WO2017079813A1

WO2017079813A1 - Processo de tratamento de células tronco provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento

Info

Publication number: WO2017079813A1
Application number: PCT/BR2016/000007
Authority: WO
Inventors: José Ricardo MUNIZ FERREIRA; Roberto DALTO FANGANIELLO
Original assignee: Muniz Ferreira José Ricardo; Dalto Fanganiello Roberto
Priority date: 2015-11-10
Filing date: 2016-01-19
Publication date: 2017-05-18

Abstract

Processo de tratamento (coleta, acondicionamento, transporte, processamento, controle de qualidade) de células tronco provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento refere-se ao processo de coleta para congelamento e armazenamento de Células Tronco (2) a partir da polpa de dentes decíduos, trata da sequência de procedimentos desde a coleta do dente decíduo, indo até o armazenamento das Células Tronco (2) em condições favoráveis a sua aplicação quando e se necessário, sendo que, para a operacionalização do processo foi desenvolvido um Kit de Coleta, de modo a permitir que o Dentista possa realizar a coleta em seu próprio consultório de acordo com protocolos técnicos e de prazos para envio pré-estabelecidos o qual denominou-se kit R-Crio, por fim a abertura de mais uma possibilidade de protocolo prevendo desde coleta até o armazenamento e posterior descongelamento das Células Tronco (2) provenientes da polpa decídua para aplicação em terapias celulares e gênicas.

Description

Processo de tratamento de células tronco provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior

criopreservação e descongelamento.

[001] Refere-se a presente invenção, ao processo de tratamento

(coleta,acondicionamento, transporte, processamento, controle de qualidade) de Células Tronco provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento, mais precisamente a abertura de mais uma possibilidade de protocolo prevendo desde coleta até o armazenamento e posterior descongelamento das Células Tronco provenientes da polpa decídua para aplicação em terapias e estudos que envolvam Biomedicina Regenerativa.

[002] Durante a fase de pesquisa e desenvolvimento do processo, foram realizadas inúmeras pesquisas em diversos bancos de dados, sendo identificada a PI 0513773-0 A, que sob o título Células Tronco (2) obtidas da polpa decídua ou de dentes permanentes e dos germes dentais, capazes de produzir tecido ósseo humano. Essa tecnologia prevê o isolamento, crescimento, aplicação para produção de osso autólogo "in vitro", com a preservação desse osso vivo e sua aplicação na reconstrução do tecido ósseo em pacientes.

[003] O processo de coleta para congelamento e armazenamento de Células

Tronco (2) a partir da polpa de dentes decíduos, trata da sequência de procedimentos desde a coleta do dente decíduo, indo até o armazenamento das Células Tronco (2) em condições favoráveis a sua aplicação quando e se necessário, sendo que, para a operacionalização do processo foi desenvolvido um Kit de Coleta, de modo a permitir que o Dentista possa realizar a coleta em seu próprio consultório de acordo com protocolos técnicos e de prazos para envio pré-estabelecidos o qual denominou-se kit R- Crio.

[004] O processo de tratamento (coleta, acondicionamento, transporte,processamento, controle de qualidade) de Células Tronco (2) provenientes dá polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento, poderá ser melhor compreendido através da descrição detalhada em consonância com as seguintes figuras em anexo, onde:

FIGURA 01 Apresenta uma ilustração do dente e a região de corte do processo de tratamento (coleta, acondicionamento, transporte, processamento, controle de qualidade) de Células Tronco (2) provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento.

FIGURA 02 Apresenta uma ilustração da Garrafa de Cultura para o processo de tratamento (coleta, acondicionamento, transporte, processamento, controle de qualidade) de Células Tronco (2) provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento.

FIGURA 03 Apresenta uma visão geral indicada da Câmara de Neubauer - Câmaras de Inserção da Amostra (A).

FIGURA 04 Apresenta uma vista geral da Câmara de Neubauer.

FIGURA 05 Apresenta uma das caixas da Lamínulas e as Lamínulas.

FIGURA 06 Apresenta uma vista do acoplamento da lamínula sobre as entradas da amostra.

FIGURA 07 Apresenta uma vista das entradas (A ou B) da câmara de contagem Neubauer

FIGURA 08 Apresenta uma ilustração dos quadrantes da Câmara de Neubauer.

FIGURA 09 Apresenta uma ilustração da Contagem e Viabilidade Celular dos quadrantes da Câmara de Neubauer.

FIGURA 10 Apresenta imagens das Características das Células;

FIGURA 11 Apresenta uma analise dada pela Coloração dos depósitos de Cálcio e

Visão Macroscópica da placa, indicando o controle negativo (7) e positivo (8).

FIGURA 12 Apresenta uma analise da coloração, indicando o controle positivo e o controle negativo.

FIGURA 13 Apresenta as vesículas lipídicas intracelulares.

FIGURA 14 Apresenta uma visão geral do equipamento.

FIGURA 15 Apresenta uma visão do equipamento (solução).

FIGURA 16 Apresenta um exemplo do PLOT gerado e seu resultado em porcentagem. FIGURA 17 Apresenta o ANEXO 1 dado pelos Cariótipos (imagens ilustrativas).

FIGURA 18 Apresenta a continuação do ANEXO 1 dado pelos Cariótipos (imagens ilustrativas).

FIGURA 19 Apresenta a continuação do ANEXO 1 dado pelos Cariótipos (imagens ilustrativas).

FIGURA 20 Apresenta a continuação do ANEXO 1 dado pelos Cariótipos (imagens ilustrativas).

FIGURA 21 Apresenta a continuação do ANEXO 1 dado pelos Cariótipos (imagens ilustrativas). [005] Detalhamento dos procedimentos do processo de coleta para congelamento e armazenamento de Células Tronco (2) a partir da polpa de dentes decíduos e da composição do Kit R-Crio de coleta.

[006] Todo o processo obedece a sequência abaixo descrita.

[007] Coleta:

[008] A coleta de dentes decíduos será feita por dentistas credenciados, após assinatura, pelos pais da criança ou responsável legal e pelo clínico responsável, do contrato de prestação de serviço. Será recomendado que, antes da extração, a criança esteja saudável e livre de doenças infecciosas orais. Também será recomendado que, antes do momento da extração, o dente seja inspecionado para identificação de possíveis cáries ou infecções que deverão ser tratadas antes da coleta. Será recomendado que, imediatamente em seguida à extração, o dente seja lavado com solução de clorexidina 0,12% e imediatamente imerso em meio de coleta, acondicionado em tubo de coleta (incluídos no Kit R-Crio), colocado na caixa do Kit R-Crio de coleta e armazenados em geladeira (temperatura média de 4°C) até o momento do envio,

[009] Envio:

[010] Será recomendado que o kit R-Crio de coleta, juntamente com uma cópia do contrato de prestação de serviço, seja enviado ao laboratório da R-Crio dentro de até 48 horas após a coleta do dente sendo observado também o controle de qualidade. O kit R-Crio é composto de:

- Caixa térmica com termómetro que verifica a temperatura interna da caixa, devidamente calibrado segundo Inmetro

- Barras de gelo para manter a temperatura interna da caixa térmica

- Rack para colocação do tubo com meio de transporte

- Algodão para colocação na base do tubo, para absorver o meio de transporte em caso de derramamento.

- Embalagem secundária, para ser utilizada como invólucro do tubo após o procedimento

- Lacre com identificação em número unívoca, para ser colocado na parte externa da caixa térmica. - Meio de transporte, composto de meio de cultura basal (RPM ou DMEM) suplementado com Etreptomicina Penicilina, o que garante a viabilidade das células durante o transporte e evita o crescimento de microorganismos.

[011] Processamento de amostra:

[012] Objetivo:

[013] Padronizar o processamento das amostras descrevendo e detalhando as etapas realizadas.

[014] Definições e abreviaturas:

- PBS: Tampão Fosfato de Potássio;

- PBS P/S: Tampão Fosfato de Potássio com Penicilina / Estreptomicina;

- PBS P/S/A: Tampão Fosfato de Potássio com Penicilina / Estreptomicina/ Anfotericina;

- U.V.: Ultra Violeta;

- XenoFree: Livre de xenobióticos;

- Meio RPMI: meio de cultura desenvolvido pelo Instituto Roswell Park Memorial;

- Meio DMEM: Meio Eag e Modíficadopor Duíbecco/ Médium;

- DMSO: Dimetil Sulfóxido;

- TA: Temperatura Ambiente;

- B.M.: Banho Maria;

- RPM: Rotações por minuto;

- ATM: atmosfera.

[015] Procedimento:

[016] 1 - Preparação para processamento da amostra:

[017] 1.1.1- Materiais inanimados:

- 02 Pipetas graduadas estéreis de 10 ml;

- 06 Pipetas Pasteur estéreis de 3,5 ml ;

- 02 Pacotes de wiper's estéreis;

- 01 Criotubo de 1,2 ml;

- 01 Tubo estéril de 15 ml ;

- 02 Placas de petri estéreis 90x15 com três divisórias;

- 02 Tubos tipo falcon de 50 ml estéril;

- 01 Garrafa de Cultura de 25 cm^2; - 01 Pipetador (semi automático e/ou manual);

- 01 Alicate de corte estéril;

- 02 Pinças estéreis;

- 01 Alicate de ponta grossa;

- 01 Cureta de Gray;

- 01 Lima de Kerr n°25 ou lima extirpa polpa;

- 01 Lima de Kerr n°35 ou lima extirpa polpa;

- 01 Bisturi com haste estéril;

- 01 Lâmina de Bisturi.

[018] 1.1.2- Soluções:

- 5 ml de Solução A (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina e Anfotericina);

- 5 ml de Solução de Clorexidina 2%;

- 5 ml de Solução de Tiossulfato de Sódio 0,1%;

- 5 ml Solução B (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina);

- 2 ml de Meio XenoFree Completo, previamente aquecido a 37°C;

- 4 ml de meio RPMI, previamente aquecido a 37°C;

- 2 ml de Solução B (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina);

- 3 ml de Solução de PBS IX;

- 1 Vial de 1,5 ml de Solução de Colagenase 0,3 %.

[019] Observações: Apenas os Materiais Inanimados são colocados dentro dacabine e expostos à luz U.V.

[020] 1.2- Processamento da amostra (dente de leite ou terceiro molar):

[021] O processo realizado na amostra é dividido em 4 partes: Limpeza; Corte;

Coleta e Digestão da Polpa e Cultura. Exceto as etapas de centrifugação da amostra, todo o procedimento é realizado em Cabine de Segurança Biológica. A cnopreservação da Polpa só ocorrerá quando houver quantidade abundante da mesma. Abaixo encontra- se o detalhamento do procedimento a ser realizado.

[022] 1.2.1 - Limpeza do dente:

[023] A primeira etapa realizada no processamento é a limpeza do dente. Para isso utiliza-se quatro soluções, esterilizadas por filtração a 0,22 μηι:

- Solução A (PBS lx, penicilina estreptomicina e anfotericina);

- Gluconato de Clorexidina à 0,2%;

- Tiossulfato de Sódio a 0,1% v/v; - Solução B (PBS lx, penicilina/estreptomicina).

[024] Realizar a limpeza do dente conforme descrito abaixo:

- Separar os tubos com as soluções de limpeza em estante;

- Com o auxílio de uma pinça estéril, retirar o dente do tubo de transporte, previamente higienizado com álcool 70°GL e transferir para Solução A de PBS (Penicilina Estreptomicina/Anfotericina);

- Homogeneizar suavemente o tubo por 1 minuto;

- Após o período, retirar o dente com a pinça e com movimentos suaves, retirar o excesso da solução;

- Transferir o dente para outro tubo com a solução de Clorexidina 0,2%;

- Homogeneizar suavemente o tubo por 1 minuto;

- Retirar novamente o dente, remover o excesso da solução e transferir para o próximo tubo com a solução Tiossulfato de Sódio 0,1%;

- Homogeneizar suavemente o tubo por 1 minuto, remover o dente e novamente retirar o excesso da solução;

- Transferir para a Solução B de PBS (Penicilina Estreptomicina);

- Homogeneizar novamente por 1 minuto e transferir o dente para placa de Petri estéril.

[025] 1.2.2- Corte:

[026] A segunda etapa realizada é o corte do dente, na região entre a coroa e a raiz(amelo-cementária), para obter o acesso à câmara pulpar. Abaixo encontra-se uma foto ilustrativa para conhecimento da estrutura do dente, localização da região de corte (1), localização da câmara pulpar.

- Colocar um tubo tipo Falcon de 50 ml estéril em uma estante apropriada e deixar a tampa semi-aberta;

- Com o auxílio de uma pinça reta cirúrgica estéril ou alicate apropriado, segurar o dente com umas das mãos.

- Com o auxílio de um alicate de corte estéril, posicionar o mesmo na junção amelo- cementária e segurar o dente;

- Retirar a tampa do tubo e inserir o dente, segurado pelo alicate de corte dentro do tubo.

- Realizar o corte.

[027] 1.2.3- Coleta e Digestão da polpa:

[028] A terceira etapa realizada é a coleta e a digestão da polpa. Esta etapa é realizada de maneira suave e com materiais específicos, garantindo assim a qualidade do material coletado. - Identificar um tubo de fundo cónico de 15 ml (Identificação do beneficiário unívoca), contendo 2 mL de Solução B (PBS /Penicilina/Estreptomicina);

- Com o auxílio de uma extirpa polpa e/ou uma cureta (Lima err 25 ou 35 mm), retirar toda a polpa possível e transferir diretamente para o tubo de fundo cónico, contendo 2 mL de Solução B de (PBS /Penicilina Estreptomicina);

- Homogeneizar o tubo suavemente por alguns segundos;

- Centrifugar o tubo por 5 minutos a 1000 RPM;

- Adicionar de 1,5 ml de solução enzimática de Colagenase 0,3% estéril;

- Submeter à incubação em banho-maria, com uma temperatura de 37 ±2°C por 15 a 30 minutos. Verifique visualmente o branqueamento e esfacelamento do material no interior do tubo, característico da digestão da polpa;

- Ao término da incubação, adicionar 3 ml de meio basal (RPMI ou DMEM) pré- aquecido a 37°C em Banho Maria;

- Homogeneizar o tubo e submeter a centrifugação por 5 minutos a 1000 RPM.

- Dispensar o sobrenadante;

- Adicionar 3ml de solução de PBS IX e submeter o tubo a centrifugação por 5 minutos a 1000 RPM para lavar o material;

- Dispensar o sobrenadante;

- Com este pellet será realizado a etapa de cultivo.

[029] 1.2.4- Cultivo Celular:

[030] A quarta etapa realizada é o cultivo celular. Nesta etapa ocorre a transferência do material para uma garrafa de cultura e posterior incubação da amostra em condições adequadas para expansão. Proceder conforme descrito abaixo:

- Identificar uma garrafa de 25 cmⁱ com a etiqueta de identificação unívoca do beneficiário;

- Ressuspender o conteúdo do tubo com 2 ml de meio Xenofree Completo;

- Homogeneizar o tubo e transferir todo o conteúdo para garrafa de 25 cm² também identificada;

- Submeter esta garrafa à incubação em estufa com uma temperatura de 37 ± 1°C e uma atmosfera de 5% de C0₂;

- Caso a garrafa não possua filtro em sua tampa, deixar a mesma semi-aberta desrosqueando-a levemente ao posicioná-la na prateleira da incubadora. Verificar o espaço reservado antes de abrir porta da incubadora; acompanhamento e troca de meio.

[031 ] Acompanhamento e troca de meio:

[032] Objetivo: padronizar o acompanhamento e troca de meio das amostras, durante a fase de crescimento e expansão celular, descrevendo e detalhando as etapas realizadas.

[033] Definições e abreviaturas:

[034] Confluência - Diminuição dos espaços entre as células com formação de uma camada ou tapete de células, devido a multiplicação e aumento do número de células em um frasco de cultura.

- UFC(Unidades Formadoras de Colónias).

[035] Debris - Resíduos celulares.

[036] PROCEDIMENTO: PREPARAÇÃO PARA O PROCEDIMENTO.

[037] Materiais Inanimados:

- Kit de mangueiras para sucção (Aspiramax);

- Ponteira de 0,2 ml sem filtro estéril;

- 02 Pipetas sorológicas de 10 ml estéril;

- 08 Pipetas Pasteur estéril de 6 ml;

- 01 tubo de fundo cónico de 50 ml para descarte de resíduos;

- 02 Pacotes de ipers.

[038] Soluções:

- Alíquota de Meio Xenofree completo previamente aquecido a 37°C;

- Alíquota de Solução B (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina) previamente aquecido a

37°C;

- Álcool 70°GL.

[039] Observações: Apenas os Materiais Inanimados são colocados dentro da cabine e expostos à luz U.V. As soluções são revestidas em saco plástico e inseridas em Banho Maria a 37°C.

[040] Características das Células Observadas durante o Acompanhamento:

- Células Puntiformes Não aderidas: São células arredondadas refringentes, ou seja, cuja imagem em microscópio assemelha-se a um ponto de luz, porém não estão aderias ao fundo da garrafa, permanecendo suspensas no sobrenadante da garrafa. - Alguns pontos com Células Aderidas não espraiadas: São células arredondadas, refringentes e que estão no processo inicial de adesão, ou seja, ainda estão aderidas ao fundo da garrafa, porém não estão com formato fusiforme e espraiado.

- UFCs Aderidas e/ou Semi aderidas: São "bolsas" ou conjuntos de células arredondadas, refringentes que estão no início de processo para liberação de células espraiadas.

- UFCs Aderidas liberando células espraiadas: São "bolsas" ou conjuntos de células arredondadas, refringentes totalmente aderidas, envolta por células fusiformes e espraiadas.

- Raros pontos de Células espraiadas: São células aderidas, espraiadas e fusiformes em poucos pontos da garrafa. Geralmente são encontradas antes do início de sua multiplicação ou após a passagem para expansão.

- Células Espraiadas, Fusiformes, esparsas: São células com as características mencionadas, em vários lugares da garrafa, porém sem confluência, ou seja, com espaços grandes entre o crescimento das células. Geralmente são encontradas no início de sua multiplicação.

- Vários pontos com crescimento de Células Espraiadas: São células com as características mencionadas, em vários lugares da garrafa e com o início de confluência.

- Baixa Confluência: São células em estágio avançado de crescimento e multiplicação, com pouco espaço entre as células e confluência aproximada de 30 a 40 %. Ainda não estão aptas para passagem.

- Apta para Passagem: São células com crescimento homogéneo em toda a garrafa, nesta fase as grandes quantidades de células formam um "tapete" ou uma "monocamada" de células, que cobrem a superfície do fundo da garrafa em uma porcentagem entre 60 a 90%. Quando as células são encontradas nesta etapa de desenvolvimento a passagem para garrafa maior ou criopreservação, deve ser realizada.

[041] Acompanhamento do Crescimento das Células:

- Embeber um pano apropriado com álcool 70°GL e limpar as bordas da incubadora;

- Borrifar e espalhar álcool nas mãos;

- Verificar no mapa da incubadora onde a amostra que será verificada está;

- Abrir a incubadora, pegar a amostra e fechar a tampa da garrafa de cultura;

- Transportar a garrafa suavemente na posição horizontal, atentando-se para que o meio sobrenadante não encostar-se à tampa; A- Realizar a limpeza da base da garrafa com pano embebido em álcool 70°GL;

- Encaixar a garrafa na mesa do microscópio e selecionar a objetiva de 10X;

- Analisar a garrafa como um todo para registrar um parecer homogéneo da garrafa;

- Seguir a Técnica para Verificação Homogénea da Garrafa de Cultura em Microscópio descrita na figura 02.

- Iniciar o cronometro, pré-ajustado para 5 minutos;

- Ajustar o foco e realizar as observações;

[042] Atenção: Não exceder o tempo de 5 minutos para a verificação em microscópio, a fim de não perturbar a evolução e o crescimento celular. Exposições longas à luz podem atrapalhar o crescimento celular, assim como o tempo fora da incubadora apropriada pode diminuir a concentração de C0₂.

[043] Períodos e Cuidados no Acompanhamento:

[044] Os períodos e cuidados estabelecidos abaixo, são de extrema importância para a obtenção de células viáveis, assim como garantem a qualidade e eficácia no crescimento das células.

- Realizar o início do acompanhamento entre 3 a 5 dias após o processamento da amostra;

- Realizar a limpeza da garrafa com pano embebido em álcool, após a retirada da garrafa da incubadora e antes de devolvê-la a mesma;

- O acompanhamento da amostra deve ser realizado o mais rápido possível, afim de não perturbar e comprometer a qualidade das células;

- Não exceder o tempo de 5 minutos quando a amostra estiver sendo observada em microscópio;

- Realizar o transporte da garrafa de maneira mais suave possível;

- Após os 5 minutos, voltar a garrafa a incubadora e deixá-la por 10 minutos, antes de analisá-la novamente;

- Após a manipulação da amostra e retorno para incubadora, verificar se a tampa da garrafa está desrosqueada, caso a mesma não possua sistema de ventilação por filtro.

[045] Troca de meio:

[046] A troca de meio ocorre a partir do início do acompanhamento da amostra,

OU seja, entre o 3^o e 5^o dia após o processamento. Existem dois métodos para a realização da troca de meio, sendo um a Troca de Meio com Equipamento de Sucção e o outro a Troca de Meio com Pipeta. Com relação ao protocolo utilizado, também existem dois tipos, sendo um a Troca de 2/3 do Meio e o outro a Troca de Volume Total do Meio.

[047] Volume adequado para troca do meio:

[049] Abaixo encontram-se as descrições dos métodos de troca de meio que podem ser utilizados.

[050] Troca de Meio com Equipamento de Sucção:

[051] O Kit de mangueiras para a sucção é embalado em duas partes, sendo uma apenas com a mangueira e o outro com a mangueira, o engate rápido e a conexão da ponteira. O kit é fornecido ao setor de processamento em embalagem apropriada e estéril.

- Inserir a embalagem com a mangueira, o engate rápido e a conexão da ponteira, em cabine de segurança biológica;

- Abrir a outra embalagem, na área externa, inserir uma extremidade da mangueira no equipamento de aspiração e a outra extremidade, inserir na cabine de segurança biológica;

- Abrir a outra embalagem, com a mangueira de silicone, a ponteira de sucção e o engate rápido, e conectar à mangueira ligada ao equipamento;

- Na parte interna da cabine, ligar o aspirador;

- Com o auxílio da ponteira de sucção, conectar a ponteira de 200 μL estéril;

- Abrir a garrafa e inserir a ponteira de sucção o suficiente para retirar o meio da garrafa. [052] Troca de Meio com Pipeta:

- Abrir a garrafa e inserir a pipeta o suficiente para retirar o meio da garrafa;

- Dispensar o meio em descarte apropriado.

[053] Troca de 2/3 do Meio:

[054] Essa troca é realizada nos primeiros 15 dias de incubação, para acelerar o crescimento das células devido aos fatores parácrinos liberados pela mesma. A utilização ou não deste protocolo, irá depender do acompanhamento das células ao longo do processo.

[055] Abaixo encontra-se o detalhamento deste processo:

- Verificar no registro anterior o volume de meio da garrafa de cultura;

- Em Cabine de segurança biológica, retirar a tampa da garrafa e colocá-la ao lado, virada para cima;

- Escolher o método que será utilizado para a aspiração do meio sobrenadante;

- Realizar a aspiração de maneira suave, do volume correspondente a 2/3 do total, e introduzindo o mínimo possível da pipeta/ponteira à garrafa;

- Dispensar o volume adequado de meio pré-aquecido, de maneira suave, do lado oposto à superfície de crescimento celular;

- Fechar a garrafa utilizando técnicas assépticas.

- Verificar no mapa a posição de incubação da amostra;

- Coldcá-la no local e caso a tampa da garrafa Não tiver filtro, desrosqueie a mesma i

deixando-a semi aberta.

[056] Troca de Volume Total do Meio:

[057] Essa troca é realizada durante as passagens da amostra, quando as células já encontram-se adaptadas ao meio e na fase log de multiplicação.

[058] Abaixo encontra-se o detalhamento deste processo:

- Realizar a aspiração de maneira suave, de todo o volume da garrafa e introduzindo o mínimo possível da pipeta/ponteira à garrafa;

- Dispensar o volume adequado, de acordo com a garrafa, de Solução B no lado oposto ao crescimento das células; - Virar a garrafa e homogeneizá-las com movimentos suaves, fazendo com que o líquido se espalhe por toda a superfície inferior da mesma, limpando a monocamada;

- Com o auxílio da ponteira de sucção ou pipeta, retirar a Solução B "suja";

- Caso ainda sejam verificados Debris celulares, realizar a limpeza novamente;

- Fechar a garrafa utilizando técnicas assépticas;

- Verificar no mapa a posição de incubação da amostra;

- Colocá-la no local e caso a tampa da garrafa Não tiver filtro, desrosqueie a mesma deixando-a semi-aberta.

{059] Expansão ou passagem celular:

[060] Objetivo: Padronizar o procedimento de expansão celular ou passagem celular, descrevendo e detalhando as etapas.

[061] Definições e abreviaturas:

[062] Confluência - Diminuição dos espaços entre as células com formação de uma camada ou tapete de células, devido a multiplicação e aumento do número de células em um frasco de cultura.

[063] Debris - Resíduos celulares

[064] Procedimento: Preparação para expansão ou passagem da amostra.

[065] Materiais Inanimados:

- Kit de mangueiras para sucção (Aspiramax);

- Micropipetas de 1000, 200 e 20μΙ.;

- Ponteira de 1 ,0, 0,2 ml com e sem filtro estéril;

- 05 Pipetas sorológicas de 10 ml estéril;

- 06 Pipetas pasteur estéril;

- 03 Tubos tipo eppendorf;

- 03 Tubos de fundo cónico de 15 ml ou tubo adequado para centrifugação estéril;

- 02 Garrafas de cultura 25 cm²;

- 02 Garrafas de cultura 75 ou 175 cm² (Caso for realizada o a expansão pós Split);

- Etiquetas para identificação das garrafas.

[066] Soluções:

- Meio Xenofree completo previamente aquecido a 37°C;

- Meio RPMI previamente aquecido a 37°C; - Solução B (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina) previamente aquecido a 37°C;

- Solução de Accutase para destacamento celular;

- Solução de Tripan Blue 0,4% (Caso seja realizado a contagem e viabilidade). Atenção: Tóxico.

[067] Expansão ou Passagem Celular:

[068] O procedimento de expansão ou passagem celular, ocorre quando as amostras atingem confluência adequada, conforme Foto 1 - Apta para Passagem ou Criopreservação.

[069] A amostra após o processamento corresponde a passagem zero, ou seja, as células que cresceram estavam na polpa e ainda não foram transferidas para uma nova garrafa.

[070] Split para Controle de Qualidade e Criopreservação (Primeira passagem) quando o crescimento da amostra pós processamento atmgir a confluência adequada, é realizado o Split pra Controle de Qualidade, onde a suspensão deste crescimento é dividida e transferida para duas garrafas de 25 cm².

[071] As expansões são realizadas nas duas garrafas, de forma idêntica, ou seja, uma garrafa para Controle de Qualidade e uma garrafa para Criopreservação.

[072] As duas garrafas do Split (CRIO e C.Q.), são trabalhadas simultaneamente, utilizando os mesmos materiais e soluções.

[073] Para isso, proceder conforme descrito abaixo:

- Identificar com etiqueta, as garrafas que irão para criopreservação e para o controle de qualidade;

- Dispensar o volume adequado, de acordo com a garrafa, de Solução B no lado oposto ao crescimento das células;

- Virar a garrafa e homogeneizá-las com movimentos suaves, fazendo com que o líquido se espalhe por toda a superfície inferior da mesma, limpando a monocamada;

- Caso ainda sejam verificados debris celulares, realizar a limpeza novamente; - Adicionar solução de destacamento celular;

- Submeter a incubação por 10 a 30 minutos com uma temperatura de 37°C;

- Verificar em microscópio se houve completo destacamento celular, ou seja, células refringentes, circulares suspensas;

- Caso não haja destacamento total, bater suavemente na lateral da garrafa e caso as células persistam sem se destacarem totalmente, fazer uma nova incubação por mais ou menos 5min, até destacamento total;

- Adicionar meio de cultura, suavemente na superfície de crescimento celular e homogeneizar a garrafa;

- Remover todo o conteúdo da garrafa, com o auxílio de uma pipeta sorológica e dispensar em tubo apropriado estéril, previamente identificado;

- Submeter à centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm;

- Retirar o tubo e dispensar o sobrenadante, invertendo o tubo ou retirando com pipeta de maneira cuidadosa

- Adicionar entre 4 mL de meio Xenofree pré aquecido, ressuspender o pellet e homogeneizar;

- Caso necessário, realizar a contagem e viabilidade das células conforme procedimento específico, retirando 50 μΐ, desta suspensão;

- Transferir uma alíquota de 2mL para uma garrafa identificada com numeração urrívoca, I^o passagem e a sigla CRIO, a qual será expandida para Criopreservação;

- Transferir uma alíquota de 2mL para uma garrafa identificada com numeração unívoca, I^o passagem e a sigla C.Q., que será expandida para análises de Controle de Qualidade;

- Submeter as garrafas a incubação, com uma temperatura de 37°C e uma atmosfera de 5% de C0₂, sobrepostas uma em cima da outra.

[074] Expansão Celular pós Split:

[075] A expansão celular é realizada para se obter uma densidade suficiente de células para criopreservação.

[076] Observação: Esta etapa é realizada após a primeira passagem.

[077] Toda vez em que as células são transferidas para outra garrafa, numeramos, de maneira sequencial, uma nova passagem das células.

[078] Densidade de células esperadas por tamanho (cm²) por garrafa:

Tablel.Espected Celi Yields and Recommended Médium Volumes for Corning Flasks [ Corninig Flask Average Cell Tield* Médium Volume

25 cm² 2.5 x lO^A6 5 to 7.5 ml

75 cm² 7.5 x 10^Λ7 15 to 22.5 ml

150 cm² 1.5 x 10 7 30 to 45 ml

175 cm² 1.75 x 10 7 35 to 52.5 ml

225 cm² 2.25 x 10^A7 45 to 67.5 ml

* Assumes an average yield of 1 x 10^A5 cells/com² from a 100% confluent culture.

[079] Para realizar as passagens, proceder conforme descrito abaixo:

- Identificar com etiqueta os criotubos para Criopreservação e Controle de Qualidade;

- Realizar o mesmo procedimento com a outra amostra;

- Dispensar, de acordo com a garrafa, solução B no lado oposto ao crescimento das células, das duas garrafas;

- Virar as garrafas e homogeneizá-las com movimentos suaves, fazendo com que o líquido se espalhe por toda a superfície inferior da mesma, limpando a monocamada de crescimento celular;

- Caso ainda for verificado Debris celulares, realizar a limpeza novamente;

- Adicionar volume adequado de solução de destacamento celular;

- Submeter as garrafas a incubação por 10 a 30 minutos com uma temperatura de 37°C;

- Caso não haja destacamento total, bater suavemente na lateral da garrafa e caso as células persistam sem se destacarem totalmente, fazer uma nova incubação por ± 5 min, até destacamento total;

- Adicionar meio de cultura, suavemente na superfície de crescimento celular e homogeneizar a garrafa.

- Remover todo o conteúdo da garrafa, com o auxílio de uma pipeta sorológica e dispensar em tubo apropriado estéril, previamente identificado; - Submeter à centrifugação por 10 minutos a 1500 rpm;

- Retirar o tubo e dispensar o sobrenadante, invertendo o tubo;

- Adicionar entre 4mL de meio Xenofree pré aquecido, em ambos os tubos para ressuspender o pellet e homogeneizá-los;

- Transferir todo o volume da suspensão do tubo identificado como CRIO, para uma garrafa identificada com numeração unívoca, 2^o passagem, no caso de expansão de garrafa de 25 para 75 cm² ou 3^o passagem, no caso de expansão de garrafa de 75 para 175 cm², também identificada com a sigla CRIO, a qual será expandida para Criopreservação;

- Transferir todo o volume da suspensão do tubo identificado como C.Q., para uma garrafa identificada com numeração unívoca, 2^o passagem, no caso de expansão de garrafa de 25 para 75 cm² ou 3^o passagem, no caso de expansão de garrafa de 75 para 175 cm², também identificada com a sigla C.Q., a qual será expandida para análises de Controle de Qualidade;

- Completar o volume da garrafa de cultura com meio de cultura Xenofree.

[080] Controle de qualidade:

[081] No setor de Controle de Qualidade, são realizados os testes que aprovam acriopreservaçâo das células em definitivo, ou seja, os criotubos que estão criopreservados em tanque de Quarentena são transferidos para tanque de amostras liberadas.

[082] Abaixo encontra-se as análises realizadas e o detalhamento do processo.

[083] Teste de esterilidade:

[084] Esta análise é realizada para verificar a esterilidade da amostra, ou seja, a ausência de microrganismos na mesma. Este ensaio é realizado de acordo com a Farmacopéia Brasileira 5^o edição e no momento de sua criopreservação.

[085] Procedimento:

[086] O ensaio de esterilidade é realizado para certificar que as amostras que serão submetidas à criopreservação, estão estéreis, ou seja, isentas de micro-organismos. O ensaio é realizado em capela de fluxo laminar e em ambiente controlado.

[087] As alíquotas das amostras biológicas são oriundas do crescimento e expansão das células que serão submetidas à criopreservação, ou seja, da garrafa de cultura identificada como CRIO. As mesmas são coletadas conforme procedimento PO.02.01.030: Criopreservação das amostras.

[088] Preparação para Teste de Esterilidade:

[089] A Capela de Fluxo Laminar deve ser operada e limpas conforme

PO.02.01.026: Operação e limpeza Fluxo Laminar.

[090] Para facilitar o preparo, abaixo encontra-se os materiais necessários para cada etapa:

[091] Materiais Inanimados:

- Ponteira de 1,0 mL com filtro estéril;

- Pipeta Pasteur estéril;

- Pano apropriado estéril;

[092] Soluções:

- Meio Caldo Caseína Soja;

- Meio Caldo Tioglicolato;

- Amostras para o teste;

[093] Equipamentos:

- Micropipetas de 200 e 20μί;

- Capela de Fluxo Laminar;

- Estufa Bacteriológica com temperatura de 25 ± 2°C;

- Estufa Bacteriológica com temperatura de 35 ± 2°C;

[094] Precauções para o teste de esterilidade pelo método de Inoculo Direto:

[095] O ensaio de esterilidade é realizado de acordo com a Farmacopéia

Brasileira 5^o Edição.

[096] Abaixo encontra-se as recomendações e precauções para a realização do teste:

- O ensaio deve ser realizado por pessoal treinado e qualificado para tal.

- Os testes devem ser realizados sob condições assépticas, em capela de fluxo laminar, que deve estar instalada em sala limpa classe B - ISO 7.

- As condições devem ser adequadas de forma a evitar contaminação acidental da amostra durante o teste e, também, não afetar a detecção de possíveis contaminantes.

- Realizar o controle ambiental da Capela, conforme PL.04.02.001 - Monitoramento Microbiológico - Imprimir as etiquetas para a identificação dos tubos onde serão realizados os testes, conforme Anexo 1.

[097] Teste de Esterilidade:

[098] O ensaio é realizado utilizando 02 amostras, sendo uma inoculada em meio Caldo Caseína Soja e a outra inoculada em meio Caldo Tioglicolato. Todo o procedimento é realizado em capela de fluxo laminar e utilizando técnicas assépticas.

[099] Após realizar os preparos descritos nos itens acima, proceder o ensaio da seguinte maneira:

- Identificar os tubos de meio de cultura, Caldo Caseína Soja e Tioglicolato com etiqueta.

- Transferir as alíquotas de o teste para capela de fluxo laminar.

- Realizar a assepsia externa das amostras com pano apropriado embebido em álcool 70°GL.

- Deixar os tubos de meio e das amostras semi-rosca.

- Com o auxílio de uma pipeta de Pasteur ou micropipeta com ponteira estéril com filtro, transferir o conteúdo da alíquota de teste para tubo contendo meio de cultura.

- Realizar o mesmo procedimento para a outra amostra, inoculando o conteúdo no outro tubo contendo meio de cultura.

- Incubar o tubo contendo o meio de cultura Caldo Caseína Soja em estufa bacteriológica com uma temperatura de 25 ± 2°C.

- Incubar o tubo contendo o meio de cultura Caldo Tioglicolato em estufa bacteriológica com uma temperatura de 35 ± 2°C.

- Monitorar os meios diariamente por 14 dias.

[ 100] Interpretação dos Resultados :

[101] A interpretação dos resultados é feita através da visualização dos tubos de meio de cultura. Os meios são monitorados diariamente durante 14 dias, conforme descrito abaixo:

- Examinar os meios quanto às evidências macroscópicas de crescimento microbiano, através da turbidez do mesmo.

- Se, ao final do período de incubação, não houver evidências de crescimento microbiano, a amostra sob exame cumpre com o requisito de esterilidade. - Se for evidenciado crescimento de micro-organismos, a amostra não cumpre com o requisito de esterilidade, a não ser que se evidencie falha durante a execução do teste como, por exemplo, contaminação não relacionada com o produto em análise.

- O teste de esterilidade pode ser considerado inválido se uma ou mais das seguintes condições forem observadas:

a) Os dados de monitoramento microbiológico da área de realização do teste demonstram falha;

b) Uma revisão dos procedimentos analíticos utilizados durante o teste revela falha; c) Crescimento microbiano é observado nos controles negativos;

d) Após a identificação do micro-organismo(s) isolado(s) a partir do teste, o crescimento dessa espécie(s) pode ser atribuído, inequivocadamente, a falhas relacionadas ao material utilizado e/ou a técnicas utilizadas na execução do teste de esterilidade.

- Se for considerado inválido, o teste de esterilidade deve ser repetido com o mesmo número de unidades do teste inicial.

- Se, após a repetição do teste, não for observado crescimento microbiano, a amostra cumpre com o requisito de esterilidade.

- Se for observado crescimento microbiano após a repetição do teste, a amostra sob exame não cumpre com o requisito de esterilidade.

- Técnicas microbiológicas/bioquímicas convencionais são geralmente satisfatórias para identificação dos micro-organismos recuperados em um teste de esterilidade.

- No caso de se considerar somente que, após a determinação da identidade dos microorganismos isolados no teste, o crescimento dessa(s) espécie(s) possa ser atribuído inequivocamente a falhas com respeito ao material e/ou técnica utilizados no procedimento do ensaio de esterilidade, pode ser necessário empregar técnicas mais sensíveis para demonstrar que o micro-organismo isolado no produto é idêntico ao isolado em materiais ou no ambiente.

- Se as técnicas de identificação microbiológicas / bioquímicas de rotina podem demonstrar que 2 isolados não são idênticos, esses métodos podem não ser suficientemente sensíveis ou confiáveis para fornecer evidência inequívoca de que dois isolados são provenientes de uma mesma fonte.

- Métodos moleculares podem ser empregados para determinar se dois microorganismos pertencem a um mesmo clone e possuem origem em comum. [102] Nota: Os testes de identificação de micro-organismos, são realizados por empresa terceirizada. Se houver contaminação das amostras, os tubos contaminados são encaminhados ao setor de descontaminação, conforme PL.08.02.001 - Plano de Gerenciamento de Resíduos.

[103] Contagem e viabilidade celular:

[104] Esta etapa ocorre durante na fase final do processo, ou seja, quando a amostra atingiu concentração adequada para a criopreservação, elas são contadas através de equipamento específico e sua viabilidade também é medida no mesmo equipamento, através da adição de um reagente corante. São criopreservados 06 tubos.

[105] Procedimento:

[106] A contagem e viabilidade celular é um método que verifica a densidade celular por mililitro (mL) em uma determinada solução, assim como verificada a porcentagem de células mortas em relação as vivas, através de um corante que permite distingui-las.

[107] A contagem e Viabilidade Celular, pode ser realizada por dois métodos;

[108] O Método de Automático, que utiliza o equipamento Countess™ e o

Método tradicional, que utiliza a câmara de Neubauer.

[109] Em ambas as metodologias utilizadas para a contagem e viabilidade celular, é de extrema importância seguir os seguintes itens:

- Realizar as alíquotas conforme descrito nos procedimentos PO.02.01.032: Expansão Celular e PO.02.01.030: Criopreservação das amostras.

- Certificar se a suspensão para contagem está homogénea e sem particulados visíveis, a fim evitar uma contagem falsa negativa.

- Alíquotar a suspensão com o auxílio de uma micropipeta previamente limpa com pano estéril embebido em álcool 70°GL e com ponteira adequada com filtro.

- Dispensar a alíquota da suspensão em tubo apropriado e previamente identificado.

[110] Contagem e Viabilidade em Câmara de Neubauer

[111] Preparação para Contagem e Viabilidade Celular

[112] A alíquota da suspensão para contagem e viabilidade, é realizada em cabine de segurança biológica.

[113] O procedimento de contagem e viabilidade celular é realizado em bancada previamente higienizada. Abaixo encontram-se os materiais necessários para a realização da Contagem e viabilidade.

[114] Insumos:

- Ponteira de 0,2 ml com e sem filtro;

- 04 Tubos tipo eppendorf;

- Caneta para identificação da amostra;

- Pano apropriado;

[115] Soluções:

- Suspensão de células;

- Solução de Tripan Blue 0,4%. (Atenção, Tóxico.)

[116] Equipamentos:

- Micropipetas de 200 e 20μΕ;

- Cabine de segurança Biológica;

- Câmara de Neubauer;

- Lamínula;

- Microscópio;

[117] Visão Geral da Câmara de Neubauer:

[118] Observando na figuras 03 vê-se as câmaras de inserção da amostra (1), bem como na figura 04 que evidencia o local da sobra (3) , da amostra (4), da lamina (5) e da grade de contagem (2). E como ilustração, a figura 05 a caixa de Lamínulas (6) e as Lamínulas (5).

[119] Contagem e Viabilidade Celular:

[120] Após a realização da coleta da suspensão em cabine de segurança biológica, proceder conforme descrito abaixo:

- Identificar um tubo tipo eppendorf com a ID do beneficiário e a diluição 1:10.

- Transferir 10 μΐ, da solução de Azul de Tripan 0,4% para este tubo.

- Homogeneizar o tubo com a suspensão aliquotada em cabine.

- Transferir 10 μΐ, desta suspensão para o tubo contendo 10 μΐ, de Azul de tripan 0,4%.

- Homogeneizar.

- Acoplar a lamínula (5) sobre as entradas da amostra (4) (figura 06).

- Transferir 10 μΐ, desta solução para uma das entradas (A ou B) da câmara de contagem Neubauer, conforme a figura 07.

- Transferir a câmara para mesa do microscópio.

- Ajustar a objetiva para 10 ou 20X. - Focar a imagem nos quadrantes, conforme a figura 08.

- Os quadrantes são divididos em 04 partes, sendo: QSE - Quadrante Superior Esquerdo; QSD - Quadrante Superior Direito; QIE - Quadrante Inferior Esquerdo e QID - Quadrante Inferior Direito

- Com o formulário PO.11.01.004. A - Contagem e Viabilidade Celular, realizar a contagem conforme a figura 09.

- Realizar a contagem dos 04 Quadrantes, da mesma maneira descrita acima.

- Contar as células refringentes como VIVAS e as células coradas em Azul e não refringentes, como MORTAS.

- Anotar os resultados em formulário específico.

[121] Observações: Caso a contagem de células não alcance ou exceda o

RANGE do Método, ou seja, obtenha um valor fora de 2,5x10⁵ a 2,5x10⁶ células por mL, proceder da seguinte maneira:

- Concentrar a amostra por centrifugação quando inferior a 2,5xl0⁵.

- Diluir a amostra através da adição da mesma solução da suspensão original, quando superior a 2,5x10⁶ e multiplicar o resultado final, pela diluição realizada.

[122] Registros: Os registros são feitos em formulários específicos e conforme descrito abaixo:

- Preencher os resultados da contagem no formulário PO.02.01.XX - Contagem e Viabilidade Celular

- Com os resultados obtidos no formulário PO.02.01.XX - Contagem e Viabilidade Celular, preencher a planilha eletrônica no seguinte caminho: Z:\Sistema R- Crio\l 1. Controle de QualidadeU 1.03. Planilha de Contagem e Viabilidade.

[123] ADESÃO CELULAR:

[ 124] Esta análise também é realizada com o intuito de obter uma característica fenotípica das células. As Células Tronco (2) de polpa de dente possuem essa característica de adesão ao fundo da garrafa e formação de um "tapete" ou "monocamada". Este ensaio é realizado durante o acompanhamento de crescimento das células.

[125] Procedimento: [126] Preparação para Verificação de Adesão Celular

[127] A preparação para a realização da verificação de aderência celular consiste na verificação do equipamento e do software necessário para tal, conforme descrito abaixo:

[128] Microscópio invertido: O microscópio invertido será utilizado para localizar a imagem que irá comprovar a adesão celular.

[139] Para isso proceder conforme descrito abaixo:

- Realizar a limpeza da mesa do microscópio com pano embebido em álcool 70°GL.

- Ligar o equipamento, girando o botão localizado na parte direita inferior do microscópio.

- Ajustar a intensidade de luz no botão situado na parte direita da parte inferior do equipamento.

[130] Software: O programa ZEISS é o software que será utilizado para registrar a imagem que irá comprovar a adesão celular.

[131] Para isso proceder conforme descrito abaixo:

- Clicar no ícone do programa ZEISS, localizado na área de trabalho, para abrir o programa.

- Clicar no botão LIVE do programa, localizado na aba esquerda da tela.

[132] Procedimento :

[133] O procedimento de verificação de adesão celular, consiste no registro fotográfico em dois pontos aleatórios da garrafa, de células com características morfológicas descritas em Anexo 1.

[134] Este procedimento é realizado em no máximo 20 dias após o processamento, portanto caso não for verificado a adesão de células dentro deste período, comunicar o responsável da área e registrar o ocorrido no formulário PO.02.01.021.C: Comunicado de Não Aderência Celular para devidas providências.

[135] Este procedimento está diretamente ligado ao PO.02.01.021 -

Acompanhamento de amostra processada e Troca de Meio.

[136] A amostra não deve ficar por um tempo maior que 5 minutos em observação no microscópio. Caso este tempo seja excedido, voltar a amostra novamente à incubação e deixá-la por no mínimo 10 minutos incubada novamente.

[137] Proceder conforme descrito abaixo, para a verificação de aderência celular: - Realizar a limpeza das bordas da estufa, com pano embebido em álcool 70°GL.

- Verificar onde a amostra está localizada, através do mapa da incubadora

- Abrir a incubadora fechar a tampa da garrafa e levá-la com cuidado à mesa do microscópio.

- Com pano embebido em álcool 70°GL, limpar o fundo da garrafa e colocá-la à mesa do microscópio, com a tampa voltada para o lado esquerdo do colaborador.

- Ajustar o foco movimentando o ajuste macro e micrométrico do microscópio.

- Verificar a presença de células fusiformes e espraiadas.

- Clicar no botão SNAP, localizado ao lado do botão LIVE.

- Repetir este procedimento novamente até a verificação de dois pontos aleatórios na garrafa.

- NÃO excede o tempo de 5 minutos em observação.

- Acima da imagem, abrirá uma aba com a foto capturada (Ex: Snap 888).

- Clicar com o botão direito do mouse, nesta aba e selecionar SAVE AS.

- Entrar no caminho: \\RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l 1.Controle de QualidadeU 1.01.Laudos-CertificadosU 1.01.01 Beneficiários

- Dentro desta pasta, caso for a primeira imagem a ser registrada, criar uma pasta com a ID do beneficiário, por exemplo:001.1 e dentro desta, uma pasta de Acompanhamento.

- Dentro da pasta de acompanhamento, Criar uma pasta identificada com o número de dias que a amostra está incubada (Ex: Dia 5)

- Nesta pasta, identificar a foto no campo Nome de Arquivo conforme exemplo: ID - Objetiva de Aumento - Dias de Incubação - Característica da Célula (ver anexo I e procedimento PO.02.01.021: Acompanhamento e Troca de Meio).

- No campo Tipo, selecionar o formato JPEG e clicar em salvar.

- Caso a amostra já possua as pastas mencionadas, proceder normalmente e salvar a amostra no caminho: Ex: \\RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l l. Controle de QualidadeM 1.01. Laudos-CertificadosM 1.01.1 BenefíciáriosMD do beneficiário\Acompanhamento\Dia X

[138] Rastreabilidade de informações: Registrar a execução da Adesão Celular conforme descrito abaixo:

- Copiar a imagem salva no caminho citado acima e colar no PO.l 1.01.002.A: Registro de Adesão Celular, encontrado na lista mestra de registros. - Salvar no seguinte caminho: RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\ 11. Controle de QualidadeM l.Ol Laudos-Certificados\ 11.01.01 ID do BeneficiárioYTestes Controle de Qualidade\ PO.l 1.01.002.A: Registro de Adesão Celular.

- Colar a imagem no Quadro 1 ajustá-la caso necessário, utilizando as ferramentas do programa WORD.

- Repetir este procedimento com a outra imagem.

- Imprimir o documento e anexar aos formulários em andamento.

[139] Caso não haja a adesão celular em até 20 dias, preencher o formulário

PO.l 1.01.002.B - Comunicado de Não Aderência Celular, procedendo conforme item

6.2.1, porém com imagens que comprovam a não adesão celular.

[140] Comunicação aos departamentos comercial e atendimento ao cliente:

[141] O gerente técnico deve comunicar formalmente aos departamentos comercial e atendimento ao cliente caso não haja adesão conforme descreve

PO.04.02.004.

[142] As não conformidades são registradas no o formulário PG.04.02.004.A

Notificação de Não Conformidade e enviá-lo ao setor de Garantia de Qualidade determinação de ações corretivas.

[143] Todo registro gerado no processamento da amostra é arquivado no

Dossiê Do Beneficiário no departamento de Garantia da Qualidade.

[144] O processo também é registrado resumidamente em arquivo eletrônico na

Planilha de Acompanhamento do Processo em: RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l l. Controle de Qualidade\ 11.02. Acompanhamento do Processo, dando uma visão sistémica do processamento do dente de cada beneficiário.

[145] Pode-se acompanhar através da figura 10 - Características das Células caracterizadas por Células Espraiadas, Fusiformes

[ 146] Diferenciação Celular (teste funcional) :

[147] Esta análise é realizada com o intuito de obter uma característica fenotípicadas células. As células são induzidas a diferenciação em células formadoras de osso, cartilagem e gordura.

[148] Procedimento:

[149] Materiais, soluções e equipamentos:

- Suspensão Celular

- Solução PBS IX estéril. - Meio Inicial para Controle de Qualidade

- Meio para Diferenciação Osteogênica

- Meio para Diferenciação Condrogênica

- Meio para Diferenciação Adipogênica

- Solução Corante de Vermelho de Alizarina

- Solução Corante de OilRed O

- Solução Corante de Azul de Alcian

- Hematoxilina de Harris

- Solução Fixadora de Formaldeído a 10%

·- Água Ultrapurificada

- Azul de Tripan a 0,4%.

- Placa de Cultura de 12 poços estéril.

- Pipeta Pasteur.

- Câmara de Neubauer

- Micropipeta

- Microscópio.

- Centrífuga.

- Countess.

[150] Cuidados e Precauções:

- Todo o procedimento de manipulação da amostra é realizado dentro da Cabine de Segurança Biológica através de técnicas assépticas.

- Durante a troca do meio tomar o máximo de cuidado para que a monocamada não seja perturbada.

- Utilizar uma ponteira por amostra.

- Nunca encoste a ponteira dentro do poço da placa, caso isto acontecer dispense a mesma e utilize outra.

- Verifique sempre o mapa da placa para identificar as amostras.

- Atente-se para não colocar Meio de Diferenciação no Controle Negativo (7).

- O Controle Negativo (7) será sempre o último poço da triplicata.

[151] Diferenciação Osteogênica:

[152] A diferenciação osteogênica é realizada para verificar o potencial de diferenciação das células tronco da polpa de dente de leite em células ósseas. Essas células indiferenciadas não fazem deposito de cálcio extracelular, sendo este depósito o indicativo da diferenciação de células tronco para células osteoblásticas. O procedimento é dividido em três etapas, sendo a primeira o inoculo da amostra, a indução da diferenciação e a coloração dos depósitos de cálcio.

Para realizar a diferenciação, proceder conforme descrito abaixo:

[153] Inoculo da Amostra:

- Inocule lxl O⁵ células/poço em uma placa de 12 poços em triplicata.

- Adicione 2 mL de Meio Inicial para Controle de qualidade em cada poço.

- Incube a amostra com uma temperatura de 37°C e uma atmosfera de 5% de C0₂.

- Deixe a amostra incubada por 48 horas ou até a obtenção de confluência > 90%.

[154] Indução da Diferenciação:

- Retirar o meio cuidadosamente com o auxílio de uma micropipeta.

- Dispensar 2 mL de Meio para Diferenciação Osteogênica de maneira suave, pela borda do poço.

- Utilizar uma ponteira para cada poço.

- Dispensar 2 mL de Meio Inicial para Controle de Qualidade no poço da amostra de controle negativo (7), da mesma maneira citada acima.

- Incubar a amostra novamente.

- Realizar este procedimento a cada 3 dias.

- Repetir esta etapa por 21 dias.

[155] Análise de Coloração de Depósitos de Cálcio com Vermelho de

Alizarina:

- Após 21 dias sob condição de diferenciação, retirar o meio sobrenadante dos poços e lavar uma vez com PBS IX, 0,5 mL por poço.

- Retirar o PBS e descartar.

- Fixar as células com solução de formaldeído a 4% durante 30 minutos.

- Após a fixação, lavar os poços duas vezes com água ultra purificada.

- Dispensar 0,5 mL de solução a 2% de vermelho de alizarina pH 4,2.

- Deixar agir por 45 minutos ao abrigo da luz.

- Lavar os poços três vezes com água destilada.

- Visualizar em microscópio e capturar imagens para análise qualitativa ou quantitativa.

[156] Seguindo a analise da figura 1 1 :

A) Coloração dos depósitos de Cálcio.

B) Visão Macroscópica da placa. [157] Diferenciação Condrogênica:

[158] As células tronco de polpa de dente de leite, ao se diferenciarem em condrócitos, produzem uma matriz celular típica. Esta matriz é composta de duas moléculas características de cartilagem, o Colágeno tipo II e o AgrecamProteoglicano. Este Agrecano é utilizado como um indicador da formação de cartilagem e pode ser detectado através da coloração de Azul de Alcian (Alcian Blue), um corante que contém cobre azul escuro em sua composição. O procedimento é dividido em três etapas, sendo a primeira o inoculo da amostra, a indução da diferenciação e a coloração dos esferóides.

[159] Para realizar a diferenciação, proceder conforme descrito abaixo:

[160] Inoculo da Amostra:

- Inocule lxlO⁵ células/poço em uma placa de 12 poços em triplicata.

- Adicione 2 mL de Meio Inicial para Controle de qualidade em cada poço.

- Incube a amostra com uma temperatura de 37°C e uma atmosfera de 5% de C0₂.

[161] Indução da Diferenciação:

- Retirar o meio cuidadosamente com o auxílio de uma micropipeta.

- Utilizar uma ponteira para cada poço.

- Incubar a amostra novamente.

- Realizar este procedimento a cada 3 dias.

- Repetir esta etapa por 21 dias.

[162] Análise de Coloração com Azul de Alcian:

- Após 21 dias sob condição de diferenciação, retirar o meio sobrenadante dos poços e lavar um a vez com PBS IX, 0,5 mL por poço.

- Tenha o máximo de cuidado para não aspirar os esferóides.

- Retirar o PBS e descartar.

- Fixar as células com solução de formaldeído a 4% durante 60 minutos.

- Após a fixação, lavar os poços novamente com PBS e descartar a solução.

- Dispensar 0,5 mL de solução de Azul de Alcian. - Deixar a placa incubada overnight à temperatura ambiente ao abrigo da luz.

- Após a incubação, lavar os poços três vezes com solução de descoloração.

- Adicionar 1 mL de PBS IX para neutralizar a acidez.

- Visualizar em microscópio e capturar imagens para análise.

- A Coloração azulada, indica a síntese de proteoglicanos geradas por células condreócitas.

[163] Seguindo a analise da Figura 12 :

A) Coloração azul de Alcian desenvolvida pelo sedimento condrogênico.

C) A coloração por azul Alcian de secção transversal após 20 dias do mesmo pellet condrogênico.

[ 164] Diferenciação Adipogênica:

[165] A diferenciação das células tronco de polpa de dente de leite em adipócitos produzem vesículas lipídicas intracelulares. Estas vesículas são marcadas com solução de OilRed e identificadas através de sua coloração vermelho brilhante. O procedimento é dividido em três etapas, sendo a primeira o inoculo da amostra, a indução da diferenciação e a coloração das vesículas.

Para realizar a diferenciação, proceder conforme descrito abaixo:

[ 166] Inoculo da Amostra:

- Inocule lxl O³ células/poço em uma placa de 12 poços em triplicata.

- Adicione 2 mL de Meio Inicial para Controle de qualidade em cada poço.

- Incube a amostra com uma temperatura de 37°C e uma atmosfera de 5% de C0₂.

[ 167] Indução da Diferenciação:

- Retirar o meio cuidadosamente com o auxílio de uma micropipeta.

- Utilizar uma ponteira para cada poço.

- Incubar a amostra novamente.

- Realizar este procedimento a cada 3 dias.

- Repetir esta etapa por 14 dias. [168] Análise de Coloração com Oil Red:

- Após 14 dias ou mais sob condição de diferenciação, retirar o meio sobrenadante dos poços e lavar um a vez com PBS IX, 0,5 mL por poço.

- Retirar o PBS e descartar.

- Fixar as células com solução de formaldeído a 4% durante 30 minutos.

- Após a fixação, lavar os poços duas vezes com PBS IX.

- Dispensar 0,5 mL de solução de Isopropanol a 60%.

- Incubar por 5 minutos.

- Dispensar 0,5 mL de solução Oil Red.

- Deixar agir por 30 minutos.

- Lavar os poços duas vezes com PBS IX.

- Retirar todo resquício de PBS do poço.

- Adicionar 0,5 mL de Solução de Hematoxilina de Harris.

- Incubar por 1 minuto.

- Lavar os poços, duas vezes com água ultra purificada.

- Aspirar a água e adicionar 0,5 mL de PBS IX.

- Visualizar as imagens em miciroscópio.

[169] Seguindo a figura 13, observa-se as vesículas lipí dicas intracelulares são coradas em vermelho brilhante, enquanto os núcleos são corados em azuí-violeta pela solução de Hematoxilina.

[ 170] Citometria de fluxo:

[171] Esta análise é realizada com o intuito de obter uma característica fenotípicadas células. As Células Tronco (2) de polpa de dente, possuem marcadores específicos em sua superfície. Este ensaio é realizado através de anticorpos monoclonais que se ligam ou não a estes marcadores (no caso de marcadores Negativos), identificando a integridade da célula e a característica genética da mesma.

[172] A análise de citometria de fluxo é utilizada para identificar a característica fenotípica das células tronco de polpa de dente de leite. Estas células possuem receptores de superfície que a identificam e as diferenciam de outros tipos de células tronco.

[173] A análise é realizada com a utilização de anticorpos monoclonais específicos para determinados receptores. Estes anticorpos são marcados com uma molécula fluocromófilas, que ao receber a incidência de lasers específicos, são excitadas e emitem uma luz. Esta luz passa por filtros específicos com comprimentos de onda capaz de absorver apenas a luz de interesse, em um determinado canal de absorção. A luz captada é convertida em um sinal eletrônico, gerando assim um gráfico de densidade ou "Plot".

[174] O procedimento a seguir, descreve como realizar e interpretar os dados gerados pelo sistema.

[175] Para melhor entendimento do aparelho e seu software, o manual do mesmo deve ser consultado.

[176] Acompanhando a figura 14 e 15, vê-se uma Visão Geral do

Equipamento.

[177] Manutenção e Calibração do instrumento:

[178] Diariamente e antes de realizar as análises de amostras, as verificações das soluções utilizadas, limpeza da SIP e calibração do equipamento são realizadas.

[179] Abaixo encontra-se os detalhes desta etapa: Verificação e preparo das

Soluções.

[180] Antes de ligar o equipamento, verificar os seguintes frascos de soluções:

- WASTE: Descartar seu conteúdo em local apropriado, conforme plano de gerenciamento de resíduos, e lavá-lo com água Ultra purificada.

- SHEATH: Adicionar o conteúdo de 01 vial da solução Bacteriostática em 01 litro de água Ultra purificada. Esta solução tem validade de 01 mês após o preparo a temperatura ambiente.

- CLEANING SOLUTION: Adicionar 3 mL do conteúdo de 01 vial da solução Cleaning em 197 mL de água Ultra purificada. Esta solução tem validade de 02 semanas.

- DECONTAMINATION SOLUTION: Adicionar o conteúdo de 01 vial da solução Bacteriostática em 180 mL de água Ultra purificada. Esta solução tem validade de 01 mês.

[181] Atenção: Após a troca das soluções, as mesmas são etiquetadas com a data da troca, o responsável e a validade. Todo este processo também é registrado no logbook do equipamento.

[182] Limpeza da SIP e do sistema:

[183] A limpeza da SIP e do sistema, é realizada ANTES de iniciar qualquer procedimento, ENTRE as amostras e APÓS a utilização do equipamento (SHUTDOWN). A sonda é o local onde a amostra é aspirada e levada à análise na parte interna do equipamento. O sistema compreende o sistema fluídico do equipamento, ou seja, todo o caminho onde há o contato das soluções e amostra.

[184] Os seguintes procedimentos são realizados na aba MANUAL

COLLECT.

[185] Abaixo encontra-se os detalhes deste procedimento:

[186] Antes do Início do Procedimento:

- Clique em EJECT PLATE.

- Coloque um tubo vazio na sonda ou SIP.

- Na tela principal do software, clique èm B ACKFLUSH.

- Aguarde o procedimento terminar.

- Coloque outro tubo com 2 mL de água ultra purificada na no rack de amostra, na posição Al .

- Em FILE (Canto Superior esquerdo) selecione Open WorkspaceorTemplate.

- Selecione a WorkspaceLimpeza Diária.

- No campo A01, coloque a data da realização do procedimento.

- Selecione a posição Al.

- Clique em Detecte Events(Canto Inferior Esquerdo).

- Clique em RUN ou ADD to A01.

- Ao término do procedimento salvar os dados, subscrevendo-o na própria Works Pace.

- Ejete o rack e remova o tubo.

[187] Entre as Amostras de Beneficiários ou Shutdown.

- Clique em EJECT PLATE.

- Coloque um tubo com 2 mL de água ultra purificada na no rack de amostra, na posição Al.

- Em FILE (Canto Superior esquerdo) selecione Open WorkspaceorTemplate.

- Selecione a WorkspaceAgua 2'.

- No campo A01 , coloque a data da realização do procedimento.

- Selecione a posição Al .

- Clique em Detecte Events(Canto Inferior Esquerdo).

- Clique em RUN ou ADD to A01.

- Ejete o rack e remova o tubo.

- Coloque um tubo com 2 mL de Solução de Descontaminação, Frasco DECONTAMINATION. - Em FILE (Canto Superior esquerdo) selecione Open WorkspaceorTemplate.

- Selecione a Workspace Decontamination .

- No campo A01, coloque a data da realização do procedimento.

- Selecione a posição Al.

- Clique em Detecte Events (Canto Inferior Esquerdo).

- Clique em RUN ou ADD to A01.

- Ejete o rack e remova o tubo.

- Em FILE (Canto Superior esquerdo) selecione Open WorkspaceorTemplate.

- Selecione a WorkspaceAgua 2'.

- No campo A01, coloque a data da realização do procedimento.

- Selecione a posição Al.

- Clique em Detecte Events (Canto Inferior Esquerdo).

- Clique em RUN ou ADD to A01.

- Ao término, o equipamento está liberado para análise de outro Beneficiário ou poderá ser desligado.

[188] Calibração dos Lasers:

[189] Antes das corridas de amostras que serão realizadas no dia, as calibrações dos lasers são realizadas. A calibração destes lasers garante o alinhamento e a alta resolução dos resultados obtidos.

[190] O equipamento possui dois lasers, os quais são responsáveis pela excitação dos fluorocromos.

[191] Em FILE abrir a Workspace de Calibração de Lasers.

[192] No Rack de 24 tubos, selecionar o próximo poço, da última análise realizada, ou seja, se no dia anterior o poço escolhido foi o Al , selecionar o A2 e inserir a data da análise.

[193] Para 8 PeakBeads, selecionar os poços de Al até B6 e para 6 PeakBeads, selecionar os poços de Cl a D6.

[194] Quando todos os poços forem utilizados, salvar uma nova Works Pace adicionando o número sequencial, referente à última Works Pace, Ex: Calibração de Lasers 2. Este procedimento é realizado para obter uma Carta Controle e monitorar o equipamento durante o tempo.

PEAK 8 Laser Azul.

- Homogeneizar o reagente ValidationPeakBeads8 em Vortex.

- Adicionar 0,5 mL de água purificada em tubo apropriado.

- Adicionar 2 gotas do reagente ValidationPeakBeads 8a este tubo.

- Colocar o tubo no rack.

- Na caixa de seleção do rack, selecione o campo onde se encontra a amostra.

- Salve o como 8 Peakbeads e insira a data do procedimento.

- Clique em RUN.

- Quando o número de eventos for atingindo, o equipamento irá parar automaticamente.

- Repita o passo 6.2.2.2.

[195] PEAK 6 Laser Vermelho:

- Homogeneizar o reagente ValidationPeakBeadsó em Vortex.

- Adicionar 1,0 mL de água purificada em tubo apropriado.

- Adicionar 4 gotas do reagente ValidationPeakBeadsó a este tubo.

- Colocar o tubo no rack.

- Na caixa de seleção do rack, selecione o campo onde se encontra a amostra.

- Salve o como 6 Peakbeads e insira a data do procedimento.

- Clique em RUN.

- Repita o passo 6.2.2.2.

[196] Análise dos Resultados da Calibração:

[197] Após a corrida das Beads de Calibração, os resultados são analisados para a confirmação do correio funcionamento do equipamento.

Para verificação os gráficos devem atender os seguintes critérios:

[198] PEAK 8 Laser Azul:

- 8 picos nos PLOTS, FLI e FLII.

- No mínimo 6 picos em FLUI.

- Coeficiente de Variação (CV) < 5% nos picos de maior intensidade de fluorescência, ou seja, nos últimos picos em todos os PLOTS.

- Englobar população > 80% no Gate estabelecido, no PLOT FCS/SSC.

[ 199] PEAK 6 Laser Vermelho : - 6 picos no PLOT FLIV.

- Englobar população > 80% no Gate estabelecido, no PLOT FCS/SSC.

[200] Análise das Amostras dos Beneficiários:

[201] Após os procedimentos de limpeza e calibração, o equipamento está apto para a realização da análise fenotípica de amostras dos beneficiários.

[202] A análise fenotípica das amostras é realizada através de 4 marcadores;

STRO - 1, marcado com FITC; CD 73, marcado com PE; CD 45, marcado com PE Cy

5 e CD 146, marcado com Alexa flúor 647.

[203] Proceda a análise conforme descrito abaixo:

- Dispense 0,1 mL da suspensão de células, com concentração > 1x106 células por mL em um tubo.

- Adicione 1 mL de PBS IX.

- Centrifugue a 900 RPM por 5 minutos.

- Dispense o sobrenadante.

- Ressuspenda o pellet com 0,1 mL de Stain Buffer.

- Adicione 20 μL· do reagente STRO - 1 (FITC).

- Adicione 20 do reagente CD 73 (PE).

- Adicione 20 μL· do reagente CD 45 (PECy 5).

- Adicione 5 do reagente CD 156 (AlexaFlour 647).

- Incube a amostra por 30 minutos a uma temperatura de 2 a 8°C.

- Adicione lmL de stain Buffer.

- Centrifugue a 900 RPM por 5 minutos .

- Dispense o sobrenadante.

- Ressuspenda novamente em 1 mL de Stain Buffer.

- Repita este passo por mais 2 vezes (a partir da adição de 1 mL de Stain Buffer).

- Ressuspenda o pellet após a última lavagem em 0,5 mL de Stain Buffer.

- Homogeneíze a amostra.

- Coloque o tubo no rack do equipamento.

- Abra a Works Pace Análise Fenotípica do Beneficiário.

- Insira o número do beneficiário no campo onde à amostra foi inserida no rack.

- Clique em RUN.

- Aguarde o término da corrida. - Após o término, realizar a etapa 6.2.2.2.

[204] Análise dos Dados Gerados:

[205] Ao término da corrida os dados são verificados através dos PLOTS gerados. O dado verificado para cada PLOT, encontra-se no quadrante Inferior Direito, no eixo X, representado pela sigla LR - LowerRight. Para cada marcador há um PLOT.

[206] Em seguida, através da figura 16, vê-se um exemplo do PLOT gerado e seu resultado em porcentagem.

[207] Registro das Análises:

[208] Os registros de cada análise, é realizado através do formulário

PO.11.01.006. A - Análise Fenotípica por Citometria de Fluxo e os dados brutos são gerados da seguinte manei FUI

- Na tela de Desktop, criar uma pasta com a ID do beneficiário.

- No software Accuri, clicar no PLOT de análise com o botão esquerdo do mouse e segurar.

- Arrastar o mesmo para o desktop e enviá-lo para a pasta de destino.

- Abrir a pasta do beneficiário e imprimir todos os arquivos.

- Anexar os arquivos ao formulário PO.11.01.006. A - Análise Fenotípica por Citometria de Fluxo.

[209] Resultados e Critérios de Aceitação:

[210] Como os dados gerados os resultados são observados conforme descrito no item 6.4.

[211] Estes resultados são expressos em porcentagem, onde esta porcentagem irá determinar a aprovação da análise fenotípica conforme descrito abaixo:

- CD 105: >90%

- CD 73: > 90%

- CD 146: > 90%

- CD 45: < 10%

[212] Os resultados são preenchidos em formulário específico e os dados brutos gerados são anexados a este.

[213] CONTROLE GENÉTICO:

[214] Este procedimento permite identificar alterações cromossômicas, numéricas e estruturais, na resolução de 5 a 10Mb. [215] Alteração cromossômica numérica é uma variação numérica da constituição cromossômica, como, por exemplo: Euploidia (alteração do conjunto cromossômica (n), Aneuploidia (perda ou ganho de um ou mais cromossomos inteiros).

[216] As alterações cromossômicas estruturais são provenientes de perdas, ganhos ou reorganização cromossômica. Esse tipo de alteração pode ser classificada em: Deleção, Duplicação, Inversão, translocação e cromossomo em anel.

[217] Toda alteração cromossômica identificada será descrita de acordo com o

International System For Human CytogenetcNomenclatute (ISCN 2013).

[218] Procedimento:

[219] As células-tronco pulpar dentária, após extração e proliferação em meio de cultura específico, de acordo com PO.02.01.020: Processamento de Amostra do Beneficiário, são extraídas e cultivadas em meio suplementado para a realização do controle genético, que será realizada por meio da análise citogenética clássica (bandeamento GTG), protocolo padrão e amplamente utilizado para verificar a integridade cromossômica.

[220] Este procedimento permite identificar alterações cromossômicas, numéricas e estruturais, na resolução de 5 a 10Mb. Alteração cromossômica numérica é uma variação numérica da constituição cromossômica, como, por exemplo: Euploidia (alteração do conjunto cromossômica (n)), Aneuploidia (perda ou ganho de um ou mais cromossomos inteiros). As alterações cromossômicas estruturais são provenientes de perdas, ganhos ou reorganização cromossômica. Esse tipo de alteração pode ser classificada em: Deleção, Duplicação, Inversão, translocação e cromossomo em anel. Toda alteração cromossômica identificada será descrita de acordo com o International System For HumanCytogenetcNomenclatute (ISCN 2013).

[221] Análise de controle genético em células-tronco é importante, uma vez que, as células podem adquirir alterações cromossômicas durante o processo adaptação ao cultivo e se fixar com o passar do tempo, aumentando a tumorigenicidade celular. A baixo encontra-se o protocolo completo garantido os padrões de qualidade desta empresa. A ocorrência da tumorgênese é um obstáculo importante na inviabilização da utilização das células-tronco no tratamento clínico futuro. [222] Preparação para verificação do controle genético:

[223] A preparação para a realização da verificação do controle genético consiste na verificação do equipamento e do software necessário para tal, conforme descrito abaixo:

[224] Material utilizado:

[225] Preparo do meio de cultura:

- 4,5ml de meio RPMI 1640.

- 0.5ml de Soro Fetal Bovino (SFB).

- 0,05ml de Antibiótico (3 gotas).

[226] Preparo das soluções:

- KaryoMaxColcemid.

- Solução hipotônica (KC1 0.075M).

- Tripsina 0.025%

- Tampão fosfato 0.06M pH 6.8 (Potássio Fosfato Monobásico e Sódio Fosfato BibásicoDiidratado).

- Giemsa 4% com tampão fosfato pH 6.8

- Fixador (3:1 de metanol e ácido acético)

- HBSS: solução salina balanceada de Hank^'s

[227] Materiais Inanimados:

- Garrafa de cultura de 25cm²

- Tubo tipo falcon estéril de 15ml com tampa .

- Microtubo 1,5 ml estéril com tampa.

- Pipeta pasteur estéril.

[228] Lâminas para microscopia com extremidade lapidada e fosca, devidamente lavada de acordo com o procedimento abaixo:

[229] Lavagem das lâminas:

- Colocar 10 lâminas em solução de água com detergente específico e deixar de molho por 20 minutos.

- Lavá-las em água corrente, esfregar com esponja macia e enxaguar bem.

- Retornar a lâmina limpa em frasco com água corrente. [230] Inoculação das células com meio de cultura:

- Adicionar ao frasco de cultura (25ml) 1 ml de meio que contenha as células e adicionar 4ml do mesmo meio (sem células) e colocar em estufa 37°C com 5% de C0₂para crescimento.

- Entre 24 e 36 horas de crescimento, acrescentar 60μ1 de Colcemidao meio de cultura e incubar por 20 minutos a 37°C com 5% de C0₂.

- Transferir o conteúdo da garrafa para um tubo de centrífuga.

- Adicionar 2ml HBSS na garrafa com as células e mexer gentilmente de 5 a 10 segundos.

- Destacar as células com auxílio de um scraper.

- Ressuspender as células e transferir para tubos de centrífuga de 15ml.

- Centrifugar por 5 minutos a 1500rpm.

- Retirar o sobrenadante com o auxílio de uma pipeta Pauster e adicionar 5ml de solução hipotônica (KC1 0.075M).

- Ressuspender lentamente e colocar na estufa comum a 37° C por 20 minutos.

- Adicionar lml de fixador e ressuspender o material.

- Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm.

- Desprezar o sobrenadante e colocar 5ml de fixador .

- Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm.

- Adicionar lml de fixador e ressuspender o material.

- Desprezar o sobrenadante e colocar 5ml de fixador .

- Centrifugar por 5 minutos a 1500 rpm.

- Adicionar lml de fixador e ressuspender o material.

- Distribuir o material ressuspendido em lâminas, (estas previamente lavadas e mantida na geladeira em um Becker com água destilada), de acordo com o procedimento.

[231] 6.4 Preparo das Lâminas

- Retirar o Becker de água com as lâminas da geladeira;

- Pingar 0.2 a 0.3 ml do material em uma lâmina;

- Observar ao microscópio se houve obtenção de metáfases;

- Preparar mais 3 lâminas, se necessário;

- Secar em temperatura ambiente por 3 dias;

- Armazenar o material extra em tubo 1 ,5ml e congelar. [232] 6.5 Técnica de Bandeamento GTG

[233] Para obtenção de banda G, será utilizada a técnica modificada de

Seabright (1971).

- Mergulhar as lâminas em solução de tripsina 0.025% (DIFCO®), diluída em tampão fosfato 0.06M com pH 6.8 em banho-maria a 37°C por dois a três segundos.

- Lavar com água destilada.

- Corar em solução de Giemsa 4% com tampão fosfato pH 6.8 por, aproximadamente, dois minutos.

[234] 6.6 Análise do cariótipo

[235] Para isso proceder conforme descrito abaixo:

- Ligar o equipamento.

- Ajustar a intensidade de luz.

- Focalizar a metáfase com Macrométrico e micrométrico (objetiva de lOx e 40x).

- Colocar objetiva de lOOx e óleo de imersão.

- Analisar o cariótipo.

- Documentar com imagem.

[236] 6.7 Software

[237] O softwarelMAGE J será utilizado para registrar e processar a imagem do cariótipo.

[238] Para isso proceder conforme descrito abaixo:

[239] 6.7.1 Registro de imagem

[240] Ao fotografar uma metáfase, siga os passos abaixo:

[241] 6.7.2 Procedimento:

- Clicar com o botão direito do mouse e selecionar SAVE AS.

- Entrar no caminho: \\RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l 1.Controle de QualidadeU 1.01.Laudos-CertificadosU 1.01.1 Beneficiários\

- Dentro desta pasta, caso for a primeira imagem a ser registrada, criar uma pasta com a ID do beneficiário, por exemplo: 001.1 e dentro desta, uma pasta de Acompanhamento.

- Dentro da pasta de acompanhamento, criar uma pasta identificada com nome CONTROLE GENÉTICO.

- Nesta pasta, identificar a foto no campo Nome de Arquivo conforme exemplo: ID - n. da metáfase - data. No campo Tipo, selecionar o formato JPEG e clicar em salvar. - Clicar no ícone do programa IMAGE J, localizado na área de trabalho, para abrir o programa.

- Para abrir a foto acesse: \\RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l 1.Controle de QualidadeM 1.01.Laudos-CertificadosM 1.01.1

Beneficiários\Acompanhamento\CQ\Controle Genético.

- Abrir uma foto da metáfase a ser processada e recortar os cromossomos.

- Ordenar os cromossomos, aos pares, obedecendo ao padrão de bandeamento.

- Agrupar os cromossomos, de acordo com a norma internacional (ISCN 2013), e montar o cariótipo.

- Verificar ANEXO 1 (figura 17, 18, 19, 20 e 21).

- Caso a amostra já possua as pastas mencionadas, proceder normalmente e salvar a amostra no caminho:

Ex: \\RC-SRV01\Dados\Sistema R-Crio\l 1.Controle de QualidadeM 1.01. Laudos- CertificadosM 1.01.1 Benefíciários\41.01\Acompanhamento\CQ\CONTROLE GENÉTICO.

- Dentro desta pasta, caso seja o primeiro cariótipo a ser registrado, criar uma pasta com a ID do beneficiário + Cariótipo, por exemplo: 001.1 Cariótipo e dentro desta, salve o cariótipo montado.

- Nesta pasta, identificar a foto no campo Nome de Arquivo conforme exemplo: ED - n. cariótipo - data. No campo Tipo, selecionar o formato JPEG e clicar em salvar.

[242] Registros:

[243] Para realizar o registro do controle genético, proceder conforme descrito abaixo:

- Copiar a imagem do CARIÓTIPO salva no caminho citado acima.

- Entrar no seguinte caminho: Lista Mestra de Registros\ Registros laboratório \ Controle de Qualidade \ Histórico Controle genético PO.02.01.008.A - Controle Genético.

- Imprimir o documento e anexar aos formulários em andamento.

[244] Registros:

PO.02.01.008.A: Relatório do Controle Genético

PO.02.01.008.B: Histórico de Controle Genético

[245] A seguir observar as figuras 17, 18, 19, 20 e 21, para o acompanhamento do referido ANEXO 1 - Cariótipos (imagens ilustrativas). [246] Criopreservação:

[247] Objetivo: Padronizar o procedimento de criopreservação das amostras

Biológicas descrevendo e detalhando as etapas realizadas.

[248] Definições e abreviaturas:

[249] Confluência - Diminuição dos espaços entre as células com formação de uma camada ou tapete de células, devido a multiplicação e aumento do número de células em um frasco de cultura.

[250] Debris - Resíduos celulares

[251] Quarentena - Amostra em local específico e NÃO liberada para uso

[252] DMSO - Dimetil Sulfóxido

[253] Procedimento:

[254] Preparação para Expansão ou Passagem da amostra.

[255] Materiais Inanimados:

- Kit de mangueiras para sucção (Aspiramax);

- Micropipetas de 1000, 200 e 20μ1,;

- Ponteira de 1 ,0, 0,2 ml com e sem filtro estéril;

- 05 Pipetas sorológicas de 10 ml estéril;

- 06 Pipetas pasteur estéril;

- 02 Tubos tipo eppendorf;

- 03 Sacolas plásticas pré-sanitizadas;

- 06 Criotubos;

- Etiquetas para identificação dos tubos;

- Câmara de Neubauer.

[256] Soluções:

- Meio Xenofree completo previamente aquecido a 37°C;

- Meio RPMI previamente aquecido a 37°C;

- Solução B (PBS IX, Penicilina, Estreptomicina) previamente aquecido a 37°C;

- PBS IX;

- Dimetil Sulfóxido (Previamente esterilizado por Filtração);

- Solução de Accutase para destacamento celular;

- Solução de Tripan Blue 0,4% (Caso seja realizado a contagem e viabilidade). (Atenção, Tóxico). [257] Verificação de Equipamentos:

[258] Todo equipamento que fará parte do processo deverá ser verificado antes do processamento da amostra, quanto ao correto funcionamento, limpeza e manutenção geral. Abaixo estão listados os equipamentos que farão parte do processo.

- Cabine de segurança Biológica;

- Banho Maria com Agitação;

- Centrífuga;

- Incubadora de C02;

- Pipetador semi-automático;

- Microscópio Invertido;

- Contador de Células automático;

- Câmara de Neubauer e lamínula;

- Cronometro;

- Freezal.

[259] Processo de Criopreservação:

[260] A criopreservação consiste no armazenamento de amostras a baixas temperaturas, em torno, a fim de preservar sua viabilidade celular para uma futura aplicação. O congelamento é realizado em equipamento específico que permite o decaimento da temperatura gradualmente, mantendo assim, condições ideais para a manutenção de sua viabilidade.

[261] O procedimento de Criopreservação da amostra, ocorre quando as amostras estão na etapa final de expansão e já em confluência e densidade celular adequada para tal.

[262] As Criopreservação é realizada em 06 Criotubos, sendo:

[263] As amostras criopreservadas conservam a passagem em que estão, ou seja, a passagem na qual conseguiu-se atingir densidade de células adequada para tal.

[264] Critérios para Criopreservação da Amostra:

[265] A.s amostras com potencial para criopreservação, devem respeitar os seguintes critérios:

1. Estar incubada por um período de até 90 dias.

2. Volume mínimo de suspensão de 8 mL com densidade de células adequada.

3. Densidade de células > lxl O⁶ células /mL viáveis (Live cells).

4. Estar abaixo da 5^o passagem. [266] Criopreservação das Amostras:

[267] A metodologia inicial utilizada para criopreservação, é a mesma utilizada para a passagem ou expansão celular. Ao final do processo, a quantidade de células exigida é transferida para tubos adequados, em meio específico e após isto ocorre a adição da solução crioprotetora.

[268] O mesmo procedimento realizado para a garrafa identificada como

CRIO,também é realizado para a garrafa identificada como C.Q. Para realizar o procedimento de criopreservação, proceder conforme descrito abaixo:

- Realizar o mesmo procedimento com a outra amostra;

- Caso ainda for verificado Debris celulares, realizar a limpeza novamente;

- Adicionar volume adequado de solução de destacamento celular;

- Caso não haja destacamento total, bater suavemente na lateral da garrafa. Se após este processo as células persistam sem se destacarem totalmente, fazer uma nova incubação por ± 5min, até destacamento total;

- Adicionar meio de cultura para inativação (RPMI ou DMEM), suavemente na superfície de crescimento celular e homogeneizar a garrafa;

- Submeter à centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm; - Retirar o tubo e dispensar o sobrenadante, invertendo o tubo, ou pela retirada cuidadosa com pipeta ou ponteira estéril;

- Dispensar, 2 mL de solução PBS lXao tubo

- Submeter à centrifugação por 5 minutos a 1000 rpm.

- Dispensar o sobrenadante

- Adicionar 4mL de meio de Criopreservação, sem a solução crioprotetora no tubo identificado como CRIO para ressuspender o pellet e homogeneizá-los até verificação de conteúdo homogéneo;

- Adicionar 4mL de PBS IX estéril, no tubo identificado como C.Q. para ressuspender o pellet e homogeneizá-los até verificação de conteúdo homogéneo, caso não seja realizada a criopreservação desta amostra;

- Após homogeneização, completar o volume dos tubos para 8 mL e homogeneizar novamente;

- Realizar a contagem e viabilidade das células conforme procedimento específico para o tubo destinado ao CQ, retirando 50 μL· de cada suspensão;

- Homogeneizar novamente os tubos destinados à criopreservação;

- Dispensar 1,2 mL da suspensão em cada criotubo;

- Adicionar 0,13 mL de DMSO previamente filtrado;

- Homogeneizar os tubos rapidamente e transferir os mesmos para o setor de Criopreservação.

[269] Precauções: Após a adição do DMSO, as amostras devem ser transferidas imediatamente ao equipamento de decaimento de temperatura (FreezalO).

[270] Descongelamento:

[271] Objetivo: padronizar o procedimento de descongelamento de células

Criopreservadas, descrevendo e detalhando as etapas realizadas.

[272] Procedimento: Preparação para descongelamento da amostra.

[273] Materiais Inanimados:

- 03 Pipetas graduadas estéreis de 10 ml;

- 03 Pipetas Pasteur estéreis de 3,5 ml;

- 04 Sacolinhas plásticas pré-sanítizadas, para tubo falcon de 15 e 50 ml;

- 02 Pacotes de wiper's estéreis;

- 01 Tubo tipo falcon de 15 ml;

- 01 Tubo tipo falcon de 50 ml estéril;

- 01 Garrafa de Cultura de 25 cm². [274] Soluções:

- 5 ml de Meio XenoFree Completo, previamente aquecido a 37°C;

- 5 ml de meio RPMI, previamente aquecido a 37°C;

- 3 ml de Solução B, previamente aquecido a 37°C.

[275] Descongelamento da amostra:

[276] Após a etapa de preparação concluída, a amostra que será descongelada deverá ser tratada conforme descrito abaixo.

- Verificar a integridade da embalagem;

- Leva o criotubo a Banho Maria à 37°C, cuidadosamente;

- Com movimentos circulares, deixar o tubo em banho por 3 minutos ou até verificar que 80-90% da solução foi liquefeita restando apenas traços da solução congelada;

- Levar o tubo imediatamente a Cabine de segurança Biológica;

- Com o auxílio de uma pipeta transferir o volume do criotubo para tubo contendo 5 mL de meio RPMI;

- Homogeneizar e submeter a centrifugação por 5 minutos a 1000 RPM;

- Retirar o tubo, levar a cabine e dispensar o sobrenadante;

- Ressuspender o pellet com 3 mL de Solução B;

- Homogeneizar e submeter a centrifugação por 5 minutos a 1000 RPM;

- Retirar o tubo, levar a cabine e dispensar o sobrenadante;

- Ressuspender o pellet com 2mL de meio XenoFree Completo;

- Transferir para garrafa de 25 cm² e incubar a 37°C com atmosfera de 5% de C0₂;

- Verificar a adesão celular entre 3 a 4 dias após o descongelamento.

[277] O processo de tratamento (coleta, acondicionamento, transporte,processamento, controle de qualidade) de Células Tronco (2) provenientes da polpa de dentes decíduos com posterior criopreservação e descongelamento, além de ser rápido e eficaz, aumenta a possibilidade de armazenamento e recuperação de Células Tronco (2), sendo inédito e operacional, portanto atende aos quesitos de ineditismos a aplicabilidade industrial inerentes ao deferimento de uma patente.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO DE TRATAMENTO (COLETA, ACONDICIONAMENTO, TRANSPORTE, PROCESSAMENTO, CONTROLE DE QUALIDADE) DE CÉLULAS TRONCOS PROVENIENTES DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS COM POSTERIOR CRIOPRESERVAÇÃO E DESCONGELAMENTO caracterizado por ser destinado a possibilitar a coleta de Células Tronco (2) de dentes decíduos durante o processo de extração dos mesmos, e por ser constituído de três fases, quais sejam a coleta (fase 1), o envio (fase 2) e o processamento (fase 3); por a dita fase 1 ser realizada por dentistas e pediatras, tendo como condições prévias à extração, a criança estar saudável e livre de doenças infecciosas orais e a inspeção visual visando a identificação de possíveis cáries ou infecções e como condições posteriores à extração, a imediata lavagem do dente com solução de soro fisiológico, a inspeção visual e em seguida a imersão em meio de coleta acondicionado dentro de um tubo de coleta, a colocação em uma caixa de coleta e o armazenamento refrigerado com temperatura média' de 4°C até o momento do envio (fase 2);

2. PROCESSO DE TRATAMENTO (COLETA, ACONDICIONAMENTO, TRANSPORTE, PROCESSAMENTO, CONTROLE DE QUALIDADE) DE CÉLULAS TRONCOS PROVENIENTES DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS COM POSTERIOR CRIOPRESERVAÇÃO E DESCONGELAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita fase 2 ser realizada com o envio ao laboratório no intervalo máximo de 48 horas após a extração do dente; por a dita fase 3 ser realizada com a inspeção visual do dente no momento da chegada ao laboratório para identificação de cáries ou condições infecciosas, para na sequência proceder-se três lavagens em solução de tampão fosfato-salino IX ("phosphatebuffered saline": 137 mMNaCl; 2.7 mMKCl; 4.3 mM Na₂HP0₄; 1.47 mM KH₂P0₄, pH ajustado para 7.4) por 1 minuto, uma lavagem em solução de 1% iodopovidona por 2 minutos, uma lavagem em solução de 0.1% tiossulfato de sódio por 1 minuto e uma lavagem em solução de tampão fosfato-salino IX, por 30 segundos;

3. PROCESSO DE TRATAMENTO (COLETA, ACONDICIONAMENTO, TRANSPORTE, PROCESSAMENTO, CONTROLE DE QUALIDADE) DE CÉLULAS TRONCOS PROVENIENTES DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS COM POSTERIOR CRIOPRESERVAÇÃO E DESCONGELAMENTO de acordo com a reivindicação 1 , caracterizado por em seguida a raiz ser separada da coroa dental com o uso de alicate de corte ortodôntiço e, em seguida, a polpa dental ser acessada e isolada com o auxílio de lima ou cureta de Gracey, sendo lavada duas vezes em solução de tampão fosfato-salino IX suplementado com antibiótico (100U/ml de penicilina e 100 ug/mL de estreptomicina);

4. PROCESSO DE TRATAMENTO (COLETA, ACONDICIONAMENTO, TRANSPORTE, PROCESSAMENTO, CONTROLE DE QUALIDADE) DE CÉLULAS TRONCOS PROVENIENTES DA POLPA DE DENTES DECÍDUOS COM POSTERIOR CRIOPRESERVAÇAO E DESCONGELAMENTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por na sequência as polpas serem colocadas em solução de colagenase tipo I e II e incubadas a 37°C por 40 minutos e, após a digestão enzimática, adicionado meio de cultivo celular xeno-free suplementado com 15% de soro humano AB, 100U/mL de penicilina e 100 ug mL de estreptomicina, sendo tudo centrifugado por 5 minutos a 1500 g e o sobrenadante descartado e o precipitado ressuspendido em 5mL de meio de cultivo celular e transferido para garrafas de cultura de 25 cm² de área, onde são monitorados diariamente, frascos com contaminação ou indícios de início de contaminação são descartados imediatamente e frascos com populações celulares saudáveis são monitorados quanto ao crescimento celular, com troca do meio de cultivo a cada 3 dias.