JP2008295415A - １細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
【課題】１個の免疫細胞由来のｍＲＮＡの遺伝子解析を将来的な研究開発の目的と位置づけ、特定の免疫関連遺伝子の配列を効率よく解析・同定する技術や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する技術等を提供すること。
【解決手段】がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取し、標識化がん特異的抗原ペプチド及びヒト抗体により、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化して、抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を１細胞ずつ分取し、全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により遺伝子断片を増幅して、増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する。
【選択図】なし
【解決手段】がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取し、標識化がん特異的抗原ペプチド及びヒト抗体により、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化して、抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を１細胞ずつ分取し、全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型としたＰＣＲ反応により遺伝子断片を増幅して、増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する。
【選択図】なし
Description
本発明は、１細胞レベルでの抗体遺伝子の解析・同定方法や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法や、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
人間などの高等脊椎動物の体には、体外から侵入する細菌・ウイルスなどの病原体や、危険物質、がん細胞などの異物から生命を守るために獲得免疫系が存在する。抗体はタンパク質等の相互に類似した物質を特異的に識別できる免疫グロブリンというタンパク質であり、生体内では抗原特異的液性免疫に関与している。抗体は、無数の異物を認識するために、抗体の一部（可変領域）をコードする遺伝子では、ＤＮＡレベルでの再編成が起き、多様な抗体遺伝子配列を持つＢリンパ球の集団が生じている。このＤＮＡ再編成を通じた遺伝子多様化の仕組みは、生物が子孫の遺伝子を多様化しつつ、環境変動に適応して生き残ろうとする性の過程にも見られる。また、それぞれのＢリンパ球細胞１個からは必ず一種類の抗体遺伝子がコードする一種類の免疫グロブリンが産生されることが知られている。
従来、抗体遺伝子を取得する方法等としては、ヒト末梢血リンパ球を分離後、ＣＤ１１ｃ特異的抗体及びマグネチックビーズを用いＣＤ１１ｃ陽性細胞を除去し、体外免疫を行い、抗原特異的ヒト抗体産生応答を誘導し、抗原特異的抗体の産生応答が誘導された末梢血リンパ球細胞を、エプスタインバールウィルスにより不死化し、抗原特異的Ｂ細胞を単離し、この抗原特異的抗体産生Ｂ細胞からＲＮＡを抽出し、抽出されたＲＮＡからｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡを鋳型とし、ＶＨ及びＶＬのそれぞれに特異的なプライマーを用いたＰＣＲにより抗体可変領域遺伝子の増幅を行う抗原特異的抗体遺伝子の取得方法（例えば、特許文献１参照）や、目的の抗体が認識する抗原を標識化してなる標識化抗原を、前記抗体を産生するターゲット細胞を含む細胞集団に接触させ、前記標識化抗原を前記ターゲット細胞に結合させ、得られる標識化ターゲット細胞を分離し、分離した標識化ターゲット細胞を用いて、それが保有する抗体遺伝子を調製し、調製した抗体遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させる抗体作製方法（例えば、特許文献２参照）などが知られている。
近年、がんや自己免疫疾患という病態での免疫細胞の異常クローンが注目されているが、免疫のダイナミックな順応メカニズムを考えれば、個々の細胞の機能的性格が異なることは容易に想像できる。免疫応答の観点からしてもＴ細胞受容体や抗体遺伝子の変異も最初は１個の細胞から始まる現象であり、免疫細胞の機能研究においては、１細胞レベルでの研究はもはや避けては通れない時代である。特に、がんという病態下での個々の免疫細胞の動態については、未だ詳細な検討はなされておらず、新しい治療を考える上で重要な研究課題となりうる。本発明の課題は、１個の免疫細胞由来のｍＲＮＡの遺伝子解析を将来的な研究開発の目的と位置づけ、特定の免疫関連遺伝子の配列を効率よく解析・同定する技術や、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する技術等を提供することにある。
本発明者らは、転移性メラノーマの症例を対象にＨＬＡ−Ａ２又はＡ２４ペプチドカクテルにて処理をした樹状細胞ワクチンの臨床試験を実施している。今回、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性をもつＭＡＧＥ１ペプチドにて処理した樹状細胞ワクチン投与を受けたメラノーマ患者由来の不死化Ｂ細胞を用いて１細胞レベルでのメラノーマペプチド特異的な抗体遺伝子について解析・同定を行った。すなわち、樹状細胞ワクチンの投与を受けたメラノーマ患者において増幅されているＭＡＧＥ１Ａ２４ペプチドに対するＩｇＧ抗体を産生すると考えられるＢ細胞を、ＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１ペプチド及びＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体による染色にて同定する方法を開発した。この方法でＥＢ−ウイルスを用いて不死化したＢ細胞やプライマリーＢ細胞でもペプチド特異的なＢ細胞を検出することができることを見い出し、さらに１個のＢ細胞を分離し、全ＲＮＡを抽出後、特異的な抗体遺伝子をクローニングする実用化技術を確立し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、[１]以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
や、[２]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
に関する。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
や、[２]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
に関する。
また本発明は、[３]がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする上記[１]又は[２]記載の解析・同定方法や、[４]以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
や、[５]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
や[６]がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする上記[４]又は[５]記載の抗体を製造する方法に関する。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
や、[５]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
や[６]がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする上記[４]又は[５]記載の抗体を製造する方法に関する。
さらに本発明は、[７]以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
や、[８]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
や、[９]がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする上記[７]又は[８]記載の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
や、[８]以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
や、[９]がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする上記[７]又は[８]記載の抗体遺伝子を調製する方法に関する。
本発明によると、腫瘍免疫学的観点から見ると従来不可能とされてきた１個のＢ細胞レベルでの機能的な抗体遺伝子を解析・同定することができ、免疫応答のモニタリングが可能となるため、画期的な基盤技術の開発につながる可能性が高い。その上、特異的な免疫エピトープや腫瘍抗原に対する抗体遺伝子を網羅的に解析・同定することが可能となるため、今後のがんのテーラーメイド医療や診断も可能となる。
本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）や、工程（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）や、工程（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではなく、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法としては、以下に示す工程（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）や、工程（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）を順次備えた方法であれば特に制限されるものではない。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程；
上記工程（Ａ）において、がん特異的抗原ペプチドを特異的に認識する抗体産生Ｂ細胞を増やしておくことが特に重要であり、がん特異的抗原ペプチド、好ましくはＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血を用いることにより、がん特異的抗原ペプチドを特異的に認識する抗体産生Ｂ細胞を増やしておくことができる。かかるＨＬＡ−Ａ２４拘束性のがん特異的抗原ペプチドとして、メラノーマ細胞特異的抗原ペプチドＭＡＧＥ１由来のＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１１３５−１４３を挙げることができる。通常がん患者より樹状細胞を製造する場合には、末梢血より成分採血装置にて採取した単球細胞をサイトカインとともに７日間培養し、その後ＭＡＧＥを含むペプチドカクテル（各ペプチドあたり２５μｇ／ｍｌ）とＫＬＨ（２５μｇ／ｍｌ）にて処理を行い、最終的に樹状細胞が得られる。現在進行中の第II相試験では、１〜５×１０７個の樹状細胞を４回投与し、明らかな有害事象がなければ最大１０回まで樹状細胞の投与を行うものである。この結果ペプチドカクテルに含まれる複数のペプチドに対する患者体内の抗体価の上昇が見込まれる。この工程（Ａ）において、目的とする抗体産生Ｂ細胞を、全Ｂ細胞中の１％以上、好ましくは２％、より好ましくは２．５％以上とすることがきわめて重要である。すなわち、この工程（Ａ）を、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られ、目的とする抗体産生Ｂ細胞を、全Ｂ細胞中の１％以上、好ましくは２％、より好ましくは２．５％以上含む末梢血単核球を採取する工程とすることがきわめて重要である。
上記工程（Ｂ）における末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製するには、末梢血単核球とＥＢＶをフィーダー細胞の共存下で培養し、末梢血単核球を不死化すればよく、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体に加えて、標識化したがん特異的抗原ペプチドを用いて、目的とするがん抗原特異的抗体産生ＥＢＶ−Ｂ細胞株の存在を確認することが好ましい。また、この工程（Ｂ）を省略した本発明の態様においても、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体に加えて、標識化したがん特異的抗原ペプチドを用いて、目的とするがん抗原特異的抗体産生プライマリーＢ細胞の存在を確認することが好ましい。前記のように、目的とする抗体産生Ｂ細胞が、全細胞中の１％以上、好ましくは２％、より好ましくは２．５％以上存在しない場合、目的とする１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製することが困難になる可能性がある。
上記工程（Ｃ）における標識物質としては、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリスリン（ＰＥ）テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）などの蛍光物質、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム誘導体などの化学発光物質、ビオチン、マグネットビーズを挙げることができる。標識物質による標識化は常法で行うことができ、例えばMolecular Cloning, Third Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照することができる。また、工程（Ｃ）におけるヒト抗体を認識しうる抗体としては、抗ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体を好適に例示することができる。例えば、工程（Ｃ）において、標識物質により標識されたがん特異的抗原ペプチドとして、ＦＩＴＣ標識がん特異的抗原ペプチドを用い、異なる標識物質により標識されたヒト抗体を認識しうる抗体として、ＰＥ標識抗ヒト抗ヒトＩｇＧ抗体を用いる場合など、がん抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の細胞膜結合型抗体が脱落しない条件で標識化を行うことが好ましい。さらに、この工程（Ｃ）の前に、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、がん特異的抗原ペプチドを用いて、がん抗原特異的抗体産生Ｂ細胞の比率を高めておくこともできる。
なお、これまでの検討でヒト末梢血に含まれるＢ細胞は、全細胞の約１０％、細胞膜上に抗体（ＩｇＧ）を発現するＢ細胞は、その内の約２％と考えられ、細胞膜表面抗体陽性のＢ細胞は、全細胞の０．２％しか存在せず、この中でさらにＭＡＧＥ１ペプチド陽性細胞はさらに少数であり、通常の方法では検出することが困難と考えられる。しかし、本発明では、前記工程（Ａ）において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンにより免疫され、すでに抗体価の増加したがん患者のＢ細胞を用いるため、微少の細胞の検出が可能となる。このように、本発明においては、あらかじめがん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンを投与する工程（Ａ）が、きわめて重要である。
なお、これまでの検討でヒト末梢血に含まれるＢ細胞は、全細胞の約１０％、細胞膜上に抗体（ＩｇＧ）を発現するＢ細胞は、その内の約２％と考えられ、細胞膜表面抗体陽性のＢ細胞は、全細胞の０．２％しか存在せず、この中でさらにＭＡＧＥ１ペプチド陽性細胞はさらに少数であり、通常の方法では検出することが困難と考えられる。しかし、本発明では、前記工程（Ａ）において、がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンにより免疫され、すでに抗体価の増加したがん患者のＢ細胞を用いるため、微少の細胞の検出が可能となる。このように、本発明においては、あらかじめがん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンを投与する工程（Ａ）が、きわめて重要である。
上記工程（Ｄ）において、がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＥＢＶ−Ｂ細胞やプライマリーＢ細胞を、１細胞ずつ分取する。Ｂ細胞を１細胞ずつ分取するには、使用した標識物質の種類に応じて適切な手法が用いられる。例えば、標識物質として蛍光物質を使用した場合には、蛍光を指標としたフローサイトメトリー（シングルセルソーター）によって、１細胞ずつ分取することが好ましい。フローサイトメトリーによれば効率的かつ高精度の細胞分離が可能となる。また、標識物質としてビオチンを採用した場合においてもアビジンとの結合反応を利用して１細胞ずつ分取することができる。マグネットビーズを採用した場合にも同様に、磁石を用いた良好な分離が可能である。さらに、マイクロマニピュレーターやマイクロメッシュフィルターを用いて１細胞ずつ分取することもできる。
上記工程（Ｅ）においては、１細胞ずつ分取した１個のがん抗原特異的抗体産生Ｂ細胞から、全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する。全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニングなどはいずれも常法（例えば、Molecular Cloning: A laboratory Mannual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.,1989.参照）に従って実施することができる。
上記工程（Ｆ）においては、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する。ヒト抗体重鎖領域遺伝子、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては、それぞれの領域遺伝子配列に特異的なプライマー対であれば特に制限されないが、例えば、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号１〜２４に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号２５又は２６に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号２７〜３７に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号３８に示される塩基配列とからなるプライマー対を挙げることができ、また、ヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対としては配列番号３９〜６１に示される塩基配列の１種又は２種以上の配列と、配列番号６２及び６３に示される塩基配列の１種又は２種の配列とからなるプライマー対を挙げることができる。増幅された遺伝子断片の塩基配列が、上記工程（Ｇ）において常法により解析・決定される。抗体のタイプとしては、ＩｇＧの他、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ，ＩｇＭを挙げることができる。
上記工程（Ｆ）で増幅された遺伝子断片を用いて、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製することができる。すなわち、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖遺伝子を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体軽鎖遺伝子を調製することができる。さらに、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。また、ヒト抗体軽鎖κ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ可変部領域遺伝子断片に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応により、ヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片を調製することができる。これら調製されたヒト抗体遺伝子をサブクローニングして増幅させることもできる。なお、ゲノムＤＮＡを鋳型にする場合、エクソンが離れているためいるため効果的な増幅が期待できない。
また、ヒト抗体重鎖可変部領域遺伝子断片（重鎖断片）及びヒト軽鎖可変部領域遺伝子断片（軽鎖断片）をＰＣＲ法により増幅し、これら重鎖断片と軽鎖断片をＰＣＲ法によりそれぞれ重鎖断片−重鎖リンカー配列−制限酵素ＸｂａＩ認識配列を含む重鎖複合断片と、制限酵素ＮｈｅＩ認識配列−軽鎖リンカー配列−軽鎖断片を含む軽鎖複合断片として増幅し、重鎖複合断片を制限酵素ＸｂａＩで、前記軽鎖複合断片を制限酵素ＮｈｅＩで、それぞれ消化した後に、ライゲーションにより連結させ、ライゲーション産物を制限酵素ＸｂａＩと制限酵素ＮｈｅＩで消化した後、重鎖断片−リンカー配列−軽鎖断片からなるヒト一本鎖抗体遺伝子（ＳｃＦｖ）断片としてＰＣＲ法により増幅する本発明者らによる方法（特願２００７−９２９６８）を用いると、ヒトＳｃＦｖ断片を大量かつ効率よく製造することができる。
上記工程（Ｈ）において、工程（Ｆ）において増幅された遺伝子断片である、ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子を、発現ベクターを用いて発現させ、１個のＢ細胞由来の抗体を製造することができる。発現ベクターとしては、抗体遺伝子の発現に適したものであれば特に限定されず、例えば、非分列細胞を含む全ての細胞（血球系以外）での一過性発現に用いられるアデノウイルスベクター（Science, 252, 431-434, 1991）や、分裂細胞での長期発現に用いられるレトロウイルスベクター（Microbiology and Immunology, 158, 1-23, 1992）や、非病原性、非分裂細胞にも導入可能で、長期発現に用いられるアデノ随伴ウイルスベクター（Curr. Top. Microbiol. Immunol., 158, 97-129, 1992）の他、ＳＶ４０ウイルスベクター、ＥＢウイルスベクター、パピローマウイルスベクターを挙げることができる。これらのウイルスベクターには、発現効率を高めるためにプロモータ配列、エンハンサー配列などの制御配列の他、選択マーカー遺伝子を導入しておくこともできる。発現ベクターへの抗体遺伝子の導入は、制限酵素及びＤＮＡリガーゼを用いた周知の方法(例えば、Molecular Cloning, Third Edition, 1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New Yorkを参照できる)により行うことができる。
上記ヒト抗体重鎖遺伝子やヒト抗体軽鎖遺伝子は、通常、それぞれ別の発現ベクターに挿入され、これら２つの組換えベクターで宿主を共形質転換し、同一細胞内で重鎖及び軽鎖を発現させることが好ましい。上記宿主としては、組換えベクターで形質転換されることにより、導入された抗体遺伝子を発現可能な状態に保有できるものであれば特に制限されず、例えば、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＣＨＯ細胞、ＷＩ３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞、ＭＤＣＫ細胞等を挙げることができる。組換えベクターにより宿主を形質転換する方法としては、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法等を例示することができる。このようにして、ハイブリドーマを用いることなく、１個のＢ細胞から、モノクローナル抗体を製造することができる。また、上記ヒトＳｃＦｖ断片が組み込まれたファージミドベクター又はファージベクターにより大腸菌を形質転換し、この形質転換大腸菌を用いてファージディスプレイヒト一本鎖抗体を作製することもできる。
本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法によって、がん患者のがん特異的抗体の遺伝子を解析・同定することにより、患者個人の体内で産生されているがん抗原特異的抗体の種類の全体像に関する情報を得ることができる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法によって、がん抗原特異的抗体を大量に得ることができ、テイラーメイド的な患者個人の診断や治療が可能となる。また、本発明の１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法によって得られる抗体遺伝子は、がん抗原特異的抗体を大量に製造する場合に有利に用いられる他、テイラーメイド的な患者個人の診断にも利用することができる。特に、従来マウスで免疫してハイブリドーマを作製して得られていた部分的なヒトの抗体を、実際にヒトの体内で増幅した形で、１００％ヒトの抗体として獲ることができるという大きな利点がある。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
［末梢血単核球の採取］
メラノーマ細胞特異的抗原ペプチドＭＡＧＥ１を用いたワクチン治療を受けた転移性メラノーマ患者由来の末梢血単核球を以下のようにして採取した。
転移性メラノーマ患者（症例：ＭＥＬ−０１８）に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１１３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４）により処理された樹状細胞ワクチンを投与し、ＭＡＧＥ１−Ａ２４に対する免疫応答を確認した。ＭＡＧＥ１１３５−１４３のアミノ酸配列は配列番号７０に示す。このＭＥＬ−０１８患者由来の末梢血から、末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell; ＰＢＭＣ)を採取し、以下の実験に用いた。
メラノーマ細胞特異的抗原ペプチドＭＡＧＥ１を用いたワクチン治療を受けた転移性メラノーマ患者由来の末梢血単核球を以下のようにして採取した。
転移性メラノーマ患者（症例：ＭＥＬ−０１８）に、ＨＬＡ−Ａ２４拘束性ＭＡＧＥ１１３５−１４３（ＭＡＧＥ１−Ａ２４）により処理された樹状細胞ワクチンを投与し、ＭＡＧＥ１−Ａ２４に対する免疫応答を確認した。ＭＡＧＥ１１３５−１４３のアミノ酸配列は配列番号７０に示す。このＭＥＬ−０１８患者由来の末梢血から、末梢血単核球（peripheral blood mononuclear cell; ＰＢＭＣ)を採取し、以下の実験に用いた。
［不死化Ｂ細胞株の作製］
エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）による不死化Ｂ細胞株（ＥＢＶ−Ｂ細胞株）を以下のようにして作製した。
フィーダーであるヒト繊維芽細胞株（ＭＲＣ−５；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＣＣＬ−１７１）を、２５ｃｍ２フラスコにて９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙまで増殖させ（培地：ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、３０−４０Ｇｙのirradiationを実施した。２４時間後、実施例１で採取したＭＥＬ−０１８症例由来ＰＢＭＣを１〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／４ｍｌとなるように培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ）に懸濁し、上記の培養ＭＲＣ−５に加えた。その後、ＥＢＶ溶液（ＥＢＶ strain Ｂ９５−８, ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＶＲ−１４９２）１ｍｌを２５ｍｌフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の気相条件下で培養した。４８時間後に培地を交換した後、４日ごとに培地交換を行った。３〜４週間後に、Ｂ細胞の増殖を確認し、ＥＢウイルスにより不死化したＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を回収した。株化した細胞を、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにて染色し、ＥＢＶ−Ｂ細胞株の特性を検討した。
エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）による不死化Ｂ細胞株（ＥＢＶ−Ｂ細胞株）を以下のようにして作製した。
フィーダーであるヒト繊維芽細胞株（ＭＲＣ−５；ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＣＣＬ−１７１）を、２５ｃｍ２フラスコにて９０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙまで増殖させ（培地：ＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）、３０−４０Ｇｙのirradiationを実施した。２４時間後、実施例１で採取したＭＥＬ−０１８症例由来ＰＢＭＣを１〜２×１０７ｃｅｌｌｓ／４ｍｌとなるように培地（ＩＭＤＭ＋２０％ＦＢＳ）に懸濁し、上記の培養ＭＲＣ−５に加えた。その後、ＥＢＶ溶液（ＥＢＶ strain Ｂ９５−８, ＡＴＣＣ ｃａｔ．ＶＲ−１４９２）１ｍｌを２５ｍｌフラスコに添加し、３７℃、５％ＣＯ２の気相条件下で培養した。４８時間後に培地を交換した後、４日ごとに培地交換を行った。３〜４週間後に、Ｂ細胞の増殖を確認し、ＥＢウイルスにより不死化したＢ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）を回収した。株化した細胞を、Ｂリンパ球マーカーである抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにて染色し、ＥＢＶ−Ｂ細胞株の特性を検討した。
［ＥＢＶ−Ｂ細胞株の特性］
ＥＢＶ−Ｂ細胞を抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにより染色した。結果を図７に示す。抗ＣＤ１９抗体よる染色の結果、ＥＢＶ−Ｂ細胞株は、ほとんどすべての細胞がＣＤ１９＋（９８．４％）であった。また、ＥＢＶ−Ｂ細胞株の抗原特異性を検討する目的で、ＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４により細胞を染色した。ネガティブコントロールとしてＡ２４拘束性ＨＩＶペプチド（ＨＩＶ−Ａ２４）を、ポジティブコントロールとしてＡ２４拘束性ＣＭＶペプチド（ＣＭＶ−Ａ２４）を合成・精製し、染色に用いた。ＣＤ１９＋細胞のうち、ヒトＩｇＧ、ＭＡＧＥ１−Ａ２４陽性細胞は、それぞれ約２０％、６％（ペプチド濃度１０μｇ／ｍｌでの染色結果）であり、ヒトＩｇＧ＋／ＭＡＧＥ１−Ａ２４ともに陽性細胞は、約２．５％であった（図７）。このＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１＋／ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ＋ のＥＢＶ−Ｂ細胞は、シングルセルソーティングにより１細胞として選別・分離することができる。
ＥＢＶ−Ｂ細胞を抗ＣＤ１９抗体、抗ヒトＩｇＧ抗体、及びＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチドにより染色した。結果を図７に示す。抗ＣＤ１９抗体よる染色の結果、ＥＢＶ−Ｂ細胞株は、ほとんどすべての細胞がＣＤ１９＋（９８．４％）であった。また、ＥＢＶ−Ｂ細胞株の抗原特異性を検討する目的で、ＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１−Ａ２４により細胞を染色した。ネガティブコントロールとしてＡ２４拘束性ＨＩＶペプチド（ＨＩＶ−Ａ２４）を、ポジティブコントロールとしてＡ２４拘束性ＣＭＶペプチド（ＣＭＶ−Ａ２４）を合成・精製し、染色に用いた。ＣＤ１９＋細胞のうち、ヒトＩｇＧ、ＭＡＧＥ１−Ａ２４陽性細胞は、それぞれ約２０％、６％（ペプチド濃度１０μｇ／ｍｌでの染色結果）であり、ヒトＩｇＧ＋／ＭＡＧＥ１−Ａ２４ともに陽性細胞は、約２．５％であった（図７）。このＦＩＴＣ標識ＭＡＧＥ１＋／ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ＋ のＥＢＶ−Ｂ細胞は、シングルセルソーティングにより１細胞として選別・分離することができる。
以上の結果から、ＥＢＶ−Ｂ細胞は、ほとんどすべてがＣＤ１９陽性であったため、ＦＩＴＣ標識Ａ２４ペプチドとＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体にてＥＢＶ−Ｂ細胞を染色し、フローサイトメトリー法にてＦＩＴＣ標識Ａ２４＋／ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ＋の細胞群を同定した。
［ＥＢＶ−Ｂ細胞のシングルセルソーティング］
シングルセルソーティング用モジュールを装着した、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａTMセルソーター（BD Science社製）により、ＭＡＧＥ１−Ａ２４＋／ヒトＩｇＧ＋のＥＢＶ−Ｂ細胞のシングルセルソーティングを行った。ソーティングの結果を図８に示す。ソーティングは、１００μｍのノズルを用い、sort setup: low , flow rate 5000 events/sec, Drop delay 25.73で行い、９６ウェルプレート（MicroAmp(R) Optical 96-ウェル Reaction Plate；Applied Biosystem社製）に一細胞ずつ分取した。
シングルセルソーティング用モジュールを装着した、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａTMセルソーター（BD Science社製）により、ＭＡＧＥ１−Ａ２４＋／ヒトＩｇＧ＋のＥＢＶ−Ｂ細胞のシングルセルソーティングを行った。ソーティングの結果を図８に示す。ソーティングは、１００μｍのノズルを用い、sort setup: low , flow rate 5000 events/sec, Drop delay 25.73で行い、９６ウェルプレート（MicroAmp(R) Optical 96-ウェル Reaction Plate；Applied Biosystem社製）に一細胞ずつ分取した。
［ＥＢＶ−Ｂ細胞からのＲＮＡ抽出及び逆転写反応］
分取された一細胞からのＲＮＡ抽出及び逆転写反応によるｃＤＮＡの合成は、SuperScriptTMIII CellsDirect cDNASynthesis System cell (ｃａｔ．１８０８０−３００, Invitrogen社製)を用いて行った。まず、１０μｌのResuspensinBuffer 及び１μｌのLysis Enhancer solutionを加え、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間処理した。続いて、５μｌのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μｌ）及び１．６μｌの１０ｘＤＮａｓｅＩＢｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングにより混和し、室温で５分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、１．２μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間インキュベートした。その後、プレートを軽く遠心し、氷上で、各ウェルに２μｌの５０ｍＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０及び１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘを加えた。ピペッティングによる混和の後、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間処理し、氷上で２分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、再び氷上で、６μｌの５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）、及び１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴを加え、ピペッティングにより混和した。プレートを軽く遠心し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で５０分間、８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
分取された一細胞からのＲＮＡ抽出及び逆転写反応によるｃＤＮＡの合成は、SuperScriptTMIII CellsDirect cDNASynthesis System cell (ｃａｔ．１８０８０−３００, Invitrogen社製)を用いて行った。まず、１０μｌのResuspensinBuffer 及び１μｌのLysis Enhancer solutionを加え、サーマルサイクラーを用いて７５℃で１０分間処理した。続いて、５μｌのＤＮａｓｅＩ（１Ｕ／μｌ）及び１．６μｌの１０ｘＤＮａｓｅＩＢｕｆｆｅｒを加え、ピペッティングにより混和し、室温で５分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、１．２μｌの２５ｍＭ ＥＤＴＡを加え、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間インキュベートした。その後、プレートを軽く遠心し、氷上で、各ウェルに２μｌの５０ｍＭ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２０及び１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘを加えた。ピペッティングによる混和の後、サーマルサイクラーを用いて７０℃で５分間処理し、氷上で２分間インキュベートした。プレートを軽く遠心し、再び氷上で、６μｌの５ｘＲＴ Ｂｕｆｆｅｒ、１μｌのＲＮａｓｅＯＵＴＴＭ（４０Ｕ／μｌ）、１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭIII ＲＴ（２００Ｕ／μｌ）、及び１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴを加え、ピペッティングにより混和した。プレートを軽く遠心し、サーマルサイクラーを用いて５０℃で５０分間、８５℃で５分間インキュベートし、ｃＤＮＡを合成した。
［ヒトＩｇＧ遺伝子特異的なプライマーの設計］
ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子の各領域に特異的なＰＣＲ用プライマーを設計した。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図４及び配列番号１〜２６に、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図５及び配列番号２７〜３８に、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図６及び配列番号３９〜６３にそれぞれ示す。また、各プライマーミックスにより増幅される遺伝子断片の大きさは、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子が１４００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子が７００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子が７００ｂｐである。
ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子、又はヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子の各領域に特異的なＰＣＲ用プライマーを設計した。ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図４及び配列番号１〜２６に、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図５及び配列番号２７〜３８に、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子に特異的なプライマー塩基配列を図６及び配列番号３９〜６３にそれぞれ示す。また、各プライマーミックスにより増幅される遺伝子断片の大きさは、ヒトＩｇＧ重鎖遺伝子が１４００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖κ遺伝子が７００ｂｐ、ヒトＩｇＧ軽鎖λ遺伝子が７００ｂｐである。
［ＰＣＲ反応によるヒトＩｇＧ遺伝子断片の増幅］
実施例５で調製したｃＤＮＡを、１サンプルにつき４本のＰＣＲ用０．２ｍｌチューブ(＃１〜＃４)に１μｌずつ分注し、各チューブに、１μｌの１０ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、１μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、５．９μｌのｄＨ２Ｏ、０．１μｌのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start version；タカラバイオ社製）、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、及び０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）を加え、サーマルサイクラー（GeneAmp(R) PCR System9700；Applied Biosystems社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。チューブ＃１は内部標準であるβ−アクチン遺伝子、チューブ＃２はヒトＩｇＧ重鎖領域遺伝子、チューブ＃３はヒトＩｇＧ軽鎖κ領域遺伝子、チューブ＃４はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子のＰＣＲ反応に用いた。
実施例５で調製したｃＤＮＡを、１サンプルにつき４本のＰＣＲ用０．２ｍｌチューブ(＃１〜＃４)に１μｌずつ分注し、各チューブに、１μｌの１０ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、１μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、５．９μｌのｄＨ２Ｏ、０．１μｌのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start version；タカラバイオ社製）、０．５μｌのフォワードプライマー（１０μＭ）、及び０．５μｌのリバースプライマー（１０μＭ）を加え、サーマルサイクラー（GeneAmp(R) PCR System9700；Applied Biosystems社製）を用いてＰＣＲ反応を行った。チューブ＃１は内部標準であるβ−アクチン遺伝子、チューブ＃２はヒトＩｇＧ重鎖領域遺伝子、チューブ＃３はヒトＩｇＧ軽鎖κ領域遺伝子、チューブ＃４はヒトＩｇＧ軽鎖λ領域遺伝子のＰＣＲ反応に用いた。
各チューブのＰＣＲ反応条件は以下の通りである：
チューブ＃１のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６８℃で２分間の反応を５５サイクル、７２℃で５分間の伸長反応、
チューブ＃２及び＃３のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６８℃で１分間の反応を５５、７２℃で５分間の伸長反応、
チューブ＃４のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６０℃で３０分間の反応を５５サイクル、７２℃で５分間の伸長反応。
チューブ＃１のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６８℃で２分間の反応を５５サイクル、７２℃で５分間の伸長反応、
チューブ＃２及び＃３のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６８℃で１分間の反応を５５、７２℃で５分間の伸長反応、
チューブ＃４のＰＣＲ反応は、９４℃で５分間の熱変性の後、９４℃で１５秒及び６０℃で３０分間の反応を５５サイクル、７２℃で５分間の伸長反応。
［ＰＣＲ産物の抽出・精製］
得られたＰＣＲ反応液を、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチヂウムブロマイド染色によりバンドを確認した。図９に示すように、用いた６細胞のうち５個において、β−アクチン遺伝子の増幅が確認された。また、ヒトＩｇＧ領域遺伝子領域増幅用プライマーセットにより増幅されたＰＣＲ産物のバンドの大きさを確認し、各プライマーセットにつき２サンプルずつのバンドを切り出した。選択されたバンドは図中に星印で示される。ＰＣＲ反応物は、ＤＮＡ抽出用カラム（QIAEXII(R) Gel Extraction Kit；QIAGEN社製)を用いてゲルから抽出・精製した。
得られたＰＣＲ反応液を、１．５％のアガロースゲルを用いて電気泳動し、エチヂウムブロマイド染色によりバンドを確認した。図９に示すように、用いた６細胞のうち５個において、β−アクチン遺伝子の増幅が確認された。また、ヒトＩｇＧ領域遺伝子領域増幅用プライマーセットにより増幅されたＰＣＲ産物のバンドの大きさを確認し、各プライマーセットにつき２サンプルずつのバンドを切り出した。選択されたバンドは図中に星印で示される。ＰＣＲ反応物は、ＤＮＡ抽出用カラム（QIAEXII(R) Gel Extraction Kit；QIAGEN社製)を用いてゲルから抽出・精製した。
まず、メスでＰＣＲ反応チューブ＃２、＃３、及び＃４の増幅バンド部分のゲルを切り出し、１．５ｍｌサンプルチューブに移し、切り出したゲルを秤量した。１ｍｇ＝１μｌと換算し、３倍量のＢｕｆｆｅｒＱＸ１及び１７．２μｌのＱＩＡＥＸIIＳｕｓｐｅｎｓｉｏｎを加えた。Vortexにてよく混和してから、予め５０℃に設定しておいたヒートブロック上に置き、２分ごとにVortexにかけ、合計１０分間処理した。次いで、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。再度、沈殿に５００μｌのＢｕｆｆｅｒＱＸ１を加えた後、vortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。上清を取り除き、予めエタノールを加えておいた５００μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心後、上清を取り除いた。再度、１００００×ｇを沈殿に加えてからvortexにて混和し、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を取り除いた。サンプルチューブをクリーンベンチ内で蓋を開けたまま１５分間置き、沈殿を乾燥させた。沈殿に２０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製)を加えてvortexにて混和し、室温に５分間置いた。室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、上清を別の１．５ｍｌサンプルチューブに回収し、沈殿に再び２０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを加えた。Vortexにて混和した後、室温に５分間置き、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、先に回収した上清に加えた。
計４０μｌの回収液に対して、３００μｌのＢｕｆｆｅｒＥＲＣ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製)を加え、vortexにて混和した。混和溶液が黄色であることを確認し、２ｍｌcollection tube（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製) にセットしたMinElute column（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGE社製)の中に全量をアプライし、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再びcollection tubeに戻し、予めエタノールを加えておい７５０μｌのＢｕｆｆｅｒＰＥを加え、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行った。流出液を廃棄してから、カラムを再度collection tubeに戻し、室温・２２０００×ｇで１分間遠心を行った。カラムの淵についている液滴をマイクロピペットで取り除き、カラムを新しい１．５ｍｌサンプルチューブにセットした。１０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＥＢ（MinEluteTM Reaction Cleanup Kit；QIAGEN社製）を加え、室温で１分間静置した後、室温・１００００×ｇで１分間遠心を行い、精製されたＤＮＡ断片を回収した。
［pCR2.1-TA Plasmid vectorへの挿入］
実施例８で得られたＰＣＲ断片を、pCR2.1-TA Plasmid vectorに挿入することによりプラスミドＤＮＡを作製した。ＤＮＡ断片１μｌのSalt Solution（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1(R)TOPO (R) Vector；Invitrogen社製）及び１μｌのＴＯＰＯ(R)Ｖｅｃｔｏｒ（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1(R)TOPO (R) Vector；Invitrogen社製）を氷上で混和した。室温で５分間反応させた後、再び氷上に戻しTransformationに使用した。
実施例８で得られたＰＣＲ断片を、pCR2.1-TA Plasmid vectorに挿入することによりプラスミドＤＮＡを作製した。ＤＮＡ断片１μｌのSalt Solution（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1(R)TOPO (R) Vector；Invitrogen社製）及び１μｌのＴＯＰＯ(R)Ｖｅｃｔｏｒ（TOPO TA Cloning(R) Kit pCR2.1(R)TOPO (R) Vector；Invitrogen社製）を氷上で混和した。室温で５分間反応させた後、再び氷上に戻しTransformationに使用した。
［ＤＨ５αコンピテントセルへのプラスミドＤＮＡの導入］
ＤＨ５αコンピテントセル（Competent high DH5α；TOYOBO社製)を氷上で融解し、２０μｌずつ別のサンプルチューブに分注した。実施例８で調製した反応液を２μｌずつ加え、チップの先で穏やかに混和した。氷上に３０分間置いた後、ヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間処理をした。再び、氷上に２分間置き冷却した後、２５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。振盪培養を行っている間に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ固形培地に０．１Ｍ ＩＰＴＧ（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；SIGMA社製）及び０．１ＭＸ−Ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside；SIGMA社製）を５０μｌずつ塗付した。作製した固形培地に培養したサンプル１００μｌを播き、３７℃で一晩培養した。
ＤＨ５αコンピテントセル（Competent high DH5α；TOYOBO社製)を氷上で融解し、２０μｌずつ別のサンプルチューブに分注した。実施例８で調製した反応液を２μｌずつ加え、チップの先で穏やかに混和した。氷上に３０分間置いた後、ヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間処理をした。再び、氷上に２分間置き冷却した後、２５０μｌのＳＯＣ培地を加え、３７℃で１時間振盪培養を行った。振盪培養を行っている間に、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ固形培地に０．１Ｍ ＩＰＴＧ（Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside；SIGMA社製）及び０．１ＭＸ−Ｇａｌ（5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside；SIGMA社製）を５０μｌずつ塗付した。作製した固形培地に培養したサンプル１００μｌを播き、３７℃で一晩培養した。
［青白選択及びコロニーＰＣＲ法によるスクリーニング］
実施例９で作製したプレートにコロニーが出現していることを確認した後、４℃に５時間静置した。白いコロニーをマークしてからチップの先を使って軽くつつき、５０μｌの滅菌水の入った９６ウェルプレートに入れて軽くゆすいだ。サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間処理をした後に、軽く遠心を行い、２μｌを新しいプレートのウェルに入れた。続いて、１μｌの１０ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、０．８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、６．１１μｌのｄＨ２Ｏ、０．０５μｌのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start version；タカラバイオ社製）、０．０２μｌの１００μＭ Ｍ１３ フォワードプライマー、及び０．０２μｌの１００μＭ Ｍ１３ リバースプライマーを加え、プレートを軽く遠心した。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で１０秒、及び６８℃で２分間の反応を３５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、各ＰＣＲ反応液のＰＣＲ産物（チューブ＃２：１．６Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．９Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．９Ｋｂｐ）を確認した。
実施例９で作製したプレートにコロニーが出現していることを確認した後、４℃に５時間静置した。白いコロニーをマークしてからチップの先を使って軽くつつき、５０μｌの滅菌水の入った９６ウェルプレートに入れて軽くゆすいだ。サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間処理をした後に、軽く遠心を行い、２μｌを新しいプレートのウェルに入れた。続いて、１μｌの１０ｘ ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒII（Ｍｇ＋）、０．８μｌの２．５ｍＭ ｄＮＴＰ Ｍｉｘ、６．１１μｌのｄＨ２Ｏ、０．０５μｌのＬＡ−Ｔａｑポリメラーゼ（TaKaRa LA-Taq(R) Hot Start version；タカラバイオ社製）、０．０２μｌの１００μＭ Ｍ１３ フォワードプライマー、及び０．０２μｌの１００μＭ Ｍ１３ リバースプライマーを加え、プレートを軽く遠心した。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で１０秒、及び６８℃で２分間の反応を３５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、各ＰＣＲ反応液のＰＣＲ産物（チューブ＃２：１．６Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．９Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．９Ｋｂｐ）を確認した。
［ポジティブクローンの液体培養と、プラスミドＤＮＡの抽出］
実施例１１により、ベクターへのＰＣＲ増幅断片の挿入が確認されたコロニーを選び、３．５ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で、３７℃で一晩振盪培養を行った。培養したサンプル１．８ｍｌを２ｍｌサンプルチューブに入れ、１０００×ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿に対して２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ１（NucleoSpin(R) Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えvortexして混和した。続いて、２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ２を加え転倒混和してから室温で５分間置き、細胞を溶解させた。３５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ３を加え転倒混和し、４℃・１４０００×ｇで１０分間遠心をした。上清をNucleoVac vacuum manifoldにセットしたNucleoSipn(R) Plasmid Binding Stripsに移した。４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液をsilica membraneを透過させ、ＤＮＡを結合させた。６００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＷを加え４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させた後、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。再度、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。６００ｍｂａｒで１５分間吸引し、silica membraneを乾燥させた。NucleoVac vcuum manifoldに回収用のNucleoSipn(R) MN Tube Stripsを付け替え、membraneに１２０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥを加え１分間置き、４００ｍｂａｒで１分間吸引してプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡ液３μｌに、１μｌの１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＨ２Ｏ、及び１μｌのＥｃｏＲＩ（TOYOBO社製）加え、３７℃で１時間処理した。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、酵素反応液中のＤＮＡ消化断片（チューブ＃２：１．４Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．７Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．７Ｋｂｐ）を確認し、各プラスミドサンプルについて吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１００μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ希釈液を調製した。
実施例１１により、ベクターへのＰＣＲ増幅断片の挿入が確認されたコロニーを選び、３．５ｍｌの５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含む２×ＹＴ液体培地中で、３７℃で一晩振盪培養を行った。培養したサンプル１．８ｍｌを２ｍｌサンプルチューブに入れ、１０００×ｇで１０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿に対して２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ１（NucleoSpin(R) Multi-8 Plasmid；MACHEREY-NAGEL社製）を加えvortexして混和した。続いて、２５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ２を加え転倒混和してから室温で５分間置き、細胞を溶解させた。３５０μｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ３を加え転倒混和し、４℃・１４０００×ｇで１０分間遠心をした。上清をNucleoVac vacuum manifoldにセットしたNucleoSipn(R) Plasmid Binding Stripsに移した。４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液をsilica membraneを透過させ、ＤＮＡを結合させた。６００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＷを加え４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させた後、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。再度、９００ｍｌのＢｕｆｆｅｒ Ａ４を加えて、４００ｍｂａｒで１分間吸引して溶液を透過させ、silica membraneを洗浄した。６００ｍｂａｒで１５分間吸引し、silica membraneを乾燥させた。NucleoVac vcuum manifoldに回収用のNucleoSipn(R) MN Tube Stripsを付け替え、membraneに１２０μｌのＢｕｆｆｅｒ ＡＥを加え１分間置き、４００ｍｂａｒで１分間吸引してプラスミドＤＮＡを回収した。回収したプラスミドＤＮＡ液３μｌに、１μｌの１０×Ｈ Ｂｕｆｆｅｒ、５μｌのｄＨ２Ｏ、及び１μｌのＥｃｏＲＩ（TOYOBO社製）加え、３７℃で１時間処理した。１．５％アガロースゲルを用いた電気泳動により、酵素反応液中のＤＮＡ消化断片（チューブ＃２：１．４Ｋｂｐ、チューブ＃３：０．７Ｋｂｐ、チューブ＃４：０．７Ｋｂｐ）を確認し、各プラスミドサンプルについて吸光度を測定してＤＮＡ濃度を算出し、１００μｇ／μｌのプラスミドＤＮＡ希釈液を調製した。
［Cycle Sequencing法による塩基配列の決定］
氷上に置いた９６ウェルプレートに実施例１１で調製したＤＮＡ希釈液をチューブ＃２については３ウェル（＃２−１、＃２−２、＃２−３）に、チューブ＃３及び＃４については２ウェル (＃３−１、＃３−２及び＃４−１、＃４−２) にそれぞれ６μｌずつ加えた。続いて、各ウェルに、３μｌの５×Sequencing Buffer （BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、２μｌのBigDye(R) Terminator Pre mix（BigDye(R)Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、８μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌの３．２μＭ プライマーを加え、軽く遠心した。
氷上に置いた９６ウェルプレートに実施例１１で調製したＤＮＡ希釈液をチューブ＃２については３ウェル（＃２−１、＃２−２、＃２−３）に、チューブ＃３及び＃４については２ウェル (＃３−１、＃３−２及び＃４−１、＃４−２) にそれぞれ６μｌずつ加えた。続いて、各ウェルに、３μｌの５×Sequencing Buffer （BigDye(R)Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、２μｌのBigDye(R) Terminator Pre mix（BigDye(R)Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit；Applied Biosystem社製)、８μｌのｄＨ２Ｏ、１μｌの３．２μＭ プライマーを加え、軽く遠心した。
各サンプルに用いたプライマーは、サンプル＃２−１：Ｍ１３ リバースプライマー、サンプル＃２−２：Ｍ１３ フォワードプライマー、サンプル＃２−３：ＨｕＩＧＣＨ−ｓｅｑ００１、サンプル＃３−１：Ｍ１３ リバースプライマー、サンプル＃３−２：Ｍ１３ フォワードプライマー、サンプル＃４−１：Ｍ１３ リバースプライマー、サンプル＃４−２：Ｍ１３ フォワードプライマーである。サーマルサイクラーGeneAmp(R) PCR System9700を用いて、９４℃で１分間の熱変性の後、９４℃で１０秒、５０℃で５秒、及び６８℃で４分間の反応を２５サイクル繰り返す反応条件でのＰＣＲ反応を行った。反応が終わるまでに、MultiScreenTMHV-plate（MultiScreen(R) HV-plate；MILLIPORE社製）のウェルにSephadex G-50（SephadexTMG-50 Superfine；GE Healthcar社製)、及び滅菌水３００μｌを加え、室温で２時間静置した。十分に水和させた後、室温・１１００×ｇで５分間遠心して、流出液を廃棄した。MultiscreenTMHV-plateに新しい９６ウェルプレート（ASSAY PLATE 96 well round bottom；IWAKI社製）を付け替え、反応液全量を各ウェルにアプライし、室温・１１００×ｇで５分間遠心してサンプルを回収した。
精製されたサンプルを全量シークエンサー用の９６ウェルプレート（MicroAmp(R) Optical 96- well Reaction Plate；Applied Biosystem社製）に移し、さらに元のウェルに滅菌水１７．２μｌを加え、ウェルを洗いながら全量を同一のサンプルに加えた。x3130/Genetic Analyzer（Applied Biosystem社製)を用いて、各サンプルに付いて６〜８クローンずつ配列を読み、得られた配列のMultiple alignment解析を行った。クローン間で差があった塩基については、その塩基を有するクローンが多いほうを正しい配列であるとし、各サンプルの塩基配列を決定した。
［１細胞のＥＢＶ−Ｂ由来抗体遺伝子配列の解析結果］
ＥＢＶ−Ｂ１細胞由来の抗体遺伝子レパトワ解析結果を表１に示す。ヒトＩｇＧ重鎖領域（ＩＧＨ）は１クローンが、ヒトＩｇＧ軽鎖領域はそれぞれ２つの配列が得られた。
ＥＢＶ−Ｂ１細胞由来の抗体遺伝子レパトワ解析結果を表１に示す。ヒトＩｇＧ重鎖領域（ＩＧＨ）は１クローンが、ヒトＩｇＧ軽鎖領域はそれぞれ２つの配列が得られた。
また、ヒトＩｇＧ重鎖領域（ＩＧＨ）の塩基配列は図１０及び配列番号６４に、ヒトＩｇＧ軽鎖κ領域（ＩＧＫ）の塩基配列は図１１及び配列番号６５、６６に、ヒトＩｇＧ軽鎖λ領域（ＩＧＬ）の塩基配列は図１２及び配列番号６７、６８にそれぞれ示す。図１０〜１２では、配列中のＶ、Ｄ、Ｊ、Ｄ領域をそれぞれ黄、赤、青、緑で色分けして示している。
［不死化処理をしていないＢリンパ球細胞におけるレパトワ解析］
実施例１４で決定した、不死化したＥＢＶ−Ｂ細胞のレパトワが、不死化処理をしていないＢリンパ球（集団）においても発現しているかを以下の実験により確認した。
実施例１４で決定した、不死化したＥＢＶ−Ｂ細胞のレパトワが、不死化処理をしていないＢリンパ球（集団）においても発現しているかを以下の実験により確認した。
まず、ＭＥＬ−０１８患者から採取したリンパ球（ＰＢＭＣ）をＰＥ標識抗ＣＤ１９抗体と反応させ、抗ＰＥ-マイクロビーズを用いたＣＤ１９陽性Ｂ細胞のマグネティックソーティング（純度９８．５％）よりＢ細胞を単離した（以下、ＭＥＬ０１８−Ｂ細胞と記載する）。実施例３の方法に従い、ＦＩＴＣ標識Ａ２４ペプチド及びＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ抗体による染色を行うことで、このＭＥＬ０１８−Ｂ細胞集団の性質を確認した。結果を図８（ＩＩ．ＣＤ１９＋ Ｂｃｅｌｌｓ）に示す。ＣＤ１９陽性のＭＥＬ０１８−Ｂ細胞のうちＭＡＧＥ１−Ａ２４ペプチド陽性細胞は２．２％、細胞表面のヒトＩｇＧ陽性細胞は、９．８％であった。
続いて、ＭＥＬ０１８−Ｂ細胞（集団）の抗体遺伝子レパトワの解析を行った。実施例７〜１３の方法に従って、ＭＥＬ０１８−Ｂ細胞（集団）より全ＲＮＡを抽出した。１μｇのＲＮＡより、ｃＤＮＡを合成し、１／１００量のｃＤＮＡ溶液を鋳型としたＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応は実施例１４で決定されたＥＢＶ−Ｂ細胞のレパトワに対応するプライマーにより行った。重鎖領域（ＩＧＨ）特異的プライマーとしてＨＶ＿８（対応レパトワ：ＩＧＨＶ２−２６）、ＩｇＧ重鎖領域（ＩＧＨ）特異的プライマーとしてＫＶ＿８（対応レパトワ：ＩＧＫＶ３−２０）及びＫＶ＿１（対応レパトワ：ＩＧＫＶ１−５）、ＩｇＧ軽鎖λ領域（ＩＧＬ）特異的プライマーとしてＬＶ＿５（対応レパトワ：IGLV2-14）を用いた。ＰＣＲ産物の電気泳動結果は図１３に示す。
得られたＰＣＲ反応産物を、ゲルから抽出精製し、ヒトＩｇＧ重鎖領域（ＩＧＨ）の塩基配列を解析決定した。ＭＬＡ０１８−Ｂ細胞由来の１０クローンのＩＧＨＶ（ヒト抗体重鎖遺伝子Ｖ領域）のレパトワ解析とＣＤＲ３の配列を検討した結果を図１４及び配列番号６９に示す。すべてのクローンは、ＥＢＶ−Ｂ細胞から得られたレパトワＩＧＨＶ２−２６＊０１と同一であり、ＣＤＲ３も全く同じ配列であった。これらの結果よりＥＢＶ−ＢにてクローニングされたＩＧＨＶ２−２６＊０１の抗体遺伝子は不死化前のＭＬＡ０１８−Ｂ細胞集団にすでに発現しているものと考えられる。
Claims (9)
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程； - 以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｇ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子の解析・同定方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｇ）増幅された遺伝子断片の塩基配列を解析・決定する工程； - がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする請求項１又は２記載の解析・同定方法。
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程； - 以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、（Ｆ）及び（Ｈ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体を製造する方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程；
（Ｈ）増幅された遺伝子断片を、発現ベクターを用いて発現させる工程； - がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする請求項４又は５記載の抗体を製造する方法。
- 以下の（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）、及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｂ）得られた末梢血単核球をエプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を用いて、不死化Ｂ細胞（ＥＢＶ−Ｂ細胞）株を作製する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程； - 以下の（Ａ）、（Ｃ）、（Ｄ）、（Ｅ）及び（Ｆ）の工程を順次備えたことを特徴とする、１個のＢ細胞由来の抗体遺伝子を調製する方法。
（Ａ）がん特異的抗原ペプチドで処理された樹状細胞ワクチンの投与により、該がん特異的抗原ペプチドに対する免疫応答が確認されているがん患者から得られる末梢血単核球を採取する工程；
（Ｃ）標識物質により標識された前記がん特異的抗原ペプチドと、前記標識物質とは異なる標識物質により標識された、ヒト抗体を認識しうる抗体とにより、末梢血単核球中のＢ細胞を標識化する工程；
（Ｄ）前記がん特異的抗原ペプチドを認識する抗体を細胞膜上に発現するＢ細胞を、１細胞ずつ分取する工程；
（Ｅ）１細胞から全ＲＮＡを抽出し、逆転写反応によりｃＤＮＡを合成する工程；
（Ｆ）合成したｃＤＮＡを鋳型として、ヒト抗体重鎖領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、ヒト抗体軽鎖κ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応、又はヒト抗体軽鎖λ領域遺伝子に特異的なプライマー対を用いたＰＣＲ反応とにより、それぞれの領域遺伝子断片を増幅する工程； - がん特異的抗原ペプチドが、ＨＬＡ−Ａ２４又はＨＬＡ−Ａ２拘束性のがん特異的抗原ペプチドであることを特徴とする請求項７又は８記載の抗体遺伝子を調製する方法。
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