JP2008511297A - ICA512はβ−細胞におけるインスリン分泌および遺伝子発現に関与する - Google Patents
ICA512はβ−細胞におけるインスリン分泌および遺伝子発現に関与する Download PDFInfo
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Abstract
【選択図】なし
Description
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型の存在または活性;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性;
を、ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロン中で促進する工程を含む、前記方法sに関する。さらに、本発明は、ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンの細胞増殖を促進する方法であって:
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型の存在または活性;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性;
を、ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロン中で促進する工程を含む、前記方法に関する。本発明にしたがって、前記内分泌細胞はβ-細胞であり、そして前記ペプチドホルモンはインスリンであることが好ましい。本発明のさらなる態様は、添付する特許請求の範囲に記載される。
ADM前駆体、アグーチスイッチタンパク質前駆体、アグーチ-関連タンパク質前駆体、アペリン前駆体、心房性ナトリウム利尿因子、β-ネオエンドルフィン-ダイノルフィン前駆体、脳ナトリウム利尿ペプチド前駆体、カルシトニン遺伝子-関連ペプチドI前駆体、カルシトニン遺伝子-関連ペプチドII前駆体、カルシトニン前駆体、コレシストキニン前駆体、クロモグラニンA前駆体、コカイン-調節型転写物およびアンフェタミン-調節型転写物タンパク質前駆体、コルチコリベリン前駆体、コルチコトロピン-リポトロピン前駆体、コルチスタチン前駆体、FMRFアミド-関連ペプチド前駆体、FMRFアミド-関連ペプチド前駆体、フォリスタチン前駆体、フォリトロピンβ鎖前駆体、ガラニン前駆体、ガラニン-様ペプチド前駆体、胃抑制ポリペプチド前駆体、ガストリン前駆体、ガストリン-放出ペプチド前駆体、グレリン前駆体、グルカゴン前駆体、糖タンパク質ホルモンα鎖前駆体、成長ホルモン変異体前駆体、インスリン前駆体、インスリン-様成長因子結合タンパク質3前駆体、インスリン-様ペプチドINSL6前駆体、膵島アミロイドポリペプチド前駆体、ライディッヒインスリン-様ペプチド前駆体、形態形成ニューロペプチド、モチリン前駆体、ニューレキソフィリン2前駆体、ニューレキソフィリン3前駆体、ニューレキソフィリン4前駆体、神経内分泌タンパク質7B2前駆体、ニューロキニンB前駆体、ニューロメジンB-32前駆体、ニューロメジンU-25前駆体、ニューロペプチドB前駆体、ニューロペプチドW前駆体、ニューロペプチドY前駆体、ニューロテンシン前駆体、ノシセプチン前駆体、オレキシン前駆体、オキシトシン- ニューロフィジン1前駆体、膵臓ホルモン前駆体、副甲状腺ホルモン前駆体、副甲状腺ホルモン-関連タンパク質前駆体、ペプチドYY前駆体、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド前駆体、プロエンケファリンA前駆体、プロゴナドリベリンI前駆体、プロゴナドリベリンII前駆体、プロキネチシン2前駆体、プロラクチン前駆体、プロ-MCH前駆体、プロリラキシンH1前駆体、プロタキキニン1前駆体、タンパク質-チロシンホスファターゼ-様N前駆体、受容体型タンパク質-チロシンホスファターゼN2前駆体、調節型内分泌特異的タンパク質18前駆体、レジスチン前駆体、レジスチン-様β前駆体、セクレチン前駆体、セクレトリグラニンI前駆体、セクレトリグラニンII前駆体、セクレトリグラニンIII前駆体、ソマトリベリン前駆体、ソマトスタチン前駆体、ソマトトロピン前駆体、スタニオカルシン1前駆体、スタニオカルシン2前駆体、ウロコルチンII前駆体、ウロコルチン前駆体、血管作動性ペプチド前駆体、バソプレッシン-ニューロフィジン2-コペプチン前駆体
の一つに由来するペプチドホルモンまたはニューロペプチドである。
1)グルカゴン前駆体(P01275)
MKSIYFVAGL FVMLVQGSWQ RSLQDTEEKS RSFSASQADP LSDPDQMNED KRHSQGTFTS DYSKYLDSRR AQDFVQWLMN TKRNRNNIAK RHDEFERHAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGRGRR DFPEEVAIVE ELGRRHADGS FSDEMNTILD NLAARDFINW LIQTKITDRK
誘導ペプチド:
a)Glicentin-関連ポリペプチド(残基21-50):RSLQDTEEKS RSFSASQADP LSDPDQMNED
b)グルカゴン(残基53-81):HSQGTFTS DYSKYLDSRR AQDFVQWLMN T
c)グルカゴン-様ペプチド1 (残基98-127):HAE GTFTSDVSSY LEGQAAKEFI AWLVKGR
d)グルカゴン-様ペプチド2 (残基146-178):HADGS FSDEMNTILD NLAARDFINW LIQTKITD
2)コルチコリベリン前駆体(P06850)
MRLPLLVSAG VLLVALLPCP PCRALLSRGP VPGARQAPQH PQPLDFFQPP PQSEQPQQPQ ARPVLLRMGE EYFLRLGNLN KSPAAPLSPA SSLLAGGSGS RPSPEQATAN FFRVLLQQLL LPRRSLDSPA ALAERGARNA LGGHQEAPER ERRSEEPPIS LDLTFHLLRE VLEMARAEQL AQQAHSNRKL MEIIGK
誘導ペプチド:
a)コルチコリベリン(残基154-194):SEEPPIS LDLTFHLLRE VLEMARAEQL AQQAHSNRKL MEII
3)コルチコトロピン-リポトロピン前駆体(P01189)
MPRSCCSRSG ALLLALLLQA SMEVRGWCLE SSQCQDLTTE SNLLECIRAC KPDLSAETPM FPGNGDEQPL TENPRKYVMG HFRWDRFGRR NSSSSGSSGA GQKREDVSAG EDCGPLPEGG PEPRSDGAKP GPREGKRSYS MEHFRWGKPV GKKRRPVKVY PNGAEDESAE AFPLEFKREL TGQRLREGDG PDGPADDGAG AQADLEHSLL VAAEKKDEGP YRMEHFRWGS PPKDKRYGGF MTSEKSQTPL VTLFKNAIIK NAYKKGE
誘導ペプチド:
a)NPP(残基27-102):WCLE SSQCQDLTTE SNLLECIRAC KPDLSAETPM FPGNGDEQPL TENPRKYVMG HFRWDRFGRR NSSSSGSSGA GQ
b)メラノトロピンγ(残基77-87):YVMG HFRWDRF
c)メラノトロピンα(残基138-150):SYS MEHFRWGKPV
d)コルチコトロピン(残基138-176):SYS MEHFRWGKPV GKKRRPVKVY PNGAEDESAE AFPLEF
e)リポトロピンβ(残基179-267):EL TGQRLREGDG PDGPADDGAG AQADLEHSLL VAAEKKDEGP YRMEHFRWGS PPKDKRYGGF MTSEKSQTPL VTLFKNAIIK NAYKKGE
f)リポトロピンγ(残基179-234):EL TGQRLREGDG PDGPADDGAG AQADLEHSLL VAAEKKDEGP YRMEHFRWGS PPKD
g)メラノトロピンβ(残基217-234):DEGP YRMEHFRWGS PPKD
h)βエンドルフィン(残基237-267):YGGF MTSEKSQTPL VTLFKNAIIK NAYKKGE
i)Met-エンケファリン(残基237-241):YGGF M
4)オレキシン前駆体(043612)
MNLPSTKVSW AAVTLLLLLL LLPPALLSSG AAAQPLPDCC RQKTCSCRLY ELLHGAGNHA AGILTLGKRR SGPPGLQGRL QRLLQASGNH AAGILTMGRR AGAEPAPRPC LGRRCSAPAA ASVAPGGQSG I
誘導ペプチド:
a)オレキシンA(残基34-66):QPLPDCC RQKTCSCRLY ELLHGAGNHA AGILTL
b)オレキシンB(残基70-97):R SGPPGLQGRL QRLLQASGNH AAGILTM
5)下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド前駆体(P18509)
MTMCSGARLA LLVYGIIMHS SVYSSPAAAG LRFPGIRPEE EAYGEDGNPL PDFGGSEPPG AGSPASAPRA AAAWYRPAGR RDVAHGILNE AYRKVLDQLS AGKHLQSLVA RGVGGSLGGG AGDDAEPLSK RHSDGIFTDS YSRYRKQMAV KKYLAAVLGK RYKQRVKNKG RRIAYL
誘導ペプチド:
a)PACAP-関連ペプチド(残基82-129):DVAHGILNE AYRKVLDQLS AGKHLQSLVA RGVGGSLGGG AGDDAEPLS
b)下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド-27(残基132-158):AHSDGIFTDS YSRYRKQMAV KKYLAAVL
c)下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチド-38(残基132-169):HSDGIFTDS YSRYRKQMAV KKYLAAVLGK RYKQRVKNK
6)グレリン前駆体(Q9UBU3)
MPSPGTVCSL LLLGMLWLDL AMAGSSFLSP EHQRVQQRKE SKKPPAKLQP RALAGWLRPE DGGQAEGAED ELEVRFNAPF DVGIKLSGVQ YQQHSQALGK FLQDILWEEA KEAPADK
誘導ペプチド:
a)グレリン(残基24-51):GSSFLSP EHQRVQQRKE SKKPPAKLQP R
この態様に基づいて、関連する疾患の多数の治療方法が実現可能である;さらなる手引きについては、以下のものを参照:Harrison's Principles of Internal Medicine. By Eugene Braunwald M. D. (Editor), Anthony S. Fauci M. D. (Editor), Dennis L. Kasper M. D. (Editor), Stephen L. Hauser M. D. (Editor), Dan L. Longo M. D. (Editor), J. Larry Jameson M. D. (Editor). McGraw-Hill Professional;15th edition (February 16, 2001) ISBN: 0070072728;Williams Textbook of Endocrinology, by Robert Hardin Williams (Editor), P. Reed Larsen (Editor), Jean D. Wilson, Melmed Shlomo, Daniel W. Foster, Henry M. Kronenberg. W B Saunders;10th edition (December 20, 2002) ISBN: 0721691846. Peptide and Non Peptide in Neuroendocrinology and Oncology: From Basic to Clinical Research, by E. E. Muller (Editor) Springer-Verlag Telos (August 2003) ISBN: 8847002958。
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型の存在または活性;そして(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性、を促進する工程を含む。
膵臓β-細胞は、2型糖尿病の治療方法を開発する際に最も有用であると考えられる。
本発明のさらに具体的な好ましい態様において、前記化合物ライブラリは、低分子、ペプチド、抗体、または抗体誘導体(例えば、Fab、F(ab2)'、scFv、ヒト化抗体またはキメラ抗体)のライブラリである。
(1)部位特異的変異生成またはキメラタンパク質研究による、化合物と相互作用性タンパク質との結合部位の同定;
(2)化合物の結合部位と相互作用性タンパク質の結合部位との両方の分子モデリング;そして
(3)相互作用性タンパク質への化合物の結合特異性を向上させるための化合物の修飾;を含む。
本発明は、さらに、別の好ましい態様において、上述したように、同定された化合物およびさらに修飾された化合物が、医薬組成物中に製剤化される方法を企図しても良い。
図1:ICA512 細胞質ドメインは、β-細胞の刺激に反応して、μ-カルパインにより切断される。(A):1時間の休止後、休止バッファーまたは刺激バッファーにより105分間、インキュベーションしたINS-1細胞からの40μgタンパク質に対する、ICA512(上パネル)およびγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。プロテアーゼ阻害剤L-685,458およびカルペプチンを、示された濃度で添加した。(B):(A)に示された4つの独立した実験からのICA512-TMFの定量。(C):0 mMグルコース(休止)または25 mMグルコース(刺激)により示された時間インキュベーションされたラット膵島由来の30μgタンパク質に対する、ICA512(上パネル)およびγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。(D):(C)において示された2つの独立した実験からのICA512-TMFの定量。(E):(A)におけるのと同様の休止バッファーまたは刺激バッファー(60μMのカルペプチンを含むかまたは含まない)中でインキュベートしたラット膵島由来の30μgタンパク質に対する、ICA512(上パネル)およびγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。(F):スクランブル化siRNAオリゴ1または抗-μ-カルパインsiRNAオリゴ1でトランスフェクトしたINS-1細胞中での、半定量的RT-PCRによるμ-カルパインmRNAおよびβ-アクチンmRNAレベル。(G):スクランブル化siRNAオリゴ1または抗-μ-カルパインsiRNAオリゴ1でトランスフェクトした刺激INS-1細胞由来の40μgタンパク質に対する、μ-カルパイン(上パネル)、ICA512(中パネル)およびγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。(H):(G)において示される3つの独立した実験からの、μ-カルパインおよびICA512-TMFの定量。(I):ホタルルシフェラーゼcDNAでトランスフェクトし、その後ホタルルシフェラーゼについてのsiRNAオリゴで処理しなかったかまたは処理したINS-1細胞中の、30μgタンパク質に対する、ホタルルシフェラーゼ(上パネル);μ-カルパイン(中上パネル)、ICA512-TMF(中下パネル)およびγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。(J):(I)に示される3つの独立した実験に由来する、ホタルルシフェラーゼ活性およびホタルルシフェラーゼ、μ-カルパイン、およびICA512-TMFのタンパク質レベル。(K):μ-カルパイン-V5についてのcDNAの示された量でトランスフェクトし、そして(A)におけるように刺激したINS-1細胞由来の40μgタンパク質に対する、ICA512(上パネル)、μ-カルパイン-V5(中パネル)そしてγ-チューブリン(下パネル)についてのウェスタンブロット。(L):(K)において示された3つの独立した実験に由来する、ICA512-TMFの定量。(B)、(D)、(H)、(J)、そして(L)において、タンパク質シグナルは、γ-チューブリンについて正規化され、そして休止期の細胞(BおよびD)、スクランブル化siRNAオリゴでトランスフェクトされた細胞(H)またはホタルルシフェラーゼcDNAでトランスフェクトされた細胞(J)、またはエレクトロポレーションされた細胞(L)におけるそれぞれの値の%として表された。(B)、(D)、(H)、(J)および(L)におけるエラーバーは、平均+SDを示す。
(A):[35S]-標識IVTT ICA512細胞質ドメイン(ICA512-cyt)、陽性対照としてのp53、および陰性対照としてのルシフェラーゼを、それぞれ独立して、マルトース結合タンパク質と融合させた組換えUbc9(MBP-Ubc9)とともにインキュベートした。タンパク質は、アミロース樹脂を用いて、プルダウンされた。ビーズを洗浄しそして溶出した。上清をSDS-PAGEに供し、そしてオートラジオグラフィーにより示された。(B):組換えタンパク質として細菌中で発現される4種類の精製GST-ICA512構築物のポンソー赤色(Ponceau red)染色。(C):[35S]-標識IVTT PIASyとインキュベートしたGST-ICA512構築物での、プルダウンアッセイおよびオートラジオグラフィー。
(A):ICA512 cyt.(601-979)を、GST融合タンパク質として細菌中で発現させ、そしてE1(ヘテロ二量体Aos1/Uba2)、Ubc9、およびSUMO1を含有するSUMO化酵素装置とともにin vitroでインキュベートさせた。示される場合、100 ngのGST-PIASyを添加した。SUMO化反応物をSDS-PAGEに供し、そしてモノクローナル抗体mICA512を用いたウェスタンブロットにより示された。アスタリスクは、SUMO化型のICA512を示す。(BおよびC):ICA512は、in vivoでSUMO-修飾される。ICA512(659-979)-GFPを、INS-1細胞中で単独で発現させるか、またはSUMO1(B)またはHA-SUMO1(C)のいずれかとともに共発現させた。等量の全細胞タンパク質を、抗-GFP Abを用いて免疫沈降した。ウェスタンブロットを、抗-GFP Ab(B)、または抗-HA Ab(C)を用いて行った。
実施例1A:実施例2〜5の材料および方法
膵島単離および細胞培養
膵島は、以前に記載されたように(26)、コラゲナーゼ消化によりメスウィスターラットから単離し、密度勾配遠心法により精製し、そして培養した(400/60 mm培養ディッシュ)。INS-1細胞を、以前に記載されたように(27)増殖させた。
完全長ヒトICA512をコードするcDNAおよびICA512(659-979)をコードするcDNAを、PCRにより増幅し、そしてpEGFP-N1またはpECFP-N1(Clontech, Palo Alto, CA)中に、EcoRI-AgeI挿入物またはAgeI-BglII挿入物として、GFPまたはCFPとそれぞれインフレームで、サブクローニングした。そのcDNAをKpnI-XbaI挿入物としてMoHa3ベクター(Monika Suchanekの好意により譲受)中にサブクローニングすることにより、3-HAエピトープを有するC-末端でICA512をタグ付けした。ラットダイナミン1および2アリルのcDNA、またはGFPと融合させたドミナントネガティブのダイナミン1および2(K44A)アリルのcDNAをコードするプラスミドを、Kai Simonsの好意により譲受した。マウスPIASy cDNA(Rudolf Grosschedlの好意により譲受)を、pEYFP-N2(Clontech)のEcoRI-BglII挿入物として挿入した。Ism4-CFPをコードするプラスミドおよびIsm4-YFPをコードするプラスミドを、Karla Neugebauerの好意により譲受した。4×106 INS-1細胞を、ヌクレオフェクターキットVおよびプログラムT-20を使用するAmaxa nucleoprator(Amaxa Biosystems, Cologne, Germany)により、エレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、細胞を35 mmウェル2つに分注し、そして回収されるまで4日間増殖させた。ICA512-GFPを安定に発現するINS-1細胞(INS-1 ICA512-GFP細胞)を、600μg/mlネオマイシンを用いて選択し、そして限界希釈によりクローニングした。ウェスタンブロットおよび共焦点顕微鏡により評価した、ICA512-GFPを発現する8個の独立したクローンの内の一つを、GFP蛍光を使用したFACSに関して選択し、そしてさらに特徴づけた。
野生型INS-1細胞およびトランスフェクトINS-1細胞およびラット膵島(350-450)を、0 mMグルコースおよび5 mM KClを含有する休止バッファー中で60分間プレ-インキュベートし、その後、以前に記載したように(7)、25 mMグルコースおよび55 mM KClを含む新鮮な休止バッファーまたは刺激バッファー中で様々な時間インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤カルペプチン、MG-132、L-685,458(Calbiochem, La JoIIa, CA)を、プレ-インキュベーションの最後の15分間に添加し、その後細胞を回収するまでのすべての時間インキュベートした。次に、細胞を氷冷PBSで洗浄し、そして溶解バッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8.0、140 mM NaCl、1%Triton X-100、1 mM EDTA、1 mM PMSF、および1%プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma, St. Louis, MO))中で4℃にて抽出した。細胞質抽出物および核抽出物を、NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents(Pierce, Rockford, IL)を製造者の指示に従って使用して調製した。タンパク質濃度を、Bio-Rad Protein Assay Reagent(Bio-Rad, Hercules, CA)を使用して測定した。核抽出物に関して、対応する細胞質抽出物の場合と比較して半分のタンパク質をロードしたこと以外は、等量のタンパク質を8〜10%SDS-PAGEで分離した。タンパク質転写後、ニトロセルロースフィルターを、以下の抗体:マウスモノクローナル抗-ICA512抗体(6)、抗-μ-カルパイン抗体(Chemicon, Temecula, CA)、抗-γ-チューブリン抗体および抗-HA抗体(Sigma)、抗-GFP抗体(Clontech);ウサギポリクローナル抗-Glut2抗体(Alpha Diagnostics International, St Antonio, TX)、抗-CPE抗体(Chemicon)、抗-GFP抗体(Molecular Probes, Eugene, OR)および抗-HA抗体(Christoph Thieleより譲受)を用いてインキュベートした。化学発光を、Supersignal West Pico Substrate(Pierce)を基質として発色させ、そしてLAS 3000 Bioimaging System(Fuji, Tokyo, Japan)を使用して検出した。タンパク質シグナルの定量を、Image Gauge v3.45ソフトウェア(Fuji)を使用して行った。
INS-1細胞を、休止バッファー(2.8 mMグルコースおよび5 mM KCl)中で1時間インキュベートし、その後40μMカルペプチンを含むかまたは含まない休止バッファーまたは刺激バッファー中で6時間インキュベートし、その後再び休止バッファー中で24時間までインキュベートした。リアルタイムPCR用の全RNAを、刺激中の時点0、2および6時間に回収し、そしてその後の休止期間中の2、6、12および24時間の時点で回収した。
0.4〜2 Mスクロースからの連続的スクロース密度勾配上でのINS-1細胞およびINS-1 ICA512-GFP細胞の分画を、記載されたように行った(28、29)。フラクションを、SDS-PAGEにより分離し、そして上述したようにイムノブロットにより解析した。
pET28a(Invitrogen)中のICA512(601-979)cDNA(29)を、T7/関連転写-翻訳システム(Promega, Madison, Wl)を製造者の指示書にしたがって使用して、in vitroにて転写しそして翻訳した。PIAS1-GSTおよびPIASy-GST(Rudolf Grosschedlの好意により譲受)を、以前に記載されたように細菌中で発現させた(21、30)。次に、[35S]-メチオニン-標識ICA512(601-979)を、グルタチオンセファロースビーズ(Amersham, Freiburg, Germany)に結合させたGST-融合タンパク質またはGST単独と共に、GST結合バッファー(120 mM NaCl、50 mM Tris pH8、0.25%Nonidet P-40、1 mM DTT、1 mM PMSF)中、4℃にて一晩インキュベートした。ビーズを結合バッファーを用いて5回洗浄し、その後10 mM還元グルタチオンを用いて溶出した。溶出物をSDS-PAGEにかけ、そしてオートラジオグラフィーにより解析した。
3μgの細菌により発現されたHis-ICA512 細胞質ドメイン(残基601-979)(Ort et al., 2001)を、20μlバッファー(20 mM Tris-HCl pH 7.5、50μM CaCl2、1 mM L-システイン)中、室温にて、150 ngのμ-カルパイン(Calbiochem)および30μMカルペプチンまたはMG-132を含むかまたは含まない条件下、1、5、15または45分間、インキュベートした。等量の2×SDSサンプルバッファーを添加することにより、反応を停止させた。SDS-PAGEの後、タンパク質をクマシーブルー(Bio-Rad)を用いて染色した。
休止条件下または刺激条件下のINS-1細胞を、2%パラホルムアルデヒド中で固定し、その後0.2%サポニンまたは0.3%Triton X-100を用いて透過処理した。透過処理の後、細胞を、マウスモノクローナル抗-μ-カルパイン抗体およびインスリン抗体(Sigma)またはウサギポリクローナル抗-ICA512ecto抗体(1)と共に、1時間インキュベートした。洗浄およびヤギ-抗-マウスAlexa488-複合化IgGまたはAlexa568-複合化IgG(Molecular Probes)とのインキュベーション後、核を、DAPI(Sigma)で対比染色した。反転LSM Meta 405 nm共焦点顕微鏡(Zeiss, Goettingen, Germany)を用いて、0.5μm切片中で画像を得た。
細胞を、60 mM PIPES、25 mM HEPES、10 mM EDTA、2 mM MgCl2、pH 6.9中4%PFAを用いて、室温にて1時間固定し、その後10%ゼラチンを含むPBS中でかき集めそしてペレットにした。ペレットを、1%PFAを含むPBS中で固定しそして貯蔵した。極薄凍結切片を記載されたように調製し(32)、そしてマウス抗-インスリン抗体(Sigma, 1:1000)およびウサギ抗-GFP抗体(Molecular Probes, 1:500)と共に、その後6 nm金粒子および12 nm金粒子(Dianova, 1:30)とそれぞれ結合させたヤギ-抗-マウスIgGおよびヤギ-抗-ウサギIgGと共に、インキュベートした。
ICA512-CFP、PIASy-YFP、Ism4-YFP、およびIsm4-CFPで一過性にコトランスフェクトさせたINS-1細胞を、休止バッファーまたは刺激バッファー中で90分間インキュベートさせた。2%パラホルムアルデヒド中で固定した後、Plan-Apochromat 100X 1.4油浸DIC対物レンズを使用して、反転LSM Meta 405 nm共焦点顕微鏡(Zeiss)により、細胞を画像化した。ピンホール倍率(pinhole diameter)を、1.0〜1.25 Airy-Unitに設定した。Z軸に0.57μmの光学的厚さを有する一連の大量の画像は、6.4μ秒のピクセル滞留時間で、512×512ピクセル以上の8-bit強度の解像度で回収した。458 nmおよび514 nmレーザー光を使用して、CFPおよびYFPをそれぞれ励起した。CFP画像は、458 nmの2色性ミラーおよび475〜495 nmのバンドパスフィルターを用いて取得され、一方、YFP蛍光は、514 nmの2色性ミラーおよび530〜600 nmのバンドパスフィルターを用いて取得された。514 nmのレーザー光を70%出力で用いてそして各30秒を6サイクルのあいだ行うYFPのフォトブリーチングのあいだ、CFPの発光を測定することにより、FRETをを評価した。“目的とする領域”のソフトウェア機能を使用して、細胞の核周辺をトレースすることにより、CFPおよびYFPの平均蛍光を決定した。フォトブリーチング後のCFPの蛍光強度を、時間0で100%に正規化した。各実験において、各スライドにつき6〜9視野をフォトブリーチングして、記録した。各実験を独立して2回行った。
ダイナミン-GFP構築物でトランスフェクトし、そしてカバースリップ上で3〜4日間増殖させたINS-1細胞を、FBSを含まない培地中で1時間、飢餓状態にさせ、次いでAlexa568(Molecular Probes)と複合体形成したトランスフェリンおよび1 mg/ml BSAを含む血清不含培地中、37℃にて15分間のインキュベーションを行った。細胞を冷PBS中で4回洗浄し、そして上述したように固定した。画像をOlympus BX61顕微鏡(Olympus, Tokyo, Japan)に付属させたCoolSnap-HQ CCDカメラ(Roper Scientific, Tuscon, AZ)を用いて取得し、そしてMetamorph 4.65ソフトウェア(Universal Imaging, Downington, PA)を用いて処理した。
INS-1細胞(6×105/35-mmウェル)を、トランスフェクションの前2日間、増殖させた。ラットμ-カルパインに対する21-merのサイレンシングRNA(siRNA)オリゴヌクレオチド1、2および3を、Silencer siRNA Construction Kit(Ambion, Austin, TX)で、以下のプライマー:
センスプライマー1、5'-AAGAGAGCGCTCCAGAACTCGCCTGTCTC-3';
アンチセンスプライマー1、5'-AACGAGTTCTGGAGCGCTCTCCCTGTCTC-3';
センスプライマー2、5'-AACCTGGATCTGGTCATCTAGCCTGTCTC-3';
アンチセンスプライマー2、5'-AACTAGATGACCAGATCCAGGCCTGTCTC-3';
センスプライマー3、5'-AAGTTACTGACCTCTCGAAGGCCTGTCTC-3';
アンチセンスプライマー3、5'-AACCTTCGAGAGGTCAGTAACCCTGTCTC-3';
を使用して、合成した。細胞を、Lipofectamine(Invitrogen)を使用して、Optimem培地中1μgのsiRNAオリゴ/ウェルで、day 2およびday 4にトランスフェクトした。day 6に、細胞を回収し、そしてRT-PCRまたはイムノブロットのために処理した。
ホタルルシフェラーゼのためのsiRNAオリゴのトランスフェクションの2日前に(8)、INS-1細胞を、それぞれホタルルシフェラーゼとレニラルシフェラーゼの共発現のため、pGL3-BasicベクターおよびphRLベクター(Promega)を用いてエレクトロポレーションをすることにより、コトランスフェクトさせた。ホタルルシフェラーゼ発現および活性は、細胞をプレートに播いてから6日後に測定した。
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造者のプロトコルにしたがって使用して、細胞質RNAを単離した。1μgの単離RNAを、Titan One Tube RT-PCR System(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)を使用するRT-PCRによる、ラットμ-カルパインcDNAフラグメントとβ-アクチンcDNAフラグメントの同時増幅のためのテンプレートとして、使用した。μ-カルパインの増幅用に、以下のプライマー:
センス、5'-AACGAGTTCTGGAGCGCTCTC-3';
アンチセンス、5'-CTTCAGAATGATCTGGTAGAGG-3';
を使用した。両遺伝子についてのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマー(0.4μM)を、同一反応物中に添加した。サイクル数(32)は、反応の対数期内にはいるように最適化した。PCR生成物を、2%アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドを用いて可視化し、そしてGeneGnome(Syngene)により画像を取得した後、GeneSnapソフトウェア(Syngene, Cambridge, UK)を用いて半定量した。
エタノール、H2Oおよび37%HClの3:1:0.06容量中、-20℃にて、細胞を一晩抽出した。遠心分離後、細胞中および培地中の全インスリン含量を、Sensitive Rat Insulin RIA Kit(Linco Research, St. Charles, MO)を用いて測定した。刺激インデックス(Sl)を、以下の様にして計算した:分泌インスリン:細胞インスリン含量+刺激細胞からの分泌インスリン/分泌インスリン:細胞インスリン含量+休止細胞からの分泌インスリン。対照細胞からの刺激インデックスを、100%に合わせた。
RNeasy Mini Kit(Qiagen, Hilden, Germany)を製造者のプロトコルにしたがって、細胞質RNAを単離した。Titan One Tube RT-PCR System(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)および各遺伝子用の0.4μMプライマーを使用したRT-PCRによる、ラットμ-カルパインcDNAおよびβ-アクチンcDNAの同時増幅のために、1μgのRNAを使用した。μ-カルパイン用のプライマーは:
センス、5'-AACGAGT TCTGGAGCGCTCTC-3';
アンチセンス、5'-CTTCAGAATGATCTGGTAGAGG-3'
の通りである。サイクル数は、反応の対数期内に入るように最適化された。PCR生成物を、2%アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドで染色し、そしてGeneGnome(Syngene)で画像を取得した後、GeneSnapソフトウェア(Syngene, Cambridge, UK)で半定量した。
Trizol(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)を製造者のプロトコルにしたがって使用して、INS-1細胞由来の全RNAを単離した。記載されたように(31)、1μgの全RNAを、β-アクチンおよびインスリンに対して特異的な2μMのアンチセンスプライマーと共に、逆転写酵素反応のために使用した。mRNA発現を、Mx4000 Multiplex Quantitative Real Time PCR System(Stratagene)で、Brilliant SYBR Green QPCR(Stratagene, La JoIIa, CA)を使用する、定量的リアルタイムPCRにより測定した。
ICA512ノックアウトマウスの作製
マウス129/Sv ES細胞において相同組換えによりICA512遺伝子をターゲティングするための構築物を、標準的な方法にしたがって作製した。ES細胞を、ターゲティングベクターを用いてエレクトロポレーションし、そしてC57BL/6ドナーマウスの胚盤胞中に注入して、キメラマウスを作製する。生殖系列伝達を、サザンブロッティングおよびneoトランスジーンに対して特異的なプライマー(リバース、CTATCGCCTTCTTGACGAGTTC)および隣接するICA512コード領域に対して特異的なプライマー(フォワード、CTGCTGGTCTGCCTGCTGTTG)を使用するPCRにより、評価した。ICA512+/-マウスおよびICA512-/-マウスを、サザンブロッティングおよび欠損したICA512ゲノム領域に対して特異的なプライマー(フォワード、CTGTTTGACCGCAGACTTTGTTC;リバース、CTTGTAGGCGCTGGAGAACTG)を使用するPCRにより同定した。ICA512発現の欠損を、膵島由来のRNAに対してICA512-特異的プライマー(フォワード、CTGTTTGACCGCAGACTTTGTTC;リバース、CATTAGCAGATGCTCCAAGAGAG)を用いて行うRT-PCRにより、そして抗-ICA512抗体を用いた免疫組織化学により、確認した。これらのマウスは、Dr. Myung-Shik Lee(Dept. of Medicine, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan Univ. School of Medicine, Seoul 135-710, Korea)により作製され、そして本発明者らに提供された。
INS-1細胞を、記載されたように増殖させた(27)。いくつかの事例において、細胞を休止バッファー(0 mMグルコース、5 mM KCl)中で1時間プレ-インキュベートし、その後、記載されたように(7)休止バッファーまたは刺激バッファー(25 mMグルコース、55 mM KCl)中で2時間または6時間インキュベートした。カルペプチン(Calbiochem)を、プレ-インキュベーションの最後の15分間に添加し、その後、細胞を回収するまでのすべての期間インキュベートした。細胞を20 nMヒト成長ホルモン(hGH)とともに20分間刺激し、その後RPMI-1640、11 mMグルコース、0.5%FBS、25 mM HEPES、 1%ペニシリン-ストレプトマイシンおよび0.05 mMβ-メルカプトエタノールを含有する低血清培地(LSM)中で18時間のインキュベーションを行った。洗浄した後、細胞を回収するか、またはLSM中でさらに6時間インキュベートした。免疫沈降のため、hGHでの刺激の1時間後に、細胞を回収した。
膵島を、記載されたように(26)、15〜17週齢ICA512 +/+マウスまたは-/-マウスから単離した。培養48時間後に、膵島をLSM中で18時間インキュベートし、その後25 mMグルコースおよび20 nM hGHまたはhGH単独で2時間刺激し、その後LSM中でさらに6時間インキュベーションした。
以下の構築物は、以前に記載された:ICA512-CCF-GFP(38);GST-ICA512(601-979)、GST-ICA512(700-979)、およびGST-ICA512(800-979)(29);p53、活性化SUMO-1(SUMO-1GG)、E2-SUMO複合化酵素MBP-Ubc9、および組換えヘテロ二量体E1-SUMO活性化酵素を作製するためのHis-Uba2およびGST-Aos1(21)。GST-PIASy cDNAおよびHA-タグ化SUMO-1 cDNAは、Rudolf GrosschedlとRaIf Janknechtからそれぞれ譲受された。pGL-3(Promega)中のホタルルシフェラーゼの8GLE上流を含むβ-カゼインプロモータ(8GLE-CAS-FL)を、Andreas Barthelから譲受した。ICA512-CCFリジン754、アラニン877およびアスパラギン酸911を、QuickChange Mutagenesis kit(Stratagene)を用いて、それぞれアラニン、アスパラギン酸、およびアラニンに変異生成した。ICA512-CCF(K/A754)cDNAおよびICA512-CCF(A/D877-D/A911)cDNAを、EcoRI-AgeIフラグメントとしてpEGFP-N1(Clontech)中にそれらをサブクローニングすることにより、GFPをC-末端に融合させた。マウスPIASy cDNAをpcDNA3.1(Invitrogen)中にサブクローニングし、そしてBglII-EcoRIフラグメントとしてpEGFP-N2中に、GFPに対してそのC-末端側に融合させた。
INS-1細胞を、記載したようにエレクトロポレーションした(38)。安定なGFP INS-1細胞クローンおよびICA512-CCF-GFP INS-1細胞クローンの作製は、以前に記載された(38)。
INS-1細胞および膵島を、RIPAバッファー〔50 mM Tris-HCl、pH 8.0、150 mM NaCl、1%NP-40、0.1%SDS、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、および1×プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma)〕中で4℃にて回収し、抽出物全体を得た。不溶性物質を、遠心分離により除去した。細胞質抽出物および核抽出物を、NE-PER NuclearおよびCytoplasmic Extraction Reagents(Pierce)を使用して調製した。タンパク質を、8〜10%SDS-PAGEにより分離し、そして以下の抗体:マウスモノクローナル抗-ICA512抗体(7)、抗-STAT5抗体(Santa Cruz)、抗-γ-チューブリン抗体および抗-HA抗体(Sigma);ウサギ抗-PY-STAT5抗体および抗-STAT3抗体(Cell Signaling);親和性精製されたヤギ抗-GFP IgG;を用いてイムノブロットした。化学発光を、Supersignal West PicoまたはFemto kits(Pierce)を用いて発色させ、そしてLAS 3000 Bioimaging System(Fuji)を用いて検出した。タンパク質シグナルを、Image Gauge v3.45ソフトウェア(Fuji)を用いて定量した。核抽出タンパク質の半量を、抽出物全体タンパク質および細胞質抽出物タンパク質と比較して、イムノブロットした。
INS-1細胞を、1またはそれ以上の以下の構築物:GFP、ICA512-CCF-GFP、ICA512-CCF(K/A754)-GFP、SUMO-1およびHA-SUMO-1;で一過性にトランスフェクトさせた。抗-GFP IgGを、抽出物全体または細胞質抽出物からの免疫沈降のために使用した。免疫沈降物を、抗-STAT5b抗体、抗-PY-STAT5抗体、抗-GFP抗体または抗-HA抗体を用いてイムノブロットした。600μgおよび200μgのタンパク質を、それぞれSUMO化ICA512およびSTAT5の免疫沈降の開始物質として使用した。
GST-ICA512(601-979)、GST-ICA512(700-979)、およびGST-ICA512(800-979)を、記載したように(26)細菌により発現させた。[35S]-メチオニン-PIASy、[35S]-ICA512(601-979)、[35S]-p53および[35S]-ホタルルシフェラーゼを、T7/関連転写-翻訳システム(Promega)を製造者の指示書にしたがって使用して、in-vitroにて転写しそして翻訳した。[35S]-PIASyを、GST-ICA512タンパク質またはGSTとともにインキュベートし、一方[35S]-ICA512(601-979)、[35S]-p53および[35S]-ホタルルシフェラーゼをMBP-Ubc9とともにインキュベートした。記載されたように(38)、グルタチオンセファロースビーズ(Amersham)またはアミロースセファロースビーズ(New England Biolabs)を用いて、タンパク質を回収した。グルタチオンまたはマルトースを用いてビーズから溶出したタンパク質を、SDS-PAGEおよびPhosphorImager BAS 1800 Il(Fuji)を用いたオートラジオグラフィーにより解析した。
ICA512-CCF-GFPを発現するINS-1細胞またはICA512-CCF(A/D877-D/A911)-GFPを発現するINS-1細胞またはsiRNAオリゴヌクレオチドで処理されたINS-1細胞を、2%パラホルムアルデヒドを用いて固定した。STAT5bを検出するため、細胞を、ヤギ-血清希釈バッファー(63)中で0.3%Triton X-100により透過処理され、そしてマウスモノクローナル抗-STAT5bおよびヤギ-抗マウスAlexa568-複合化IgG(Molecular Probes)を連続的に用いてインキュベートした。核を、DAPI(Sigma)で対比染色した。共焦点画像を、反転LSM Meta 405nmの共焦点顕微鏡(Zeiss)により得た。
以下のフォワードオリゴヌクレオチドおよびリバースオリゴヌクレオチド:
STAT5b、F1、5'- AATTGGTTGATCTGAAGGTGCCCTGTCTC-3';
R1、5'-AAGCACCTTCAGATCAACCAACCTGTCTC-3';
F2、5'-AAGTTCATGTGCACGTTCAGCCCTGTC TC-3';
R2、5'-AAGCTGAACGTGCACATGAACCCTGTCTC-3';
を使用して、以前に記載されるように(38)、RNA干渉を行った。まいた後、細胞を、day 2およびday 3に、Lipofectamine(Invitrogen)中それぞれ1μgおよび0.5μg siRNAオリゴ/ウェルを、連続的にトランスフェクトした。day 4には、細胞を回収し、そしてイムノブロットまたは免疫組織化学のためにプロセッシングした。
INS-1細胞を、8GLE-CAS-FLおよび1または2の以下のプラスミド:pEGFP、ICA512-CCF-GFP、ICA512-CCF(K/A754)-GFPおよびPIASy-GFPにより、コトランスフェクトさせた。トランスフェクションの2日後に、細胞を低血清培地中で18時間インキュベートし、次いで20 nM hGHで20分刺激し、そして最終的に休止バッファー中でさらに6時間そのままにした。細胞をルシフェラーゼアッセイ用の500μl溶解試薬(Promega)中で回収し、そして10μlを、Berthold照度計におけるルシフェラーゼ活性の測定のために使用した。各サンプルは、3重で行い、そしてデータは、少なくとも2つの独立した実験の平均を示す。
培養中で3日後、GFPまたは様々な量のICA512-CCF-GFPでトランスフェクトされたINS-1細胞を、18時間、低血清培地中でインキュベートし、その後hGHで刺激し、そして回収した。核抽出物を、上述したように調製した。ラットインスリン1遺伝子プロモータのGLEモチーフ(GLE-rIns1)を含む20 fmolの二重鎖ビオチニル化オリゴヌクレオチド(5'-AGCTATGTTCTGAGAAAATC-3')および5μg核内タンパク質との結合反応を、製造者の指示書にしたがって行った。競合実験のため、300 fmolの非-ビオチニル化GLE-rIns1オリゴヌクレオチドを結合反応に添加した。反応物を、6%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、その後ナイロンメンブレンに転写し、そして化学発光による検出用にストレプトアビジン-複合化ホースラディッシュペルオキシダーゼでブロッティングした。
安定なGFP INS-1細胞またはICA512-CCF-GFP INS-1細胞を、1%ホルムアルデヒドを培地に対して15分間添加することにより、架橋させた。クロマチン免疫沈降用に2μg対照IgGまたは抗-GFP抗体で予め取り除かれた(Pre-cleared)核抽出物を、記載されたように(64)調製した。免疫複合体を、タンパク質G-セファロースビーズを用いて回収した。共免疫沈降DNAフラグメントを溶出し、そしてPCRおよびアガロースゲル電気泳動によりおよび定量的リアルタイムPCRにより、解析した。
細胞質mRNAを、Oligotex Direct mRNA kit(Qiagen)を製造者のプロトコルにしたがって使用して単離した。ポリA+-豊富化RNAを、記載されたように(8)、ICA512およびβ-アクチンに対して特異的なアンチセンスプライマーで逆転写させた。ラットインスリン1(rINS1)遺伝子プロモータにおけるGLEに隣接する200 bpフラグメントのPCRおよびリアルタイムPCRによる増幅を、以下のプライマー:
センス5'-CTCAGCTGAGCTAAGAATCCA-3'、
アンチセンス5'-ATTAACAAGGGGCCAGATGCC-3'
を使用して行った。ICA512およびβ-アクチンの増幅は、記載したように行った(16)。
GFPまたはICA512-CCF-GFPでのトランスフェクションの3日後、INS-1細胞をLSM中で18時間インキュベートし、その後25μCi [5-3H]ウリジン/ウェルで2時間、5μg/mlのアクチノマイシンD(Sigma)の存在下または非存在下にて放射性標識した。mRNAを、Oligotex Direct mRNA kit(Qiagen)を用いて精製した。ウリジン取り込みを、液体シンチレーションカウンター(Wallac)で測定した。正規化のため、各サンプル由来のポリA+-豊富化RNAを、β-アクチン(8)用のアンチセンスプライマーを使用して逆転写し、そして対応するmRNAを、リアルタイムPCRにより定量した。
ヒストグラムは、Microsoft Excel(Microsoft)を用いて調製した。エラーバーは、少なくとも2つの独立した実験からの標準偏差を示す。
最初の実験において、プロ-ICA512が、グルコース-制御様式で合成されることを確認した(図1Aレーン2、4、5および7を参照)。上述したように、furin-様プロテアーゼによる分泌経路にしたがったその細胞外ドメインのプロセッシングにより、プロ-ICA512が65 kDのその成熟型膜貫通型(ICA512-TMF)へと変換され、それがSG上に蓄積される(1)。ラットインスリノーマINS-1細胞の高グルコース(25 mM)および高K+(55 mM)による刺激は、プロ-ICA512生合成を誘導し、そしてICA512-TMFレベルを減少させる(Ort et al., 2001;そして図1AおよびB、レーン1および2)。ICA512に対するこの2作用は、INS-1細胞を高グルコースまたは高K+のいずれかで刺激することによって解離される可能性がある(33)。高グルコース単独では、プロ-ICA512生合成が刺激されるが、しかしインスリンの穏やかな放出およびICA512-TMFの減少を刺激する。一方、高K+は、強力なインスリン分泌を誘導しそしてICA512-TMFの減少を誘導するが、プロ-ICA512生合成を亢進しない。ICA512-TMFの減少は、SGエクソサイトーシスの誘導の際の刺激の強度に依存する。高グルコース単独での30、60および120分間の刺激は、実際に新たに単離されたラット膵島におけるICA512-TMFの進行性の減少を引き起こし(図1CおよびD)、それがINS-1細胞の場合とは異なり、グルコースに対する事実上は無傷の分泌反応性を保持する。グルコース刺激の“特徴(signature)”であるプロ-ICA512生合成の迅速な誘導は、INS-1細胞の場合よりも膵島においてはそれほど明らかではなかった(図1 E、レーン4および2)。というのも、前者は、後者よりもはるかに迅速にプロ-ICA512をICA512-TMFへと変換するためである(8)。
次の実験の組合せにおいて、μ-カルパインにより生成されるICA512の切断された細胞質フラグメント(ICA512-CCF)の運命を、調べた。我々のモノクローナル抗-ICA512抗体は、切断部位の上流に位置する細胞内エピトープに反応するため(データは示さず)、ICA512のC-末端を、GFP(ICA512-GFP)でタグ化し、そしてINS-1細胞中で安定に発現させた(ICA512-GFP INS-1細胞)。ICA512-GFP INS-1細胞からの抽出物に対する抗-GFP抗体または抗-ICA512抗体でのイムノブロットでは、それぞれ135 kDおよび90 kDの予想分子量でのプロ-ICA512-GFPおよびICA512-TMF-GFPの発現が示され(図4AおよびB)、一方、共焦点顕微鏡像および免疫電子顕微鏡像から、ICA512-GFPの大半がインスリンと同じところに位置することが示唆された(図4Cおよび4D)。SG上でのICA512-GFPの豊富化が、スクロース密度勾配上での細胞内分画により、確認された(図4E)。さらに、μ-カルパインをRNA干渉によりノックダウンしたところ、ICA512-TMF-GFPレベルが増加した(図4Fおよび図12)。したがって、GFP-タグ化は、プロ-ICA512のICA512-TMFへの変換にも、SGタグ化および後者のμ-カルパイン-媒介性切断にも、干渉しなかった。
続いて、ICA512-CCFの役割について検討した。酵母におけるツーハイブリッドスクリーニングにより、ICA512の細胞質ドメインがPIASyに結合し、それによりICA512-CCFがβ-細胞における遺伝子発現を調節する可能性が上昇することが示された。PIASタンパク質は、活性化STATのタンパク質阻害剤として同定され(18)、そしてより最近では、転写因子を含む多数の基質に対してE3-SUMO化活性を有することが示された(19〜21)。ICA512 細胞質ドメインのPIASタンパク質(PIASyおよびPIAS1を含む)との特異的相互作用を、プルダウンアッセイによりin-vitroで確認した(図6A)。具体的には、in-vitro転写および翻訳により作製された、6×ヒスチジン-タグ化、35S-標識ヒトICA512細胞質ドメイン(残基601-979)を、PIASy-GSTまたはPIAS1-GSTと結合させたグルタチオンセファロースビーズ上で回収したが、GST単独と結合させたビーズ上では回収されなかった(図6A)。同様に、35S-標識PIASyは、GST-ICA512(601-979)およびGST-p53(図6B)と特異的に相互作用する。INS-1細胞において、他の細胞型における場合と同様に、PIASyは、核に限定された。核画分におけるICA512-CCFとPIASyとのin vivoでの相互作用は、ICA512-CFPおよびPIASy-YFPにより一過性にコトランスフェクトされたINS-1細胞中でのFRETにより確認された(図6C)。具体的には、フォトブリーチング後のICA512-CFPシグナルの回収は、刺激後、約5倍増加した(図6D)。平行した実験において、ICA512-CCF-CFPと核内タンパク質Ism4-YFPとの間で(図6Dおよび図16)またはIsm4-CFPとPIASy-YFPとの間では(図6D)、休止条件であっても刺激条件であっても、FRETは何も検出されなかった。このことから、ICA512-CCFとPIASyとは、核内で特異的に相互作用することが確認された。
さらなる実験において、ICA512が遺伝子発現を制御するメカニズムを研究した。最初に、PIASyとの相互作用に関与するICA512のドメインをマッピングした。図17に示されるように、PTPドメインがPIASyとの結合に必要とされる。さらに、ICA512がPIASyによりSUMO化されること(図18を参照)、そしてICA512の発現がSUMO経路により調節されること(図19)が示された。最終的には、ICA512-CCFの過剰発現により、核内のSTAT5bレベルおよびSTAT3レベルが亢進され(図20)、そして成長ホルモンによる刺激に反応してSTAT5bのチロシンリン酸化が亢進される(図21)ことが見いだされた。図20のデータによりさらに、ICA512-CCFの過剰発現によりSTAT5のγ-活性化配列-様DNAエレメント(GLE)への結合が亢進されることも示される。
ICA512が関与する逆行性経路がインスリン以外のSG構成要素の発現に影響を与えるかどうかを確認するため、我々は、ICA512それ自体の発現を解析した。以前に示されたように(6)、ラットインスリノーマINS-1細胞を2時間刺激すると、休止条件で維持した細胞と比較して、プロ-ICA512の発現が上昇する。一方、カルパイン-1によるその切断のため、それは、ICA512-TMFレベルを減少させる(図22a)。この迅速な上昇は、SGタンパク質をコードするmRNAを安定化させそしてその翻訳を亢進する(16)ポリピリミジン管-結合タンパク質の核-細胞質転移を含む、グルコース-活性化転写後メカニズムにより説明される。したがって、転写を阻害するアクチノマイシンDによる処理(8)またはカルパインによるICA512-TMF切断を阻害するカルペプチンによる処理(図22a)は、2時間刺激した細胞中のプロ-ICA512の迅速な誘導を阻害しなかった。その代わり、カルペプチンは、プロ-ICA512のより大きな誘導を部分的に阻害し、そして6時間刺激した細胞中でのICA512-TMFを減少させる(図22a)。これらの条件下でのICA512 のターンオーバーの減少は、細胞外ドメインにおけるN-糖鎖の進行性の成熟に由来する、110 kDおよび130 kDのプロ-ICA512分子種の蓄積を説明する(6)。ICA512がそれ自身の発現をICA512-CCFを介して亢進することの直接的な証拠は、ICA512-CCF-GFPによりトランスフェクトされたINS-1細胞において、GFP単独を発現する細胞と比較して、ICA512 mRNAレベル(図22b)およびプロ-ICA512レベル(図22cおよびd)が、それぞれ81%および40%増加した、ということが見いだされたことである。プロ-ICA512タンパク質と比較してICA512 mRNAの増加が多くなることは、後者がICA512-TMFへと迅速に変換されることにより説明することができ、それらのレベルは、実際にICA512-CCF-GFPにより増加した(図22c)。さらに、3H-ウリジンの全取り込みは、ICA512-CCF-GFPによりトランスフェクトされたINS-1細胞において、GFPによりトランスフェクトされたINS-1細胞と比較して、270%にまで増大した(図22e)。これは、アクチノマイシンDにより消失した作用である。あわせると、これらのデータから、ICA512-CCFが、インスリンの遺伝子転写に加えて、それ自体の遺伝子転写も促進することが示される(38)。
核内において、ICA512-CCFは、活性化STAT-yのタンパク質阻害剤(Protein Inhibitor of Activated STATy;PIASy)と結合する(38)。シグナル伝達物質および転写アクチベーター(Signal Transducers and Acitivators of Transcription;STAT)は、サイトカインおよび成長ホルモン受容体の活性化に反応し、Janusキナーゼによりチロシンリン酸化される(41)。チロシンリン酸化されたSTAT(PY-STAT)は二量体を形成し、そして核内に移動し、そこでそれらは直接的にまたは多量体の転写複合体の一部として他の因子と共に、DNAに結合する。ヒトゲノムによりコードされる7種類のSTATの中で、STAT5a/bおよびSTAT3は、細胞中で最も関連している(42、43)。妊娠中の成長ホルモン、プロラクチン、または胎盤性ラクトジェンによるSTAT5a/bの活性化により、インスリンの発現およびグルコーストランスポーター-2、グルコキナーゼ、およびサイクリンD2を含むその他の中心的なβ-細胞分子の発現が亢進され(44、45)、そしてβ-細胞増殖が上昇する(45)。したがって、我々は、ICA512がSTAT活性を調節するかどうかを調べた。INS-1細胞におけるICA512-CCF-GFPの発現が、核内でのSTAT5bおよびSTAT3の濃度依存的な増加を引き起こした(図23aおよびb)。核内におけるSTAT3の選択的濃縮(図30を参照)およびSTAT5bの選択的濃縮(示さず)もまた、INS-1細胞と比較してICA512を過剰発現する、安定なICA512-GFP INS-1細胞から明らかである(38)。これらの知見は、ICA512ノックアウトマウス(-/-)および対照同腹子(+/+)から単離された膵島の解析により裏付けられた(図23c)。STAT5bは、ICA512(+/+)の膵島を、hGHに曝露したことに加えて、SGエクソサイトーシスおよびICA512-CCFの生成を誘導するグルコースで同時刺激した場合(38)、核内においてより濃縮された。驚くべきことに、hGHとグルコースとの間のその様な相乗作用は、ICA512(-/-)膵島においては存在しなかった。ICA512(-/-)膵島において、核内STAT5bは、ICA512(+/+)膵島と比較して、約56%まで減少し(図23d)、一方核内STAT5b量対全体STAT5b量の比は、約45%から約29%まで減少した(図23e)。
次に、PTPドメインがチロシンホスファターゼ活性を欠損している(38)ICA512-CCFが、STAT5bのチロシンリン酸化に影響を与えることができるかどうか、そしてその結果、その核標的化に影響を与えることができるかどうか、我々は調べた。PY-STAT5の検出を向上させるため、GFPによりトランスフェクトされたINS-1細胞およびICA512-CCF-GFPによりトランスフェクトされたINS-1細胞を、hGHで20分間インキュベートし、その後回収前に成長因子にさらに曝露されることを回避するため、血清不含培養液に戻した。核STAT5bおよび核PY-STAT5は、GFP INS-1細胞と比較して、ICA512-CCF-GFP INS-1細胞において明らかに増加したが、全STAT5bは増加しなかった(図24a)。驚くべきことに、アラニン877およびアスパラギン911がそれぞれアスパラギンとアラニンに置換されているICA512-CCFホスファターゼ活性変異体(ICA512-CCF(AD/DA)-GFP)(4)(図29を参照)が、ICA512-CCF-GFPよりも、核内での存在量がかなり少なかった(図24bおよびc)。対応して、STAT5bの核内レベル(図24c)およびPY-STAT5の核内レベル(図24dおよびe)が、ICA512-CCF-GFP INS-1細胞と比較して、ICA512-CCF(AD/DA)-GFP INS-1細胞において大幅に減少した。これらのデータは、ICA512-CCFがSTAT5bと結合し、そしてその“不活性な”PTPドメインがPY-STAT5のチロシン脱リン酸化を阻害しているという可能性をもたらした。この仮説と一致して、STAT5bおよびPY-STAT5が、ICA512-CCF-GFPとは同時免疫沈降(共沈)したが、GFPとは同時免疫沈降しなかった(図24f)。hGH-刺激細胞の抽出物全体からICA512-CCF-GFPによりSTAT5bを回収することから、その一過性細胞質起源を排除することができたとしても、2種類のタンパク質を含む複合体が実質的に核に限局していることがさらに示されたが、細胞質抽出物から回収してもそれは示されなかった。あわせて、これらのデータから、ICA512-CCFが、PY-STAT5の核内保持を促進することが示される。
次に、我々は、ICA512-CCFが、PY-STAT5bと同様に、クロマチンと結合しているかどうかを調べた。この目的のため、抗-GFP抗体または対照IgGを、安定なGFP- INS-1細胞またはICA512-CCF-GFP INS-1細胞に由来する抽出物を使用する、クロマチン-免疫沈降アッセイのために使用した。PCR(図25a)およびリアルタイムPCR(図25b)による解析により、STAT5b(46)と結合する、ラットインスリン1遺伝子プロモータのγ-インターフェロン活性化配列-様要素(Gamma-Interferon Activated Sequence-like Element;GLE)を、抗-GFP抗体を用いて同時免疫沈降(共沈)したが、対照IgGでは免疫沈降されず、そしてICA512-CCF-GFP INS-1細胞からのみ免疫沈降されることが、示された。次に、増加量のICA512-CCF-GFPを発現するINS-1細胞の核抽出物を、ラットインスリン1のGLEを含むビオチニル化オリゴヌクレオチドと共にインキュベートした。電気泳動移動度シフトアッセイは、ICA512-CCF-GFPレベルの上昇と、ある因子、おそらくはSTAT5bの、オリゴヌクレオチドへの結合の亢進との間で、正の相関を示した(図25cおよび4d)。この結合の特異性は、対応する非-ビオチニル化オリゴヌクレオチドを用いた競合的阻害により確認された。ICA512-CCFがSTAT5の転写活性を増加させるかどうかを直接的に試験するため、INS-1細胞に、GFPまたはICA512-CCF-GFPのいずれかと、8GLEを有するウシβ-カゼインプロモータにより駆動されるホタルルシフェラーゼ(8GLE-CAS-FL)とを、コトランスフェクトした(図25e)。hGHでの刺激後、ICA512-CCF-GFP/8GLE-CAS-FL INS-1細胞が、GFP/8GLE-CAS-FL INS-1細胞と比較して、>500%のルシフェラーゼ活性を示した。予想されたように、PIASyは、この活性を減少させたが、しかしながら、ICA512-CCF-GFPにより部分的に回復された(図25e)。これらのデータは、ICA512-CCFがSTAT5転写活性を亢進する一方、PIASyがこの亢進を阻害することを、結果的に示す。
PIASyとICA512-CCFとの関係に関する知見を得るため、我々は次に、PIASyに結合するICA512のドメインをマッピングした。この目的のため、GSTと融合させたICA512細胞質ドメインの部分を、細菌中で発現させ(図31を参照)、そしてin-vitroで転写されそして翻訳された[35S]-PIASyとのその相互作用についてプルダウンアッセイにより試験した。(図26a)。PTPドメインのみを含有するGST-ICA512(700-979)は、[35S]-PIASyだけでなくICA512細胞質ドメイン全体をカバーするGST-ICA512(601-979)にも結合した。[35S]-PIASyは、その代わり、PTPドメインの最初の100残基を欠損するGST-ICA512(800-979)に対しては結合しなかった。このことから、この領域は、2つのタンパク質の会合のために必要とされることが示された(図26a)。PTPドメインの検討から、リジン754(Lys754)がSUMO化のためのコンセンサス部位(ΨKXE)内部に存在することが示された(47)(図29を参照)。したがって、我々は、ICA512がE3 SUMO-リガーゼである(48)PIASyによりSUMO化され得るかどうかを調べた。この可能性をサポートするのは、in-vitroで転写されそして翻訳された[35S]-ICA512細胞質ドメインが、[35S]-p53と同様に、マルトース結合タンパク質と融合させたE2 SUMO-複合化酵素Ubc9に対して結合する能力であった(図26b)。SUMO化タンパク質は、p53と同様に、実際に、E2 SUMO-複合化酵素とE3 SUMO-リガーゼとの両方ともと相互作用することが示された(49)。In-vitro SUMO化アッセイにより、PIASyとともにインキュベーションすると、86 kDと105 kDの2つのGST-ICA512種が出現することが示された。70 kDタンパク質として移動するGST-ICA512(601-979)と比較して、これらのペプチドの移動度がよりゆっくりであることは、1または2のSUMO-1ペプチドがそれぞれに付加されていることと一致していた(図26c)。次いで、INS-1細胞中のICA512のSUMO化を、ICA512-GFPおよびHA-タグ化SUMO-1のコトランスフェクションにより評価し、その後抗-GFP抗体で免疫沈降し、そしてGFP(図32を参照)およびHA-エピトープ(図26d)に関してウェスタンブロットを行った。HA-SUMO-1-トランスフェクト細胞中で、ICA512-CCF-GFP単独を発現する細胞と比較して、HAに対して反応性のさらに2つのICA512-CCF-GFP種を検出することにより、ICA512-CCFがSUMO化されることが結果的に証明された。ICA512がLys754でSUMO化されるかどうかを明らかにするため、INS-1細胞に、HA-SUMO-1とLys754をアラニンに置換したICA512-CCF-GFP構築物(ICA512-CCF(K/A754)-GFP)とでコトランスフェクションした(図26d)。ICA512-CCF(K/A754)-GFPが、ICA512-CCF-GFPとは異なり、2種のSUMO化種ではなく、1つのSUMO化種にのみ由来する可能性があるという証拠から、Lys754がSUMO化されていることが確認された。さらには、この結果は、場所はまだ特定されていないが、第二のSUMO化部位の存在を指摘した。興味深いことに、Lys754は、PTPのそれらの基質との相互作用のために重要なリン酸化チロシン認識モチーフに隣接している(50)(図29を参照)。したがって、魅力的な可能性は、SUMO化がICA512-CCFとSTAT5bとの関係を調節しているというものである。この仮説をサポートするのは、STAT5bと結合するICA512-CCF(K/A754)-GFP(図33を参照)が、その転写活性を、ICA512-CCF-GFPよりも、亢進しない、という証拠である(図25e)。
STAT5は、β-細胞遺伝子発現だけでなく、β-細胞増殖も促進することが知られている。したがって、ICA512もまた、β-細胞の複製のために必要とされると考えることができる。この仮説を試験するため、ICA512を欠損するマウスと野生型同腹子を、部分膵臓切除し、そしてブロモデオキシウリジン(BrdU)を腹腔内に注入した。この目的のため、30匹の野生型c57/bl6マウスを、2群に分割した。1群には、ほぼ全体的な膵臓切除を行い、もう一方の群は、脾臓のみを除去することにより行うシャムオペレーションであった。部分膵臓切除に関して、膵臓の尾部を、横行結腸、胃から、そして後腹膜策状体から、腸間膜根部まで移動させた。胆管をそのままにしておく限りで、膵臓頭部を、十二指腸から分離した。手術の最後に、すべての動物に、ブロモデオキシウリジン(BrdU)を7日間にわたって連続的に放出する小型の浸透性ポンプ(Alzet(商標))を与えた。
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Claims (28)
- ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンにおいて、以下のもの:
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、チロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じうる、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型(pro-form)の存在または活性;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性;
を促進する工程を含む、ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンにおけるペプチドホルモンの発現を刺激する方法。 - ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンにおいて、以下のもの:
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じうる、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか1つの前駆型の存在または活性;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性;
を促進する工程を含む、ペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンの細胞増殖を促進する方法。 - PIASタンパク質が、PIASy、PIAS1、PIAS3、PIASxαまたはPIASxβである、請求項1または2に記載の方法。
- 促進が、外来性で導入したベクターからの、
前記(aa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;
の一過性発現または安定な発現を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 促進が、前記細胞またはニューロン中に、
(aa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;
を導入することを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 促進が、
(aa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;
の細胞またはニューロン中での分解を減少させるかまたは安定性を向上させることを含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。 - 前記ICA512のC-末端フラグメントが、成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなる、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内分泌細胞が、膵臓β-細胞である、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記促進が、グルコース、GLP-1またはカルシウムによりもたらされる、請求項8に記載の方法。
- 前記分泌顆粒中に含有されるペプチドホルモンまたはニューロペプチドが、インスリン、アミリン、または以下のもの:
ADM前駆体、アグーチスイッチタンパク質前駆体、アグーチ-関連タンパク質前駆体、アペリン前駆体、心房性ナトリウム利尿因子、β-ネオエンドルフィン-ダイノルフィン前駆体、脳ナトリウム利尿ペプチド前駆体、カルシトニン遺伝子-関連ペプチドI前駆体、カルシトニン遺伝子-関連ペプチドIl前駆体、カルシトニン前駆体、コレシストキニン前駆体、クロモグラニンA前駆体、コカイン-調節型転写物およびアンフェタミン-調節型転写物タンパク質前駆体、コルチコリベリン前駆体、コルチコトロピン-リポトロピン前駆体、コルチスタチン前駆体、FMRFアミド-関連ペプチド前駆体、FMRFアミド-関連ペプチド前駆体、フォリスタチン前駆体、フォリトロピンβ鎖前駆体、ガラニン前駆体、ガラニン-様ペプチド前駆体、胃抑制ポリペプチド前駆体、ガストリン前駆体、ガストリン-放出ペプチド前駆体、グレリン前駆体、グルカゴン前駆体、糖タンパク質ホルモンα鎖前駆体、成長ホルモン変異体前駆体、インスリン前駆体、インスリン-様成長因子結合タンパク質3前駆体、インスリン-様ペプチドINSL6前駆体、膵島アミロイドポリペプチド前駆体、ライディッヒインスリン-様ペプチド前駆体、形態形成ニューロペプチド、モチリン前駆体、ニューレキソフィリン2前駆体、ニューレキソフィリン3前駆体、ニューレキソフィリン4前駆体、神経内分泌タンパク質7B2前駆体、ニューロキニンB前駆体、ニューロメジンB-32前駆体、ニューロメジンU-25前駆体、ニューロペプチドB前駆体、ニューロペプチドW前駆体、ニューロペプチドY前駆体、ニューロテンシン前駆体、ノシセプチン前駆体、オレキシン前駆体、オキシトシン-ニューロフィジン1前駆体、膵臓ホルモン前駆体、副甲状腺ホルモン前駆体、副甲状腺ホルモン-関連タンパク質前駆体、ペプチドYY前駆体、下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ポリペプチド前駆体、プロエンケファリンA前駆体、プロゴナドリベリンI前駆体、プロゴナドリベリンII前駆体、プロキネチシン2前駆体、プロラクチン前駆体、プロ-MCH前駆体、プロリラキシンH1前駆体、プロタキキニン1前駆体、タンパク質-チロシンホスファターゼ-様N前駆体、受容体型タンパク質-チロシンホスファターゼN2前駆体、調節型内分泌特異的タンパク質18前駆体、レジスチン前駆体、レジスチン-様β前駆体、セクレチン前駆体、セクレトリグラニンI前駆体、セクレトリグラニンII前駆体、セクレトリグラニンIII前駆体、ソマトリベリン前駆体、ソマトスタチン前駆体、ソマトトロピン前駆体、スタニオカルシン1前駆体、スタニオカルシン2前駆体、ウロコルチンII前駆体、ウロコルチン前駆体、血管作動性ペプチド前駆体、バソプレッシン-ニューロフィジン2-コペプチン前駆体
の一つに由来するペプチドホルモンまたはニューロペプチドである、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。 - 前記β-細胞中での
(aa)(i)ICA512の存在または活性;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体の存在または活性;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメントの存在または活性;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体の存在または活性;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、チロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じうる、ICA512のフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型の存在または活性;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体の存在または活性;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体の存在または活性;
を促進する工程を含む、膵臓β-細胞におけるインスリンの発現を刺激することを含む、1型糖尿病または2型糖尿病を治療または予防する方法。 - (aa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有するICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、チロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じうる、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vii)(i)〜(vi)のいずれか一つの前駆型;そして
(ab)所望によっては、μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(b)核に対して標的化する能力を有するか、または前記細胞またはニューロン中のPIASタンパク質と相互作用する能力または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;
の、1型糖尿病または2型糖尿病を治療しまたは予防するための医薬組成物を調製するための使用。 - 前記PIASタンパク質が、PIASy、PIAS1、PIAS3、PIASxαまたはPIASxβである、請求項12に記載の使用。
- (a)試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aaa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有し、そして前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するか、および/または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有し、そして前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するか、および/または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)(i)〜(v)のいずれか一つの前駆型;そして
(aab)μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(ab)PIASタンパク質と相互作用する能力および/または核に対して標的化する能力を有するかまたは前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;そして
(ac)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;
を発現する試験細胞における前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔ここで、試験化合物の存在下におけるより高いレベルの発現が、発現の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロン中のペプチドホルモンの発現を刺激することができる薬剤をスクリーニングする方法。 - (a)試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aaa)(i)ICA512;または
(ii)ICA512機能を有するその誘導体;または
(iii)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有し、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するか、および/または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントを生じ得る、ICA512のフラグメント;または
(iv)μ-カルパインにより切断されて、核に対して標的化する能力を有し、そして前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するか、および/または前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、前記ICA512のC-末端フラグメントの誘導体を生じ得る、前記(iii)のフラグメントの誘導体;または
(v)μ-カルパインにより切断されて、前記細胞またはニューロン中でPIASタンパク質と相互作用する能力を有するICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体を生じ得る、ICA512のフラグメントまたは誘導体;または
(vi)(i)〜(v)のいずれか一つの前駆型;そして
(aab)μ-カルパイン、またはμ-カルパイン機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;または
(ab)PIASタンパク質と相互作用する能力および/または核に対して標的化する能力を有するかまたは前記細胞またはニューロン中のSTATの核内レベル、またはチロシンリン酸化、またはDNA結合活性を亢進させる能力を有する、ICA512のC-末端フラグメントまたはその誘導体;そして
(ac)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;
の、試験細胞における前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔ここで、試験化合物の存在下におけるより高いレベルの発現が、発現の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロンの細胞増殖を促進することができる薬剤をスクリーニングする方法。 - (a)試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aa)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(ab)ICA512のC-末端フラグメント、好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなるICA512のC-末端フラグメント;
を発現する試験細胞において、前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、発現の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロン中においてペプチドホルモンの発現を刺激することができる薬剤についてスクリーニングする方法。 - (a)試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aa)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(ab)好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなる、ICA512のC-末端フラグメント;
を発現する試験細胞において、前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、細胞増殖の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロンの細胞増殖を促進することができる薬剤についてスクリーニングする方法。 - (a)前記プロモータの誘導に際して、試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aa)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(ab)ICA512のC-末端フラグメント、好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなるICA512のC-末端フラグメント;
を発現する非ヒトトランスジェニック動物において、誘導可能なプロモータの制御下、前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、発現の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロン中のペプチドホルモンの発現を刺激することができる薬剤についてスクリーニングする方法。 - (a)前記プロモータの誘導に際して、試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(aa)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(ab)ICA512のC-末端フラグメント、好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなるICA512のC-末端フラグメント;
を発現する非ヒトトランスジェニック動物において、誘導可能なプロモータの制御下、前記ペプチドホルモンの発現を評価する工程〔ここで、試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、増殖の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、ペプチドホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロンにおけるペプチドホルモンの細胞増殖を促進することができる薬剤についてスクリーニングする方法。 - 前記試験細胞が、ホルモン-分泌性の内分泌細胞またはニューロンである、請求項14〜19のいずれか1項に記載の方法。
- 前記内分泌細胞が、膵臓β-細胞である、請求項14〜20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記分泌顆粒中に含有される分泌性ペプチドが、インスリンである、請求項21に記載の方法。
- 試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(a)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(b)ICA512のC-末端フラグメント、好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなるICA512のC-末端フラグメント;
を発現する試験細胞において、インスリンの発現を評価する工程〔ここで、試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、インスリン発現の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、膵臓β-細胞におけるインスリンの発現を刺激することができる薬剤についてスクリーニングする方法。 - 試験化合物の存在下および所望によってはその非存在下において、
(a)PIASタンパク質またはPIAS機能を有するそのフラグメントまたは誘導体;および/または
(b)ICA512のC-末端フラグメント、好ましくは成熟型ICA512のアミノ酸659〜979からなるICA512のC-末端フラグメント;
を発現する試験細胞におけるインスリンの発現を評価する工程〔試験化合物の存在下でのより高いレベルの発現が、細胞増殖の刺激因子として機能する能力の指標である〕、
を含む、膵臓β-細胞の細胞増殖を促進することができる薬剤についてのスクリーニング方法。 - 前記化合物が、化合物ライブラリの構成物質である、請求項14〜24のいずれか1項に記載の方法。
- 前記化合物ライブラリが、低分子ライブラリ、ペプチドライブラリ、抗体または抗体誘導体ライブラリである、請求項25に記載の方法。
- 前記誘導体が、模倣薬〔好ましくはペプチド模倣薬〕、ペプチドアプタマー、またはアンチカリンである、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法または使用。
- 動物モデルにおいて、前記ペプチドホルモンの発現を刺激するかまたはペプチドホルモン分泌性の内分泌細胞またはニューロンの細胞増殖を促進する能力を有するものとして評価される化合物の効率を試験することをさらに含む、請求項14〜27のいずれか1項に記載の方法。
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