CN110129407A - 玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了玉米秸秆降解真菌的分离与鉴定方法，选取样品，接种培养，菌种筛选培养，真菌筛选培养基、刚果红纤维素筛选琼脂培养、种子培养基和秸秆高效降解液态发酵培养基四个筛选培养基对多次活化得到的菌种进行筛选培养，纤维素降解真菌的初步筛选与生长形态观察，分子生物学鉴定，将形态学鉴定得到的各菌株进行PCR检测，对得到的结果建立系统发育树从而更加准确的鉴定出待测菌株。本发明用真菌筛选培养基筛选玉米秸秆高效降解真菌，用刚果红纤维素筛选琼脂培养基、种子培养基和秸秆高效降解液态发酵培养基进行筛选高效降解真菌。不同的筛选培养基进行培养，可以更加准确的得到需要的菌种，提高实验的准确性。纯化过程中通过严格的灭菌，使得鉴定结果更加的精准。
Description
技术领域
本发明涉及生物降解领域，特别涉及玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法。
背景技术
中国作为一个农业大国，其农作物秸秆资源量非常丰富，每年可收集的农作物秸秆资源量超过9亿吨，其中玉米秸秆占其总量的三分之一，现在农村耕地普遍存在着土壤肥力下降的现象，严重制约了现代农业的发展，秸秆还田是提高作物稻杆利用效率、提髙土壤肥力、改善土壤微环境的有效方法，当前蒙自对玉米秸秆的综合利用率仍然很低，不能实现玉米秸秆还田后的高效利用，大多数农户对玉米秸秆的处理方法仍是直接焚烧，不仅污染了环境，也使其不能发挥更好的作用。
当前大棚种植中土壤严重退化时只能弃棚，造成对土壤资源的破坏和经济上的损失。生物质基质栽培可以增加植物生物量和土壤微生物数量，能够克服连作障碍，其中农作物秸秆经高温腐熟后可作为生物质栽培基质，在把农作物秸秆转化为生物质栽培基质过程中，降解真菌起到了加速其腐烂的速度的作用，因此，要想更高效率的完成秸秆到栽培基质的转化，进一步了解并研究农作物秸秆高效降解真菌尤为必要，纯化培养最重要的是在于生理研究，方法是依靠灭菌和分离。在自然界中，有的培养条件很困难，特别是具有密切共生关系的生物及进行寄生性营养的生物，也有一些在理论上不可能进行纯粹培养的生物。微生物的分离鉴定整个过程中，操作的严谨性和精确性非常重要。尤其在纯化过程中由于灭菌不够彻底或者操作环境有杂菌而导致的污染，都能对试验结果致命的影响，进而使得鉴定结果不够精准。
发明内容
本发明的目的在于提供玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，以解决玉米秸秆基质化利用问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，包括以下步骤：
S1：(1)选取样品，设五个不同的取样点,选取不同地区且不同腐解程度的玉米秸秆；(2)选取没有腐解迹象的秸秆，自然晾干，粉碎后过40目的筛，将过筛粉末放于自封袋保存，使用前灭菌并烘干；
S2：接种培养，对所得样品进行表面消毒，然后在超净工作台无菌条件下，将材料接种到PDA培养基，待微生物长出来后再进行多次培养活化；
S3：菌种筛选培养，真菌筛选培养基、刚果红纤维素筛选琼脂培养基、种子培养基和秸秆高效降解液态发酵培养基四个筛选培养基对多次活化得到的菌种进行筛选培养；
S4：纤维素降解真菌的初步筛选与生长形态观察；
S5：分子生物学鉴定，将形态学鉴定得到的各菌株进行PCR检测，对得到的结果建立系统发育树从而更加准确的鉴定出待测菌株。
优选的，将取得的材料用75％乙醇进行表面清洗与消毒1min，在超净工作台无菌条件下，分别接种到PDA培养基，在28℃条件下的恒温培养箱培养。
优选的，在进行菌种的生长习性和形态的观察时，需要对从玉米秸秆分离纯化微生物的整个过程进行记录，
优选的，在PDA培养基中加入阿莫西林和1％的孟加拉红水溶液。
优选的，所述刚果红纤维素筛选琼脂培养基由刚果红、琼脂、明胶、CMC-Na、 KH2PO4和MgSO4·7H2O组成，用蒸馏水定容，灭菌备用，自然pH值，使用前加 100μl氨苄青霉素，且刚果红纤维素筛选琼脂培养基按照重量份数组成分别是：刚果红0.2份、琼脂15份、明胶2份、CMC-Na1.88份、KH2PO40.5份和 MgSO4·7H2O4份。
优选的，所述种子培养基由CMC-Na、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和水组成，且种子培养基按照重量份数组成分别是：CMC-Na 10份、蛋白胨3份、 MgSO4·7H2O 0.03份、KH2PO44份和水1000份。
优选的，所述秸秆高效降解液态发酵培养基由已灭菌的玉米秸秆粉、 (NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、牛肉膏和水组成，且秸秆高效降解液态发酵培养基按照重量份数组成分别是：玉米秸秆粉20份、(NH4)2SO4 4份、 KH2PO42份、MgSO4·7H2O0.5份、蛋白胨10份、牛肉膏5份和水1000份。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明通过四个筛选培养基对多次活化得到的菌种进行筛选培养，不同的筛选培养基进行培养，可以更加准确的得到需要的菌种，提高实验的准确性。纯化过程中通过严格的灭菌，使得鉴定结果更加的精准。
2、本发明对从玉米秸秆分离纯化微生物的整个过程进行记录，通过更好的观察，可以更加准确的对玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定，提高鉴定的准确性。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供了玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，选取样品，(1)选取不同地区且不同腐解程度的玉米秸秆，设五个不同的取样点，(2)选取没有腐解迹象的秸秆，自然晾干，粉碎后过40目的筛将过筛粉末放于自封袋保存，使用前灭菌并烘干；且将取得的材料用75％乙醇进行表面清洗与消毒1min，在超净工作台无菌条件下，分别接种到PDA培养基，在28℃条件下的恒温培养箱培养，接种培养，对所得样品进行表面消毒，然后在超净工作台无菌条件下，将材料接种到PDA培养基，待微生物长出来后再进行多次培养活化，菌种筛选培养，真菌筛选培养基、刚果红纤维素筛选琼脂培养基、种子培养基和秸秆高效降解液态发酵培养基四个筛选培养基对多次活化得到的菌种进行筛选培养，纤维素降解真菌的初步筛选与生长形态观察，在进行菌种的生长习性和形态的观察时，需要对从玉米秸秆分离纯化微生物的整个过程进行记录，分子生物学鉴定，将形态学鉴定得到的各菌株进行PCR检测，对得到的结果建立系统发育树从而更加准确的鉴定出待测菌株。
制备真菌筛选培养基，真菌筛选培养基(改良的PDA培养基)在 PDA培养基中加入和1％的孟加拉红水溶液(1000mL培养基加3.3mL)，阿莫西林添加时每800mL培养基加一颗，所述刚果红筛选纤维素琼脂培养基由刚果红、琼脂、明胶、CMC-Na、KH2PO4和MgSO4·7H2O组成，用蒸馏水定容，灭菌备用，自然pH值，使用前加100μl氨苄青霉素，且刚果红筛选纤维素琼脂培养基按照重量份数组成分别是：刚果红 0.2份、琼脂15份、明胶2份、CMC-Na1.88份、KH2PO40.5份和 MgSO4·7H2O4份，所述种子培养基由CMC-Na、蛋白胨、MgSO4·7H2O、 KH2PO4和水组成，且牛种子培养基按照重量份数组成分别是：CMC-Na10 份、蛋白胨3份、MgSO4·7H2O0.03份、KH2PO4 4份和水1000份，所述秸秆高效降解液态发酵培养基由已灭菌的玉米秸秆粉、(NH4)2SO4、 KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、牛肉膏和水组成，且秸秆高效降解液态发酵培养基按照重量份数组成分别是：玉米秸秆粉20份、(NH4)2SO4 4份、KH2PO42份、MgSO4·7H2O0.5份、蛋白胨10份、牛肉膏5份和水1000份；
将得到的已纯化菌种放入加有阿莫西林和孟加拉红的PDA培养基中再次培养，从而纯化得到降解真菌。把得到的降解真菌放入刚果红纤维素培养基中进行初步筛选，28℃培养箱中培养，出现透明水解圈的菌株为纤维素降解真菌，测定菌落直径(d，cm)和水解圈直径(D，cm)，采用D0＝D/d表示水解能力。纤维素刚果红平板透明圈直径与菌落直径(d)的比值(D/d)可以用于初步判断纤维素降解真菌酶活力的大小，其大小直接反映了纤维素酶浓度的相对高低。将分解能力强的菌株在28℃下培养7d，对各菌种进行以透明度、大小、形态、干湿度、表面、菌丝长短、边缘、正面和背面颜色为主的生长形态观察，用滤纸酶活性测定的方法测定纤维素酶活力，在5支试管中加入0.5mL酶溶液和浓度为0.05mol/L。pH值为4.5的柠檬酸缓冲液, 并向对照试管中加入1.5mLDNS,放在50℃水浴锅中预热5～10min,各加入1.0cm×6.0cm无淀粉新华滤纸条,在温度为50℃条件下保温 60min,取出后立刻向非对照试管中加入1.5mLDNS停止反应。在540nm 处记录测定的其他各试管的D540nm。根据葡萄糖标准曲线计算得出相应的葡萄糖含量,并计算出相应的滤纸酶活性，第一次复筛得到的菌株再进行第二次复筛，将其接种到种子培养基内，在温度为25℃，转速为170r/min条件下于摇床振荡培养7d后制得种子液。采用尼龙网袋法，分别以0.6g的玉米秸秆为培养基唯一碳源，取事先制得的种子液1mL接入20mL新鲜秸秆高效降解液态发酵培养基，再在温度为25℃，转速为170r/min条件下于摇床振荡培养，7d后利用失重法测定不同分解菌株纤维材料的分解量(失重量)，计算分解率(失重率)。具体方法：利用38μm尼龙袋过滤培养基，再用大量蒸馏水冲洗，80℃条件下烘干，恒重，计算。纤维材料分解率＝(纤维材料原质量+尼龙袋质量-烘干后纤维材料与尼龙袋质量和)/纤维材料原质量×100％，将从腐烂玉米秸秆中分离得到的降解真菌放到PDA培养基上培养7d，待长出大量菌丝后，挑取菌丝，用DNA提取试剂盒提取DNA。再用引物对DNA进行PCR扩增ITS序列，PCR产物经过电泳观察条带来判断DNA含量和纯度，PCR产物纯化后进行ITS测序，得到的序列通过NCBI和MEGA5.1进行比对和构建发育树得到鉴定结果，把第二次复筛得到降解能力较强的单一菌株筛选出来，按不同的方式对其进行组合，把各组合菌系接入种子培养基培养7d制得种子液，并以玉米秸秆为唯一碳源采用尼龙网带法测定其分解率。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，包括以下步骤：
S1：(1)选取样品，设五个不同的取样点,选取不同地区且不同腐解程度的玉米秸秆；(2)选取没有腐解迹象的秸秆，自然晾干，粉碎后过40目的筛，将过筛粉末放于自封袋保存，使用前灭菌并烘干；
S2：接种培养，对所得样品进行表面消毒，然后在超净工作台无菌条件下，将材料接种到PDA培养基，待微生物长出来后再进行多次培养活化；
S3：菌种筛选培养，真菌筛选培养基、刚果红筛选纤维素琼脂培养基、种子培养基和秸秆高效降解液态发酵培养基四个筛选培养基对多次活化得到的菌种进行筛选培养；
S4：纤维素降解真菌的初步筛选与生长形态观察；
S5：分子生物学鉴定，将形态学鉴定得到的各菌株进行PCR检测，对得到的结果建立系统发育树从而更加准确的鉴定出待测菌株。
2.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，其特征在于：将取得的材料用75％乙醇进行表面清洗与消毒1min，在超净工作台无菌条件下，分别接种到PDA培养基，在28℃条件下的恒温培养箱培养。
3.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，其特征在于：在进行菌种的生长习性和形态的观察时，需要对从玉米秸秆分离纯化微生物的整个过程进行记录。
4.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离方法，其特征在于：在PDA培养基中加入阿莫西林和1％的孟加拉红水溶液。
5.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，其特征在于：所述刚果红纤维素筛选琼脂培养基由刚果红、琼脂、明胶、CMC-Na、KH2PO4和MgSO4·7H2O组成，用蒸馏水定容，灭菌备用，自然pH值，使用前加100μl氨苄青霉素，且刚果红筛选纤维素琼脂培养基按照重量份数组成分别是：刚果红0.2份、琼脂15份、明胶2份、CMC-Na 1.88份、KH2PO40.5份和MgSO4·7H2O 4份。
6.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，其特征在于：所述种子培养基由CMC-Na、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4和水组成，且牛种子培养基按照重量份数组成分别是：CMC-Na10份、蛋白胨3份、MgSO4·7H2O0.03份、KH2PO44份和水1000份。
7.根据权利要求1所述的玉米秸秆高效降解真菌的分离与鉴定方法，其特征在于：所述秸秆高效降解液态发酵培养基由已灭菌的玉米秸秆粉、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、牛肉膏和水组成，且秸秆高效降解液态发酵培养基按照重量份数组成分别是：玉米秸秆粉20份、(NH4)2SO4 4份、KH2PO42份、MgSO4·7H2O 0.5份、蛋白胨10份、牛肉膏5份和水1000份。
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