ES2199305T3 - Uso de lactobacillus reuteri para inhibir criptosporidiosis en mamiferos. - Google Patents
Uso de lactobacillus reuteri para inhibir criptosporidiosis en mamiferos.Info
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Abstract
EL CRYPTOSPORIDIUM PARVUM (LA CAUSA DE LA CRIPTOSPORIDIOSIS) SE HA CONVERTIDO EN UNO DE LOS ENTEROPATOGENOS MAS COMUNES QUE PRODUCEN DIARREA EN TODO EL MUNDO. LOS SINTOMAS ASOCIADOS CON LA CRIPTOSPORIDIOSIS SON MUY DEBILITANTES, ESPECIALMENTE EN UN SUJETO INMUNOCOMPROMETIDO (POR EJEMPLO UN PACIENTE CON SIDA). LAS CARACTERISTICAS CLINICAS INCLUYEN DIARREA GRAVE Y CRONICA, CALAMBRES ABDOMINALES, FATIGA, PERDIDA DE PESO, ETC. QUE CONDUCEN A UN AUMENTO EN LOS COSTES SANITARIOS Y EN LA MORTALIDAD. EN LA MEMORIA DESCRIPTIVA SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA INHIBIR LA GRAVEDAD DE UNA INFECCION POR CRYPTOSPORIDIUM PARVUM MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE FORMA ENTERICA DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFICAZ DE LACTOBACILLUS REUTERI.
Description
Uso de Lactobacillus reuteri para inhibir
criptosporidiosis en mamíferos.
Esta invención se refiere al uso de
Lactobacillus reuteri para la inhibición de estadios de
enfermedades asociados con Cryptosporidium parvum.
La criptosporidiosis es causada por el parásito
protozoario Cryptosporidium parvum (C. parvum).
Históricamente, se ha reconocido C. parvum como una causa de
la diarrea y mortalidad en animales jóvenes con un sistema inmune
subdesarrollado. No era hasta el estallido del síndrome de
inmunodefiencia adquirido (SIDA) que C. parvum se consideró
como un problema importante en seres humanos (Petersen,
``Cryptosporidiosis in patients infected with the human
immunodeficiency virus,'' Clinical Infectious Diseases,
15:903-909, 1992). Un mayor conocimiento y
técnicas diagnósticas mejoradas indican que C. parvum puede
ser ahora uno de los tres enteropatógenos más importantes que
provoca la enfermedad diarrea en todo el mundo (Laughten, et al.,
``Summary of the workshop on future directions in discovery and
development of therapeutic agents for opportunistic infections
associated with AIDS'', The Journal of Infectious Diseases,
164:244-251, 1991). Se ha informado de estallidos
en pacientes pediátricos en hospitales (Navarrete, et al., ``An
outbreak of Cryptosporidium diarrhea in a pediatric
hospital,'' The Pediatric Infectious Disease Journal,
10:248-250, 1991) y centros de atención primaria
(Anónimo, ``Cryptosporidiosis among children attending
day-care centres - Georgia, Pennsylvania, Michigan,
California, New Mexico,'' Morbid. Mortal.
33:599-601, 1984). Incluso más reciente, un
estallido grande a través del agua en Milwaukee, Wisconsin, afectó a
más de 400.000 personas (MacKenzie, et al., ``A massive outbreak in
Milwaukee of Cryptosporidium infection transmitted thorugh the
public water supply,'' New England Journal of Medicine, 331:
161-167, 1984).
La infección por C. parvum se adquiere a
través de la ingestión de oocistos procedentes de las heces de
animales o seres humanos infectados que permanecen en el medio
ambiente. Durante el ciclo de vida de C. parvum se pueden
producir numerosos oocistos que se pueden excretar al medio ambiente
o permanecer dentro del huésped para provocar la autoinfección
(Fayer, y Unger, ``Cryptosporidium spp. and
cryptosporidiosis,'' Microbiological Reviews,
50:458-483, 1986). Los oocistos son asombrosamente
resistentes a la mayoría de los desinfectantes usados habitualmente,
y es probable que la cloración rutinaria de agua potable no tenga
ningún efecto en la viabilidad de los mismos (Current, ``The biology
of Cryptosporidium,'' ASM News}, 54:805-811,
1988). Este oocisto resistente al medio ambiente ayuda a la
transmisión de los organismos a través de bien la contaminación del
suministro de agua potable o bien por contacto entre individuos.
Algunas investigaciones sugieren que sólo se necesitan 30 oocistos
para infectar a un individuo, pero en el caso de un individuo
inmunosuprimido, podría bastar con sólo uno. Esto podría basarse en
el hecho de que sólo se encontraron de 8 a 10 oocistos por cada 100
litros de agua en el estallido reciente en Milwaukee (Schwartz, et
al., ``Biliary cryptosporidiosis in HIV^{+} patients after a
waterbourne outbreak in Milwaukee,'' Gastroenterology,
106(4): A770 (resumen), 1984). Interesantemente, hace poco
el gobierno estadounidense emitió el siguiente aviso para agua del
grifo: ``Oficiales federales de sanidad han avisado a la nación de
que la amenaza diaria de criptosporidiosis está tan extendida que
toda persona con un sistema inmune debilitado podría desear evitar
beber agua directamente del grifo. La Agencia de Protección del
Medio Ambiente de EE.UU. y los Centros para el Control y Prevención
de Enfermedades indican que las personas con sistemas inmunes
gravemente debilitados deberían tomar precauciones tal como hervir
el agua, instalar filtros o usar agua embotellada. Aquellos que
corren riesgo son los enfermos con el SIDA o VIH; pacientes con
cáncer; pacientes con transplante; personas con un sistema inmune
genéticamente debilitado, y niños desnutridos,'' [The Columbus
Dispatch Sábado, 17 de Junio, 1985 página 4). Hasta la fecha,
ninguna terapia ha demostrado ser clínicamente eficaz.
Aunque la criptosporidiosis puede ser
problemática para cualquier persona, el impacto más notable ha sido
entre pacientes con el virus de inmunodeficiencia humano (VIH).
Signos clínicos incluyen la diarrea crónica (parecida al cólera),
calambres abdominales, el cansancio, la pérdida de peso, etc. En
personas inmunocompetentes, el inicio de esta enfermedad es
explosivo pero es generalmente autolimitante después de
aproximadamente dos semanas. Sin embargo, este estado es muy
debilitante para el individuo inmunosuprimido y constituye una
amenaza para la vida. Recientemente, Blanshard y Gazzard (``Natural
history and prognosis of diarrhoea of unknown cause in patients with
acquired immunodeficiency syndrome (AIDS),'' Gut,
36:283-286, 1995) han demostrado que la diarrea
asociada con C. parvum en pacientes de SIDA se correlaciona
con un tiempo de supervivencia mediano significativamente más corto.
En su estudio, el tiempo de supervivencia mediano para pacientes
con diarrea ``negativa para el patógeno'' fue 48,7 meses, que era
similar al de los pacientes control sin diarrea; sin embargo, el
tiempo de supervivencia mediano fue significativamente más largo que
el de pacientes equivalentes con un patógeno gastrointestinal (9,6
meses). De esos pacientes con una diarrea positiva para el
patógeno, se determinó que la causa fue C. parvum en
aproximadamente el 40% de los casos. Otros han informado de una
tasa de mortalidad más alta en pacientes de SIDA con
criptosporidiosis en comparición con pacientes de SIDA no infectados
(Gilson, et al., ``Impact of a community-wide
outbreak of cryptosporidiosis on patients with AIDS,'' Tenth
International Conference of AIDS 2:24 (resumen), 1994).
Se desconoce la verdadera prevalencia de
criptosporidiosis. Se ha estimado que del 10 al 20 por ciento de
pacientes de SIDA en los Estados Unidos han desarrollado una diarrea
crónica de C. parvum, mientras que la incidencia es
probablemente mayor en países en vías de desarrollo en los que
suministros de agua contaminados constituyen una preocupación
grande. Las tasas de incidencia reseñadas subestiman la existencia
de la infección por C. Parvum,} porque en el pasado no se reconocía
su patogenicidad en seres humanos y por la dificultad relativa para
identificarlo.
Aunque recientemente se ha ensayado numerosas
terapias, ninguna de ellas parece mejorar este estado debilitante.
Se describe un método para reducir la infestación intestinal por
C. parvum a través de un suplemento enteral diario con
probióticos. Se ha definido a los probióticos como un suplemento
alimenticio microbiano vivo que afecta al huésped de forma
beneficiosa porque mejora el equilibrio microbiano intestinal
(Fuller, ``Probiotics in man and animals,'' Journal of Applied
Bacteriology, 66:365-378, 1989). Algunos
investigadores creen que esta normalización de la microbiota
intestinal conferirá los siguientes beneficios: (a) la protección
contra patógenos a través de la exclusión competitiva (también
denominada resistencia a la colonización); (b) la provisión de
ciertos nutrientes y reacciones enzimáticas/detoxificantes; (c) la
implicación en la morfogenesis de tejidos y la actividad
peristáltica; y (d) la interacción con los sistemas inmunes y
endocrinos del huésped. (Speck, et al., ``Lactobacillus
reuteri in food supplementation,'' Food Technology,
Julio: 90-94, 1983). Ejemplos de organismos
probióticos incluyen varias bacterias del ácido láctico tales como
lactobacilos, estreptococos y las bifidobacterias.
Los lactobacilos encontrados con más frecuencia
en el intestino en personas sanas son Lactobacillus reuteri (L.
reuteri) y Lactobacillus acidophilus (L. acidophilus). L.
reuteri es un organismo ubicuo en hombres y animales. De las
bacterias intestinales de ácido láctico (BAL), L. reuteri se
considera una de las especies más dominantes. Debido a la
incapacidad del microbiólogo a diferenciar L. reuteri de
Lactobacillus fermentum (L. fermentum) en el pasado, muchos
investigadores creen que un alto porcentaje de BALs clasificadas
como L. fermentum en la bibliografía más antigua son en
realidad cepas de L. reuteri.
L. reuteri es una especie de
heterofermentación típica de Lactobacillus. Al igual que
otros lactobacilos, L. reuteri produce productos finales
metabólicos ácidos (el acetato y lactato) que tienen una actividad
antimicrobiana considerable. Se ha descubierto recientemente que el
metabolismo del glicerol por L. reuteri puede resultar en la
excreción de un intermedio metabólico, el
3-hidroxipropionaldehído (reuterina; Axelsson,
``Production of a broad spectrum antimicrobial substance by
Lactobacillus reuteri,'' Microbial Ecology in Health and
Disease, 2:131-138, 1989). Se ha demostrado que
este compuesto tiene una actividad antimicrobiana contra una
diversidad de organismos, que incluyen bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas,
levaduras, mohos y protozoos (Chung, et al., ``In vitro
studies on reuterin synthesis by Lactobacillus reuteri,''
Microbial Ecology in Health and Disease,
2:137-144, 1989). Se sospecha que la actividad de
reuterina contribuye a la supervivencia de L. reuteri dentro
del ecosistema gastrointestinal.
Así mismo, L. acidophilus es un habitante
normal del tracto gastrointestinal humano. L. acidophilus es
una especie de homofermentación, que fermenta sobre todo azúcares de
hexosa, proporcionando predominantemente el ácido láctico
(85-95%). El uso de L. acidophilus data de
principios del siglo veinte.
Se proporciona, de acuerdo con un aspecto de la
presente invención, un medicamento para la inhibición de la
infección de un mamífero por Cryptosporidium parvum
utilizando Lactobacillus reuteri administrado por vía enteral
en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para inhibir dicha
infección.
Se proporciona de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención un medicamento para la inhibición de la infección
de un mamífero con Cryptosporidium parvum utilizando
Lactobacillus reuteri por vía enteral en una cantidad que es
terapéuticamente eficaz para inhibir dicha infección, tal como se
evidencia por una reducción del despojo de oocistos de
Cryptosporidium parvum en las heces.
Se proporciona, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención, un medicamento para la inhibición de la
infección del intestino de un mamífero por oocistos de
Cryptosporidium parvum utilizando Lactobacillus
reuteri administrado por vía enteral en una cantidad que es
terapéuticamente eficaz para inhibir dicha infección.
Se proporciona, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención, un medicamento para la inhibición de la
infección del intestino de un mamífero por los oocistos de
Cryptosporidium parvum utilizando Lactobacillus
reuteri administrado por vía enteral en una cantidad que es
terapéuticamente eficaz, se evidencia por una reducción del despojo
de oocistos de Cryptosporidium parvum en las heces.
Se proporciona, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención, un medicamento para incrementar la resistencia a
la infección por Cryptosporidium parvum en un mamífero
inmunocomprometido utilizando Lactobacillus reuteri
administrado por vía enteral en una cantidad que es
terapéuticamente eficaz para la inhibición de dicha infección.
Se proporciona, de acuerdo con otro aspecto de la
presente invención, un medicamento para incrementar la resistencia a
la infección con Cryptosporidium parvum en un mamífero
inmunocomprometido utilizando Lactobacillus reuteri
administrado por vía enteral en una cantidad que es terapéuticamente
eficaz para inhibir dicha infección, evidencia por una reducción del
despojo de oocistos de Cryptosporidium parvum en las
heces.
La Figura 1 es una representación gráfica de los
resultados del Experimento 1.
Se llevaron a cabo dos experimentos para
determinar el efecto de L. reuteri o L. acidophilus en
la infección por C. parvum en un modelo murino de SIDA.
La criptosporidiosis es la única infección
oportunista de pacientes por SIDA para la cual no existe ninguna
terapia clínicamente eficaz. Generalmente, se reconoce que el
modelo mejor descrito es el del ratón. Se han descrito varios
``tipos'' de modelos de ratones, incluyendo el del ratón neonatal
desprovisto de sistema inmune BALB/c. Este ratón desarrolla una
infección persistente; sin embargo, estos ratones llegan a ser más
resistentes a la infección después de 42 días de edad (Heine, et
al., ``Persistent Cryptosporidium infection in congenitally
athymic (nude) mice,'' Infection and immunity
43(3):856-859, 1984). Además, se han
descrito modelos en ratones que padecen inmunodeficiencia combinada
grave (IDCG) y ratones que reciben anticuerpos
anti-células T (Harp, et al., ``Resistance of severe
combined immunodeficient mice to infection with Cryptosporidium
parvum: the importance of intestinal microflora,'' Infection
and immunity, 60(9):3509-3512, 1992;
Ungar, et al., ``New mouse models for chronic Cryptosporidium
infection in immunodeficient hosts,'' Infection and immunity
58(4):961-969, 1990). Un modelo de interés
especial es el ratón infectado con SIDAM (síndrome de
inmunodeficiencia adquirida murino). En este modelo, se infectan
ratones con retrovirus leucémicos de SIDAM en un intento de imitar
la evolución de la enfermedad que se produce en el SIDA humano. Los
beneficios de este modelo incluyen una reducción similar en la
respuesta de las células T y una esplenomegalia y linfadenopatia
progresivas tal como en el VIH/SIDA, además de un desarrollo
relativamente rápido de la enfermedad (Alak, et al., ``Alcohol and
murine acquired immunodeficiency syndrome suppression of resistance
to Cryptosporidium parvum infection during modulation of
cytokine production,'' Alcoholism: Clinical and Experimental
Research, 17(3): 539-544, 1993). Se ha
sugerido que este modelo proporciona medios para el estudio de
mecanismos de resistencia a la infección por C. parvum y
métodos para el tratamiento de criptosporidiosis (Darban, et al.,
``Cryptosporidiosis facilitated by murine retroviral infection with
MO-LP5,'' The Journal of Infectious Diseases,
164:741-743, 1991).
Un resumen presentado por Famularo et al.,
(``Effect of lactobacilli on Cryptosporidium parvum infection
in man and animals,'' Microbial Ecology in Health and
Disease, 8(1):III, 1985) sugirió que una mezcla de
numerosos organismos de lactobacilos (S. thermophilus, L.
acidophilus, L. bulgaricus, L. casei, L. plantarum y una mezcla
de bifidobacterias) era eficaz para mejorar los síntomas asociados
con la criptosporidiosis. La presente invención documenta
claramente la capacidad de un solo organismo de inhibir la
infectividad de C. parvum.
Experimento 1 (Exp.
1)
El objetivo de este estudio era determinar si un
pretratamiento con L. reuteri podría prevenir o suprimir la
infección por C. parvum en ratones hembras C57BL/6
inmunosuprimidos por inoculación con MO-LP5 (médula
ósea linfoproliferativa 5)
Se adquirieron ratones hembras C57BL/6 (3 a 4
semanas de edad) de Harian Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis,
Indiana). Los ratones se alojaron en una unidad
micro-aisladora con un sistema de filtración de
aire. Se alojaron cinco ratones por cada jaula para reducir la
agresividad. La instalación de alojamiento se mantuvo a una
temperatura de 20 a 22ºC y a una humedad relativa del 60 a 80%. Se
expusieron los animales a un ciclo de luz/oscuridad de
12-12 horas y se les permitió consumir agua y pienso
para ratones (Purina Company, St. Louis, Missouri) de forma ad
libitum. Los ratones se mantuvieron en la instalación según las
normas estandarizadas establecidas por el Comité para el Cuidado de
Animales de la Universidad de Tuskegee (Tuskegee, Alabama) para la
salud y el bienestar de los animales.
Se inocularon los ratones por vía intraperitoneal
(IP) con 0,30 mililitros (ml) de virus leucémico murino
MO-LP5 (VLMu) que tenía un título acotrópico de 4,5
log_{10} UFP/ml (unidades formadoras de placas/mL) en un línea de
células XC. La cepa de VLMu fue proporcionada por el Dr. Ronald R.
Watson (Escuela de Medicina de la Universidad de Arizona, Tucson,
Arizona, fuente original: Dr. Robert Yetter, Centro para la
Evaluación e Investigación Biológica, FDA, Bethesda, Maryland).
Oocistos esterilizados inóculos de C.
parvum fueron proporcionados por el Dr. James A. Harp (Centro
Nacional de Enfermedades Animales, Ames, Iowa). Los oocistos de
C. parvum fueron purificados de terneras experimentalmente
infectadas tal como se describió anteriormente (Harp, et al.,
``Resistance of severe combined immunodeficient mice to infection
with Cryptosporidium parvum; the importance of intestinal
microflora'', Infection and Immunity,
60(9):3509-3512, 1992).
Dos aislados de L. reuteri de ratón (un
aislado del estómago y otro del intestino delgado, las cepas 4000 y
4020, respectivamente) se obtuvieron de BioGaia Biologics, Inc.,
(Raleigh, North Carolina). Se suministró la cepa de L.
reuteri como preparaciones congeladas en agua de peptona al
0,1% para la inoculación de los ratones. Las cepas de L.
reuteri se desarrollaron por separado y luego el mismo número de
unidades formadoras de colonias (UFC) de cada cepa se unieron para
dar una concentración final de 5 x 10^{8} UFC/ml. Generalmente,
se reconoce que la capacidad para colonización de la mucosa por
lactobacilos (por ejemplo, L. reuteri) es específico para el
huésped (Lin y Savage, ``Host specificity of the colonization of
murine gastric epithelium by lactobacilli,'' FEMS Microbiology
Letters 24:67-71, 1984). Para que un probiótico
pueda competir con los patógenos por los receptores de adhesión,
tiene que poder colonizar el intestino. Por tanto, se utilizó L.
reuteri aislado de ratones en los estudios.
En total, se asignaron aleatoriamente 40 ratones
hembras C57BL/8 (10 ratones por grupo) a uno de cuatro tratamientos
(A, B, C o D; Tabla 1) después de que hubieran sido inmunosuprimidos
durante 4 meses por inoculación previa con
MO-LP5.
| Descripción de los grupos de tratamiento para el Exp. 1 | |||
| Tratamiento | |||
| Grupo^{1} | MO-LP5^{2} | L. reuteri^{3} | C. parvum^{4} |
| A | + | - | - |
| B | + | - | + |
| C | + | + | - |
| D | + | + | + |
| ^{1} diez ratones por grupo (5 ratones por jaula). | |||
| ^{2} inmunosuprimidos durante 4 meses por inoculación con MO-LP5. | |||
| ^{3}L. reuteri alimentado a la fuerza diariamente (1,0 x 10^{8} UFC por ratón) durante la fase de apresto y la fase | |||
| experimental. | |||
| ^{4} infectados con C. parvum (8,5 x 10^{8} oocistos por ratón) 11 días después de suplementación con L. reuteri. |
El experimento se dividió en una fase de apresto
y una fase experimental. La fase de apresto duró 10 días durante
los cuales 20 ratones (los grupos C y D) fueron alimentados a la
fuerza con L. reuteri (1 x 10^{8}UFC en 0,2 ml)
diariamente. Los 20 ratones restantes (los grupos A y B) fueron
alimentados a la fuerza diariamente con solución salina tamponada
con fosfato (STF). Los ratones que recibieron L. reuteri o
STF durante la fase de apresto fueron tratados de forma similar
durante la fase experimental, mientras que los animales tenían
acceso ad libitum a la comida y al agua. Durante la fase de
apresto, se recogieron muestras fecales los días 0 (línea de base),
4 y 7 para el recuento de lactobacilos totales y de L.
reuteri. El día 10 se recogieron heces fecales de todos los
ratones para la detección de despojo de oocistos de C. parvum
y el recuento de los lactobacilos totales y de L. reuteri.
Se inició la fase experimental el día 11 del estudio, durante el
cual se expuso a los ratones a 6,5 x 10^{6} oocistos de C.
parvum en 0,2 ml de STF esterilizada. Anteriormente, se había
demostrado que una concentración de oocistos de 2,0 x 10^{5}
potenciaba el crecimiento y reducía la variabilidad en el despojo de
parásitos del tracto intestinal de animales de los mismos grupos
experimentales (Darban, et al., ``Cryptosporidiosis facilitated by
murine retroviral infection with MO-LP5,'' The
Journal of Infectious Diseases, 164:741-745,
1991). Se recogieron muestras fecales los días 17 y 25 para el
recuento de L. reuteri, Lactobacillustotales y C.
parvum. El día 26, los ratones fueron sacrificados por
inhalación de éter. Después, se extrajeron 1 a 2 centímetros (cm)
del estómago proximal, íleon distal y colon de cada ratón, y se
fijaron en formalina al 10%. Se registraron la ingesta diaria de
comida y agua, el peso corporal inicial y final, y el desarrollo de
la diarrea.
Muestras fecales frescas (3 a 4 heces) se pesaron
y se colocaron en pequeños viales esterilizados (resistentes hasta
-70ºC). Las muestras se congelaron rápidamente utilizando alcohol y
nieve carbónica y se almacenaron a -70ºC hasta su transporte. Se
transportaron las muestras sobre nieve carbónica con entrega el día
siguiente a BioGala Biologics, Inc, para el recuento de
Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. Se contaron
L. reuteri y Lactobacillus spp. totales utilizando
técnicas estándares para microbios anaerobios y/o técnicas
desarrolladas por BioGala Biologics, Inc., tal como se ha descrito
anteriormente (Wolf, et al., ``Safety and tolerance of
Lactobacillus reuteri in healthy adult male subjects,''
Microbiological Ecology in Health and Diseases
8:41-50, 1995). Recuentos de
Lactobacillusspp. totales y L. reuteri fecales se
registraron como UFC/gramo (g) de heces húmedas. En este
experimento, se ha definido la colonización como más de 5.0 x
10^{3} UFC/g de heces húmedas.
Goodgame et al., (``Intensity of infection in
AIDS-associated cryptosporidiosis'', The Journal
of Infectious Diseases, 167:704-709, 1983)
encontraron una correlación significativa entre la excreción fecal
de oocistos y los números de organismos de C. parvum
observados en biopsias del intestino delgado. Sugirieron que existe
un umbral de intensidad de la infección por debajo del cual no
aparecen los síntomas y que una reducción en la excreción de
oocistos, aun en ausencia de la erradicación total, puede ser una
medida válida de la eficacia de un fármaco. En este experimento los
oocistos de C. parvum despojados en las heces se estimaron
como oocistos/g de heces tal como se describió anteriormente (Alak,
et al., ``Alcohol and murine acquired immunodeficiency syndrome
suppression of resistance to Cryptosporidium parvum infection
during modulation of cytokine production,'' Alcoholism: Clinical
and Experimental Research, 17(3):539-544,
1993). En resumen, se recogieron 3 a 4 heces fecales de cada ratón
en tubos estériles de microcentrífuga pesados anteriormente. El
peso de cada muestra fecal se determinó restando el peso de cada
tubo de microcentrífuga del peso total de los tubos más el contenido
fecal. Se añadió un ml de solución tamponada de formalina al 10% a
cada tubo de microcentrífuga y las muestras se almacenaron a
temperatura ambiente o a 4ºC hasta su análisis. Primero, las
muestras fecales se mezclaron utilizando varas aplicadoras, luego se
revolvieron fuertemente. Se hicieron unas diluciones apropiadas en
STF, se filtraron a través de filtros millipore con una luz de paso
de 0,45 micrómetros (\mum) (Micron Separation Inc., Westboro,
Massachusetts) en una cámara de alojamiento (Gelman Sciences Inc.,
Ann Arbor, Michigan) utilizando jeringuillas de 5 ml. Los extremos
inferiores de la cámara se envolvieron con cinta PARAFILM (parafilm
es una marca registrada de American Can Co.) y se añadieron 150
microlitros (\mul) de una dilución 1:8 de reactivo para la
detección de Cryptosporidium (Meridian Diagnostics, Inc.,
Cincinnati, Ohio) diluido en STF a cada cámara y se dejaron incubar
a temperatura ambiente durante 1 hora protegidas de la luz. La
cinta PARAFILM se retiró y las cámaras se lavaron 3 veces con STF
utilizando jeringuillas de 5 ml. Se sellaron los extremos
inferiores de las cámaras con cinta PARAFILM, luego se añadieron a
cada cámara 150 \mul de reactivo de contratinción, diluido 1:10 en
STF, se incubaron y luego se lavaron. Los filtros que contenían los
oocistos retenidos en las superficies superiores de los filtros se
montaron sobre platinas de cristal (Meridian Diagnostics, Inc.). Se
añadieron una o 2 gotas de glicerina tamponada, diluida 1:9 en STF.
Se aplicaron fundas para taparlas y se sellaron los bordes con
esmalte transparente para las uñas (Pavlon LTD, Nyack, Nueva York).
Los oocistos de C. parvum mostraron una tinción
característica de verde manzana de las paredes cuando se observaron
en un microscopio fluorescente Leitz (Leica Inc., Chicago, Illinois)
utilizando una lente de objetivo de 40x. Teniendo en cuenta el
factor de dilución de la muestra, el peso y volumen total de las
heces y el recuento de oocistos por filtro, se estimó el número de
oocistos despojados por gramo de heces. Para el recuento de la
colonización parasítica del epitelio intestinal, se extirparon
quirúrgicamente 1 a 2 cm de íleon distal de cada ratón y se
aclararon en PBS. Cada sección intestinal se tiñó histológicamente
mediante el método convencional de hematoxilina/eosina.Se contó el
número medio de oocistos colonizados por centímetro del trozo de
intestino utilizando un hemocitómetro bajo un microscopio de
contraste de fase con una lente de objetivo de 40x. Puntuaciones de
infectividad para las secciones histológicas se determinaron como el
número de oocistos por cm de órgano.
Dado que se manejaron los ratones en jaulas de 5
animales cada una, las jaulas se colocaron dentro de los grupos de
tratamiento. El resultado fue un modelo de Análisis de Varianza
(ANOVA) colocado con un efecto de tratamiento principal (A, B, C, D)
y un efecto colocado (una jaula en un tratamiento dado). Se
examinaron todos los datos para evaluar la suposición de una
distribución normal de residuos ajustando al modelo de ANOVA
colocado, examinando los residuos mediante el ensayo de
Shapiro-Wilk. Los datos que se ajustaron a la
suposición de normalidad se analizaron utilizando el modelo de ANOVA
colocado. Los datos que no se ajustaron a la suposición de
normalidad se ordenaron y el orden resultante se analizó utilizando
el ANOVA colocado. Para efectos significativos de tratamiento, los
medios de tratamiento se compararon a través del ensayo HSD de
Tukey. Los medios de tratamiento eran significativos si diferían el
uno del otro a un nivel de probabilidad del 5%.
Los ratones en los Grupos A, B y C tenían una
pequeña reducción en el peso corporal a diferencia de los ratones
en el Grupo D, cuyo peso corporal se mantuvo sin cambios hasta el
final del estudio. Los ratones en el Grupo A tenían el peso
corporal más bajo de todos los grupos al inicio del estudio (21,45
comparado con 23,08, 23,66 y 23,22 g/ratón para los Grupos A, B, C y
D, respectivamente) que se pueden correlacionar con sus pesos
corporales finales inferiores (p<0,05) (21,13, 22,55, 22,30 y
23,28 g/ratón para los Grupos A, B, C y D, respectivamente). Los
ratones en el Grupo D tenían los pesos corporales más altos aunque
este parámetro no era diferente (P > 0,05) para los ratones de
los Grupos B y C.
\newpage
Puesto que se alojaron 5 animales por cada jaula,
no se pudieron determinar las ingestas individuales, por tanto estos
datos se tabularon sólo con fines descriptivos. La ingesta de
comida fue similar entre todos los Grupos de tratamiento (2,80,
2,98, 2,97 y 3,19 g/ratón/día para los Grupos A, B, C y D,
respectivamente). Los ratones suplementados con L. reuteri
(los Grupos C y D) tuvieron consumos de agua más altos (4,95 y 4,75
ml/ratón/día, respectivamente) que los Grupos A y B (3,83 y 3,98
ml/ratón/día, respectivamente) que recibieron STF.
No se detectaron oocistos de C. parvum en
las heces de los ratones (los Grupos A y C) no expuestos a C.
parvum. Sin embargo, los ratones expuestos a los parásitos
(los Grupos B y D) desarrollaron criptosporidiosis
persistente
(Tabla 2). La infección con C. parvum sin suplemento de L. reuteri (el Grupo B) incrementó (p < 0,05) el despojo de oocistos a los 7 y 14 días después de la infección. Aunque no hubo diferencias (p > 0.05) en el despojo de oocistos entre los Grupos B y D a los 7 días después de la infección, se redujo el despojo (p < 0,05) a los 14 días después de la exposición en los ratones que recibían suplementos con L. reuteri (el Grupo D). Hubo ausencia de la infección con el parásito de Cryptosporidium en el epitelio intestinal (concretamente el íleon distal) de los ratones del Grupo D. Además, no se detectaron parásitos en los vellos intestinales de ratones no infectados (los Grupos A y C). Sin embargo, se detectaron cargas de parásito significativas (p < 0,05) en los intestinos de ratones (el Grupo B) infectados con C. parvum solo. Al contrario de la colonización del íleon distal, no se observaron parásitos de C. parvum en los tejidos del estómago o del colon de ratones expuestos.
(Tabla 2). La infección con C. parvum sin suplemento de L. reuteri (el Grupo B) incrementó (p < 0,05) el despojo de oocistos a los 7 y 14 días después de la infección. Aunque no hubo diferencias (p > 0.05) en el despojo de oocistos entre los Grupos B y D a los 7 días después de la infección, se redujo el despojo (p < 0,05) a los 14 días después de la exposición en los ratones que recibían suplementos con L. reuteri (el Grupo D). Hubo ausencia de la infección con el parásito de Cryptosporidium en el epitelio intestinal (concretamente el íleon distal) de los ratones del Grupo D. Además, no se detectaron parásitos en los vellos intestinales de ratones no infectados (los Grupos A y C). Sin embargo, se detectaron cargas de parásito significativas (p < 0,05) en los intestinos de ratones (el Grupo B) infectados con C. parvum solo. Al contrario de la colonización del íleon distal, no se observaron parásitos de C. parvum en los tejidos del estómago o del colon de ratones expuestos.
| Efectos de alimentación con suplementos de L. reuteri sobre el despojo de oocistos (oocistos x 10^{3} g \pm EEM) en | ||||
| las heces y la colonización del epitelio del íleon distal (oocistos/cm de intestino \pm EEM) de ratones C578BL/6 | ||||
| inmunosuprimidos por previa inoculación con MO-LP5 y expuestos (+/-) a C. parvum | ||||
| Días después de alimentación con L. Reuteri | ||||
| Grupo^{1} | Día 10^{2} | Día 17^{3} | Día 25^{4} | Íleon |
| A | 0,00 \pm 0,00 | 0,00 \pm 0,00^{b} | 0,00 \pm 0,00^{c} | 0,00 \pm 0,00^{b} |
| B | 0,00 \pm 0,00 | 1,58 \pm 0,24^{a} | 9,19 \pm 4,29^{a} | 4,00 \pm 1,13^{a} |
| C | 0,00 \pm 0,00 | 0,00 \pm 0,00^{b} | 0,00 \pm 0,00^{c} | 0,00 \pm 0,00^{b} |
| D | 0,00 \pm 0,00 | 1,34 \pm 0,33^{a} | 0,46 \pm 0,13^{b} | 0,00 \pm 0,00^{b} |
| ^{1} Diez ratones por grupo (5 ratones por jaula). | ||||
| ^{2} Corresponde a una muestra basal tomada justo antes de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{3} Corresponde al día 7 después de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{4} Corresponde al día 14 después de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{a, b, c} Valores dentro de la misma columna con diferentes letras de superíndice son diferentes (p < 0,05). |
Los niveles fecales de Lactobacillus spp.
totales fueron similares entre todos los tratamientos durante todo
el estudio (Tabla 3). Sólo se encontraron niveles estadísticamente
diferentes el día 17 (Grupo B > Grupo A). El nivel de L.
reuteri en las heces fue similar (> 0,05) entre todos los
tratamientos el día 0 (línea de base). El día 4, los grupos de
tratamiento C y D tenían niveles de L. reuteri más altos (p
< 0,05) y tendían a tener niveles más altos el día 7. Sin
embargo, en los días 10, 17 y 25, todos los grupos de tratamiento,
con la excepción del Grupo B consistentemente despojaron niveles
más altos de L. reuteri en las heces. El porcentaje de
ratones colonizados por L. reuteri se muestra en la Figura 1,
que muestra el efecto de L. reuteri o STF en el porcentaje
de ratones colonizados por L. reuteri (la colonización se
define como más de 5,0 x 10^{3} UFC de L. reuteri/g heces
húmedas). En general, los grupos de tratamiento alimentado con
suplemento de L. reuteri tenían un porcentaje más alto de
animales que fueron colonizados por el organismo en comparación con
los grupos sin tratar. Además, los días 10, 17 y 25, los ratones
en el Grupo D tenían un porcentaje más alto (p < 0,05) de
colonización que los ratones en el Grupo B.
| Efectos de alimentación con suplementos de L. reuteri sobre el nivel fecal de Lactobacillus spp. totales y | ||||||
| L. reuteri (log_{10} UFC/g \pmEEM) de ratones C57BL/6 inmunosuprimidos por previa inoculación con | ||||||
| MO-LP5 y expuestos (+/-) a C. parvum | ||||||
| Lactobacilos totales - días después de alimentación con L. reuteri | ||||||
| Grupo^{1} | Día 1 | Día 4 | Día 7 | Día 10 | Día 17 | Día |
| A | 8,90 \pm 0,11 | 9,11 \pm 0,12 | 9,07 \pm 0,12 | 9,25 \pm 0,06 | 8,49 \pm 0,17^{b} | 9,15\pm |
| B | 8,83 \pm 0,11 | 8,82 \pm 0,06 | *9,04 \pm 0,07 | *9,00 \pm 0,08 | 9,18 \pm 0,10^{a} | **9,07 |
| C | 8,71 \pm 0,11 | 9,77 \pm 0,12 | 9,33 \pm 0,08 | 9,22 \pm 0,15 | **9,01 \pm 0,10^{a, b} | **9,07 |
| D | 8,60 \pm 0,08 | 9,70 \pm 0,11 | 9,35 \pm 0,15 | 9,12 \pm 0,20 | 8,93 \pm 0,18^{a, b} | 8,98 \pm |
| L. reuteri | ||||||
| A | 4,85 \pm 0,48 | 4,67 \pm 0,51^{b} | 5,29 \pm 0,60^{a,b} | 6,12 \pm 0,68 | 6,88 \pm 0,24 | 7,15\pm |
| B | 4,25 \pm 0,28 | 4,65 \pm 0,39^{a} | *5,17 \pm 0,47^{b} | *5,29 \pm 0,65 | 5,76 \pm 0,69 | **5,01 |
| C | 4,33 \pm 0,28 | 6,79 \pm 0,60^{a} | 6,75 \pm 0,39^{a, b} | 6,20 \pm 0,19 | **6,66 \pm 0,51 | **7,64 |
| D | 5,13 \pm 0,39 | 7,48 \pm 0,45^{a} | 6,88 \pm 0,49^{a} | 7,97 \pm 0,23 | 7,26 \pm 0,16 | 8,16 \pm |
| ^{1} Diez ratones por grupo (5 ratones por jaula), a menos que se indique de otro modo: *=9; **=8. | ||||||
| ^{a, b} Valores dentro de la misma columna con diferentes letras de superíndice son diferentes (p < 0,05). |
La infección de ratones con
MO-LP5 indujo el síndrome de SIDA murino sin ninguna
fase latente. Este síndrome tenía muchas similitudes con el SIDA
humano. Los síntomas incluían la esplenomegalia progresiva, la
linfadenopatia y una susceptibilidad aumentada a la infección por
C. parvum. Al contrario del SIDA humano, que se asocia con
la pérdida de peso y a veces con una diarrea que amenaza la vida del
paciente, el SIDA murino no se asoció con una pérdida de peso
significativa ni con la diarrea.
El tratamiento de ratones con L. reuteri
incrementó (p < 0,05) la población intestinal de L.
reuteri (Grupos C y D) en comparación con los ratones que no
recibieron un suplemento de L. reuteri (los Grupos A y B) el
día 4 después de alimentación con L. reuteri. Existía una
relación inversa entre la población de L. reuteri y el
aclaramiento de parásitos con C. parvum del tracto intestinal
en los grupos de tratamiento B y D. Por tanto, los ratones
infectados con C. parvum y alimentados concomitantemente con
L. reuteri (Grupo D) aclararon (p < 0,05) cargas de
parásito (Tabla 2) en comparación con los que fueron infectados por
C. parvum solo (Grupo B). A los 14 días después de la
exposición a Cryptosporidium, no se detectaron parásitos en
el epitelio del tracto intestinal de estos ratones (el Grupo D). Al
contrario, los ratones control expuestos a Cryptosporidium
no pudieron aclarar la infección 14 días después de la exposición.
Esto demuestra un papel profiláctico, hasta ahora no reconocido, de
L. reuteri en la inhibición del crecimiento de C.
parvum en la mucosa intestinal. Se desconocen los mecanismos
por los cuales L. reuteri inhibe la proliferación de C.
parvum. Se especula que L. reuteri puede inhibir la
proliferación de otras bacterias y otros parásitos en la microbiota
del intestino a través de competición para los sitios de unión o a
través de la secreción de productos que inhiben otros organismos.
Este estudio proporciona evidencia de que L. reuteri es
beneficioso para la inhibición de infecciones oportunísticas tales
como C. parvum, especialmente en individuos
inmunocomprometidos.
Experimento 2 (Exp.
2)
Se llevó a cabo un segundo experimento para
determinar si el pretratamiento con L. reuteri o L.
acidophilus podría prevenir o inhibir la infección por C.
parvum en ratones infectados con SIDAM.
Se consiguieron y cuidaron ratones de la misma
manera que en el Exp. 1, salvo que a los ratones se le hizo una
muesca en la oreja para identificar a cada animal.
Lo mismo que el Exp. 1.
Lo mismo que el Exp. 1
Se preparó L. reuteri tal como se explicó
en el Exp. 1. Un aislado humano de L. acidophilus (cepa
NCFM) se consiguió de BioGala Biologics, Inc. Se preparó L.
acidophilus con una concentración final de 5 x 10^{8} UFC/mL.
Los ingredientes probióticos se almacenaron congelados en agua de
peptona al 0,1% hasta su uso.
En este experimento, 60 ratones hembras C57BL/6
(15 por cada grupo) se asignaron aleatoriamente a uno de cuatro
tratamientos (E, F, G y H; Tabla 4). De nuevo, el estudio se
dividió en una fase de apresto y otra fase experimental.
| Descripción de los grupos de tratamiento para el Exp. 2 | ||||
| Tratamiento | ||||
| Grupo^{1} | MO-LP5^{2} | L. reuteri^{3} | L. acidophilus^{4} | C. parvum^{5} |
| A | + | - | - | - |
| B | + | - | - | + |
| C | + | + | - | + |
| D | + | - | + | + |
| ^{1} Quince ratones por grupo (5 ratones por jaula). | ||||
| ^{2} Inmunosuprimidos durante 4 meses por inoculación con MO-LP5. | ||||
| ^{3}L. reuteri alimentado a la fuerza diariamente (1,0 x 10^{8} UFC por ratón) durante la fase de apresto y la fase | ||||
| experimental. | ||||
| ^{4}L. acidophilus alimentado a la fuerza diariamente (1,0 x 10^{8} UFC por ratón) durante la fase de apresto y la fase | ||||
| experimental. | ||||
| ^{4} Infectados con C. parvum (8,5 x 10^{8} oocistos por ratón) 14 días después de suplementación probiótica. |
Durante la fase de apresto (una duración de 13
días), 30 ratones (Grupos E y F) fueron alimentados a la fuerza con
agua de peptona al 0,1% (0,2 ml), 15 ratones (Grupo G) fueron
alimentados a la fuerza con L. reuteri (1 x 10^{6} UFC en
0,2 ml) y 15 ratones (el Grupo H) fueron alimentados a la fuerza
diariamente por vía oral con L. acidophilus
(1 x 10^{6} UFC en 0,2 ml). Se seguía alimentando a los ratones a la fuerza diariamente por vía oral con sus tratamientos respectivos durante el experimento. Durante la fase de apresto, se tomaron muestras fecales el día 1 (basal) y el día 8 para el recuento de Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. Se intentó determinar los niveles fecales de L. acidophilus con algunas muestras del Grupo H; sin embargo, el método era demasiado engorroso y variable, así que no se completó el análisis de L acidophilus}. El día 13, las muestras fecales se recogieron de todos los ratones para la detección del despojo de C. parvum y el recuento de los Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. La fase experimental se inició el día 14 durante el cual los animales (Grupos F, G y H) se expusieron a C. parvum (1,4 x 10^{5} oocistos). Se recogieron muestras fecales los días 21 y 28 (7 y 14 días después de la exposición) para el recuento de C. parvum, Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. El día 28, los ratones fueron sacrificados por inhalación de éter. Después, se extrajeron 1 a 2 cm de estómago proximal, íleon distal y colon de cada ratón para la detección de C. parvum en el epitelio del intestino. Se registraron la documentación de ingesta diaria de comida y agua, y la diarrea. Además, se registraron los pesos corporales iniciales y finales.
(1 x 10^{6} UFC en 0,2 ml). Se seguía alimentando a los ratones a la fuerza diariamente por vía oral con sus tratamientos respectivos durante el experimento. Durante la fase de apresto, se tomaron muestras fecales el día 1 (basal) y el día 8 para el recuento de Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. Se intentó determinar los niveles fecales de L. acidophilus con algunas muestras del Grupo H; sin embargo, el método era demasiado engorroso y variable, así que no se completó el análisis de L acidophilus}. El día 13, las muestras fecales se recogieron de todos los ratones para la detección del despojo de C. parvum y el recuento de los Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. La fase experimental se inició el día 14 durante el cual los animales (Grupos F, G y H) se expusieron a C. parvum (1,4 x 10^{5} oocistos). Se recogieron muestras fecales los días 21 y 28 (7 y 14 días después de la exposición) para el recuento de C. parvum, Lactobacillus spp. totales y L. reuteri. El día 28, los ratones fueron sacrificados por inhalación de éter. Después, se extrajeron 1 a 2 cm de estómago proximal, íleon distal y colon de cada ratón para la detección de C. parvum en el epitelio del intestino. Se registraron la documentación de ingesta diaria de comida y agua, y la diarrea. Además, se registraron los pesos corporales iniciales y finales.
Lo mismo que el Exp. 1. Debido a variaciones en
los límites de detección del Exp. 2, se definió la colonización
como más de 2,7 x 10^{4} UFC de L. reuteri}/g de heces
húmedas.
\newpage
Lo mismo que el Exp. 1, salvo que las
puntuaciones de infectividad para las secciones histológicas del
íleon distal se determinaron como número de oocistos por 25 vellos
intestinales.
Lo mismo que el Exp. 1. No se trató a los
animales de forma individual, sino en jaulas de 5 animales cada
una, por tanto, las jaulas se colocaron dentro de un grupo de
tratamiento. Este resulta en un modelo de análisis de varianza
colocado con un efecto principal de tratamiento (E, F, G y H) y un
efecto anidado (jaula dentro de tratamiento). Los métodos
estadísticos fueron similares a los descritos para el Exp. 1. De
nuevo, se consideró que los resultados fueron estadísticamente
significativos si el nivel de significancia era menor que 5 por
ciento.
Los pesos corporales iniciales (21,80, 22,82,
22,03 y 22,48 g/ratón para los Grupos E, F, G y H, respectivamente)
y finales (22,18, 23,01, 22,28 y 23,07 g/ratón para los Grupos E, F,
G y H, respectivamente) fueron similares (p < 0,05) entre todos
los tratamientos. En general, los ratones mostraron un ligero
aumento en el peso corporal durante la duración del estudio.
El consumo de comida (3,33, 3,40, 3,33 y 3,40
g/ratón/día para los Grupos E, F, G y H, respectivamente) y de agua
(3,92, 3,97, 3,98 y 3,96 ml/ratón/día para los Grupos E, F, G y H,
respectivamente) fueron similares entre los tratamientos.
No se detectaron oocistos de C. parvum en
las heces de los ratones (grupo E) no expuestos a C. parvum.
Como en el Exp. 1, los animales expuestos desarrollaron
criptosporidiosis persistente (Tabla 5). El día 7 después de la
exposición, los ratones que fueron suplementados con L.
reuteri o L. acidophilus (Grupos G y H, respectivamente)
despojaron menos (p < 0,05) oocistos de C. parvum
comparados con los controles sin exposición (el Grupo F). El día 14
después de la exposición, sólo ratones suplementados con L.
acidophilus (Grupo H) tuvieron niveles fecales de oocistos de
C. parvum más bajos (p < 0,05) comparados con controles
expuestos (Grupo F); sin embargo, este nivel no fue diferente (p
> 0,05) de animales suplementados con L. reuteri (Grupo
G). A diferencia del Exp. 1, la infección intestinal de los vellos
ileales se observó en los ratones expuestos que habían recibido el
suplemento probiótico. Se detectaron menos oocistos en los vellos
de animales suplementados con L. acidophilus (Grupo H) sin
diferencias detectadas (p > 0,05) con respeto a animales no
expuestos a C. parvum de control. Sin embargo, no hubo
diferencias (p > 0,05) con respecto a los otros grupos expuestos
(Grupos F y G). Como en el Exp. 1, no se observó ninguna
colonización de oocistos en el estómago proximal o colon de
ratones.
| Efectos de alimentación con suplementos de L. reuteri o L. acidophilus sobre el despojo de oocistos | ||||
| (log_{10} oocistos /g \pm EEM) en las heces y la colonización del epitelio del íleon distal (oocistos/25 | ||||
| vellos intestinales \pm EEM) de ratones C578BL/6 inmunosuprimidos por previa inoculación con | ||||
| MO-LP5 y expuestos (+/-) a C. parvum | ||||
| Días después de alimentación probiótica | Íleon | |||
| Grupo^{1} | Día 13^{2} | Día 21^{3} | Día 28^{4} | Día 28^{4} |
| E | 0,00 \pm 0,00 | **0,00 \pm 0,00^{c} | **0,00 \pm 0,00^{c} | **0,00 \pm 0,00^{b} |
| F | 0,00 \pm 0,00 | 4,32 \pm 0,17^{a} | 3,88 \pm 0,32^{a} | 2,33 \pm 0,81^{a} |
| G | 0,00 \pm 0,00 | 2,96 \pm 0,43^{b} | 3,50 \pm 0,29^{a, b} | 2,13 \pm 0,58^{a} |
| H | 0,00 \pm 0,00 | 2,35 \pm 0,62^{b} | *1,95 \pm 0,13^{b} | *1,79 \pm 0,71^{a,b} |
| ^{1} Quince ratones por grupo (5 ratones por jaula), a menos que se indique otra cosa: *=14, **=13. | ||||
| ^{2} Corresponde a una muestra basal tomada justo antes de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{3} Corresponde al día 7 después de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{4} Corresponde al día 14 después de la exposición a C. parvum | ||||
| ^{a, b, c} Valores dentro de la misma columna con diferentes letras de superíndice son diferentes (p < 0,05). |
Los niveles fecales de Lactobacillus spp.
totales fueron similares entre todos los tratamientos a lo largo
de todo el ensayo (Tabla 6). Diferencias estadísticas se
encontraron sólo para los días 13 y 28. Los niveles fecales de
L. reuteri fueron similares entre tratamientos en la línea de
base, el día 8 y el día 13; sin embargo, los niveles fueron
aproximadamente dos órdenes de magnitud más altos en el Exp. 2 que
los niveles basales del Exp. 1. Generalmente, los niveles de L.
reuteri fueron altos en todos los tratamientos con diferencias
estadísticas observadas para los días 21 y 28 (véase la Tabla
6).
| Efectos de alimentación con suplementos de L. reuteri o L. acidophilus sobre el nivel fecal de | |||||
| Lactobacillus spp. totales y L. reuteri (log_{10} UFC/g \pmEEM) de ratones C57BL/6 inmunosuprimidos | |||||
| por previa inoculación con MO-LP5 y expuestos (+/-) a C. parvum | |||||
| Lactobacillus spp. totales - días después de alimentación probiótica | |||||
| Grupo^{1} | Día 1 | Día 8 | Día 13 | Día 21 | Día 28 |
| E | 8,48 \pm 0,18 | 8,54 \pm 0,10 | 9,89 \pm 0,15^{a} | **9,58 \pm 0,11 | **9,91 \pm 0,12^{b} |
| F | 8,43 \pm 0,12 | 8,35 \pm 0,15 | 8,80 \pm 0,15^{b} | 10,14 \pm 0,11 | 10,66 \pm 0,05^{a} |
| G | 8,48 \pm 0,21 | 9,32 \pm 0,10 | 8,50 \pm 0,11^{b} | 10,17 \pm 0,12 | 10,72 \pm 0,22^{a} |
| H | 8,94 \pm 0,13 | 9,22 \pm 0,09 | 9,71 \pm 0,11^{a} | **10,15 \pm 0,20 | *10,94 \pm 0,08^{a} |
| L. reuteri | |||||
| E | 5,90 \pm 0,44 | 6,58 \pm 0,39 | 6,45 \pm 0,58 | **4,90 \pm 0,56^{b} | **8,09 \pm 0,17^{b} |
| F | 6,44 \pm 0,20 | 6,04 \pm 0,47 | 4,72 \pm 0,50 | 7,70 \pm 0,32^{a, b} | 8,52 \pm 0,13^{b} |
| G | 6,30 \pm 0,36 | 7,76 \pm 0,19 | 6,15 \pm 0,39 | 7,79 \pm 0,57^{a} | 9,72 \pm 0,11^{a} |
| H | 6,23 \pm 0,43 | 8,58 \pm 0,45 | 6,97 \pm 0,49 | **8,33 \pm 0,18^{a} | *8,42 \pm 0,57^{a,b} |
| ^{1} Quince ratones por grupo (5 ratones por jaula), a menos que se indique otra cosa: *=14, **=13. | |||||
| ^{a, b} Valores dentro de la misma columna con diferentes letras de superíndice son diferentes (p < 0,05) |
Los animales en este ensayo fueron colonizados de
modo natural con L. reuteri; sin embargo, los niveles
basales de L. reuteri fueron mucho más altos que los
descritos en el Exp. 1. Debido a este hecho, no se puede
correlacionar el nivel fecal más alto de L. reuteri con el
despojo más bajo de oocistos de C. parvum (día 7). No
obstante, los animales suplementados con L. reuteri
despojaron menos oocistos (p < 0,05) el día 7 después de la
exposición a C. parvum que los animales control expuestos
(Tabla 3).
Desgraciadamente, el análisis fecal para L.
acidophilus fue demasiado difícil, por tanto, no se completó el
análisis. Los ratones suplementados con L. acidophilus
despojaron menos oocistos (p < 0,05) a los 7 y 14 días después de
la exposición a C. parvum en comparación con los controles
expuestos; sin embargo, esta reducción no fue diferente para los
animales suplementados con L. reuteri. Este experimento
sugiere que L. acidophilus tiene un efecto beneficioso para
la prevención de criptosporidiosis parecido al de L.
reuteri.
En conjunto, la suplementación profiláctica con
probióticos (específicamente L. reuteri y L.
acidophilus) reduce la infectividad de C. parvum de un
mamífero en este modelo murino del SIDA, tal como se evidencia a
través de una reducción en el despojo de oocistos de C.
parvum en las heces. Saber si L. reuteri y L.
acidophilus poseen un efecto sinérgico exige más estudios.
Estos experimentos han demostrado un beneficio de probióticos
(específicamente L. reuteri y L. acidophilus) para la
prevención de criptosporidiosis en una población inmunosuprimida.
El nivel de L. reuteri dado a comer a ratones en nuestros
experimentos fue 1 x 10^{8} UFC por ratón y por día. Sobre una
base de peso corporal, esto correspondería a aproximadamente 3 x
10^{11} UFC por día para una persona de 70 kilogramos. La
presente invención se puede poner en práctica alimentando al menos,
pero, no limitado a 1 x 10^{8} UFC por día por sujeto. La
evaluación clínica del uso de L. reuteri para inhibir C.
parvum en pacientes de SIDA se anticipa en el futuro
próximo.
La presente invención, tal como se respalda con
los experimentos descritos anteriormente y la discusión de los
mismos, es un medicamento para la inhibición de la infección de un
mamífero por Cryptosporidium parvum que se fabrica utilizando
Lactobacillus reuteri administrado por vía enteral en una
cantidad que es terapéuticamente eficaz para inhibir dicha
infección. Es decir, la presente invención es un medicamento para
la inhibición de la infección del intestino de un mamífero por los
oocistos de Cryptosporidium parvum utilizando
Lactobacillus reuteri administrado por vía enteral en una
cantidad que es terapéuticamente eficaz para inhibir dicha
infección. Además, la presente invención es un medicamento para
aumentar la resistencia a la infección por Cryptosporidium
parvum en un mamífero inmunocomprometido utilizando
Lactobacillus reuteri administrado por vía enteral en una
cantidad que es terapéuticamente eficaz para inhibir dicha
infección. La inhibición de la infección de un mamífero por
Cryptosporidium parvum se puede evidenciar a través de una
reducción en el despojo de oocistos de Cryptosporidium parvum
en las heces del mamífero en tratamiento. La resistencia a la
infección con Cryptosporidium parvum en un mamífero
inmunocomprometido también se puede evidenciar a través de una
reducción en el despojo de oocistos de Cryptosporidium parvum
en las heces del mamífero en tratamiento.
Aunque no es fácilmente evaluable en los estudios
murinos descritos anteriormente, el medicamento administrado por vía
enteral, que consiste en Lactobacillus reuteri, también tiene
el efecto de reducir o aliviar la diarrea (tal como se mide a través
de una reducción en la incidencia de heces acuosas); sobre todo en
casos donde la causa de dicha diarrea es la presencia de
Cryptosporidium parvum y/u oocistos de Cryptosporidium
parvum en el intestino.
Se puede administrar Lactobacillus reuteri
por vía enteral a través de cualquier medio apropiado, que incluye
pero que no se limita a:
- (a)
- la adición de Lactobacillus reuteri a un líquido a través de una bomba osmótica y después administración por vía enteral del líquido resultante;
- (b)
- la administración por vía enteral a través de la administración de una cápsula por vía enteral que contiene Lactobacillus reuteri;
- (c)
- el consumo de un yogurt que contiene Lactobacillus reuteri} a una concentración de al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g;
- (d)
- el consumo de un producto lácteo que contiene Lactobacillus reuteri a una concentración de al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/ml;
- (e)
- el consumo de un condimento que contiene 1,0 x 10^{8} a 1,0 x 10^{12} UFC de Lactobacillus reuteri/g, por ejemplo, al combinar el condimento con una comida y luego consumir la comida;
- (f)
- el consumo de una unidad de dosificación que comprende Lactobacillus reuteri y al menos un excipiente, por ejemplo, al combinar la unidad de dosificación con un alimento y luego el consumir el alimento, siendo la unidad de dosificación por ejemplo, un comprimido, una cápsula, un polvo o un líquido que contiene Lactobacillus reuteri;
- (g)
- el consumo de un producto alimenticio que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g;
- (h)
- el consumo de una suspensión que contiene Lactobacillus reuteri;
- (i)
- la administración por vía enteral de un comprimido que contiene Lactobacillus reuteri; y
- (j)
- la ingesta de una bomba osmótica que suministrará Lactobacillus reuteri al tracto intestinal.
Un producto que se puede administrar por vía
enteral que se puede utilizar en la práctica de la presente
invención es un producto que se puede administrar por vía enteral
que contiene Lactobacillus reuteri en una cantidad que es
terapéuticamente eficaz para inhibir la infección por
Cryptosporidium parvum de un mamífero que lo haya recibido.
Ejemplos de tales productos incluyen, pero no se limitan a:
- (a)
- una cápsula que contiene Lactobacillus reuteri;
- (b)
- un yogurt que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g;
- (c)
- un producto lácteo que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/ml;
- (d)
- un condimento que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g;
- (e)
- un comprimido que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g;
- (f)
- una suspensión que contiene al menos 1,0 x 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/ml;
- (g)
- un condimento que contiene Lactobacillus reuteri, siendo dicho condimento apropiado para su combinación con un alimento;
- (h)
- una dosificación que contiene Lactobacillus reuteri con al menos un excipiente;
- (i)
- una bomba osmótica que se puede usar para añadir Lactobacillus reuteri a un líquido;
- (j)
- una bomba osmótica que se puede consumir por vía enteral y que suministra Lactobacillus reuteri directamente al tracto gastrointestinal; y
- (k)
- un producto alimenticio que contiene Lactobacillus reuteri.
Claims (19)
1. Uso de Lactobacillus reuteri como un
organismo sencillo en una cantidad que es terapéuticamente eficaz
para inhibir una infección en un mamífero con Cryptosporidium
parvum para la producción de un fármaco enteral para la
inhibición de dicha infección.
2. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 1 para la producción de un fármaco enteral para
inhibir una infección en un mamífero por Cryptosporidium
parvum, en que se utiliza Lactobacillus reuteri en una
cantidad que es terapéuticamente eficaz para inhibir dicha infección
tal como se evidencia a través de una reducción en el despojo de
oocistos de Cryptosporidium parvum en las heces.
3. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 1 para la producción de un fármaco enteral para
inhibir una infección del intestino de un mamífero por los oocistos
de Cryptosporidium parvum, en que se utiliza Lactobacillus
reuteri en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para
inhibir dicha infección.
4. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 3 para la producción de un fármaco enteral para
inhibir la infección del intestino de un mamífero por
Cryptosporidium parvum, en que se utiliza Lactobacillus
reuteri en una cantidad que es terapéuticamente eficaz para
inhibir dicha infección tal como se evidencia a través de una
reducción en el despojo de oocistos de Cryptosporidium parvum
en las heces.
5. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 1 para la producción de un fármaco enteral para
aumentar la resistencia a la infección por Cryptosporidium
parvum en un mamífero inmunocomprometido, en que se utiliza
Lactobacillus reuteri en una cantidad que es terapéuticamente
eficaz para inhibir dicha infección.
6. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 5 para la producción de un fármaco enteral para
aumentar la resistencia a la infección por Cryptosporidium
parvum en un mamífero inmunocomprometido, en que se utiliza
Lactobacillus reuteri en una cantidad que es terapéuticamente
eficaz para inhibir dicha infección tal como se evidencia a través
de una reducción en el despojo de oocistos de Cryptosporidium
parvum en las heces.
7. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de un líquido enteral farmacéutico al cual se ha añadido
Lactobacillus reuteri a través de una bomba osmótica.
8. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de una cápsula enteral farmacéutica que contiene
Lactobacillus reuteri.
9. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de un yogurt enteral que contiene Lactobacillus
reuteri a una concentración de al menos 1,0*10^{8} UFC de
Lactobacillus reuteri/ml.
10. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de un producto lácteo enteral que contiene
Lactobacillus reuteri a una concentración de al menos
1,0*10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/ml.
11. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de un condimento enteral que contiene Lactobacillus
reuteri a una concentración de al menos 1,0*10^{8} UFC de
Lactobacillus reuteri/g.
12. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 11, en que el condimento se combina con un alimento
antes del consumo del mismo.
13. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para la
producción de una unidad de dosificación enteral que contiene
Lactobacillus reuteri y al menos un excipiente.
14. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 13, en que la unidad de dosificación se combina con
la comida.
15. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6 en que el
producto farmacéutico es un producto alimenticio que contiene al
menos 10^{8} UFC de Lactobacillus reuteri/g.
16. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en que el
producto farmacéutico enteral es una suspensión que contiene
Lactobacillus reuteri.
17. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en que el
producto farmacéutico enteral es un comprimido que contiene
Lactobacillus reuteri.
18. Uso de Lactobacillus reuteri según
cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en que el
producto farmacéutico enteral es una bomba osmótica ingerible que
puede proporcionar Lactobacillus reuteri al tracto
gastrointestinal.
\newpage
19. Uso de Lactobacillus reuteri según la
reivindicación 1 para la producción de un fármaco para reducir la
incidencia en un mamífero de la diarrea causada por la presencia de
Cryptosporidium parvum en el intestino.
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