JP2008502714A - 歯肉出血を減少させ、口内炎症を軽減するための乳酸菌の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
ンク色で、引き締まった外観である。患者の生活全体にわたって厳密な口内衛生を維持することが推奨され、さもないと歯肉炎は再発する。
)、母乳および口内に、日常的に見られる。これは、抗菌活性を有することが公知である。例えば、米国特許第5,439,678号明細書、米国特許第5,458,875号明細書、米国特許第5,534,253号明細書、米国特許第5,837,238号明細書、および米国特許第5,849,289号明細書を参照されたい。ラクトバチルス・ロイテリ細胞は、グリセロールの存在下、嫌気的条件下で増殖させる場合、ロイテリン(reuterin)(βーヒドロキシ−プロピオンアルデヒド)として公知の抗菌物質を生産する。伝統的有機酸類の他に「ロイテリサイクリン(Reutericyclin)」などの他の抗菌物質も報告されている(ヘルツェル A.(Hoeltzel,A.)ら、Angewandte Chemie International Edition39、2766−2768頁、2000年)および「PCA(ピログルタミン酸)」(ヤング Z.(Yang,Z.)、ヘルシンキ大学の学位論文、2000年3月)、および「ロイテリシン(Reutericin)6」(トーバ T(Toba T)ら、Lett
Appl Microbiol 13:281−6頁)。ラクトバチルス・ロイテリを含むラクトバチルスは、栄養物の局所競合および他の代謝相互作用により種々の病原性生物を阻害する能力を有することも周知である。
われる。さらに、大抵の総合ビタミン剤はビタミンKを含有していない。
本発明により用いられる乳酸菌株の選択は、以下の4つのステップ様式で実施することができる。
阻害効果を測定するために使用する株の一例は、ポルフィロモナス・ギンギバリス、ATCC33277(米国ヴァージニア州マナサス所在、American Type Culture Collectionから入手できる)である。この単離体を、0.5%酵母抽出液(ディフコ(Difco)、米国デトロイト)(TSBY)を添加したトリプチカーゼダイズブロス(ディフコ)中で増殖させる。細胞を、指数増殖期中に1000xgでの遠心分離により採取し、PBSで2回洗浄し、同じ緩衝液中に再懸濁する。細菌凝集物を分散させるために、細胞懸濁液を低強度音波装置に供す。
試験する乳酸菌株を採取する。該菌は、MRSブロス(ディフコ)中、37℃で16時間増殖させる。プレートを、CO2+N2雰囲気下の嫌気的ジャー(ガスパックシステム(GasPak System)、BBL、ベクトン・ディッキンソン・マイクロバイオロジーシステムズ(Becton Dickinson Microbiology Systems)、米国メリーランド州コッキースビレ)中にインキュベートする。
試験乳酸菌を、それぞれデ・マン・ロゴーサ・シャーペ(de Man,Rogosa,Sharpe)(MRS)媒体およびルリア・ベルタニ(Luria−Bertani)(LB)媒体(ディフコ、メリーランド州スパークス)中で増殖させる。乳酸菌の一晩培養物を、1.0のOD600(凡そ109個の細胞/mlを表す)に希釈し、さらに1:10に希釈し、さらに4時間、8時間および24時間増殖させる。ポルフィロモナス・ギンギバリス、ATCC33277を、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したブルセラ(Brucella)ブロス(ディフコ)中で48時間培養する。培養物を1:10に希釈し、さらに24時間および48時間増殖させる。無細菌細胞の馴化培地を、4℃の8500rpmで10分間の遠心分離により採取する。馴化培地を、細胞ペレットから分離してから、0.22μmポアフィルタユニット(ミリポア(Millipore)、米国マサチューセッツ州ベドフォード)を通してろ過する。
露させる。活性化培地は、2ng LPSを1ウェル当り20μlの馴化培地を添加することにより作製する。マクロファージは、無細胞乳酸菌馴化培地とプレインキュベートまたはコインキュベート(co−incubate)する。組換えmIL−10(R&Dシステムズ(R&D Systems)、ミネソタ州ミネアポリス)を陽性対照として使用する。細胞生存度を、トリパンブルー(インビトロゲン(Invitrogen))排除により評価する。細胞培養上澄液中TNF−αの存在を、サンドイッチ酵素免疫アッセイであるクアンチカイン・エム(Quantikine M)(登録商標)マウスTNF−α免疫アッセイ(R&Dシステムズ)により測定する。
ビタミンK産生乳酸菌の選択は、MRS媒体中嫌気的に増殖させた試験細菌のHPLC分析(コンリー JM(Conly JM)、スタイン K.(Stein K.)、Am J Gastroenterol.1992年3月;87(3):311頁−ビタミンKの定量的および定性的測定(Quantitative and qualitative measurements of K vitamins)を参照)などの標準法により、または試験細菌を遺伝子プローブ分析により行われる。当業者により公知のように、株の増殖およびビタミンKに関する分析は全て、該物質が光酸化に感受性であるため、黄色光下で行う必要がある。
本実施例において、実施例1で先に記述された選択において一般的に良好な増殖特性および好ましい結果に基づいてラクトバチルス・ロイテリFJ1「プロデンチス」(ATCC PTA−5289)が、該株をチューインガムに添加させるために選択される。ラクトバチルス・ロイテリのプロテクチス(protectis)株を、産業界においてラクトバチルスを増殖させる標準法を用いて増殖させ、凍結乾燥する。
1 融解。ソフチサン(Softisan)154(サソール GMBH(SASOL GMBH)、ドイツ国Bad Homburg)を容器に溶解し、70℃に加熱して結晶構造の完全破壊を確実にする。次いで52〜55℃(その固化点のすぐ上)に冷却する。2 顆粒化。ラクトバチルス・ロイテリの凍結乾燥粉末を、ディオスナ(Diosna)高せん断ミキサー/造粒機、または等価の機器に移す。融解したソフチサン154を、ラクトバチルス・ロイテリ粉末に凡そ1分間でゆっくりと加える。さらに集結させる時間は必要としない。添加時にチョッパを使用する。
3 湿性篩い分け。顆粒化直後、トルネードミルを用いて顆粒を1−mmの篩い分けネットに通過させる。篩い分けられた顆粒を、PVCコーティングアルミニウムフォイル製のアルポーチに包装し、乾燥ポーチと共にポーチを形成するためにヒートシーラにより密封し、混合まで冷凍保存する。顆粒化バッチを2つの錠剤用バッチに分ける。
4 混合。ミキサー中の全成分を均一混合物へと混合する。
5 圧縮。最終混合物を、回転式錠剤プレスのホッパに移し、キリアン(Killian)コンプレッサ中、全重量が765mgの錠剤に圧縮する。
6 バルク包装。モレキュラーシーブの乾燥ポーチと共にアルバッグ中に該チューインガムを包装する。アルポーチをプラスチック製バケツに入れ、最終包装の前に少なくとも1週間冷所で保存する。
Claims (11)
- ヒトへの外用投与(external administration)のための乳酸菌株を選択する方法であって、抗菌性、坑炎症性ならびに口腔ムチン接着性を有し、ビタミンKを産生する能力を有するラクトバチルス株を選択することを含んでなる方法。
- ヒトの口内の歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減させる方法であって、請求項1に記載の方法により選択された乳酸菌株のヒトの細胞に投与することを含んでなる方法。
- 乳酸菌株の105〜108コロニー形成単位を、ヒトに毎日投与する請求項2に記載の方法。
- 細胞を、ヒトに経口投与する請求項2に記載の方法。
- 乳酸菌株の105〜108コロニー形成単位を、ヒトに毎日投与する請求項4に記載の方法。
- ヒトへの外用投与のために請求項1に記載の方法により選択された乳酸菌株の細胞を含有する製品。
- 歯肉出血および歯肉炎の処置または予防のための薬剤をさらに含んでなる請求項6に記載の製品。
- 製品が、含そう剤、チューイングガム、および口内錠よりなる群から選択される製品として製剤化される請求項7に記載の製品。
- 乳酸菌株が、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)「プロデンチス(Prodentis)」(ATCC PTA−5289)、ラクトバチルス・ロイテリFJ3(ATCC PTA−5290)およびラクトバチルス・ロイテリ(ATCC PTA 55730)よりなる群から選択される請求項6に記載の製品。
- 請求項1に記載の方法により選択された乳酸菌株。
- ヒトの口内の歯肉出血を減少させ、歯肉炎を軽減させる医薬品製造のために、抗菌性、坑炎症性ならびに口腔ムチン接着性を有し、ビタミンKを産生する能力を有するラクトバチルス株の使用。
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