法严格遵循Meilhoc等(1990)所述方法。首先，用酿酒酵母菌株EBY100 (Boder和Wittrup, 1997)的来自YPD中EBY100过夜培养物接种50 ml的YPD至光密度(OD) 0.1。接下来，让细胞在30℃振荡生长到OD为1.3-1.5 (约生长6小时)。通过离心收获细胞，悬浮在50 ml冷无菌水中。用25 ml冷无菌水洗涤细胞，悬浮在2 ml冰冷无菌的1M无菌山梨醇中。通过离心收获细胞，悬浮在50 μl 1M无菌山梨醇中。随后，用Bio-Rad基因脉冲仪在0.2 cm小池(电压1.5 kV，电容25 μF)对悬浮细胞实施电穿孔。在脉冲后，立即将等分试样的细胞悬浮在1 ml冷1 M山梨醇中，将整个转化混合物转移到含有卡那霉素(25 μg/ml)和pen-strep (1:100稀释)的50 ml SDC-AA选择培养基中于30℃生长。移走少量等分试样，铺在SDC-AA板上以测定转化效率。
由流式细胞术筛选小鼠瘦蛋白文库-将在SD-CAA选择培养基中于30℃振荡过夜生长的50 ml体积的转化库(pool)稀释到OD600 = 0.05，在30℃过夜生长到OD600 >1.0。然后接种5 ml体积SG-CAA至OD600约0.5，过夜生长到OD600为3-4。业已阐述用于筛选酵母多肽文库的详细方案(Boder和Wittrup，2000)。简言之，然后用生物素化的hLBD以50 nM浓度于37℃在FACS缓冲液中标记3 x 108个诱导的酵母细胞达1小时。为了检测C-末端c-myc表位标签的表达，在同一次孵育中同时加入单克隆抗体9e10 (以1:100稀释)。然后用冰冷的FACS缓冲液洗涤酵母细胞，在含有2000 nM浓度的过量冷非生物素化的hLBD的FACS缓冲液中于37℃重悬2小时。洗涤细胞，用第二抗体:缀合有R-藻红蛋白(PE)的链霉亲和素(1:50)和缀合有FITC的山羊抗小鼠抗体(1:50)标记1小时。洗涤细胞，通过在Beckton Dickinson FACSAria III细胞分选仪上双色流式细胞分选酵母来筛选，以分离相对于野生型瘦蛋白具改进的与可溶性hLBD结合的克隆。培养收集的酵母细胞并诱导表达。通过流式细胞术进行三轮分选，在每一次分选之间使其重新生长并重新诱导表面表达。在第一轮分选期间检查总共约1x107细胞，收集约5%细胞群。在第二轮分选后，以0.5-1%严格性收集1.6 x 105细胞，在第三轮筛选后，以0.1%严格性收集5000个细胞。冷冻每一文库，按照实验方案保存在-80℃(Chao等，2006)。
DNA分离和测序–在三轮分选后，将收集的细胞铺在选择培养平板上，以分离单个克隆。用Zymoprep试剂盒(Zymo Research)按照厂商方案提取来自40个单克隆的DNA。通过转化到XL-1 Blue细胞(Stratagene )中来扩增DNA。将细胞铺到补充100 μg/ml氨苄西林的选择性LB平板上。让来自这些板的菌落在37℃于LB培养基加100 μg/ml氨苄西林中过夜生长，用Qiagen小量制备试剂盒按照厂商说明分离DNA，测定DNA的序列。
在第三轮筛选后选择的酵母克隆中测定对可溶性人瘦蛋白受体(hLBD)的亲和力-在第三轮筛选后让单个酵母细胞 克隆 和wt小鼠瘦蛋白生长并诱导。用不同浓度(1000、333、111、37、12、4、1.37 nM)的生物素化的hLBD连同抗c-myc Ab和第二荧光Ab，如上所述标记1x106细胞。用Beckton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪获得c-myc阳性酵母的荧光数据。为了计算解离常数Kd，然后用平均荧光强度(MFI)对hLBD浓度作图，用每一待测生物素化的hLBD浓度获得所述MFI，通过Prism软件(Prisma, GraphPad PrismTM，第4.0版: GraphPAD 软件, San Diego,CA)用含双曲线方程的非线性回归(曲线拟合)来分析。
制备编码小鼠瘦蛋白突变蛋白的细菌表达质粒–实施PCR以分别在5'-和3'-末端引入NcoI和HindIII限制性位点，这使得随后能将最好的突变体小鼠瘦蛋白结合剂DNA亚克隆到用NcoI和HindIII线性化的pMON3401 载体中。所用引物对瘦蛋白突变体的5'末端为AAAAAACCATGGCTGTTCCGATCCAGAAAG(SEQ ID NO: 9)，对瘦蛋白突变体3'末端为AAAAAAAAGCTT TCAGCATTCCGGAGAAACGTCC(SEQ ID NO: 10)。用NcoI和HindIII消化pCT302的小鼠瘦蛋白突变蛋白的cDNA，提取并连接到线性化的pMon3401表达载体中。用新表达质粒转化大肠杆菌MON105感受态细胞，铺在含有75 μg/ml大观霉素(spectinomycin)的LB-琼脂平板上用于质粒选择。分离四个大肠杆菌菌落，通过用NcoI/HindIII限制性酶消化来确认含有小鼠瘦蛋白cDNA。所有菌落都为阳性，对其中之一测序。
将L39A/D40A/F41A突变插入到小鼠瘦蛋白突变蛋白–将突变插入到瘦蛋白以制备瘦蛋白拮抗剂的程序如国际申请PCT/IL2005/001250所公开，以如同完全公开一样以其整体通过引用并入本文。为了制备具有拮抗剂活性的瘦蛋白突变体，使用编码6种所选择的小鼠瘦蛋白突变蛋白的pMon3401表达质粒(参见以上部分)作为起始材料。用Stratagene QuickChange诱变试剂盒(La Jolla, CA)按照厂商说明用两种互补引物(表1)修饰瘦蛋白插入物。设计引物以含有碱基变化(以粗体标记)，来获得相应突变，但仍保留合适的氨基酸序列，并且不改变用于菌落筛选的特异性限制性位点(下划线)。程序包括用Pfu聚合酶的18个PCR循环。然后用DpnI限制性酶(其对甲基化及半甲基化的DNA (靶序列：5'-Gm6ATC-3')为特异性的)消化突变的构建体，以消化模板并选择含有合成DNA的突变。用突变的质粒转化XL-1感受态细胞，在5 ml LB培养基中生长，分离质粒。用设计的特异性限制性位点筛选每一突变体的5个菌落的突变，显示至少80%效率。测定每一突变体的两个菌落的序列，确定含有突变但无不想要的错误掺入的核苷酸。然后用质粒转化Mon105感受态细胞并用于表达。
将D23突变体插入到编码小鼠瘦蛋白拮抗剂的质粒–如先前段落所述制备D23A、D23G、D23L、D23R、D23K、D23F和D23W突变体，将编码小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)的pMon3401表达质粒用作起始材料。引物详述于表1。
小鼠瘦蛋白突变蛋白的表达、重折叠和纯化 -当用萘啶酸诱导并再生长4小时后，在2.5-L培养物中表达于N-末端与另外的Met-Ala (通过细菌裂解甲硫氨酸)重组突变的小鼠瘦蛋白。然后如前所述(Gertler等，1998；Salomon等，2006)制备包涵体(IB)并冷冻。随后，将自0.3L细菌培养物获得的包涵体(IB)溶解在含有1 mM半胱氨酸的50 ml的4.5 M尿素、40 mM Tris碱中。用NaOH将溶液的pH调整到11.3。于4℃搅拌2小时后，将3体积的0.67 M Arg加到终浓度0.5 M，再搅拌1.5小时。然后将溶液对10 L 10 mM Tris–HCl, pH 9透析60小时，且更换5或6次外部溶液。将NaCl加到终浓度100 mM，然后将蛋白质溶液以最大流速(400–500 ml/小时)上样到Q-Sepharose柱(5-ml珠体积)，用含有100 mM NaCl的10 mM Tris–HCl, pH 9预平衡。收集含有各自瘦蛋白突变蛋白的穿透流分(breakthrough fraction)，并浓缩为2-3 mg蛋白质/ml。然后将18-ml部分上样到制备性Superdex 75柱(26/60cm)上，用含有300 mM NaCl的25 mM Tris–HCl, pH 9预平衡。合并含有单体蛋白的流分，其如通过在分析性Superdex 75 HR 10/30柱(1/30 cm)上的凝胶过滤所测定，将该流分对NaHCO3透析以确保4:1蛋白质-比-盐的比率并冻干。
制备人强效瘦蛋白拮抗剂 使用与用于制备改良的小鼠瘦蛋白拮抗剂相似的策略制备具改进的瘦蛋白受体结合的人瘦蛋白拮抗剂。所用引物为5'-CAATTGTCACCAGGATTAATCTGATTTCACACACGCAG (修饰的限制性位点=VspI(+))(SEQ ID NO: 29)和3'-CTGCGTGTGTGAAATCAGATTAATCCTGGTGACAATTG (SEQ ID NO: 30)。
大规模纯化小鼠和人瘦蛋白D23L/L39A/D40L/F41A拮抗剂–基本上在先前段落中阐述了该程序，且有以下变化：将自3 L细菌培养物获得的IB溶解在含有1 mM半胱氨酸的400 ml的4.5 M尿素、40 mM Tris碱中。用NaOH将溶液pH调整为11.3。在4℃搅拌48小时后，加入3体积的0.67 M Arg到终浓度0.5 M。然后将溶液对10 L 10 mM Tris–HCl, pH 9透析60小时，且更换5或6次外部溶液。在将蛋白质上样到Q-Sepharose柱(30-ml珠体积)之前加入NaCl直至150 mM。如上所述实施制备性凝胶过滤，接着透析和冻干。按照先前对人L39A/D40A/F41A(HLA)所述方案–(Niv-Spector等，2005)制备命名为SHLA的人瘦蛋白强效拮抗剂(D23L/L39A/D40A/F41A)。
测定纯度和单体含量 -按照Laemmli(1970)在15%聚丙烯酰胺凝胶中在还原和非还原条件下实施SDS–PAGE。用考马斯亮蓝R对凝胶染色。在Superdex 75 HR 10/30柱上用0.2-ml等分试样Q-Sepharose-柱-洗脱的部分用TN缓冲液(25mM Tris–HCl, 300 mM NaCl, pH 8)实施凝胶过滤色谱。
SMLA和SHLA的聚乙二醇化– 在其中N-末端氨基优先聚乙二醇化的条件下将mPEG-丙酰基-ALD 20 kDa用于聚乙二醇化。将150 mg的SMLA或SHLA溶解于111 ml的0.1 M乙酸钠缓冲液(pH 5)中，以12000 rpm离心10分钟，去掉不溶性物质。然后加入0.2 M NaBH3CN (2.7 ml)，让溶解的蛋白质与溶于15 ml 的1 mM HCl 中的1.5 g mPEG-丙酰基-ALD 20 kDa缀合。在4℃搅拌20小时后，加入160 μl乙酸(17 M)。将溶液搅拌几秒，用1 L ddH2O稀释，以最大流速(400–500 ml/小时)上样到用10 mM乙酸钠, pH 4预平衡的SP-Sepharose柱(20-ml珠体积)上。用400 ml的10 mM乙酸钠, pH 4洗涤柱，用含有50和75 mM NaCl的10 mM乙酸钠, pH 5洗脱聚乙二醇化的蛋白质。合并含有聚乙二醇化的蛋白质的流分，其如在分析性Superdex 200柱(10/30 cm)的凝胶过滤所测定，见该流分对NaHCO3透析以确保2:1的蛋白质与盐的比率并冻干。通过在280 nm处的吸光度来测定蛋白质浓度，对于SMLA，用0.200 mg/ml的消光系数(对于0.1%聚乙二醇化蛋白质溶液)，对于SHLA，用0.887的消光系数。这些值适用于聚乙二醇化产物的蛋白质部分。
结合测定 - 在所有竞争性实验中，用生物素化的小鼠瘦蛋白作为配体，用各自小鼠瘦蛋白或小鼠或人瘦蛋白拮抗剂突变蛋白作为竞争物(competitor)。将hLBD用作受体源。在4℃用100 μl的PBS pH 7.4中的40 pM hLBD过夜包被聚苯乙烯96孔微滴板。然后用PBST (含有0.05 %吐温20的PBS)洗涤孔一次，在室温用含有3%脱脂奶的PBS封闭2小时。所有进一步孵育都在室温下进行。用PBST洗涤孔一次，与不同的浓度的未标记的瘦蛋白(50 μl/孔)孵育30分钟，然后将50 μl的62.5 pM生物素化的小鼠瘦蛋白加到各孔中再孵育2小时。然后用PBST洗涤孔3次，与含有1 %吐温20的PBS中的1:30,000链霉亲和素-HRP孵育1小时。随后用PBST洗涤孔3次，用TMB按照厂商说明通过微板读数仪ELISA板读数仪ELx808 – Bio-Tek Instrument Inc.(Winooski, VT, USA)在450 nm定量测定反应物。
BAF/3增殖测定 -将用长形式的hLEPR稳定转染的瘦蛋白-敏感性BAF/3细胞的增殖率，用于评估瘦蛋白和瘦蛋白突变蛋白的激动和拮抗两种活性，其如前所述(Niv-Spector等，2005，Salomon等，2006)。为了测定拮抗活性，将0.05 ng WT同源瘦蛋白加到各孔中，各孔亦含有不同浓度的突变蛋白。将不含瘦蛋白的孔的平均吸光度(阴性对照)用作空白值，从其它吸光度值减去该值得到校正吸光度值。将减去阴性对照后的WT瘦蛋白孔的平均吸光度用作阳性对照，以计算抑制百分比。用Prisma (4.0)非线性回归S形一位点竞争程序(Prisma,GraphPad PrismTM 4.0版；GraphPAD Software, San Diego, CA, U.S.A.)绘制抑制曲线，计算IC50值。应该指出的是，所有哺乳动物瘦蛋白能够将人瘦蛋白受体激活至几乎相同程度(Gertler等，1998；Raver等，2000；Niv-Spector，2005)。
通过激活荧光素酶报告基因测定生物活性- 得自Dr. M. Einat (ARO, Israel)的H-49细胞系是用以下三种构建体如先前所述以4:4:1的比率(Gertler等，2007)稳定转染的HEK-293细胞：phOB-Rb (人瘦蛋白受体的长形式)、pAH32 (荧光素酶报告构建体)和pgkPuro (含有嘌呤霉素抗性基因的表达载体)。用胰蛋白酶短暂离散H-49细胞，重悬在补充10% FCS、50 μg/ml链霉素、50单位/ml青霉素和2 μg/ml嘌呤霉素的DMEM中。将重悬细胞以每孔5 x 105个细胞500 μl终体积铺在24孔组织培养板中。16小时后，用300 μl DMEM更换每孔中的培养基。加入恒定浓度WT小鼠瘦蛋白和不同浓度的小鼠瘦蛋白突变体。在补充0.5% BSA的DMEM中进行稀释。每一浓度使用3个重复，将没有瘦蛋白的一式三份用作阴性对照。在37℃ (CO2/O2 5:95)孵育18小时后，用100 μl裂解缓冲液收获细胞，冷冻在-80℃。让每一细胞裂解物(50 μl)与Promega荧光素酶测定试剂混合，测定荧光素酶活性。将所测的冷光标准化为每孔中的蛋白量。通过Bradford测定按照厂商方案(Bio-Rad, Israel)来测量蛋白质浓度。通过Prizm软件按照非线性回归一位点竞争曲线分析结果。
STAT-3磷酸化抑制–让稳定表达长形式小鼠瘦蛋白受体(ObRb)的CHO细胞在24孔板中生长到80 %汇合，然后在除去血清的培养基中16小时，再用激素刺激。然后让细胞在存在或缺乏各种小鼠瘦蛋白突变体浓度(0.2-12.8 ug/ml)和一种小鼠瘦蛋白WT浓度(0.1 μg/ml)下，在无血清培养基的24孔板中以0.5 ml孵育20分钟。这些处理后，在75 μl冰冷裂解缓冲液中收获细胞。通过以12000 rpm离心10分钟来澄清裂解物，保留上清液用于蛋白质印迹分析。用Bradford测定来测定上清液的蛋白质浓度。在SDS-PAGE中分离(resolve)细胞蛋白质(20 μg)，接着用p-STAT-3 (Tyr705)(目录号9138)和STAT-3 (目录号9132)抗体实施蛋白质印迹。然后，通过增强化学发光(ECL)来显示蛋白质印迹条带。
体内实验 -以6.25 mg/kg/天腹膜内给予雌性C57Bl小鼠聚乙二醇化的小鼠或人瘦蛋白拮抗剂(PEG-MLA或PEG-HLA)或强效PEG-MLA(PEG-SMLA)或人强效PEG-HLA(PEG-SHLA)持续20天。在该时期，每天记录食物摄取和增重，7天平均一次。在第20天，处死每组3只小鼠，测量脂肪含量、肝酶和淋巴细胞亚群。在实验的断绝(weaning)部分，20天后停止处理，记录瘦蛋白缺陷型表型的可逆性。以相似的方式用4剂量的PEG-MLA或PEG-SMLA：20、6.7、2.2和0.72 mg/kg/天进行第二次实验，持续17天。在所有实验中，按照Tel Aviv Sourasky Medical Center的机构动物和护理当局的规章让动物保持12-小时光-暗周期
实施例1. 筛选具有改进的与可溶性人瘦蛋白受体结合的瘦蛋白突变体
(i)酵母细胞表面上的瘦蛋白的功能性表达 小鼠瘦蛋白在酵母细胞表面表达为与酵母表面的Aga2p凝集素亚单位的融合物(Boder和Wittrup KD，1997)。通过流式细胞术免疫荧光标记与Aga2p +瘦蛋白融合物C-末端连接的c-myc表位标签，来测量酵母表面Aga2p +瘦蛋白融合物的表达，这表明c-myc的符合读框的表达(图2A)。c-myc标签的存在表明能够与生物素化的hLBD相互作用的全长瘦蛋白融合物在酵母细胞表面展示。(图2B)，然而，展示不相关的EGFR的阴性对照酵母未显示任何信号(未显示)。此外，两种颜色的标记显示hLBD结合与c-myc表位展示紧密相关(图2C)。
筛选瘦蛋白文库来选择改进与hLBD的结合的克隆 用Stratagene GeneMorph?随机诱变试剂盒构建具5x105个多种多样克隆的瘦蛋白突变体的酵母展示文库。通过3轮流式细胞术分选来筛选该文库，且在每一轮分选之间使其重新生长并重新诱导表面表达，以分离改进与hLBD结合的克隆。通过双色流式细胞术筛选酵母文库的克隆，其既展示瘦蛋白(其通过C-末端c-myc表位标签的间接免疫荧光来测定)又与生物素化的hLBD结合的。筛选方法使用动力学结合筛选，其通过如下进行：用荧光标记的hLBD饱和来标记酵母，接着在过量非荧光hLBD竞争物存在下孵育。在每一轮分选中制备标记的野生型对照培养物，用于帮助设立分选窗口并确认文库富集进展。收集由非生物素化的hLBD竞争掉的展现荧光的细胞用于再生长(参见图3的右组)。对第三轮选择中获得的40种突变体测序(表2)，这导致鉴定13种总共23个氨基酸变化的新的独特序列，所述变化在1-6个氨基酸变化范围内(表2)。在40个克隆的18个中发生的最频繁的突变是D23交换为G、H或N。
(iii)用平衡结合滴定曲线测定亲和力 通过用各种浓度的生物素化的hLBD滴定全细胞，在细胞壁原位测定表面展示的小鼠瘦蛋白突变体的近似亲和力。通过流式细胞术分析在13个独特克隆中的细胞结合的hLBD和c-myc阳性测量平衡结合(在表2中鉴别)。这些数据的非线性回归(曲线拟合)表明，在13个瘦蛋白突变体中有7个(H30、H15、H22、H12、H16、H19和H7)亲和力增加约高达2.3倍，其如图4A-B和表3和4 (分别源自图4A和4B)所显示。选择这7种小鼠瘦蛋白突变体分别用于制备在大肠杆菌中表达的突变瘦蛋白。
实施例2. 制备并表征小鼠瘦蛋白和小鼠瘦蛋白拮抗剂各自6种突变体
由酵母表面展示筛选所选择的7种小鼠瘦蛋白突变体(参见以上及表5)在大肠杆菌中表达、重折叠，并通过连续阴离子交换和凝胶过滤色谱纯化为重组蛋白质，其如材料和方法部分所述。因为在初始实验中H7突变体未显示任何亲和力增加，所以未制备相应的L39A/L40A/F41A突变体。为了获得各6种小鼠瘦蛋白拮抗剂(MLA)，将L39A/D40A/F41A突变插入到全部6种突变体并分别纯化。用SDS-PAGE测定全部13种蛋白质的纯度，发现纯度> 99%，其单体含量超过95% (未显示)。
测定亲和力和生物活性的变化 通过与固定化的hLBD结合来测定全部13种重组突变蛋白(7种激动剂和6种拮抗剂)在结合特性方面的最终变化，并用BAF/3细胞增殖测定和通过激活H-49细胞中的荧光素酶报告基因测定其各自的激动剂活性或拮抗剂活性，其如在材料和方法部分所述。
如表6所显示，最有效的突变蛋白源自荷有突变 D23H的克隆H30。然而，在源自克隆H15、H16和H19的蛋白质中亦发现提高的活性，这三种克隆都将D23突变为Gly，但亦具有表3中所示的另外的突变。与此相反，源自克隆H12的蛋白质未显示亲和力或生物活性提高。只有源自缺乏D23突变但具有唯一一个突变(T12I)的克隆H22的一种蛋白显示适度增加亲和力和生物活性(后者仅在拮抗剂中发现)。
为了检查T12I突变是否可对D23突变具有附加作用，我们制备了MLA的3个双重突变体(T12I/D23H、T12I/D23R和T12I/D23L)，但它们在BAF/3生物测定中的抑制活性和对hLBD的结合亲和力分别都不比D23H或D23R或D23L MLA的高(未显示)。令人惊讶的是，尽管激动剂和拮抗剂结合特性的变化都高度相当，但仅拮抗剂的生物活性升高。
实施例3. MLA中的D23合理诱变为7种变体
鉴于显示单独D23H突变足以最大提高MLA生物活性的先前的结果(参见以上)，通过合理诱变制备了总共7种其中D23被小(G、A)或疏水(L、 F、W)或带正电荷的(K、 R)氨基酸取代的突变质粒，其如材料和方法中所述。
通过连续重折叠、透析、阴离子交换和凝胶过滤色谱将全部7种突变体纯化为重组蛋白质，由SDS-PAGE测定为纯的，并且含有不止98%的单体(图5A-C, 6A和6H)。测定所有这些突变体对hLBD的结合亲和力及其在BAF/3增殖测定中的生物抑制效力。概述于表7中的结果显示，D23L突变导致最高活性。因此，决定在大规模实验中制备该突变体，使其聚乙二醇化并用于体内实验。
小鼠瘦蛋白D23L/L39A/D40L/F41A拮抗剂的大规模纯化和聚乙二醇化 在透析之前于4.5 M尿素中将重折叠从2小时延长到48小时(见材料和方法)，显著改进了D23L/L39A/D40L/F41A小鼠瘦蛋白拮抗剂的单体流分的产量，并且自对应于3 L发酵混合物的IB纯化的蛋白质最终产量为400-500 mg不等。设计为强效MLA (SMLA)的蛋白质通过SDS-PAGE测定的纯度> 99%，并且含有95%以上的单体(见图5A-C和6A中的各种突变体)。其对hLBD的结合亲和力增加64倍，其在BAF/3或H-49细胞生物测定中的体外生物活性增加13.9和13.4倍(见表7和图7A和7C)。在半定量STAT3磷酸化生物测定中亦检测MLA和SMLA的相当的生物活性，显示为后者活性的至少5倍(图8A-B)。通过先前对MLA聚乙二醇化所述方法实施该蛋白质的聚乙二醇化，导致从400 mg非聚乙二醇化的SMLA中以低产率得到55-75 mg不等的聚乙二醇化的蛋白质。
通过SDS-PAGE标准PEG-SMLA的最终制备物是纯的，含有约9 %的双重聚乙二醇化的SMLA、85 %的单聚乙二醇化的SMLA和不到1%的非聚乙二醇化的SMLA (图9A-B)。尽管如图7B和7D中的代表性实验所示，聚乙二醇化的SMLA在H-49细胞中的生物活性和对hLBD的亲和力，与非聚乙二醇化的SMLA的比较，分别降低9-和6.2倍。这些变化与MLA的聚乙二醇化作用相当，其如图7A和7C(分别7和6.3)中及我们最近的出版物(Elinav等，2009b)中所示。
实施例4. 小鼠增重实验
为了评估SMLA的体内活性，将6.25 mg/kg溶媒、聚乙二醇化的-MLA或聚乙二醇化的SMLA腹膜内给予7-周龄雌性C57bl小鼠。如图10所描绘并如先前所发表(Elinav等, 2009)，对照小鼠保持稳定体重(99% ± 0.5)，而PEG-MLA诱导显著增重，在第5天为统计学上显著，达到121% ± 1.4的水平，在处理8天后稳定。相比之下，PEG-SMLA诱导增重在第17天最高点为143.4% ± 3.15 (平均值± SEM)，此后稳定下来。PEG-MLA和PEG-SMLA之间的增重差异从第6天及此后统计学显著。增重由食物消耗差异来介导，与聚乙二醇化的-MLA (3.17 ± 0.56 g/d/小鼠)和对照小鼠(2.54 ± 0.14 g/d/小鼠, P<0.01)比较，在聚乙二醇化的-SMLA处理的小鼠(4.02 ± 0.17 g/d/小鼠)中的食物消耗显著较高。在整个实验中，小鼠看起来健康活泼，没有明显的压力迹象。在第20天，处死每组的3只小鼠。将每组中剩余小鼠移出处理，观察增重的消退(resolution)。在接下来的17天，(图10)小鼠重量急剧降低。在针对PEG-MLA和PEG-SMLA的剂量相关比较的另外实验中，比较了两种蛋白质的几种每日剂量(20、6.7、2.2和0.73 mg/kg)。结果提供在图11中。在全部4种浓度中，由PEG-SMLA诱导的增重显著高于PEG-MLA的各自作用。通过PEG-SMLA在20和6.7 mg/kg时获得最大的几乎等同的作用(45%增重)。在2.2 mg/天的PEG-SMLA时作用较低，但仍高于20 mg/kg的PEG-MLA，这表明为前者效力的至少10倍。有趣的是，在长达11天时间两种处理得到相当的结果，但此后PEG-MLA的作用趋向平稳，而用PEG-SMLA处理的小鼠继续增重直到第16天差异显著化(P<0.05)。在第7-11天，最低剂量的PEG-SMLA (0.72 mg/kg)诱导的增重比20 mg/kg PEG-MLA的显著较低，但在第15和16天达到同样值。这表明PEG-SMLA的实际功效为PEG-MLA的高达27倍。
表8. 每日注射PEG-MLA或PEG-SMLA的小鼠的平均食物和水摄取。两种材料都每日以20、6.7、2.2和0.72 mg/kg注射17天。结果为平均值± SEM，n = 8。
增重和食物摄取之间有强烈相关性，其如表8所显示。与此相反，水摄取几乎没有差异，这证实瘦蛋白拮抗剂对食欲而不是对口渴调节途径有特异性作用。
实施例5. 制备并表征提高对瘦蛋白受体的亲和力的人和羊瘦蛋白拮抗剂(HLA)
为了确证不仅仅是在MLA中而且还在类似的瘦蛋白拮抗剂中，D23L突变提高瘦蛋白拮抗剂对瘦蛋白受体的亲和力和随后的生物活性，通过合理诱变制备了相应的突变体(D23L/L39A/D40A/F41A)，在大肠杆菌中大规模表达，纯化到同质，命名为SHLA (人)或SOLA (绵羊)。纯化的蛋白质为纯的，如通过SDS-PAGE在还原性和非还原性条件下所测定的，并且在凝胶过滤实验中出现> 98%的单体(未显示)。为了促进在体内实验中对SHLA和SOLA的利用，与SMLA相似(参见以上)使它们聚乙二醇化，并分别命名为PEG-SHLA和PEG-SOLA。按照先前对MLA、SMLA及其聚乙二醇化的衍生物所述的方法，测定SHLA、PEG-SHLA、SOLA和PEG-SOLA的结合和抑制活性(对人蛋白见图12；绵羊蛋白质的结果未显示)。如(图12A)所显示，SMLA和SHLA表现出比HLA> 9倍的相同的生物活性。该结果在另一实验中得到确认，在PEG-SHLA与PEG-HLA比较中亦观察到相似的相对活性增加(图12B)。图12C和图12D显示，由于D23L突变的生物活性增加源于对固定化hLBD的亲和力的急剧(44倍和80倍)增加。
在初始体内增重实验中，在小鼠中比较PEG-MLA和PEG-HLA (12.5 mg/kg/天，持续2周)，二者都显示相同的增重作用(未显示)。因此，为了确证D23L突变的作用，用PEG-SHLA和PEG-SMLA进行了相似的比较性体内实验。结果呈现在图13A-B中，显示两种物质都表现出相似的增重作用。
实施例6. 强效瘦蛋白拮抗剂通过抑制浸润单核巨噬细胞诱导免于先天炎症的防护
将PEG-SMLA (20mg/kg)或PEG-瘦蛋白(0.4mg/kg)腹膜内给予雌性C57bl小鼠达4天。接着经由给予脂多糖(10ug/kg)和D-半乳糖胺(600mg/kg)诱导先天性肝炎，这是通过经浸润激活先天免疫反应和单核巨噬细胞分泌TNF-a来诱导肝炎的已知模型。如图15A所描绘，与溶媒处理小鼠比较，给予PEG-瘦蛋白导致显著提高死亡率。与此相反，给予PEG-SMLA产生显著保护，其由提高小鼠存活来显现。
为测定瘦蛋白对效应(effector)浸润巨噬细胞的拮抗作用(图15B)，测定了溶媒、瘦蛋白拮抗剂和瘦蛋白-激动剂-处理的小鼠中的肝炎CD45+CD11b+CD11-F4/80+浸润(图15B, P4门(gate))群和驻留(图15B，P5门)巨噬细胞群。如图15B的下组所见，与溶媒处理小鼠比较，瘦蛋白拮抗剂介导的保护作用伴随炎症诱导的肝-浸润巨噬细胞群的急剧减少。在用PEG-瘦蛋白处理的小鼠中注意到相反的表型，其中与溶媒处理小鼠比较，瘦蛋白-激动剂-处理的小鼠的肝巨噬细胞浸润增强。
重要的是，即使在诱导先天炎症前的稳态(图15B，上组)时，与未处理的小鼠比较，强效瘦蛋白拮抗剂-处理的小鼠中的浸润巨噬细胞的降低也显著较低。在瘦蛋白激动剂-处理的小鼠的稳态中亦观察到相反的表型，其特征为已在稳态期间扩大了巨噬细胞渗透。
总而言之，这些结果显示在先天免疫介导的炎症中强效瘦蛋白拮抗剂的明显保护性结果，其通过抑制单核巨噬细胞浸润到发炎器官来介导。
实施例7. 小鼠的胰岛素-抗性和II型糖尿病模型
聚乙二醇化的瘦蛋白拮抗剂(PEG-MLA)和甚至更多拮抗剂(PEG-SMLA)对雄性和雌性小鼠二者都诱导极强的开胃作用，这导致极快速的(高达40-50%)增重，所述增重主要来自脂肪累积(图13A)。在停止PEG-MLA或PEG-SMLA注射时，可逆转这种增重。在另一实验中，用PEG-MLA (20 mg/kg/天)注射21天的雄性小鼠(n=16)逐渐发展胰岛素抗性，与对照比较，其胰岛素水平和稳态模型评估(HOMA)记分差异显著(p<0.05)。HOMA是用于量化胰岛素抗性和β细胞功能的方法。在较长期的实验(长达60天)中，亦观察到血糖、血液甘油三酯和总胆固醇的显著增加-这是出现前糖尿病代谢综合征的指证。然而，长达2个月的处理未导致肝损伤，其由血液中肝酶水平所证明。
在短期代谢实验中，让适应代谢室的雄性小鼠接受PEG-SMLA (5 mg/kg/天)或溶媒的早上皮下注射。这些注射在24小时后重复，在代谢室中研究小鼠48小时，其从第一次注射开始，在第二次注射后24小时结束。在第二次24小时结束时，比接受溶媒的小鼠重3 g (p<0.05)的接受SMLA的小鼠，在RQ的增加上与脂肪量的保留(p<0.05)及活性的降低(p<0.05)一致。
总之，这种与高血糖、高血脂和胰岛素抗性有关的可逆的瘦蛋白拮抗剂-诱导的肥胖症，可用作小鼠中2型糖尿病的快速可逆模型。可通过注射PEG-SMLA或通过产生条件性表达编码SMLA的DNA序列的转基因小鼠，来获得所述模型。
用于产生转基因小鼠的方法为常识，可选择任何合适的方法用于产生本发明转基因小鼠，例如按照以下步骤：
制备用于微注射或电穿孔的DNA
1)在琼脂糖凝胶上分离DNA消化物：一旦泳动完成，就用相当低浓度的EtBr染色凝胶。当完成染色后，用长波UV使凝胶显现，切下感兴趣的条带。
2)用例如GeneClean旋转柱(BIO 101'S GeneClean Spinkit)纯化DNA片段。
3)沉淀DNA，重新悬浮在合适溶剂中。
原核注射
1)生产用于注射的卵：为了获得大量(>250)卵用于注射，通过用连续的怀孕母马血清(PMS)和绒毛膜促性激素(HCG)注射来使没有性成熟的FVB/N雌性超数排卵。在HCG注射后立即让雌性与雄性种马交配。
2)收获卵：第二天从交配的雌性输卵管壶腹部收获卵。用透明质酸酶处理卵以去掉营养细胞，然后洗涤。
3)注射卵：在注射时从培养箱取出30-50个卵。在高倍放大下在当天给每一个卵分别注射DNA片段。当注射了该群中的每一个卵时，将所有卵放回培养箱。重复该程序直到注射了所有卵。在注射结束时，从每一组去掉未存活的注射卵。
4)移植卵：然后将注射的卵以10-15个双侧移植到假孕雌性(与切除输精管的雄性交配过的雌性)的输卵管。让动物在温热板上从麻醉中恢复，然后放回到动物房。整个怀孕期让它们保持在无菌条件下。
用于基因组DNA印迹分析的尾巴DNA制备：
1)消化尾夹(tail clip)：切下约50-100 mg的尾巴到eppendorf管中，用蛋白酶消化。
2)用苯酚/氯仿分离DNA，在乙醇中漂洗。
3)用合适的限制性酶切割DNA，实施DNA印迹。
交配方案
1)确定你小鼠的年龄：最小生殖年龄：雄性35-42天；雌性21天。第一次生殖最大年龄：雄性和雌性都为6个月。
2)为了繁殖，让雌性进入雄性笼。反转该次序可导致雄性杀死雌性(或在偶然情况下，雌性杀死雄性)。如果不可能让雌性进入雄性笼，使用干净的笼，让雄性先进入该笼。如果在预期交配前的一个星期完成这一点，这将使得雄性可标记其领域，信息素(pheremone)水平上升，这将有助于繁殖过程。
以上方案为一实例。其它实例和更详细资料可参见例如，“Transgenic animal technology: a laboratory handbook, 第2版(Carl A. Pinkert,编辑, Gulf Professional Publishing, 2002)，其全部在此并入。
参考文献
Bluher S, Shah S, Mantzoros CS (2009) Leptin deficiency: clinical implications and opportunities for therapeutic interventions (瘦蛋白缺陷：临床含义和用于治疗介入的机会). J. Investig Med 57:784-8
Boder ET, Wittrup KD (1997) Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries (用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示). Nat Biotechnol 15:553-7
Boder ET, Wittrup KD (2000) Yeast surface display for directed evolution of protein expression, affinity, and stability (用于蛋白质表达、亲和力和稳定性的定向进化的酵母表面展示). Methods Enzymol 328:430-44
Chao G, Lau WL, Hackel BJ, Sazinsky SL, Lippow SM, Wittrup KD (2006) Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display (用酵母表面展示分离及工程改造人抗体). Nat Protoc 1:755-68
Choi JH, Choi KC, Auersperg N, Leung PC (2004) Overexpression of follicle-stimulating hormone receptor activates oncogenic pathways in preneoplastic ovarian surface epithelial cells (在肿瘤前的卵巢表面上皮细胞过表达卵泡刺激激素受体激活致瘤途径). J Clin Endocrinol Metab 89:5508-16
Chong AY, Lupsa BC, Cochran EK, Gorden P.(2010)Efficacy of leptin therapy in the different forms of human lipodystrophy (人脂肪营养不良的不同形式中瘦蛋白治疗的功效) Diabetologia. 53:27-35
Elinav E, Ali M, Bruck R, Brazowski E, Phillips A, Shapira Y, Katz M, Solomon G, Halpern Z, Gertler A (2009a) Competitive inhibition of leptin signaling results in amelioration of liver fibrosis through modulation of stellate cell function (竞争性抑制瘦蛋白信号转导导致通过调节星细胞功能改善肝纤维化). Hepatology 49:278-86
Elinav E, Gertler A (2009) Use of leptin antagonists as anti-inflammatory and anti-fibrotic reagents (瘦蛋白拮抗剂作为抗炎剂和抗纤维化试剂的用途). 载于：Gertler A(编辑)Leptin and leptin antagonists. Landes Bioscience, 第133-140页
Elinav E, Niv-Spector L, Katz M, Price TO, Ali M, Yacobovitz M, Solomon G, Reicher S, Lynch JL, Halpern Z, Banks WA, Gertler A (2009) Pegylated leptin antagonist is a potent orexigenic agent: preparation and mechanism of activity (聚乙二醇化的瘦蛋白拮抗剂是有效的开胃剂：制备及活性机制). Endocrinology 150:3083-91
Frankenberry KA, Skinner H, Somasundar P, McFadden DW, Vona-Davis LC (2006) Leptin receptor expression and cell signaling in breast cancer (乳腺癌中的瘦蛋白受体表达和细胞信号转导). Int J Oncol 28:985-93
Gertler A, Niv-Spector L, Reicher S (2007) Is leptin an important physiological regulator of CRP? (瘦蛋白是CRP的重要生理调节剂吗)? Nat Med 13:18-9；author reply 19-21
Gertler A, Simmons J, Keisler DH (1998) Large-scale preparation of biologically active recombinant ovine obese protein(leptin) (大规模制备生物活性的重组绵羊肥胖蛋白质(瘦蛋白)). FEBS Lett 422:137-40
Iserentant H, Peelman F, Defeau D, Vandekerckhove J, Zabeau L, Tavernier J (2005) Mapping of the interface between leptin and the leptin receptor CRH2 domain (绘制瘦蛋白和瘦蛋白受体CRH2结构域间的界面图谱). J Cell Sci 118:2519-27
La Cava A, Matarese G (2004) The weight of leptin in immunity (瘦蛋白在免疫学中的重要性). Nat Rev Immunol 4:371-9
Laemmli UK (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 (在装配噬菌体T4头部期间结构蛋白的裂解). Nature 227:680-5
Lowman HB, Wells JA (1993) Affinity maturation of human growth hormone by monovalent phage display (由单价噬菌体展示人生长激素的亲和力成熟). J Mol Biol 234:564-78
Matarese G, Moschos S, Mantzoros CS (2005) Leptin in immunology (免疫学中的瘦蛋白). J Immunol 174:3137-42
Meilhoc E, Masson JM, Teissie J (1990) High efficiency transformation of intact yeast cells by electric field pulses (通过电场脉冲高效转化完整的酵母细胞). Biotechnology(N Y)8:223-7
Niv-Spector L, Gonen-Berger D, Gourdou I, Biener E, Gussakovsky EE, Benomar Y, Ramanujan KV, Taouis M, Herman B, Callebaut I, Djiane J, Gertler A (2005) Identification of the hydrophobic strand in the A-B loop of leptin as major binding site III: implications for large-scale preparation of potent recombinant human and ovine leptin antagonists (鉴别作为主要结合位点III的瘦蛋白A-B环中的疏水链：大规模制备有效的重组人和绵羊瘦蛋白拮抗剂的意义). Biochem J 391:221-30
Ozcan L, Ergin AS, Lu A, Chung J, Sarkar S, Nie D, Myers MG Jr, Ozcan U Endoplasmic reticulum stress plays a central role in development of leptin resistance (内质网应激在发展瘦蛋白抗性中起主要作用). 2009 Cell Metab. 9:35-51.
Pearce KH, Jr., Cunningham BC, Fuh G, Teeri T, Wells JA (1999) Growth hormone binding affinity for its receptor surpasses the requirements for cellular activity (生长激素对其受体的结合亲和力超过了细胞活性的需要). Biochemistry 38:81-9
Peelman F, Iserentant H, De Smet AS, Vandekerckhove J, Zabeau L, Tavernier J (2006) Mapping of binding site III in the leptin receptor and modeling of a hexameric leptin.leptin receptor complex (绘制对瘦蛋白受体的结合位点III的图谱并为六聚体瘦蛋白.瘦蛋白受体复合物建模). J Biol Chem 281:15496-504
Peelman F, Van Beneden K, Zabeau L, Iserentant H, Ulrichts P, Defeau D, Verhee A, Catteeuw D, Elewaut D, Tavernier J (2004) Mapping of the leptin binding sites and design of a leptin antagonist (绘制瘦蛋白结合位点图谱并设计瘦蛋白拮抗剂). J Biol Chem 279:41038-46
Peelman F, Iserentant H, Eyckerman S, Zabeau L, Tavernier J.(2005)Leptin, immune responses and autoimmune disease. Perspectives on the use of leptin antagonists (瘦蛋白、免疫反应和自身免疫病，利用瘦蛋白拮抗剂的前景). Curr Pharm Des. 11:539-48. Review.
Raver N, Gussakovsky EE, Keisler DH, Krishna R, Mistry J, Gertler A (2000) Preparation of recombinant bovine, porcine, and porcine W4R/R5K leptins and comparison of their activity and immunoreactivity with ovine, chicken, and human leptins (重组牛、猪和猪W4R/R5K瘦蛋白的制备及其与绵羊、鸡和人瘦蛋白的活性和免疫活性的比较). Protein Expr Purif 19:30-40
Raymond CK, Pownder TA, Sexson SL (1999) General method for plasmid construction using homologous recombination (用同源重组构建质粒的通用方法). Biotechniques 26:134-8, 140-1
Salomon G, Niv-Spector L, Gussakovsky EE, Gertler A (2006) Large-scale preparation of biologically active mouse and rat leptins and their L39A/D40A/F41A muteins which act as potent antagonists (生物学活跃的小鼠和大鼠瘦蛋白及其作为有效拮抗剂起作用的L39A/D40A/F41A突变蛋白的大规模制备). Protein Expr Purif 47:128-36
Sandowski Y, Raver N, Gussakovsky EE, Shochat S, Dym O, Livnah O, Rubinstein M, Krishna R, Gertler A (2002) Subcloning, expression, purification, and characterization of recombinant human leptin-binding domain (重组人瘦蛋白-结合结构域的亚克隆、表达、纯化和表征). J Biol Chem 277:46304-9
Somasundar P, Frankenberry KA, Skinner H, Vedula G, McFadden DW, Riggs D, Jackson B, Vangilder R, Hileman SM, Vona-Davis LC (2004) Prostate cancer cell proliferation is influenced by leptin (通过瘦蛋白影响前列腺癌细胞增殖). J Surg Res 118:71-82
Turek VF, Trevaskis JL, Levin BE, Dunn-Meynell AA, Irani B, Gu G, Wittmer C, Griffin PS, Vu C, Parkes DG, Roth JD (2010) Mechanisms of amylin/leptin synergy in rodent models (在啮齿动物模型中糊精/瘦蛋白协同作用的机理). Endocrinology 151:143-52
Wang MY, Chen L, Clark GO, Lee Y, Stevens RD, Ilkayeva OR, Wenner BR, Bain JR, Charron MJ, Newgard CB, Unger RH. Leptin therapy in insulin-deficient type I diabetes (在胰岛素-缺陷的I型糖尿病中的瘦蛋白治疗). 2010 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107: 4813–9.
Zabeau L, Lavens D, Peelman F, Eyckerman S, Vandekerckhove J, Tavernier J. 2003 FEBS Lett. 546: 45–50
Zhang F, Basinski MB, Beals JM, Briggs SL, Churgay LM, Clawson DK, DiMarchi RD, Furman TC, Hale JE, Hsiung HM, Schoner BE, Smith DP, Zhang XY, Wery JP, Schevitz RW (1997) Crystal structure of the obese protein leptin-E100 (肥胖蛋白瘦蛋白-E100的晶体结构). Nature 387:206-9.
Claims (35)
1.一种合成的瘦蛋白拮抗剂，其包含：
(a)经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中：
(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，以便所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，使得所述位点的疏水性变弱，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽为瘦蛋白拮抗剂；和
(ii)对应于野生型人瘦蛋白23位位置的天冬氨酸(D23)被不带负电荷的不同氨基酸残基取代，或对应于野生型人瘦蛋白12位位置的苏氨酸(T12)被疏水的不同氨基酸残基取代；
(b)所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽(a)的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或
(c)(a)或(b)的药学上可接受的盐。
2.权利要求1的合成瘦蛋白拮抗剂，其中D23被疏水或带正电荷的氨基酸残基取代。
3.权利要求2的合成瘦蛋白拮抗剂，其中所述疏水氨基酸残基选自亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、色氨酸、组氨酸或苯丙氨酸；和所述带正电荷的氨基酸残基选自精氨酸或赖氨酸。
4.权利要求3的合成瘦蛋白拮抗剂，其中D23被亮氨酸取代。
5.权利要求2的合成瘦蛋白拮抗剂，其中另外的氨基酸残基被如下取代：
(a)对应于野生型人瘦蛋白68位位置的亮氨酸(L68)被甲硫氨酸取代，对应于野生型人瘦蛋白97位位置的丝氨酸(S97)被苯丙组氨酸取代，和对应于野生型人瘦蛋白132位位置的丝氨酸(S132)被酪氨酸取代；
(b)对应于野生型人瘦蛋白112位位置的甘氨酸(G112)被丝氨酸取代；或
(c)对应于野生型人瘦蛋白37位位置的苏氨酸(T37)被丙氨酸取代,和对应于野生型人瘦蛋白44位位置的甘氨酸(G44)被天冬氨酸取代。
6.权利要求1的合成瘦蛋白拮抗剂，其中T12被异亮氨酸取代。
7.权利要求1的合成瘦蛋白拮抗剂，其中(i)中所述的2-4个氨基酸残基被选自丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸取代。
8.权利要求7的合成瘦蛋白拮抗剂，其中所述氨基酸残基为丙氨酸。
9.权利要求8的合成瘦蛋白拮抗剂，其中4个氨基酸残基中3个被丙氨酸取代。
10.权利要求1-9中任一项的合成瘦蛋白拮抗剂，其中：
(i)修饰对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，以使对应于39位位置的亮氨酸被丙氨酸取代；对应于40位位置的天冬氨酸被丙氨酸取代；和对应于41位位置的苯丙氨酸被丙氨酸取代；和
(ii) D23被亮氨酸取代。
11.权利要求10的合成瘦蛋白拮抗剂，其由具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽组成。
12.权利要求1的合成瘦蛋白拮抗剂，其中所述哺乳动物瘦蛋白多肽为人、绵羊或小鼠瘦蛋白。
13.权利要求1的合成瘦蛋白拮抗剂，其以如下亲和力与瘦蛋白受体结合：所述亲和力为所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白的高达100倍、90倍、80倍、70倍、50倍、30倍或20倍，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白仅在对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点修饰，以使所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，使得所述位点的疏水性变弱。
14.呈聚乙二醇化形式的权利要求1或11的合成瘦蛋白拮抗剂。
15.由具有SEQ ID NO: 1氨基酸序列的多肽或其药学上可接受的盐组成的合成瘦蛋白拮抗剂。
16.呈聚乙二醇化形式的权利要求15的合成瘦蛋白拮抗剂。
17.编码权利要求1或11的合成瘦蛋白拮抗剂的分离的DNA分子。
18.编码权利要求15的合成瘦蛋白拮抗剂的分离的DNA分子。
19.权利要求18的分离的DNA分子，其具有SEQ ID NO: 4的DNA序列。
20.包含权利要求1或11的合成瘦蛋白拮抗剂及药学上可接受载体的药物组合物。
21.包含权利要求15或16的合成瘦蛋白拮抗剂及药学上可接受载体的药物组合物。
22.权利要求20的药物组合物，其包含呈聚乙二醇化形式的合成瘦蛋白拮抗剂。
23.一种合成瘦蛋白激动剂，其包含：
(a)经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12；
(b)所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽(a)的片段，其中用不带负电荷的不同氨基酸残基取代D23，或用疏水的不同氨基酸残基取代T12，其中所述片段本身为瘦蛋白激动剂；或
(c) (a)或(b)的药学上可接受的盐。
24.呈聚乙二醇化的权利要求23的合成瘦蛋白激动剂。
25.一种分离的DNA分子，其编码权利要求23的合成瘦蛋白激动剂。
26.一种药物组合物，其包含权利要求23或24的合成瘦蛋白激动剂及药学上可接受载体。
27.一种用于治疗选自以下的疾病或病况的方法：代谢综合征、非酒精性脂肪性肝炎、动脉粥样硬化、II型糖尿病、厌食症、恶病质、癌症，和自发性炎性疾病和自身免疫病例如多发性硬化症、炎性肠综合征或类风湿性关节炎，所述方法包括给予有需要的患者有效量的权利要求15或16的合成瘦蛋白拮抗剂。
28.一种用于治疗选自以下的其中涉及异常瘦蛋白信号转导或促进血管生成的疾病或病况的方法：肥胖症、食欲过盛相关综合征、I型糖尿病、代谢综合征和动脉粥样硬化，所述方法包括给予有需要的患者权利要求23或24的合成瘦蛋白激动剂。
29.权利要求28的用于治疗肥胖症的方法，所述方法进一步包括给予所述患者诸如SYMLIN (乙酸普兰林肽)等糊精类似物或诸如苯丁酸钠制剂(4-PBA)或牛磺脱氧胆酸(TUDCA)等化学蛋白伴侣。
30.权利要求28的用于治疗I型糖尿病的方法，其进一步包括给予所述患者胰岛素。
31.一种转基因小鼠，其基因组包含与诱导型启动子可操作地连接的包含权利要求17或18的DNA分子的基因。
32.权利要求13的转基因小鼠，其中所述DNA分子具有SEQ ID NO: 4的DNA序列。
33.一种转基因小鼠，其基因组包含这样的基因，所述基因包含编码合成瘦蛋白拮抗剂的DNA分子，所述合成的瘦蛋白拮抗剂包含：
(a)经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽，其中修饰所述对应于野生型人瘦蛋白39-42位位置的LDFI疏水结合位点，以便来自所述疏水结合位点的2-4个氨基酸残基被不同的氨基酸残基取代，使得使所述位点的疏水性变弱，所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽为瘦蛋白拮抗剂；
(b)所述经修饰的哺乳动物瘦蛋白多肽(a)的片段，其中所述片段本身为瘦蛋白拮抗剂；或
(c) (a)或(b)的药学上可接受的盐。
34.权利要求31或33的转基因小鼠，其表现出胰岛素抗性和增加的血液胰岛素和血糖水平。
35.一种筛选对于选自高血糖、高血脂、2型糖尿病和胰岛素抗性的疾病或病症具有治疗活性的物质的方法，所述方法包括以下步骤：(1)将测试物质给予权利要求34的转基因小鼠；(2)确证所述转基因小鼠中的所述疾病或病症是否受到抑制；和(3)当在所述转基因小鼠中抑制所述疾病或病症时，选择所述测试物质作为对于所述疾病或病症具有治疗活性的物质。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
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Families Citing this family (12)
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|---|---|---|---|---|
| WO2014024189A1 (en) * | 2012-08-06 | 2014-02-13 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd | Pegylated high affinity leptins with increased biological activity |
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| CN104829708B (zh) * | 2015-05-06 | 2017-11-28 | 广东省生物资源应用研究所 | 一条d螺旋区突变的瘦素活性肽及其编码基因和应用 |
| CN104829707B (zh) * | 2015-05-06 | 2017-12-19 | 广东省生物资源应用研究所 | 一条cd环和e螺旋区突变的瘦素活性肽及其编码基因和应用 |
| WO2017013270A1 (en) | 2015-07-23 | 2017-01-26 | Universite De Strasbourg | Use of leptin signaling inhibitor for protecting kidneys from patients having ciliopathy |
| US20200069774A1 (en) * | 2016-12-06 | 2020-03-05 | St Vincent's Hospital Sydney Limited | Treatment of obesity and eating disorders |
| JP2023522921A (ja) * | 2020-04-21 | 2023-06-01 | リモデレス シーヴイ リミテッド | 肺組織に対する急性損傷のための新規治療法 |
| WO2024050285A2 (en) * | 2022-08-31 | 2024-03-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Leptin analogs for treating obesity and weight management |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101189335A (zh) * | 2004-11-26 | 2008-05-28 | 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展公司 | 瘦素拮抗剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7407929B2 (en) * | 2004-05-07 | 2008-08-05 | Boston Biomedical Research Institute | Leptin peptide antagonists |
-
2011
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| MICHAL SHPILMAN ET AL.: "Development and characterization of high-affinity leptins and leptin antagonists", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》, 30 November 2010 (2010-11-30) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105705641A (zh) * | 2013-07-18 | 2016-06-22 | 弗拉芒区生物技术研究所 | 涉及具有强烈降低的受体结合亲和力的细胞因子的融合因子 |
| CN110548037A (zh) * | 2019-09-24 | 2019-12-10 | 江西天元药业有限公司 | 精制熊胆粉及其增强体质治疗和预防肿瘤和癌症的用途 |
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