BR102013000871A2 - Processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos - Google Patents
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Abstract
PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECIDUOS. Processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos, trata-se de mais uma alternativa de a coleta de células tronco de dentes decíduos durante o processo de extração dos mesmos cujo procedimento passa pela Coleta (1) de dentes decíduos será feita por dentistas e pediatras credenciados, envio (2) na qual o material coletado será enviado ao laboratório dentro de 24 horas após a coleta do dente, Processamento (3) que no momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação de cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental, todos o material coletado será inserido no kit de coleta R-Crio, na qual o mesmo será transportado
Description
-1/3- Relatório descritivo da patente de invenção: “PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS”.
Refere-se a presente invenção, a um processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos, mais precisamente a abertura de mais uma possibilidade de coleta de células tronco.
Durante a fase de estudo e desenvolvimento do processo, foram realizadas inúmeras pesquisas em diversos bancos de dados, sendo identificada a PI 0513773-0 A, sob o título Células tronco obtidas da polpa decídua ou de dentes permanentes e dos germes dentais, 10 capazes de produzir tecido ósseo humano. Essa tecnologia prevê o isolamento, crescimento, aplicação para produção de osso autólogo “in vitro”, com a preservação desse osso vivo e sua aplicação na reconstrução do tecido ósseo em pacientes.
O processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos trata da seqüência de procedimentos desde a coleta do dente 15 decíduo, isolamento das células tronco, sua expansão, indo até o armazenamento das células tronco em condições favoráveis a sua aplicação quando e se necessário, sendo que, para a operacionalização do processo foi desenvolvido um Kit de Coleta, de modo a permitir que o Dentista possa realizar a coleta em seu próprio consultório de acordo com protocolos técnicos e de prazos para envio pré-estabelecidos o qual denominou-se kit de 20 coleta.
O detalhamento dos procedimentos do processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos e da composição do kit de coleta de coleta será descrito de acordo com as fases listadas abaixo:
COLETA (Fase 1): A coleta de dentes decíduos será feita por dentistas e 25 odontopediatras credenciados, após assinatura, pelos pais da criança ou responsável legal e pelo clínico responsável, do contrato de prestação de serviço. Será recomendado que, antes da extração, a criança esteja saudável e livre de doenças infecciosas orais. Também será recomendado que, antes do momento da extração, o dente seja inspecionado para identificação de possíveis cáries ou infecções. O serviço apenas poderá ser contratado por 30 pais ou responsáveis legais de crianças livres de doenças infecciosas no momento da extração do dente. Será recomendado que, imediatamente em seguida à extração, o dente seja lavado com solução de 10 mL de soro fisiológico (solução incluída no Kit de coleta) -2/3- inspecionado por clínicos credenciados (A) e seja imediatamente imerso em meio de coleta, acondicionado em tubo de coleta (incluídos no Kit de coleta), colocado na caixa do Kit de coleta e armazenados em geladeira (temperatura média de 4°C) até o momento do envio.
ENVIO (Fase 2): Será recomendado que o Kit de coleta, juntamente com uma
cópia do contrato de prestação de serviço, seja enviado ao laboratório dentro de 48 horas após a coleta do dente sendo observado também o controle de qualidade (B).
PROCESSAMENTO (Fase 3): No momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação da cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental. O dente passará por três lavagens em solução de PBS IX (“phosphatebuffered saline”: 137 mMNaCl; 2.7 mMKCl; 4.3 mM Na2HP04; 1.47 mM KH2PO4, pH ajustado para 7.4) por 1 minuto, 1 lavagem em solução de 1% povidoneiodina por 2 minutos, 1 lavagem em solução de 0.1% tiossulfato de sódio por 1 minuto e uma lavagem em solução de PBS IX, por 30 segundos. A raiz será separada da coroa dental com o uso de bisturi estéril descartável. A polpa dental será acessada e isolada com 0 auxílio de lima ou cureta de Gracey, lavada duas vezes em solução de PBS IX suplementado com antibiótico (lOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina). As polpas serão colocadas em solução de colagenase tipo I e II e incubadas a 37°C por 40 minutos. Após a digestão enzimática, adicionaremos meio de cultivo celular Stem Pro MSC SFM XenoFree(Life Technologies / Invitrogen) suplementado com 15% AB-HumanSerum(Coming), lOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina e centrifugaremos por 5 minutos a 1500 g. O sobrenadante será descartado e o precipitado será ressuspendido em 5mL de meio de cultivo celular e transferido para garrafas de cultura (Corning) de 25 cm2 de área.
Os frascos de cultivo serão monitorados diariamente e frascos com contaminação ou indícios de início de contaminação serão descartados imediatamente. Frascos com populações celulares saudáveis serão monitorados quanto ao crescimento celular, com troca do meio de cultivo a cada 3 dias, sendo observado também o controle de qualidade (B).
CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO (fase 4): Após atingirem semiconfluência, o meio de cultivo será removido e as células serão lavadas uma vez com -3/3- PBS IX. Adicionaremos PBS IX e as células serão soltas da base das garrafas com uso do instrumento CellLifter (Corning). As células serão contadas com o uso do equipamento CellCountessRAutomatedCelICounter ( Life Technologies) e aliquotas de 0.5x105 células serão diluídas em meio de congelamento de células (20% de meio basal, 70% AB5 HumanSerum e 10% dimetilsulfoxido), colocadas em criotubos e congeladas com redução de I0C por minuto (com o auxílio do aparato 5100 Cryo 1°C Freezing Container ThermoScientific) até -85°C e, a seguir, transferidas para galões de nitrogênio líquido.
O Kit de coleta na qual o material coletado será transportado, é acondicionado em recipiente de isopor, tubo descartável com IOml de soro fisiológico, tubo de coleta (volume de 2 ml) com a.5 ml de meio coleta (Stem Pro MSC SFM XenoFreelOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina) , 1 pacote de gelo líquido e 1 folheto de instruções para armazenamento do dente e envio do kit.
O processo de coleta para congelamento e armazenamento de células tronco a partir da polpa de dentes decíduos além de ser rápido e eficaz, aumenta a possibilidade de armazenamento e recuperação de células tronco, sendo inédito e operacional, portanto atende aos quesitos de ineditismos a aplicabilidade industrial inerentes ao deferimento de uma patente.
Claims (6)
1. PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS, caracterizado por possibilitar a coleta de células tronco de dentes decíduos, sua expansão e posterior congelamento mediante o processo de extração dos mesmos.
2. PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Coleta (Fase 1) de dentes decíduos que será feita por dentistas e odontopediatras credenciados, após assinatura, pelos pais da criança ou responsável legal e pelo clínico responsável, do contrato de prestação de serviço. Será recomendado que, antes da extração, a criança esteja saudável e livre de doenças infecciosas orais. Também será recomendado que, antes do momento da extração, o dente seja inspecionado para identificação de possíveis cáries ou infecções. O serviço apenas poderá ser contratado por pais ou responsáveis legais de crianças livres de doenças infecciosas no momento da extração do dente. Será recomendado que, imediatamente em seguida à extração, o dente seja lavado com solução de 10 mL de soro fisiológico (solução incluída no Kit de coleta) inspecionado por clínicos credenciados (A) e seja imediatamente imerso em meio de coleta, acondicionado em tubo de coleta (incluídos no Kit de coleta), colocado na caixa do Kit de coleta e armazenados em geladeira (temperatura média de 4°C) até o momento do envio.
3. PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Envio (Fase 2) na qual o material coletado será enviado ao laboratório dentro de 48 horas após a coleta do dente sendo observado também o controle de qualidade (B).
4. PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por PROCESSAMENTO (Fase 3) que no momento da chegada do material, o dente será inspecionado visualmente, para identificação de cáries ou condições infecciosas que possam aumentar o risco de contaminação da cultura celular ou diminuir a eficiência do isolamento das células-tronco da polpa dental. O dente passará por três lavagens em solução de PBS IX (“phosphatebuffered saline”: 137 mMNaCl; 2.7 mMKCI; 4.3 mM Na2HP04; 1.47 mM KH2PO4, pH ajustado para 7.4) por 1 minuto, 1 lavagem em solução de 1% povidoneiodina por 2 minutos, 1 lavagem em solução de 0.1% tiossulfato de sódio por 1 minuto e uma lavagem em solução de PBS IX, por 30 segundos. A raiz será separada da coroa dental com o uso de bisturi estéril descartável. A polpa dental será acessada e isolada com 0 auxilio de lima ou cureta de Gracey, lavada duas vezes em solução de PBS IX suplementado com antibiótico (lOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina). As polpas serão colocadas em solução de colagenase tipo I e II e incubadas a37°C por 40 minutos. Após a digestão enzimática, adicionaremos meio de cultivo celular Stem Pro MSC SFM XenoFree(Life Technologies / Invitrogen) suplementado com 15% ABHumanSerum(Corning), lOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina e centrifugaremos por 5 minutos a 1500 g. O sobrenadante será descartado e o precipitado será ressuspendido em 5mL de meio de cultivo celular e transferido para garrafas de cultura (Corning) de 25 cm2 de área. Os frascos de cultivo serão monitorados diariamente e frascos com contaminação ou indícios de início de contaminação serão descartados imediatamente. Frascos com populações celulares saudáveis serão monitorados quanto ao crescimento celular, com troca do meio de cultivo a cada 3 dias, sendo observado também 0 controle de qualidade (B).
5. PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO (fase 4) que será realizado após atingirem semiconfluência, o meio de cultivo será removido e as células serão lavadas uma vez com PBS IX. Adicionaremos PBS IX e as células serão soltas da base das garrafas com uso do instrumento CellLifter (Corning). As células serão contadas com 0 uso do equipamento CellCountessRAutomatedCellCounter ( Life Technologies) e alíquotas de 0.5x105 células serão diluídas em meio de congelamento de células (20% de meio basal, 70% ABHumanSerum e 10% dimetilsulfoxido), colocadas em criotubos, com congeladas com redução de I0C por minuto (com o auxílio do aparato 5100 Cryo 1°C Freezing Container ThermoScientifíc) até -85°C e, a seguir, transferidas para galões de nitrogênio líquido.
6.PROCESSO DE COLETA PARA CONGELAMENTO E ARMAZENAMENTO DE CÉLULAS TRONCO A PARTIR DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Kit de coleta na qual o material coletado será transportado, é acondicionado em recipiente de isopor, tubo descartável com IOml de soro fisiológico, tubo de coleta (volume de 2 ml) com a.5 ml de meio coleta (Stem Pro MSC SFM XenoFreelOOU/mL de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina) , 1 pacote de gelo líquido e 1 folheto de instruções para armazenamento do dente e envio do kit (Fase 4).
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