JP2008271927A - 高加水分解活性セルラーゼおよびヘミセルラーゼの製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】極めてセルラーゼ生産能の高い新規アクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株またはその変異株、それを培養しセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを製造する方法、およびそのセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを用いて、バイオマス資源を分解または糖化することを特徴とする、バイオマス資源の分解または糖化方法。
【選択図】なし
Description
(1)アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)と比べて高いセルラーゼ生産能を有するアクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株(受託番号FERM P−21290)またはその変異株。
(2)セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株またはその変異株を培養し、その培養物からセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを採取することを特徴とする、セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼの製造方法。
(3)セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株またはその変異株を培養し、その培養液でバイオマス資源を糖化分解することを特徴とする、バイオマス資源の糖化方法。
(4)培地の炭素源として、粉末セルロース(アビセルを含む)、セロビオース、瀘紙、一般紙類、古紙類、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、バガス、大豆粕、大豆おから、コーヒー粕、米ぬか、ラクトース、ラクトース水和物、乳清(ホエイ)、乳製品、加水分解残渣、およびこれらの混合物を用いる、(2)または(3)に記載の方法。
(5)培養方法が、液体培養または固体培養である(2)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6) セルラーゼが、FPアーゼ、CMCアーゼ、アビセラーゼ、セロビアーゼ、およびこれらの混合物を含む、(2)、(4)および(5)に記載の方法。
(7)ヘミセルラーゼが、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、およびこれらの混合物を含む、(2)、(4)および(5)に記載の方法。
(8)(2)、(4)および(5)に記載の方法により得られたセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを用いて、バイオマス資源を分解または糖化することを特徴とする、バイオマス資源の分解または糖化方法。
セルラーゼは、上記のようにFPアーゼ、CMCアーゼ、アビセラーゼ、セロビアーゼなど、セルロースの分解に関与する酵素の総称であり、セルロースの分解活性を有していれば、本発明のセルラーゼに含まれる。セルロースは、グルコースがβ−1,4グルコシド結合により高度に重合したグルコースポリマーであり、全ての植物の細胞壁構成成分として存在する。
セルラーゼ生産菌変異株は、紫外線もしくは放射線による照射処理、化学物質(例えば、亜硝酸、塩基類縁化合物(5−ブロモウラシルおよび2−アミノプリンなど)、アルキル化剤(ニトロソグアニジンおよびエチルメタンサルホネートなど)、アクリジン色素類(アクリフラビンおよびプロフラビンなど)、発がん剤(4−ニトロキノリン−1−オキシド)、抗生物質(マイトマイシンCなど))による処理によって得ることができる。
色素結合セルロース(Cellulose Azure (Sigma))を用いる方法:色素結合セルロースはセルロースに青色色素Remazol Brilliant Blue Rを結合させたものであり、セルラーゼによって分解されると色素が培地中に遊離拡散するために酵素活性を検出することができる。0.5〜1%Cellulose Azure添加Czapeck-Dox寒天培地にセルラーゼ生産菌変異株を含む試料液を塗布し、適温にて5〜7日間培養を行う。コロニー周囲の基質が分解拡散し、ハローを形成したものを釣菌する。
セルラーゼ生産菌は、下記の実施例において具体的に記載されるように培養することが可能である。
培地は、炭素源として、粉末セルロース(アビセルを含む)、セロビオース、瀘紙、一般紙類、古紙類、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、バガス、大豆粕、大豆おから、コーヒー粕、米ぬか、ラクトース、ラクトース水和物、乳清(ホエイ)、乳製品、加水分解残渣、およびこれらの混合物、窒素源として、硫安、硝安などの無機アンモニウム塩、尿素、アミノ酸、肉エキス、酵母エキス、ポリペプトン、およびタンパク質分解物などの有機窒素含有物、ならびに無機塩類として、硫酸マグネシウム、リン酸2水素カリウム、酒石酸カリウム、硫酸亜鉛、硫酸マグネシウム、硫酸銅、塩化カルシウム、塩化鉄、塩化マンガン等を含むことができる。必要ならば有機微量栄養物を含有する培地を使用してもよい。培地は、寒天やゼラチンを加えて固化した固体培地、低濃度の寒天を加えた半流動培地、培地成分のみを入れた液体培地(ブイヨン、またはブロスともいう)を用いることができるが、液体培地が好ましい。
セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼは、上記上清液より、タンパク質精製に用いられる公知の方法、例えば、硫安塩析、有機溶媒(エタノール、メタノール、アセトン等)による沈殿分離、イオン交換クロマトグラフィー、等電点クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、吸着カラムクロマトグラフィー、基質または抗体などを利用したアフィニティークロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、精密ろ過、限外ろ過、逆浸透ろ過等の濾過処理など、を1つまたは複数組み合わせて用いて精製することが可能である。
精製したセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを、固定化して用いることもできる。固定化することによって、安定化され、連続反復使用が可能となる点において有効である。セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼの固定化は、担体結合法、架橋法、包括法を用いて行うことができる。担体結合法では、セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを水不溶性の担体(例えば、ポリアクリルアミドゲル、ポリスチレン樹脂、多孔性ガラス、金属酸化物など)に、物理的吸着、イオン結合および共有結合を用いて結合させることができる。架橋法では、2個またはそれ以上の官能基を持つ試薬を用いて、酵素同士を互いに架橋することによって固定化する。架橋試薬としては、Schiff塩基をつくるグルタルアルデヒド、ペプチド結合をするイソシアン酸誘導体、N,N’-エチレンマレイミド、ジアゾカップリングをするビスジアゾベンジン、あるいはアルキル化するN,N’-ポリメチレンビスヨードアセトアミドなどを用いることができる。包括法では、高分子ゲルの細かい格子の中にセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを取り込む格子型と、半透膜の高分子の皮膜によってセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを皮膜するマイクロカプセル型を用いる。格子型の方法では、合成高分子物質のポリアクリルアミドゲル、ポリビニルアルコール、光硬化性樹脂などの高分子化合物を用いることができる。マイクロカプセル型の方法では、ヘキサメチレンジアミン、セバコイルクロリド、ポリスチレン、レシチンなどを用いることができる(福井三郎、千畑一郎、鈴木周一、「酵素工学」東京化学同人発行、1981年)。
セルラーゼ活性は、上記上清液または精製したセルラーゼに、濾紙、カルボキシメチルセルロース(CMC)、微結晶セルロース(Avicel)、サリシンおよびセロビオースなどの基質を加えて、一定時間酵素反応を行わせた後に、生じた還元糖をSomogy-Nelson法およびDNS法などにより発色させ所定の波長で比色定量して測定することが可能である。
バイオマス資源の分解または糖化のための手法としては、公知の方法を用いることができる。例えば、用いられるバイオマス資源は、乾燥物でも、また湿潤物でもよいが、処理速度を高めるためにあらかじめ100〜1000μmのサイズに粗粉砕又は細断して用いるのが好ましい。この粗粉砕又は細断は、ボールミル、振動ミル、カッターミル、ハンマーミル、ウィレーミル、ジェットミルなどの機械を用いて行うことができる。その後、粗粉砕又は細断したバイオマス資源を水性媒体中に懸濁し、セルラーゼもしくはヘミセルラーゼ、またはその両方を含む培養上清または精製もしくは固定化したセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを加え、撹拌または振とうしながら加温して、バイオマス資源を分解または糖化することができる。この方法において、反応液のpHおよび温度は、セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼが失活しない範囲内であればよく、一般的に、常圧で反応を行う場合、温度は5〜95℃、pHは1〜11の範囲でよい。例えば、50gの粉砕した稲わらに、0.25〜1Lの酢酸緩衝液(0.05M、pH 4.8)および0.01〜0.2Lのセルラーゼ(例えば、10〜20U/ml)を含む培養上清または精製したセルラーゼを添加して、45〜60℃で攪拌または振とうしながら、バイオマス資源の分解または糖化を行う。また、この酵素反応は、バッチ式で行っても、連続式で行ってもよい。
アクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株(以下、CF−2612株と記載)
(1)CF−2612株の取得方法
親株として、アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508;以下、C1株と記載)を30℃で24時間好気的に培養した後、紫外線(UV)照射を行い、その後30℃でインキュベートした。生育したコロニーから、活性がより高い変異菌株をスクリーニングした後、以上の方法を用いて二回目の突然変異を行い、さらに活性がより高い変異菌株をスクリーニングした後、NTG処理を用いて、三回目の突然変異を行い、変異株CF−2612株を得た。このCF−2612株は、以下の形態的性質を有する。
3種類の選択寒天培地を用いて、CF−2612株とC1株をそれぞれ7〜14日間培養し、その形態を観察した。結果を以下に示す。
<炭素源選択寒天培地Aで培養した場合>
〔選択培地A〕
グルコース 50 g/L
硫酸アンモニウム 5 g/L
尿素 2 g/L
硫酸マグネシウム 1.2 g/L
リン酸2水素カリウム 24 g/L
酒石酸カリウム 4.7 g/L
硫酸亜鉛 10 mg/L
硫酸マンガン 10 mg/L
硫酸銅 9 mg/L
Tween80 1 g/L
寒天 20 g/L
pH 4.0
〔選択培地B〕
選択培地Aの炭素源からグルコースを除き、代わりに
セルロースパウダー 25g/L
カルボキシメチルセルロース(CMC) 25g/L
を添加した培地。
〔ポテトデキストロース寒天培地〕
じゃがいも浸出物 4g/L
ブドウ糖 20g/L
寒天 15g/L
pH 5.6±0.2
CF−2612株とC1株との酵素活性を比較した。常法により殺菌した以下の組成を有するセルラーゼ生産菌培養培地にそれぞれの菌体を接種して30℃で7日間好気的に培養した。この培養液を遠心分離して得た上澄液について、製造されたセルラーゼの酵素活性を以下の方法に基づき測定した。
〔培地の組成〕:
セルロースパウダー 50 g/L
硫酸アンモニウム 5 g/L
尿素 4 g/L
硫酸マグネシウム 1.2 g/L
リン酸2水素カリウム 24 g/L
酒石酸カリウム 4.7 g/L
硫酸亜鉛 10 mg/L
硫酸マンガン 10 mg/L
硫酸銅 10 mg/L
Tween 80 1 g/L
pH 4.0
[酵素活性測定法]
FPアーゼ:濾紙(ワットマンNo.1、1×6cm)を基質とし、これに適宜希釈した培養上澄液0.5mLとクエン酸緩衝液(pH4.8、0.05M)1.0mLを加え、50℃で1.0時間酵素反応を行った後、ジニトロサリチル酸試薬3.0mLを加え、100℃で5分間加熱し発色させる。冷却後、蒸留水2.5mLにこれを200μl加え、540nmの波長で比色定量する。1分間に1μmolのグルコースに相当する還元糖を生成する酵素量を1ユニット(U)とした。
これらの測定結果を表1に示す。
CF−2612株およびC1株の上記培養液を用いて、その糖化作用を比較した。
〔反応液の組成〕:
蒸留水 0.7 ml
0.5M 酢酸緩衝液(pH4.8) 0.1 ml
稲わらまたはユーカリ木粉(ボールミルを用いて四時間粉砕したもの) 50mg
反応液に稲わらを用いた実験結果を、図1に示す。稲わらを用いた糖化実験より、CF-2612株の培養液は、C1株の培養液よりもグルコースの産生量が高く、糖化速度(糖化率)が大きいことが示された。さらに、CF-2612株の培養液を用いて糖化を行った場合、アラビノースが産生されるのに対して、C1株培養液を用いて糖化を行った場合、糖化液中にアラビノースが含まれていないことがわかった。この結果から、CF-2612株の培養液中には、アラビナナーゼおよび/またはアラビノフラノシダーゼが含まれるが、C1株の培養液中にはアラビナナーゼおよびアラビノフラノシダーゼが含まれないことが示唆された。
以下の組成を有するセルラーゼ生産菌培養培地を常法により殺菌して用いた。CF-2612株の前培養液(50 mL)を、30℃にて3日間、好気的に振動培養により行った。新たなセルラーゼ生産菌生産培地(0.95 L)に前培養液(50 mL)を接種して、30℃にてジャーファーメーターを用いて、5日間好気的に培養した。その後、40 g/Lのセルロースパウダーと2 g/Lの尿素を添加してさらに2日間培養した。この培養液を遠心分離して得た上澄液について、上記と同様にFPアーゼの活性を調べたところ、製造されたFPアーゼの酵素活性は26.1U/mlに達した。
セルロースパウダー 60 g/L(前培養 40 g/L)
硫酸アンモニウム 5 g/L
尿素 4 g/L(前培養 2g/L)
硫酸マグネシウム 1.2 g/L
リン酸2水素カリウム 24 g/L
酒石酸カリウム 4.7 g/L
硫酸亜鉛 10 mg/L
硫酸マンガン 10 mg/L
硫酸銅 10 mg/L
Tween 80 1 g/L
pH 4.0
Claims (8)
- アクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)C1株(FERM P−18508)と比べて高いセルラーゼ生産能を有するアクレモニウム・セルロリティカス(Acremonium cellulolyticus)CF−2612株(受託番号FERM P−21290)またはその変異株。
- セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株またはその変異株を培養し、その培養物からセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを採取することを特徴とする、セルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼの製造方法。
- セルラーゼ生産菌としてアクレモニウム・セルロリティカスCF−2612株またはその変異株を培養し、その培養液でバイオマス資源を糖化分解することを特徴とする、バイオマス資源の糖化方法。
- 培地の炭素源として、粉末セルロース、アビセル、セロビオース、瀘紙、一般紙類、古紙類、木材、ふすま、麦わら、稲わら、もみがら、バガス、大豆粕、大豆おから、コーヒー粕、米ぬか、ラクトース、ラクトース水和物、乳清、乳製品、加水分解残渣、およびこれらの混合物を用いる、請求項2または3に記載の方法。
- 培養方法が、液体培養または固体培養である請求項2〜4のいずれか1項に記載の方法。
- セルラーゼが、FPアーゼ、CMCアーゼ、アビセラーゼ、セロビアーゼ、およびこれらの混合物を含む、請求項2、4および5に記載の方法。
- ヘミセルラーゼが、キシラナーゼ、アラビナナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、キシロシダーゼ、マンノシダーゼ、およびこれらの混合物を含む、請求項2、4および5に記載の方法。
- 請求項2、4および5に記載の方法により得られたセルラーゼおよび/またはヘミセルラーゼを用いてバイオマス資源を分解または糖化することを特徴とする、バイオマス資源の分解または糖化方法。
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