CN102851350A - 使用乳酸杆菌减少牙龈出血和减轻口腔炎症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种选择乳酸杆菌菌株的方法，该菌株具有抗微生物和抗炎特性、结合口腔粘蛋白并产生维生素K。使用路氏乳杆菌菌株的这类菌株可用于治疗和预防由口腔炎症引起的牙龈出血和牙龈炎。

Description

使用乳酸杆菌减少牙龈出血和减轻口腔炎症
发明背景
相关申请交叉引用
本申请要求具有申请日为2004年6月14日的共同未决的美国临时专利申请号60/580,279的优先权，其公开内容在此引入作为参考。
发明领域
本发明涉及非病原的、抗炎及抗出血的乳酸杆菌菌株的选择和使用，以及使用这样的菌株用于治疗和预防由口腔炎症所引起的牙龈出血、牙龈炎和牙周炎的产品和方法。
相关技术说明
齿衄被认为主要是由于龈线处牙斑未完全从牙上除去所致。牙斑是一种在牙暴露部位上形成的粘性物质，由细菌、粘液和食物残渣组成。这是牙齿损坏的主要原因。没有除去的牙斑矿化为被称作牙垢的坚硬沉着物，沉积于牙基。牙斑和牙垢刺激牙龈并使之发炎。最终，导致出血增多并引发晚期牙龈和颚骨疾病，即牙周炎。
牙龈炎是人最常见的慢性炎症之一。牙龈炎——一种牙周病，是一种当牙龈失去其正常外表并变得肿胀、柔软和发红时的病症。
牙龈和牙齿问题的常见病因例如牙龈炎，也包括牙周炎(晚期牙龈炎)、诸如香豆定(华法令)和肝素的抗凝血剂、牙刷磨损、使用牙线清洁不当、牙齿或牙龈相关的感染、维生素C缺乏病、维生素K缺乏症、怀孕期间激素改变、诸如的阿司匹林的化学刺激物、白血病、放置新假牙引发的义齿性溃疡/刺激，以及原发性血小板减少性紫癜。当发炎和感染时，牙周病通常破坏支撑牙齿的组织，包括齿龈(牙龈)、牙周膜以及牙床(牙槽骨)。不重合的牙齿、镶牙填料粗糙的边缘以及不当或不洁的口腔器械(例如正畸矫治器、假牙、齿桥和牙冠)能刺激牙龈并增加牙龈炎的危险。诸如苯妥英和避孕丸的药物治疗以及诸如铅和铋的重金属摄入也与牙龈炎相关。
牙龈炎和牙周炎起因于几种机制，包括牙袋细菌积聚引发的发炎反应和牙斑沉积的长期效应。如果炎症和胶原降解增加并伸入牙袋下，牙龈炎就发展为牙周炎。对于患者而言，溃疡和牙龈出血的直接后果就是牙齿清洁变得困难。急性和重症患者通常更易受感染并发热。此外，业已报道口腔炎症和出血的副反应与心脏病及自发性早产分娩相关。并发症包括牙龈炎、牙周炎复发、牙龈或颚骨感染或脓肿、以及战壕口炎。
因为牙龈炎是导致牙周炎的第一阶段，所以对于今天之牙科医师而言，治疗和预防措施乃其共同挑战之一。现今优先用于治疗牙龈炎的方法是改善患者口腔卫生，并不时使用洗必泰或抗生素治疗。
如果牙科医师确定患者有些骨质疏松或牙龈退缩，标准治疗是一种称为龈下刮治和根面平整术(SRP)的彻底深入清洁、非外科手术的方法。龈下刮治刮除龈线上下的牙斑和牙垢。根面平整术使牙根上微生物聚集的粗糙牙斑变得光滑并有助于除去致病细菌。该光滑、清洁的表面有助于牙龈再附着在牙齿上。
一种1998年经FDA批准的称为Periostat(盐酸多西环素)的抗严重牙龈疾病的相对新药物用于与SRP联合使用。当SRP主要消灭细菌时，Periostat则通过口服抑制胶原酶(一种引起牙齿和牙龈破坏的酶)起作用。抗生素治疗可与外科手术及其它治疗联合使用或单独使用，以减少或暂时消除与牙周病相关的细菌。然而，医生、牙科医师以及公共卫生官员更加关注的是过度使用这些抗生素能增加细菌抗这些药物的风险。当微生物对抗生素具有抗性时，药物就失去抗感染的能力。也可以将抗生素凝胶、纤维或芯片直接施用于感染的牙袋上。有时，牙科医师会开含洗必泰的专用抗微生物漱口剂处方以助于控制牙斑和牙龈炎。也可使用含抗菌剂三氯生的非处方牙膏。该抗菌成分宣称能减少牙斑以及由此引起的牙龈炎，但临床效果并不明显。
已知几种不同的细菌(尤其是伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯拟杆菌、直肠弯曲杆菌和有害新月形单胞菌)涉及牙周炎疾病的发病机理。但是并不知道这些细菌是否是这些疾病的病因，或它们是否作为引起生物膜组成改变继而引起疾病进展的条件性病原微生物存在。疾病进展取决于龈沟液上微生物群的某些改变，还取决于与先天宿主防御的相互作用。
在工业化世界中牙周病十分普遍。许多人患不同程度的牙龈炎。由于激素变化通常发生在青春期或早期成年期，取决于牙齿和牙龈的健康状况，能持续很久或经常复发。取决于年龄和性别，45-70％的大于13岁的美国公民因牙龈出血而感染。在13-17岁人群中发病率最高，而在35-44岁人群中最低，在大于44岁人群中则又稍有上升。就最严重的牙周病而言，牙周炎(规定为附着损失超过3mm)出现在30-40％的30-39岁人群中，并随年龄的增加呈线性增加，出现在85-90％的80-90岁人群中。在欧洲和其它的工业化世界中很可能同样存在这种情况。瑞典的数据表明约3百万居民牙龈出血。
通常当出现牙龈炎症状时才去咨询牙科医师。牙科医师会检查口腔和牙齿并寻找柔软、肿胀、红紫色的牙龈。在牙基上可见牙斑和牙垢沉着物。牙龈通常并不疼痛或轻度触痛。尽管可进行牙科X线和牙科牙龈探通术(测量骨量)以确定是否发展为牙周炎(炎症波及到牙齿的支持结构)，但通常没有更进一步的检查可做。从发炎的牙龈上除去牙斑可能是不舒服的。非处方抗炎药物治疗有时用于缓解由严格清洁所带来的不适。健康的牙龈是粉红色且外表坚固。推荐患者终身或牙龈炎复发时保持严格的口腔卫生。
牙龈炎治疗的目的是要减轻牙龈炎症和出血。常规治疗包括由牙科医师或牙科保健员进行彻底洗牙。涉及使用多种器械或装置以从牙齿上松动并除去沉着物(刮治术)。牙科医师或卫生专家经常示范刷牙以及用牙线清洁技术。除刷牙和用牙线清洁之外，推荐每年进行两次专业洗牙，对于严重病例则要更常洗牙。除经常、小心的刷牙和用牙线清洁之外亦可推荐使用抗细菌的漱口剂或其它助剂
对于牙周炎治疗而言，主要策略类似于牙龈炎治疗；但是，对于严重疾病，需要进行额外治疗。治疗的目的在于减轻炎症、消除可能存在的牙袋以及探寻所有潜在的病因。诸如牙齿粗糙表面或牙科矫治器的牙齿刺激物都应修复。重要的是要彻底洗牙。因此，强烈推荐刮治术。在专业洗牙后需要仔细的居家口腔卫生以限制进一步的破坏。牙科医师或卫生专家会示范刷牙以及用牙线清洁技术。对于牙周炎，通常推荐多于每年两次标准的专业洗牙。可能需要外科治疗。深藏的牙袋需要打开并清洁。松动的牙齿需要加固。对于晚期牙周炎需要摘取(摘除)牙齿使得破坏无法波及相邻牙齿。
尽管专家所进行的急性治疗比较成功，但是众所周知许多经诊断和治疗的患者在出现类似或更坏的情况下才会回来就诊。对于除去即使小心刷牙和用牙线清洁都能发展的牙斑，常规的专业洗牙是重要的。许多牙科医师推荐至少每6个月进行一次专业洗牙。
一般而言，众所周知一些乳杆菌可能具有有效的抗细菌活性，但并不清楚乳酸杆菌菌株之间减轻宿主炎症能力的差异，也不清楚如何选择这样的菌株。但是，现在已有可能。(WO2004031368)
人和其它哺乳动物口腔含有许多不同种类的细菌，包括许多不同种类的乳酸杆菌。已有一些推测确定乳酸杆菌肯定能影响口腔炎症，并能有助于缓解牙龈炎和牙龈出血。例如，路氏乳杆菌是天然存在于人和动物中的乳杆菌群的主要成分。在最近10年已对该生物体作为益生素进行了广泛的研究，发现具有许多引起注意的特性。在此描述的本发明不同于乳酸杆菌的一般益生素的应用，无需摄入；乳酸杆菌局部存在于接近牙龈区域的口腔生物膜上就足以满足本发明的抗出血作用。仅使用含有乳酸杆菌的口香糖或漱口产品就能施用本发明菌株于人，并可在口中停留足够时间后吐出该产品。在几天内就可检测到抗出血和抗炎作用。
不同种类的乳杆菌(Lactobacillus SP.)菌株，包括路氏乳杆菌，已被用于配制抗微生物制剂。路氏乳杆菌是一种动物胃肠道中天然存在的细菌，一般在肠中发现，偶见于包括人的健康动物的分娩产道、母乳和口腔中。已知具有抗细菌活性。例如，参见美国专利号5,439,678、5,458,875、5,534,253、5,837,238和5,849,289。当路氏乳杆菌细胞在有甘油的厌氧条件下生长时，它们产生一种被称为无蛋白菌质(B-羟基-丙醛)的抗微生物物质。除传统的有机酸之外，业已报道了其它抗微生物物质，例如“Reutericyclin(新品种的乳酸杆菌)”(
Figure BSA00000778303300051
，A.等，Angewandte Chemie International Edition 39，2766-2768，2000)和“PCA(焦谷氨酸)”(Yang，Z.Dissertation，Univ.of Helsinki，March2000)，以及“Reutericin 6”(Toba T，等，Lett Appl Microbiol 13：281-6.)。众所周知，也包括路氏乳杆菌在内的乳酸杆菌通过局部营养竞争及其它代谢作用从而具有抑制多种病原微生物的能力。
路氏乳杆菌的粘蛋白结合蛋白已经被分离和描述。例如，参见美国专利号6,100,388。业已报道乳酸杆菌菌株粘附于不同的细胞系和宿主粘液(Klemm，P.和Schembri，M.A.(2000)Bacterial adhesins：function and structure.Int.J.Med.Microbiol.290，27-35.)。但并不很清楚乳酸杆菌菌株粘附口腔粘蛋白和其它来源粘蛋白能力之间的重要差异。某些菌株善于粘附在口腔粘蛋白和其它粘蛋白上，例如胃粘蛋白，而有些菌株则仅善于粘附在胃粘蛋白上而较少粘附在口腔粘蛋白上，有些菌株却根本就不粘附任何类型的粘蛋白。因此，本发明选择方法的一部分是使用口腔粘蛋白来发现最好的菌株。
虽然已知路氏乳杆菌和某些其它乳酸杆菌能有效地抗细菌、抗炎并具有结合特性，以及某些细菌具有分泌维生素K(甲基萘醌类)的能力，但事先并不知道乳酸杆菌菌株减少牙龈出血和减轻牙龈炎能力之间所存在的本质上差异，因此无法选择这样的菌株。现在公认的是在厌氧生活中增加了甲基萘醌类生物合成(Bentley等，Microbiologicalreview Sept.1982，p.241-280)，意味着所选择菌株所具有的产生维生素K以帮助减少出血的能力在最需要的接近于牙龈的地方增加了。
维生素K是一组三种相关的物质。维生素K1-叶绿醌来自植物，维生素K2-甲基萘醌类来自细菌，维生素K3-甲萘醌则是合成的。正常凝血需要维生素K。其是凝血酶原和涉及血液凝固其它蛋白(凝血因子IX、VII和X)合成所必需的。
业已报道，在服用抗生素的人群中某些过量流血病例(HuilgolVR，等.Am J Gastroenterol 1997；92：706-7)。该副作用可能是由于减少的维生素K活性和/或减少的通过细菌的维生素K产量的结果。一项研究显示服用广谱抗生素的人群肝脏维生素K2(甲基萘醌类)浓度较低，尽管维生素K1(叶绿醌)水平保持正常。几种抗生素似乎能强烈影响维生素K活性，而其它抗生素却没有任何影响。此外，大多数多种维生素剂并不含有维生素K。
业已出乎意料地发现依照本发明特别选择的乳杆菌菌株在减少牙龈出血和减轻牙龈炎中抗微生物、抗炎、口腔粘蛋白(牙齿生物膜)粘附特性以及产生维生素K(甲基萘醌类)的能力更好。
因此，本发明的一个目的是提供更好的乳酸杆菌菌株，所选择的该乳酸杆菌菌株具有其在口腔中通过抗微生物活性、抗炎活性减少牙龈出血和减轻牙龈炎的能力，诸如抗牙龈卟啉单胞菌所引起疾病的能力，由于其粘附口腔粘蛋白的良好能力以及能良好的分泌维生素K并因此成功地预防、缓解或治疗牙龈出血和牙龈炎。本发明的另一个目的是提供含有所述施用于人的菌株的产品。这样的产品也能用于减轻皮肤和身体其它局部表面的炎症和出血。
本发明的又一个目的是提供乳酸杆菌菌株，所选择的该乳酸杆菌菌株具有缓解诸如牙龈卟啉单胞菌引起的口腔炎症的能力，以及这类菌株是以减少牙龈出血的维生素K良好生产者。本发明的再一个目的是提供含有所述菌株的产品，包括施用于人的用于牙龈出血和牙龈炎治疗或预防的药剂。
根据下列所公开的内容以及附加的权利要求，其它目的和优点将更加显而易见。
发明概述
本发明涉及非病原的、抗炎及抗出血的乳酸杆菌菌株的应用，以及使用这样的菌株治疗和预防由口腔炎症所引起的牙龈出血和牙龈炎的产品和方法。根据下列所公开的内容以及附加的权利要求，本发明的其它目的和特征将更加显而易见。
附图说明
图1是显示乳酸杆菌效果的柱状图，对牙龈出血/牙龈炎具有目视改善效果。L.r.prodentis vs.安慰剂：p＜0.005，L.r.prodentis vs.L.r.ATCC55730：p＜0.05，L.r.ATCC55730vs.安慰剂：n.s.(Fisher′s严格)。
发明详述及其优选的实施方案
本发明涉及非病原的、抗炎及抗出血的乳酸杆菌菌株的应用，以及使用这样的菌株治疗和预防由口腔炎症所引起的牙龈出血和牙龈炎的产品和方法。
本发明提供了一种用于减少牙龈出血和减轻牙龈炎的产品，利用了该产品中所选择的菌株，特别是选自诸如路氏乳杆菌“Prodentis”(ATCC PTA-5289)和路氏乳杆菌FJ3(ATCC PTA-5290)的路氏乳杆菌。公众能从美国典型培养物保藏中心ATCC(Rockville，MD)得到，其已于2003年06月25日于此保藏这些菌株，还能得到1995年12月18日保藏的路氏乳杆菌(ATCC 55730)。路氏乳杆菌“Prodentis”(即，路氏乳杆菌FJ1)(ATCC PTA-5289)、路氏乳杆菌FJ3(ATCC PTA-5290)和路氏乳杆菌(ATCC 55730)的保藏物符合布达佩斯条约的要求。
在本文所使用的选择方法中，通过使用细菌细胞的传统微生物测定法研究了涉及牙周炎疾病发病机理细菌(尤其是伴放线放线杆菌、牙龈卟啉单胞菌、福赛斯拟杆菌、直肠弯曲杆菌和有害新月形单胞菌)的抑制作用。使用包被在微量滴定板上的口腔粘蛋白测定粘附能力(参考Jonsson等.2001FEMS Microbiol.lett.204：19-22)。
通过测试细菌在MRS培养基中厌氧生长D的HPLC分析(参考Conly JM，Stein K.Am J Gastroenterol.1992Mar；87(3)：311-Quantitative and qualitative measurements of K vitamins)的标准方法或通过遗传探针分析测试细菌的方法进行选择产生乳酸杆菌的维生素K。如本领域技术人员所公知的，关于维生素K的所有菌株生长和分析应在黄光下进行，因为该物质对光氧化敏感。
本发明的产品可以是任何置于口腔中作为局部预防或治疗牙龈出血和牙龈炎的产品，这样的产品也可作为漱口剂或其它指定的保健产品、口香糖、锭剂等等。
对于本发明产品有效性所必需的所选择的乳杆菌细胞浓度取决于被使用的制剂的类型(或在口腔中使用的时间)，但通常优选具有每日口腔放置约105-108CFU(菌落形成单位)或更多。高达约1010-1011CFU的量是可能的，能用于增加疗效且对产品的感官特性(其味道或气味)没有不利影响。
优选地，本发明的产品不含有其它抗细菌成分，至少不抑制或杀死所选择的乳酸杆菌菌株或干扰抗炎或抗出血活性。
本发明的产品还可包含任何其它有效抗牙龈炎及依照本发明不干扰乳杆菌的配料。所述产品亦可包含本领域公知的赋形剂和添加剂。在此使用的措辞“包含”应理解为包括但不限于所规定的项目。
乳酸杆菌菌株可以是一种添加剂，根据本领域配制该种类型产品的已知方法混合入配料或揉合入或包被在产品上。当使用细胞且如果制备本发明所选择的食品或其它产品需要加热步骤时，乳酸杆菌菌株应在加热后添加。一旦所选择的乳酸杆菌细胞存在于产品中，优选地不要长时间在60-70℃或更高温度下加热产品。
参考下列实施例，本发明的特征将更清楚地得到理解，其不应视为对本发明的限制。
实施例1、选择菌株的方法
选择依照本发明要使用的乳酸杆菌菌株可以如下四步法进行：
a)使用乳酸杆菌菌株细胞评估对牙龈卟啉单胞菌的抑制作用
用于测定抑制作用的菌株的一个实例是牙龈卟啉单胞菌ATCC33277(获得自美国典型培养物保藏中心ATCC，Manassas，VA，USA)。在补充有0.5％酵母抽提物(Difco)(TSBY)的胰酶解酪蛋白大豆培养液(Difco，Detroit，USA)上培养分离物。细胞在指数生长期间通过离心1000xg而收获，用PBS洗涤两次并重悬于相同的缓冲液中。使用低强度超声装置处理细胞悬液以分散细菌聚集体。
在MRS培养液(Difco)上培养测试乳酸杆菌菌株，通过在1000x g下离心收获指数生长期的细胞，用磷酸盐缓冲盐水(PBS；pH 6.8)洗涤两次并重悬于相同的缓冲液中。
在具有1em光程的1.0ml比色皿中测定细菌悬液的光密度，并将悬液终浓度调至1.0x108CFU(菌落形成单位)/ml。
抑制测定进行如下：在无菌离心管中将牙龈卟啉单胞菌悬液与乳酸杆菌悬液以100-0、75-25、50-50和25-75的比例混合(总体积100μL)，添加BHI培养液直到10ml，涡旋混合10秒钟，并在37℃下孵育90分钟，伴以柔和摇动。作为对照，在对照试管中将牙龈卟啉单胞菌悬液与等体积PBS混合(无乳酸杆菌)。随后每种悬液在1000xg下离心洗涤，用PBS洗涤两次，并在MS琼脂上进行平板培养以测定牙龈卟啉单胞菌的CFU计数。通过如下公式获得牙龈卟啉单胞菌的生存率％：
Figure BSA00000778303300101
该测定应最少重复三次。所有获得的数据应进行统计学分析。
在该实施例中，使用上述方法选择了路氏乳杆菌“Prodentis”(ATCC PTA-5289)、路氏乳杆菌FJ3(ATCC PTA-5290)和路氏乳杆菌(ATCC 55730)。
b)评估乳酸杆菌菌株粘附口腔粘蛋白/口腔生物膜的能力
收集要测试的乳酸杆菌菌株。在MRS培养液(Difco)中于37℃培养细菌16小时。将平板在厌氧罐中于CO2+N2气氛下孵育(GasPakSystem，BBL，Becton Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville，MD，USA)。
收集、离心、无菌过滤诸如人唾液的口腔粘液，如所述包被在微量滴定板孔中。在200ml冰冷的补充有0.05％Tween 20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(8.0g NaCl，0.2g KCl，1.44g Na2HPO4·2H2O和0.2g KH2PO4/1000ml dH2O)中收集粘液。将所得到的悬液首先在11000g下离心10分钟，然后在26000g下离心15分钟以便除去细胞和颗粒物质。备选使用的粘蛋白是胃粘蛋白(Sigma，M1778)。将粘液粗制备物贮存在20℃。在50mM pH 9.7的Na2CO3缓冲液中稀释粘液至约100μg/ml，并在微量滴定板(Greiner)孔(150μl/孔)中于4℃缓慢旋转孵育过夜。用含1％Tween 20的PBS封闭孔1小时，然后用PBST洗涤。用BSA包被的孔作为对照。
如上培养要测试的菌株，在补充有0.05％Tween20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.3)中洗涤一次，并在相同的缓冲液中稀释到OD6000.5。添加100μL的细菌悬液到每个孔中并在4℃下孵育过夜。用PBST洗涤孔4次并用倒置显微镜检查结合。倒掉缓冲液并在孔干燥后，在BioRad Gel Doc 2000仪器(BioRad Laboratories，Herkules，CA，USA)中测量孔整个表面的结合。所有测量重复进行三次。
在该实施例中使用上述方法首先选择了路氏乳杆菌“Prodentis”(ATCC PTA-5289)，路氏乳杆菌FJ3(ATCC PTA-5290)和路氏乳杆菌(ATCC 55730)被选择为第二备选物。
c)评估乳酸杆菌菌株的抗炎能力
分别在de Man，Rogosa，Sharpe(MRS)和Luria-Bertani(LB)培养基(Difco，Sparks，MD)中培养测试乳酸杆菌。将乳酸杆菌的过夜培养物稀释至1.0的OD600(代表约109细胞/毫升)并以1∶10进一步稀释，再培养4、8和24小时。在补充有10％胎牛血清(FBS)的Brucella培养液(Difco)中将牙龈卟啉单胞菌ATCC33277培养48小时。以1∶10稀释培养物并再培养24和48小时。通过在8500rpm下4℃离心10分钟收集无细菌细胞条件培养基。分离条件培养基和细胞沉淀，然后通过0.22μm孔径过滤装置(Millipore，Bedford，Mass.USA)过滤。
小鼠单核细胞/巨噬细胞系，RAW 264.7(ATCC TIB-71)和RAW264.7γNO(-)(ATCC CRL-2278)作为报道细胞用于研究炎症反应途径。在补充有10％FBS和2％抗生素(5000Units/ml青霉素和5mg/ml链霉素，Sigma)的Dulbecco氏改良的Eagle培养基(野生型)或RPMI培养基1640(γNO-)(Gibco-Invitrogen，Carlsbad，CA)中在5％CO2下于37℃培养RAW 264.7细胞至80-90％铺满。在96-孔细胞培养群集体中接种约5x104细胞并在脂多糖(LPS)活化及添加条件培养基之前让其粘附2小时。将天然的RAW 264.7细胞暴露于纯化自大肠杆菌E.coli血清型O127∶B8(Sigma)的LPS。通过将2ng LPS添加到每孔20μl的条件培养基中制备活化培养基。巨噬细胞与无细胞乳酸杆菌条件培养基预孵育或共孵育。重组物mIL-10(R&D Systems，Minneapolis，Min.)用作为阳性对照。使用台盼蓝(Invitrogen)排除法测定细胞生存能力。使用夹心酶免疫测定法，Quantikine
Figure BSA00000778303300121
小鼠TNF-α免疫测定法(R&D Systems)测量细胞培养物上清液中TNF-α的量。
使用上述方法选择了路氏乳杆菌“Prodentis”(ATCC PTA-5289)路氏乳杆菌FJ3(ATCC PTA-5290)。
d)评估乳酸杆菌菌株的维生素K分泌能力
使用诸如HPLC分析测试细菌在MRS培养基中厌氧生长(参考Conly JM，Stein K.Am J Gastroenterol.1992Mar；87(3)：311-Quantitativeand qualitative measurements of K vitamins)的标准方法或通过遗传探针分析测试细菌以选择产生乳酸杆菌的维生素K。如本领域技术人员所公知的，关于维生素K的所有菌株生长和分析应在黄光下进行，因为该物质对光氧化敏感。
选择在使用乳酸杆菌细胞抑制牙龈卟啉单胞菌和粘附口腔粘蛋白中都显示最佳结果、依照上述测定法具有抗炎作用并分泌维生素K的乳酸杆菌菌株。
实施例2  制造含有所选择菌株的口香糖产品
在该实施例中，基于实施例1中较早提及选择的具有良好生长特性并产生普遍和良好结果的路氏乳杆菌FJ1“Prodentis”(ATCCPTA-5289)被选择出来，以便添加该菌株到口香糖中。使用培养乳杆菌的工业标准方法培养并冻干路氏乳杆菌protectis菌株。
含有所选择菌株口香糖制造方法实施例的步骤如下，应当理解的是赋形剂、填料、调味剂、包囊剂、润滑剂、消结块剂、增甜剂以及口香糖产品的其它组分是本领域公知的，可以使用且不影响该产品功效：
1、熔化。在容器中熔化Softisan 154(SASOL GMBH，BadHomburg，Germany)并加热至70℃以确保结晶结构完全分解。然后冷却至52～55℃(正好高于其凝固点)。
2、造粒。将路氏乳杆菌冻干粉末转移到Diosna高剪切混合器/造粒机或等价物中。在约1分钟的时间内缓慢添加熔化的Softisan 154到路氏乳杆菌粉末中。无需额外的块化时间。添加过程中使用切碎机。
3、湿法筛分。造粒后立刻使用Tornado磨粉机将颗粒穿过1-mm筛网。将筛选的颗粒与干燥剂袋一起包装在由覆盖有铝箔的PVC制成的铝袋(alupouches)中，用热封机密封以形成小袋，冷冻贮存直至混合。颗粒批量分为两片一批。
4、混合。在搅拌器中混合所有成分至均匀混合。
5、压片。转移最终的混合物到旋转式压片机的料斗中，在Kilian压板中压制为总重765mg的小片。
6、成批包装。将口香糖与分子筛干燥袋一起包装在铝袋中。铝袋置于塑料桶中并在最后包装前贮存在阴凉处至少一周。
作为工业标准的过程中控制如下表1所示。
表1
Figure BSA00000778303300141
在该实施例中，接着如上将所选择的路氏乳杆菌培养物以107CFU/g产品的水平添加，该口香糖供人使用以作为一种减少牙龈出血和减轻牙龈炎的方法。
如上所述，本发明的产品可以是不同于口香糖的形式，例如锭剂及其它制剂，包括选择路氏乳杆菌培养物在内的本领域公知的制备基础产品标准方法对于制备本发明产品是有用的。
尽管某些代表性实施方案已列于此，本领域技术人员可容易地意识到能进行不背离本发明精神或范围的修改。

Claims (4)

1.一种用于减少人口腔牙龈出血和减轻牙龈炎的乳酸杆菌菌株的选择方法，包括测定具有抗微生物、抗炎和口腔粘蛋白粘附特性以及具有产生维生素K能力的乳酸杆菌菌株；以及选择具有抗微生物、抗炎和口腔粘蛋白粘附特性以及具有产生维生素K能力的乳酸杆菌菌株。
2.一种包括通过权利要求1所述的选择方法获得的乳酸杆菌菌株细胞的产品，所述产品在减少人口腔牙龈出血和减轻牙龈炎的应用中具有对牙龈卟啉单胞菌抑制作用和口腔粘蛋白粘附特性、以及具有产生维生素K能力。
3.一种路氏乳杆菌菌株“Prodentis”保藏号为ATCC PTA-5289。
4.一种路氏乳杆菌菌株FJ3保藏号为ATCC PTA-5290。
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