JP2008507962A - 人骨組織を生産することが可能な、乳歯又は永久歯の及び歯胚の歯髄から得られた幹細胞 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、良好に修復するために、骨損失は、まだ制約のある段階である。骨損失は、部位(すなわち、歯周組織、あご、頭蓋顎顔面領域等に関連する)、特質、発生学的起源、機械的骨特性(海綿骨質の強度に関連がある; Trisi P. And Rao W. Bone classification: clinical-histomorphometric comparison. Clin. Oral Implants Res. 1999, 10: 1-7)及び量(それは、損失した骨の総量と定義することができる)に関連して分類することができる。
1−歯をあごに固定する解剖学的構造の欠損
歯は、歯肉、セメント、歯周靭帯及び歯槽骨からなる歯周組織によって歯槽骨に固定されている。歯周病は、遺伝子及び環境要因による多様な病気である。臨床症状は、歯槽骨吸収及び歯吸着の損失である。病気の程度は、含まれる縦骨損失及び関連する歯槽壁の数として評価される。歯根の最大長が、約20mmであれば、適所にまだある歯の最大縦骨損失は高くないかもしれない(Lindhe J., Parodontologia, Edi-Ermes, Milano, 1991)。歯周病は、流行性である。若干の地理的地域では、人口の10%以上は、5mm以上探ることができる歯周ポケットをもっている(Orozco A.H.ら、Periodontal treatment needs in a native island community in Columbia. Int. Dent. J. 2004, 54: 73-76)。これら全ての患者は、失われた歯槽骨を元に戻すために、特定の治療を必要とする。
これらの欠損には、例えば、部分的又は全体的な無歯顎(それは、歯槽骨吸収を引き起こす)、トラウマ及び腫瘍のようないくつかの原因がある。腫瘍のうち、口腔扁平上皮癌は、米国において、約30000の新しい症例を伴い、1年につき8000人が死亡する最も頻繁な口の悪性疾患である(Greenlee R.,ら、Cancer statistic. Cancer J. Clin. 2001, 51 : 15-36)。顔面のトラウマについて、ナショナルレポートはまだ入手されていないが、1つのセンターが1年につき1000人以上の患者に手術を施すことができると考えるならば、治療をうけている患者の数は非常に多い(Gassner R.ら、Cranio-maxillo-facial trauma: a 10 year review of 9,543 cases with 21,067 injures. J Craniomaxillofacial Surg. 2003, 31: 51-61)。
骨損失を決定するいくつかの原因がある。それらは、トラウマ後後遺症、腫瘍除去のための頭蓋及び顔面の切除ならびに奇形である。自己組織の骨移植を必要とする先天性奇形の例は、唇及び口蓋(この症例では、自己組織の骨移植は、歯槽頂裂に挿入される)ならびにトリーチャーコリンズ症候群(この症例では、肋骨が下顎骨を修復するために用いられる)である。
骨損失を測定するいくつかの要因がある。トラウマ後後遺症、腫瘍除去のための骨切除及び奇形である。これらの全ての症例では、欠損を修復するための自己組織の骨の有用性は、整形外科が日常の処理において克服しなければならない制約段階がある。
上述したように、骨量欠損が、側面において、約2、3mmであれば、骨欠損は軽症(歯周病でのように)、骨損失がより大きいならば、重症として分類されるかもしれない。
軽症の骨欠損において、歯周病を予防し、修復するためにいくつかの医療及び外科的方法がある。しかし、歯周病が重篤な場合、我々は骨欠損を修復することが必要である。これは、無生物材料又は非相同/異種移植材料を用いて達成することができる。両方とも、骨誘導及び/又は骨伝導をもたらすことができる。同じ症例において、歯科医は、上皮及びアンダーライン骨の間で物理的な分離を決定する膜を使うことができる。
いずれにせよ、将来有望な基準は、自己組織の骨の使用である。非相同/異種移植骨の使用は非自己反応及び未知の病気の伝染を招くかもしれず、一方、無生物材料の使用は欠損を修復することができず、さらに、感染症及び異物生体反応を誘発しやすい。
本発明の技術水準に関連するさらなる特許は、US n. 20020119180 (Yelicら)及びUS n. 20030068305 (Sramekら)である。US n. 20020119180は、動物モデルにおける歯胚を産生する方法を記載している。これらの歯胚は、失われた歯を修復するために、ヒトの歯肉に潜在的に挿入することができる。US n. 20030068305は、歯髄を収集するための方法及び特別なツールを記載している。
1)ヒト歯髄に由来し、間葉及び造血起源でない2種の幹細胞系を分離する方法を示す。これらの細胞系は、永久歯又は歯胚の歯髄に由来するとき、歯髄幹細胞由来間葉骨産生細胞(Mesenchymal Bone Producing cells derived from Dental Pulp Stem Cells:MBP− DPSC)と称し、乳歯の歯髄に由来するとき、ヒト剥離乳歯幹細胞由来間葉骨産生細胞(Mesenchymal Bone Producing cells derived from Stem cell of Human Exfoliated Deciduous teeth:MBP−SHED)と称する。それらは、選別機及び幹抗原を選択する特定のマーカーを用いた細胞蛍光メータ(cytofluorimeter)によって得ることができる、
2)骨を産生することができる骨芽細胞における幹細胞系双方の培養、伸張及び分化。生活(vital)生物学的材料のこの新たな種類は、生存自己組織骨(Living Autologous Bone:LAB)と称される。それは、MBP−DPSC及びMBP−SHEDに由来する生活骨芽細胞を含む線維性非層状骨である。これらの細胞は、ヒトの乳歯及び永久歯ならびに歯胚の歯髄に属する。双方のMBPはメディウム中へのいかなる骨形成薬の添加なしでも、骨芽細胞に分化することができ、派生骨芽細胞は、インビトロ及びインビボにおいて骨を産生する、
3)歯、顎顔面及び整形外科診療におけるLABの臨床応用のための方法、
4)LABの広範囲な生成法を示す。
1)乳歯及び永久歯のならびに歯胚のヒト歯髄(それぞれMBP−SHED及びMBP−DPSCと称される)由来の幹細胞の単離、
2)それらの伸張(つまり、クローン数の増加)、
3)それらの骨芽細胞への分化、
4)生存自己組織の骨(LAB)と称されるこれらの骨芽細胞によって産生された繊維性骨組織のインビトロにおける産生、
5)高い細胞活力を保証する特定の条件下でのLABの保存、
6)骨欠損を修復するためのドナー患者におけるLABの移植の方法を示す。
1)低減した侵入性、実際、抜髄を実行することによる抜歯を避けることが可能である、
2)サンプル収集が、前に用いられたスターン(stern)又は腸骨稜髄に対する歯で実行されるため、高い安全性、
3)サンプルが血液生成細胞を有さないため、多くのコロニーによって特徴付けれる一次培養、
4)いかなる骨形成薬又はスカホールドを添加することなく、LABの三次元組織化、これは、髄幹細胞に由来する骨芽細胞を用いて得られることができない。
さらに、DPSC及びSHED細胞は、動物モデルに移植するためにセラミックベクターの使用を必要とするが、LABは単独で移植することができる。
同様に、本発明とUS n. 20020119180(Yelicらによる)及びUS Patent n. 20030068305(Sramekら)とに多くの違いがある。US n. 20020119180は、動物モデルで歯胚を産生するための方法を示す。これらの歯胚は、失われた歯を修復するために、ヒトの歯肉に潜在的に移植することができる。US n. 20030068305は、本発明において示されるものとは完全に異なる、歯髄を収集し、支持された幹細胞を単離するための方法及び特別のツールを示す。
幹細胞を、神経隆線から産生される間葉細胞由来のヒト歯髄から単離する。
ヒトの歯髄から幹細胞を単離するために、歯を健康に、歯髄と口腔との間になんらの伝達がないことが必要である。患者は、抜歯(又は抜髄)の一週間前に専門の口腔予防措置を受けていなければならず、1日に2回、0.12%クロルヘキシジン溶液の口内洗浄によって抗菌予防を始めなければならない。サンプリングの直前の歯についての準備について種々の方法がある。歯冠を、数分間0.2%クロルヘキシジンジェルで覆う。次いで、歯を、無菌の鉗子で徐々に取り出し、鉗子で歯を維持することによって、歯髄をグレーシィ(Gracey)キューレットを用いて取り出す。その直後、歯髄を、消化溶液(下記参照)中に載置する。
いずれにせよ、歯髄は、4mlのPBS(0.1M、pH7.4)中に100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、500μg/mlクラリトロマイシンを含有し、3mg/mlのタイプIコラゲナーゼ、4mg/mlジスパーゼを添加した消化溶液中に載置される。溶液量は、消化される歯髄の量に依存しており、乳歯では2から4ml、永久歯又は歯胚では2から5mlで変動する。組織解離を促進するために、歯髄を、穏やかな振れで、37℃にて1時間消化溶液中で維持する。消化した時点で、溶液を、20%FBS、100μMの2P−アスコルビン酸、2mMのL−グルタミン、100U/mlのペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン(インビトロゲン、ミラノ、イタリア)が添加された10倍量のα−MEM培地に浸漬する。次いで、細胞懸濁液を、遠心処理し(140gで10分間)、試験管の底を、12mlの同じ培地で再懸濁し、70μmファルコン濾過器(ベクトン&ディキンソン、サニーヴェール、CA、USA)で濾過する。濾過後、細胞を25cm2のフラスコ中にいれる。フラスコを5%の二酸化炭素中、37℃でインキュベートし、メディウムを週に2回交換する。
c−キット、CD34及びSTRO−1陽性幹細胞を、培地に塗布する。それらは、各々のフラスコで増殖する。単離からの30日目までに、細胞は、40日目までにフラスコ内で線維性骨(LAB)を産生する細胞外有機マトリックスを産生し始め、そこでは、その形成の原因である同じ細胞が観察される。
インビトロで得られた鉱化生存自己繊維性骨(LAB)は、鉱化作用の間、ヒトの骨のそれらと同様の特徴を示し、実際、イメージは直接又は膜の骨化作用において、ヒトの骨のそれらに、全く非常に組み込む(imposable)ことができる。
1)特徴的及び特異的な幹細胞発現は、ヒトの乳歯及び永久歯又は歯胚の歯髄から、クレームされた方法によって得られる。永久歯の場合、幹細胞は、若年でない個人から得ている。2)幹細胞は、適切な処置によって、骨形成性サイトタイプに分化し、鉱化マトリックス、その後、自己鉱化生存骨を産生し始め、骨形成の間、ヒトの骨と同じ特徴を示す、3)組織学的、組織化学的(アリザリンレッドS、ALP、シュモール、H&E)、免疫蛍光的検査法(カルセイン及びオステオネクチン、オステオポンチン、フィブロネクチン、コラーゲンタイプIII及び骨アルカリホスファターゼに攻撃する抗体に陽性)及びX線回折観察は、鉱化作用の間、LABとヒトの骨とは類似であることを明確に示す。4)LABに存在する細胞は成長し、細胞学的修飾なしで骨を産生する、5)インビトロで得られた生活骨(LAB)は他のフラスコに容易に移すことができ、それは培地で成長し続ける、6)トリプシン処理の後、得られた骨細胞を、第二の培養フラスコで産生させることができる、7)24〜36時間、+4℃に維持した場合、その中のLAB及び細胞は、生きたままである、8)その中のLAB及び細胞を、細胞材料の従来技術の低温保存法を用いて、長期間、80℃未満の温度で、低温保存することができる。
細胞−ポリマー又は細胞−チタンの相互作用の効果は、組織学的、組織化学的(アリザリンレッドS、ALP、シュモール、H&E)、免疫蛍光的検査法(カルセインに、オステオネクチン、オステオポンチン、フィブロネクチン、コラーゲンタイプIII及びアルカリホスファターゼ骨に攻撃する抗体に陽性)、X線回折及び顕微鏡検査法(共焦、TEM及びSEM)研究で証明されている。
実施例1
乳歯からのLABの産生
a)外科段階
1)患者の選定−全ての被験者は、全身及び口腔疾患に対して健康であった。LAB生産を、2、6及び8歳の男性3人の患者の乳歯から得た。
2)研究への患者の準備−3人の患者(抜歯の1週間前)に、0.12%クロロヘキシジンで、専門衛生及び処置を施した。抜歯時の歯の処置に関して、抜歯前の数分間、臨床歯冠を0.2%クロルヘキシジンジェルで覆った。
1)初代培養の準備−濾過した溶液をフラスコに入れ、インキュベータ(37℃、5%二酸化炭素)に載置し、週に2回培地を交換した。
2)培養物の伸張−細胞をフラスコ内で増殖させ、少なくとも15日間培地中でそれらを放置した。
3)種々のクローンの特徴づけ−細胞数が十分である(約500000の細胞)と考えられたとき、細胞を、CD34、STRO−1及びc−キットを含む幹細胞のマーカーを用いて、FAC選別機によって選別した。
5)インビトロでの特定のMBP−SHEDクローンの伸張−細胞を、培地(aの3)で先に述べた)中で成長させた。
6)LABの産生−数度の継代の後、骨芽細胞(LAB)からクローン化された生存自己繊維性骨を得た。骨芽細胞への幹細胞の完全な分化のために、この段階を、約40日継続した。
8)組織学的研究のためのLABの使用。
永久歯からのLABの産生
a)外科段階
1)患者の選定−患者の選定を臨床パラメータ及び病理学的症状を考慮して行った。全被験者は、全身及び口腔疾患に対して健康であった。LAB生産を、30、32、34、35及び37歳の男性5人の患者の永久歯から得た。この段階で、歯のドナー部位を確認した。全ての第3臼歯、上2本、下3本。
3)歯髄抽出手順−局所麻酔の後、抜歯を、レーバー及び/又はクランプを用いて行った。下歯のために、この方法を、粘膜骨膜クラップの実行による外科的アクセスによって行った。クランプのブランチ間に摘出成分を維持し、口外で、歯成分を無菌外科布の上に載置し、0.12%のクロルヘキシジン溶液で洗浄した。従って、歯冠及び解剖歯根との間の分離によって、無菌水を灌注しながら、外科用マイクロモータに搭載された無菌カッターを用いて、歯髄腔を露出させた。歯髄を、グラシーキュベット及び/又は歯内ツール(やすりのような)を用いて収集し、5mlの1M消化溶液(4mlのPBS中、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、500μg/mlクラリトロマイシン(claritromycin)、3mg/mlタイプIコラゲナーゼ、4mg/mlジスパーゼを含有する)に、37℃で1時間、浸漬した。歯髄を、歯髄の分離を促進するために、消化の間、緩やかな攪拌下に維持した。消化の最後に、50mlの容積に、培地(α-MEMタイプ、20%のFCS、100μMの2Pアスコルビン酸、2mMのL−グルタミン、100U/Lのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンが添加されている)を添加し、サンプルを140gで10分間遠心分離した。試験管の底から、溶液12mlを取り出し、70μファルコン・ストレーナーを用いて濾過した。
1)初代培養の準備−濾過溶液をフラスコに入れ、37℃、5%二酸化炭素でインキュベートした。
2)細胞培養物の増殖−培地を、少なくとも15日間、1週間に2回交換した。
3)細胞の特徴づけ−細胞数が十分である(約500000の細胞)と考えられたとき、細胞を、CD34、STRO−1及びc−キットを含む幹細胞のマーカーを用いて、FAC選別機によって選別した。
5)インビトロでのMBP−DPSCの増殖−細胞を先の培地で培養した。
6)LABの産生−数度の継代を、幹細胞から分化骨芽細胞LAB産生を行った。この実験段階を、約40日継続した。
8)組織学的分析のため、フラスコからLABの収集。
歯胚からのLABの産生
a)外科段階
1)患者の選定−患者の選定を臨床パラメータ及び病理学的症状を考慮して行った。全被験者は、全身及び口腔疾患に対して健康であった。LAB生産を、15、16、17、17、18、20、20及び22歳の男女8人の患者の歯胚から得た。この段階で、歯のドナー部位(全ての歯胚はまだ萌出していない)を確認した。全ての第3臼歯、上3本、下5本。
2)患者の準備−抜歯の1週間前、患者に対して、抜歯を行う週の全ての日に、1日に2回、0.12%クロロヘキシジンで、専門衛生及び洗浄を施した。
1)初代培養の準備−濾過溶液をフラスコに入れ、37℃、5%二酸化炭素でインキュベートした。
2)細胞培養物の増殖−培地を、少なくとも15日間、1週間に2回交換した。
3)細胞の特徴づけ−細胞数が十分である(約500000の細胞)と考えられたとき、細胞を、CD34、STRO−I及びc−キットを含む幹細胞のマーカーを用いて、FAC選別機によって選別した。
5)インビトロでのMBP−DPSCの増殖−細胞を先の培地で培養した。
6)LABの産生−数度の継代を、幹細胞から分化した骨芽細胞LAB産生に行った。この実験段階は、約40日間必要とする。
8)組織学的分析のため、フラスコからLABの収集。
LAB特徴づけ
実施例1〜3から得られたLABサンプルを以下の分析に付した。
1)LAB数評価−生存自己組織骨形成を評価した。フラスコごとに石灰化された小塊の数を数え、若い及び老いた被験者の間で比較した。データを、平均±SDとして得た。
2)組織学的、組織化学的、免疫蛍光額的検査法−分化細胞及び石灰化マトリクスを、50/50の1Mトリプシン及び0.5%EDTAの溶液を用いてフラスコから取り出し、ついで、0.1MPBS中の4%ホルムアルデヒド中で、pH7.4、4℃にて48時間固定し、4℃で、pH7.4の0.1MのPBS中で洗浄し、次いで、脱水し、パラフィンに埋没し、薄片を作った(厚さ5μm)。スライドを、ヘマトキシリン−エオシン、アリザリンレッド及びシュモール硝酸銀で染色した。
スカホールドポリマーへのLABの形成及び発達
実施例1〜3の細胞サンプルを、85:15のp/p乳酸−共グリコール酸ポリマーの予備形成フラグメントが導入された円筒形の容器の内部に入れた(臨床診療において選択された形は、対象ドナーを修正するために骨格の骨欠損をたどるであろう)。予備形成されたスカホールドの三次元細胞コロニー化を、6回転/分の速度で回転するインキュベータ(ローラー・アパラタス・ウィートン)を用いて得る。約7日後に、細胞は全スカホールドにコロニー化し、同じポリマーの形状の3DLABを生じ、ポリマーマトリクスの一部で消化する。この時点で、スカホールドと細胞とのコンプレックスをインビボに移植することができ、それは骨格体の解剖学的−機能的連続性を回復させるであろう。インビボで、ポリマーマトリックス生物分解性のプロセスが継続し、徐々にコロニー化する細胞から分泌される新たに形成された骨マトリクスから置き換えられる。ポリマーマトリクスが消失し、システムの中央において、徐々にリモデル化に向かい、古い骨格の骨近傍から区別がつかなくなる生活骨を観察することができる。新たな骨の形成を、共焦顕微鏡検査(PBSで洗浄されたサンプルを、4℃にて30分間、0.2%のトリトンX100を含有する4%のホルムアルデヒド/PBS溶液で固定する)によって、実施例4に従って評価する。サンプルを10分間、室温にて、PBS中の0.1%のBSAで2回洗浄する。細胞サンプルを、ファロイジン(phaloidin)−FITC及び核彩色のためにブルーヘキストで分析し、次いで、+4℃で1時間インキュベートした。
チタンインプラント上の繊維性LABの形成及び発達
実施例5で示したのと同様に、LABは、チタン歯科用インプラント又は大腿部の人工装具のような非再吸収性の表面をコロニー化させることができる。実施例5と同様のプロトコールを用いて、人工装具材料表面を、7日以内に細胞によって被覆する。生体材料とヒト繊維性骨との間の骨同化がインビトロで起こり、治癒期、合併症及び失敗の危険を制限する。骨形成プロセスの効果は、実施例5でのように評価する。
Claims (28)
- MBP−SHED(ヒトの脱落した乳歯からの幹細胞由来間葉骨生成細胞)と称される、ヒト歯髄乳歯から選別及び単離によって得られる幹細胞個体群。
- MBP−DPSC(歯髄幹細胞由来間葉骨生成細胞)と称される、永久歯又は歯胚のヒト歯髄から単離によって得られる幹細胞個体群。
- c−キット、STRO−1及びCD34を発現する請求項1又は2の幹細胞個体群。
- 特定の因子なく、RUNX2を発現する骨形成前駆体、続いて、HLA1、CD44、RUNX2、CD54及びオステオカルシンを発現する骨芽細胞を誘発する骨形成前駆体に分化する請求項1〜3のいずれかに記載の幹細胞個体群。
- インビトロ及びインビボで繊維性骨マトリクスを生成することができる請求項4の骨芽細胞。
- LAB(生存自己組織の骨)と称される、繊維性骨を生成する生存骨芽細胞を含有する繊維性骨マトリクス。
- 無限に成長することができる請求項6の繊維性骨マトリクス。
- 骨欠損の修復のための自己組織移植の場合においてインビボで成長することができる請求項6又は7の繊維性骨マトリクス。
- 人工装具の表面にインビトロで成長させることができ、インプラントの骨同化を促進する3D骨マトリクスを生成する請求項6の繊維性骨マトリクス。
- 乳歯歯髄からMBP−SHED幹細胞を単離する方法であって、抜き出す第1工程、単離の第2工程を特徴とする請求項1に記載のMBP−SHED幹細胞を単離する方法。
- 抜き出す工程が、
最終的に口腔の微生物叢を減少させる消毒前処置、
摘出前に歯を被覆するための消毒ゲルの使用、
無菌表面への歯成分の堆積及び無菌の溶液での消毒、
歯髄腔の開口及び無菌状態での歯髄の抜き出しを特徴とする請求項10のMBP−SHED幹細胞を単離する方法。 - 単離工程が、
歯髄の酵素消化、
遠心分離及び/又は濾過による細胞フラクションの回収、
第1次培養物の入手、
それらの伸張、
CD34、STRO−1及びc−キットのような幹細胞マーカーの使用によるMBP−SHEDのFAC選別、
適切な培地中でのMBP−SHEDの伸張を特徴とする請求項10のMBP−SHED幹細胞を単離する方法。 - 歯髄の酵素消化を、振動下、37℃にて1時間、PBS中の3mg/mlタイプIコラゲナーゼ、4 mg/mlジスパーゼ、100U/mlペニシリン、100μg/mlストレプトマイシン、500μg/mlクラリトロマイシンを用いて行う請求項12の方法。
- 細胞伸張を、幹細胞増殖用の特定の培地を用いて得る請求項12の方法。
- 細胞伸張のための培地が、20%のウシ胎児血清、100μMのアスコルビン酸2P、2mMのL−グルタミン、100U/Lのペニシリン、100μg/mlのストレプトマイシンが添加されたα−MEM培地からなり、インキュベーションを、37℃、5%二酸化炭素で25cm2フラスコ中にて行い、1週間に2回培地を交換する請求項14の方法。
- 永久歯の歯髄又は歯胚からのMBP−DPSC幹細胞を単離する方法であって、抜き出す第1工程、MBP−DPSCの単離の第2工程を特徴とする請求項2に記載のMBP−DPSC幹細胞を単離する方法。
- 抜き出す工程を、請求項11と同様に行う、請求項16のMBP−DPSC幹細胞を単離する方法。
- 単離の工程を、請求項12から15と同様に行う、請求項16のMBP−DPSC幹細胞を単離する方法。
- MBP−SHED及びMBP−DPSCからLABを産生する方法であって、幹細胞骨形成性分化及びLAB産生を特徴とする請求項10〜18の方法。
- 繊維性骨マトリクスの製造方法であって、請求項1及び2の幹細胞を骨芽細胞系に分化し、請求項15の培地を含有するフラスコ中で、5〜10日間、細胞が融合するまで細胞増殖させることを特徴とする請求項19の方法。
- 1)無機材料の半球体の中央領域結晶において、コラーゲン繊維及び糖タンパクを生成するクラスター形成、
2)繊維性骨マトリクスの形成を伴う、請求項6の生存骨芽細胞を含有する、新たな鉱化骨マトリクス付着のためのこの構造の3次元組織化を特徴とする請求項20の繊維性骨マトリクスの製造方法。 - この材料は、細胞分化及び新たな繊維性骨の引き抜きを伴って、連続的に生成され、繊維性骨の製造プロセスは、栄養分及び空間が利用できる場合には連続的である請求項21の繊維性骨の製造方法。
- 繊維性骨マトリクスは、直接外科用インプラントに使用することができる1cmの厚みより厚く、1cm3の容積よりも大きなフラグメントによって構成される請求項19から22の繊維性骨マトリクスの製造方法。
- 骨芽細胞は、繊維性骨マトリクスをコロニー化し、インビボで骨集積化の製造を促進する3D構造を組織化する請求項19から23の繊維性骨マトリクスの製造方法。
- 細胞材料を保存するための従来技術を用いて、生物材料を4℃又は0℃未満の温度で保存する請求項18から24の繊維性骨マトリクスの製造方法。
- 歯、顎顔面及び整形外科の問題に関連する骨欠損の修復に使用することができる自己組織の生物学的材料製造するための請求項1及び2の幹細胞の使用。
- 歯、顎顔面及び整形外科の問題に関連する骨欠損の修復に使用することができる自己組織の生物学的材料製造するための請求項5の骨芽細胞の使用。
- 歯、顎顔面及び整形外科の問題に関連する骨欠損の修復に使用することができる自己組織の生物学的材料製造するための請求項7から9の繊維性骨マトリクスの使用。
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