JP2008268150A - 標本の分析方法およびそれを利用した針状領域の分析装置 - Google Patents

Abstract

【課題】 目視観察による粒子や結晶の計数を補助する。
【解決手段】 未知試料の標本の画像において、粒子は、例えば、判別分析法などの手法により２値化などをして得られた画像から計数し、結晶は、撮影条件による画像の差を利用して２つの画像から計数する。一例として、粒子の計数においては、例えば２段階のノイズ除去を行い、また、結晶は、位置合わせ、アスペクト比の算出を行う。特に、アスベスト結晶を位相差顕微鏡によって目視観察により探索する分散染色法を補助することもできる。
【選択図】 図２

Description

本発明は、画像に含まれる標本を分析する方法および該方法を用いる装置に関する。さらに更に詳細には、画像処理技術を用いて粒子領域および針状領域を計数する方法およびこれを応用する装置に関する。

従来、アスベストが建材に含まれているかどうかを判定するために、顕微鏡下で目視により判定すること（顕微鏡による定性分析方法）が行われている。この分析方法を規定する非特許文献１（日本工業規格Ａ１４８１、「建材製品中のアスベスト含有率測定方法」）においては、定性的な分析手段として、位相差顕微鏡を用いた分散染色法と偏光顕微鏡を用いた消角法との二つが規定されている。これらの手法は、採取した建材の試料を粉砕し、その試料の粉砕したものを屈折率が既知の液体（以下、浸液という）に浸漬して作成したプレパラートを用いて位相差顕微鏡または偏光顕微鏡によって目視観察し、色および形状を手がかりに繊維の有無を判定する手法である。

上記の分散染色法と消光角法のうち、実際の測定を行う場合には、位相差顕微鏡を用いた分散染色法が多用される。上記非特許文献１の７.１.２.ａ）には、この分散染色法が詳細に規定され、上記の消角法やＸ線を利用した方法とともに、最終的な定量分析を行う前の定性分析のための手法とされている。一方、上記非特許文献１においては定量分析とされてはいるものの、分散染色法を定量分析に準じる分析手法として実務上用いられることもある（例えば、非特許文献２、（「建材中の石綿含有率の分析方法について」厚生労働省労働基準局長、基発第０８２１００２号））。また、このような分散分析法を精度良く行うための位相差顕微鏡が、特許文献１（特開２００５−３３８５６７号公報）に開示されている。

非特許文献１の記載に従って行う分散染色法（以下、「公定法」という）によってアスベストの有無を分析する場合には、観察者は、まず、試料（建材など）から所定の方法によって標本（粉砕した建材など）を作製する。そして、標本を位相差顕微鏡のステージに乗せる。次に、分散対物レンズ倍率を１０倍にして、アスベストの種類（クリソタイル、アモサイト、クロシドライト）に応じた分散色を示す繊維があるかどうかを確認する。分散色が見られた標本については、分散対物レンズを４０倍にして、更に、位相差顕微鏡の接眼レンズ（１０倍）に描かれたアイピースグレーティクルの直径１００μｍの円内に存在するすべての繊維状粒子を含む粒子を計数し、合計粒子数が１０００個に達するまで視野を動かして計数する。そして、分散色を示すアスベストの種類および粒子の数を記録する。公定法では、分析試料一試料あたり３つの標本、アスベストの種類が３種類あって異なる浸液を用いるため、合計９標本について、上記観察および計数を行う。

このような観察の結果、全粒子数のうち一定の規制値以上のアスベストと判定される繊維状粒子があるかどうかによって、建材が規制されている。この規制値は、２００６年に０．１％へと、従来の１％から引き下げられ、大幅に規制が強化されている（非特許文献２）。

しかし、数千個もの粒子を観察する作業は、熟練した観察者が行うとしても、作業の効率が高まりにくく、長時間、高い注意力を保って観察を継続する必要があるという課題がある。しかも、アスベストが含まれていない試料では、規制値に達するまで各標本あたり１０００粒子をすべて観察する必要がある。したがって、予備的ではあっても、標本中から粒子を計数し、また、アスベストである可能性のある繊維状粒子を計数したり特定することが求められている。

また、特許文献２（特開２００５−２３３６５８号公報）には、アスベスト自動判定方法及び判定装置が開示されている。かかる方法や装置においては、形状マップ像に特性Ｘ線に基づく元素マップ像を用いて、すなわち、画像分析に元素分析を併用することにより、アスベストの含有率を算出している。このためには、元素分析を行うための分析手段が必要となる。

特開２００５−３３８５６７号公報 特開２００５−２３３６５８号公報 日本工業規格（ＪＩＳ）Ａ１４８１「建材製品中のアスベスト含有率測定方法」、平成１８年３月２５日制定 「建材中の石綿含有率の分析方法について」厚生労働省労働基準局長、基発第０８２１００２号、平成１８年８月２１日、http://www.mhlw.go.jp/new-info/kobetu/roudou/sekimen/hourei/dl/060821-2.pdf、最終検索２００７年３月２２日

本発明は、画像処理技術によって、標本を分析することにより、上記少なくともいずれかの課題を解決することを課題とする。

本発明は、例えば上記の公定法における定性分析として観察者が行う標本の目視判定を支援するために、あるいは、目視判定の代替手法を提供するために、画像中から画像処理技術を用いて針状領域や粒子領域を計数することを用いる。

具体的には、本発明は、未知試料の標本を撮影した画像により該標本中の針状結晶を分析する標本分析方法であって、前記標本のある撮影域の画像を第１の撮影条件の下で取得して第１の画像とするステップと、前記標本の前記撮影域の画像を第２の撮影条件の下で取得して第２の画像とするステップであって、前記第１の撮影条件と前記第２の撮影条件は、撮影した画像上における前記針状結晶の像または像近傍のデータが互いに異なるデータとなる条件であり、前記第１の画像、前記第２の画像、または、前記標本の前記撮影域を撮影した第３の画像のいずれかの画像を原画像として、該原画像において背景の画素値と異なる画素値を有する領域の数を計数して、少なくとも計数した結果を保存または出力する粒子領域計数ステップと、前記第１の画像と第２の画像とのデータの差に基づいて差分画像を求めて、該差分画像に基づいて針状領域を選択して、該選択された針状領域の数を計数して、少なくとも計数した結果を保存または出力する針状領域計数ステップとを含んでなる画像に含まれる標本の分析方法が提供される。

特に、この手法は分散染色法によるアスベストの検出に応用することもできる。すなわち、本発明においては、前記未知試料は、粉砕された建材の未知試料であり、前記標本は、該粉砕された建材の試料を、該試料に含まれ得る種類のアスベスト結晶の屈折率とほぼ一致させた既知の屈折率を有する浸液中に浸漬して準備された標本であり、前記第１の撮影条件と第２の撮影条件とが、位相差顕微鏡を用いて、標本からの光路に挿入する偏光子の方位が互いに異なるようにして前記標本を撮影する条件であり、該針状領域が、粉砕した建材の試料中におけるアスベスト結晶である可能性を示す情報を対応させるステップをさらに含み、前記粒子領域係数ステップは、計数した領域の数を、前記標本における観察対象の粒子数として出力または保存するステップである、分析方法が提供される。

更に、本発明では、針状領域の分析装置が提供される。すなわち、未知試料の標本を撮影した画像により、該標本中の針状結晶を分析する標本分析装置であって、複数の撮影条件により未知試料の標本を撮影して画像データを取得するようにされた画像取得部と、該画像取得部によって第１の撮影条件により取得した前記標本のある撮影域の第１の画像データを格納するための第１の画像記録部と、該画像取得部によって第２の撮影条件により取得した前記撮影域の第２の画像データを格納するための第２の画像記録部と、ここで、前記第１の撮影条件と前記第２の撮影条件は、撮影した画像上における前記針状結晶の像または像近傍のデータが互いに異なるデータとなる条件であり、前記第１の画像、前記第２の画像、または、前記標本の前記撮影域の第３の画像のいずれかの画像を原画像として、該原画像において背景の画素値と異なる画素値の領域の数を少なくとも計数してその結果を出力する粒子領域計数部と、前記第１の画像記録部および第２の画像記録部から読み込んだ第１の画像と第２の画像とのデータの差の差に基づく差分画像を生成し、該差分画像に基づいて、針状領域を選択する針状領域選択部と、選択された針状領域を計数して、その結果を出力する針状領域計数部と、少なくとも前記針状領域計数部又は前記粒子領域計数部のいずれかの出力をデータとして格納するための計数結果記録部とを備えてなる分析装置が提供される。そして、その分析装置を用いて、針状領域を観察者がレビューするための装置が提供される。

本発明が対照とする未知試料は、針状結晶を分析する撮影のための標本になる物質である。この未知試料の例としては、建材などの固形物が典型であるが、固形物としても、混合物、複合材料など任意であるし、固形物のみならず、廃液や汚泥などのような固形物と液体の混合物、気体中から浮遊粒子をサンプリングするメンブレンフィルターなどの繊維捕集体の捕集物などの紛体も用いられる。また、採集される対象も任意であり、土壌や鉱物などの天然物、実験動物や人体からの生体試料、あるいは、いわゆるナノテクノロジー分野において作り出される人工生成物なども対象となる。本発明での未知試料は、例えば、針状の形状の物質の有無や個数を、画像を用いて計数する対象となる任意の試料である。標本は、このような未知試料を観察に適するように処理した顕微鏡用プレパラートなどが典型であるが、具体的形態や大きさ等は問わない。

撮影域は、画像処理の対象となる画像が取得される範囲である。アスベストの場合の公定法にあるようにグレーティクルに合わせた円形の形状とされていてもよいし、公定法の予備的な処理のためであれば、計算機の処理に適するように適当な比率の四角形にされていてもよい。

画像は、可視光によって撮影された顕微鏡による像の全部や一部が典型であり、撮影に用いる物理的手段や画像それ自体の形状等は何ら限定されない任意の画像である。後の処理のために、画像は、電子的に処理可能なデータとして取得される。原画像は、例えばグレースケール化されるなどして、背景とは画素値の異なる領域が計数される。計数は、対象物の個数を判定する処理である。

撮影条件は、画像を取得する条件である。その撮影条件の少なくとも一部には、針状結晶の像や像近傍の画素値のデータが変わりうる複数の条件を選択できるような条件が含まれる。例えば、位相差顕微鏡でアスベストを検出する分散分析法においては、位相差顕微鏡において光路に挿入した検光子の方位が異なり他の条件（倍率、明るさ、位置など）が変わらないものとすることができるが、本発明はこれに限定されるものではない。なお、撮影条件とは、撮影するための撮影装置のみの条件に限定されず、光などの撮影に用いる放射の条件を変更したり、標本の状態を変更するなどの任意の条件が含まれる。

本発明においては、さらに、標本のレビュー装置や、コンピュータプログラムも提供される。これらの態様は、以下の説明において例示により明らかとなる。

本発明のいずれかの態様により、少なくとも、観察者が画像を観察して、例えばアスベスト等を例えば公定法によって探索する場合に、観察対象の標本において多数の粒子を係数して、そのなかから、アスベストでありうる候補の数を計数することができる。また、粒子の計数の精度を向上させることができ、あるいは、針状結晶の計数の精度を向上させることができる。
本発明のいずれかの態様により、例えばアスベストを例えば公定法により観察する場合において、観察者の観察を補助したり、負担を軽減したりすることができる。また、本発明によれば、例えばアスベストについての現在の上記公定法又はそれ以外の画像を用いる針状結晶の分析において、少なくともその一部を実行することができる。
更に、本発明においては、いずれかの態様により、針状領域として識別された画像を表示装置に呼び出して観察者がレビューしたり、あるいは、針状領域として識別された位置において、観察者の目視によって標本のレビューが可能になる。

以下、図面を参照して本発明の実施の形態を説明する。図１は、本発明の実施の形態の一つである分析装置１００の構成を示すブロック図である。位相差顕微鏡１０には、標本１２が載置されるステージ１３が備えられており、また、標本１２に正対する位置に、配置可能な分散対物レンズ１４Ａ、１４Ｂも備えられている。位相差顕微鏡１０には、画像を電気信号として取得するための撮像素子１８が取り付けられており、また、検光子（アナライザー）１６が分散対物レンズ１４とカメラの間の光路に配置されている。

撮像素子１８により取得した画像は、図示しない任意のコンピュータ装置や画像データベースなどの画像を格納しうる任意の記憶手段２０において、識別できるように格納される。

分析装置１００は、さらに、コンピュータ３０も含んでいる。コンピュータ３０には、表示装置３２、キーボード３３、マウス３４などの入出力装置が備えられ、また、演算手段３５、記憶手段３６が備えられる。これらの各手段以外にも、本実施形態の分析装置１００には、画像データを取得するための入出力インターフェース部３８や外部の機器を制御するための制御ボード３９が備えられている。この入出力インターフェースは、例えば、ＩＥＥＥ１３９４やＵＳＢなどの汎用インターフェースとすることができる。また、外部の機器を制御するための制御ボードは、例えばＧＰ−ＩＢなどの機器制御インターフェースとすることができる。

本発明の実施形態の分析装置１００のコンピュータ３０においては、演算手段３５を用いて、粒子計数部４２と針状領域計数部４４が実現され、また、記憶手段３６を用いて、粒子計数結果記録部４６と、針状領域結果記録部４８も実現される。針状領域計数部４４には、針状領域選択部４４Ａが備えられる。

コンピュータ３０は、画像を格納する記憶手段２０における画像ファイルまたは画像レコードなどのデータを読み出すことができる。

本実施の形態は、このような機器構成によって、実現されることができる。以下その具体的な処理についてさらに図面を用いて説明する。

図２は、本発明の実施の形態の処理の概略を説明するフローチャートである。本実施の形態に置いては、図１に示した分析装置１００を用いて画像を取得し（Ｓ１２）、取得した画像を用いて粒子数係数処理Ｓ２０と針状領域計数処理Ｓ３０が行われ、これらのデータを用いた標本分析処理Ｓ１４が行われる。

図３は、画像取得処理Ｓ１２を説明するフローチャートである。画像を取得するに当たり、試料の含まれていない清浄なプレパラートを用意して、その撮影を行う（Ｓ１２２）。これにより、位相差顕微鏡１０の照明や撮影のムラのデータが取得されるので、これを以後背景画像と呼ぶ。その背景画像は、適当な記憶手段（例えば記憶手段２０）に保存される。

標本は、撮影の前に準備される（Ｓ１２４）。標本は、事前に分析対象となる建材などの試料から作成される。この際の処理は、例えば公定法に記載の手順にしたがって行われる。このようにして準備された標本は、プレパラートの形態としてステージ１３に載置される。図示しないが、自動測定などの実施形態を用いる場合には、適当な搭載装置（ローダー）などによって、予め設定した動作が可能なステージ等に載置されることができる。このようにして準備された標本は、次に撮影に移る。なお、図示しないが、どの位置を撮影したかを記録するために、ステージ１３にロータリーエンコーダーなどの座標検出手段が備えられていて、撮影データと関連付けて保存されるようにしても良い。その場合には、図１に示した記憶手段３６に撮影データとの関連を示す情報が格納されることができる。

撮影は、例えば、プレパラートの特定の位置などの撮影域が顕微鏡視野に含まれるように、まず、ステージ１３を移動させて撮影域に移動するステップ（Ｓ１２６）から開始する。次に、第１の撮影条件に設定され（Ｓ１２８）、次いでその第１の撮影条件によって第１の画像が撮影される（Ｓ１２８Ａ）。この処理も含めて、撮影条件への設定とそれに応じた撮影が、少なくとも２回繰り返されて、第２の撮影条件への設定（Ｓ１３０）と第２の画像の撮影も行われる（Ｓ１３０Ａ）。ここで、第１の撮影条件と第２の撮影条件は、撮影した画像上における針状結晶の像または像近傍のデータが互いに異なるデータとなる条件である。このような例としては、公定法の場合には、アナライザー１６を光路に挿入下場合にアスベストなどの複屈折物質（結晶）に生じる色調の違いを検出するために、例えば第１の撮影条件をある方位に設定したアナライザー方位での撮影とし、第２の撮影条件を当該方位に直交する方位に設定した別のアナライザー方位での撮影とすることができる。

さらに、必要に応じて、第３の撮影条件に設定し（Ｓ１３２）、第３の画像を取得することもできる（Ｓ１３２Ａ）。この第３の撮影条件は、例えば、公定法において撮影する粒子数を計数（カウント）する必要がある場合に、その粒子数のカウントのために利用しやすい撮影条件とすることができる。一例として、そのときの撮影域においてアナライザー１６を光路からはずして撮影した撮影を行うことができる。なお、アナライザー１６の光路中への挿入および除外や、アナライザーの方位は、必要に応じて駆動手段によって駆動されてコンピュータによって制御することができる。このようにして一つの撮影域における撮影を終えると、必要に応じて撮影域を移動する。

次に、図２に戻って本実施の形態の処理を説明すると、粒子候補領域を特定する処理（Ｓ２２）が行われる。なお、本実施の形態は、粒子計数処理（Ｓ２０）が実行された後に針状領域計数処理（Ｓ３０）が実行されるように記載するが、これらの順序を入れ替えたり、同時に別々の処理装置を利用して行うことも可能である。また、図３に示した処理によって取得された第１〜第３のいずれの画像を用いることもできる。さらに、背景画像を用いる。

図４を参照して、粒子候補領域を特定する処理（Ｓ２２）を説明する。粒子候補領域は、本実施の形態の処理において、画像に撮影されているものが粒子である可能性が高いことを示すと画像処理によって判断しうる領域である。粒子候補領域を特定するため、取得した原画をグレースケール化する処理が行われる（Ｓ２２２）。このグレースケール化は、例えば、ＲＧＢの三原色のフォーマットで得られた画像データのうちの特定の原色のデータのみを用いて他のデータを破棄したり、あるいは、適当なマトリックス演算によって輝度データにする等の処理を用いることが可能である。この処理によって用いられる標本の画像とグレースケール画像の例を図５(ａ)に示す。

次に、差分処理（Ｓ２２４）を実行する。差分処理は、原画像をグレースケール化したものの各画素のデータから、背景画像のグレースケール化したものの各画素のデータを減算する処理である。減算処理では、画像に含まれるわずかなノイズ成分がゼロでない値として残存し、その後の処理において粒子と区別できなくなるおそれが生じるため、そのようなノイズ成分を除去する処理を行う（Ｓ２２６）。このノイズ除去の処理は、差分画像の画素値が一定値以下の画素のデータを０としてしまう処理である。このようにして背景成分減算しノイズ成分を除去することにより背景差分画像を得る。

図５は、標本の撮影画像をグレースケール化した画像（図５（ａ））と、背景の撮影画像をグレースケール化した画像（図５（ｂ））と、これらから生成した背景差分画像（図５（ｃ））である。このように、背景差分画像では、画像のムラやノイズが除去された画像が得られる。

このようにして得られた背景差分画像に対して、次に、粒子の検出処理を行う（Ｓ２４）。図６および図７は、この粒子検出処理の処理フローを示している。本実施の形態における処理においては判別分析法（Ｓ２４０）を用いて候補領域ごとに異なる閾値を設定して粒子の検出を行っている。候補領域とは、背景差分画像において画素値が０または０に近い値となる画素によって囲まれた領域のそれぞれをいう。背景差分画像は、上述のように、グレースケール化した上で原画像から背景画像を減算したものであり、そこでの画素値が０または０に近い値となる画素は、すなわち、原画像をグレースケール化したものから、グレースケール化された背景レベルの画素値の値に相当する。先にノイズ除去の処理をしているため、画素値が０でない小さな値を有する場合にも若干の相違があるが、本質的な差違ではない。

そして、候補領域は、それぞれ、異なる閾値が関連付けされる。この閾値を、各候補領域のデータの統計的性質にのみ基づいて定める手法の一つが、判別分析法である。判別分析法以外にも、ｐタイル法、モード法などの手法を用いることも可能である。

判別分析法は、ヒストグラムをある閾値で二つに分類し、クラス間分散とクラス内分散の比が最大（極大）となる閾値を算出して、その閾値をクラスの分類のための閾値とする手法である。すなわち、本実施の形態においては、例えば２５６階調の画素値によって表現されたグレースケール画像によってある候補領域の閾値を設定する場合に、閾値ｔを用いて０〜ｔ−１のクラス（クラス０）とｔ〜Ｄ（ただし、Ｄ＝２５５）のクラス（クラス１）に分けて２値化するとする。このときに、クラス０の平均濃度、クラス１の平均濃度および全体の平均濃度を、それぞれ、
とすると、クラス間分散
およびクラス内分散
は、それぞれ、
および
となる。ここで、ｎ_kは、画素値がｋとなる画素数である。そして、このときの分散比
が最大となるｔを閾値として採用し、その候補領域を２値化する。

図７は、この判別分析法を用いて閾値を設定するための処理の流れを記載したものである。まず、閾値ｔが適当な値に設定され（Ｓ２４２）て、数４に従ってクラス間分散が計算され（Ｓ２４４Ａ）、数５に従ってクラス内分散が計算される（Ｓ２４４Ｂ）。これらの順序は逆でも良い。そして、クラス間分散とクラス内分散から、数６に従って分散比を算出する（Ｓ２４４Ｃ）。その後、閾値が残っているかどうかを判定して（Ｓ２４６）、残っている場合には閾値を新たな値に設定して計算を繰り返す。また、全ての閾値について計算を行った後は、最大の分散比を与える閾値を抽出する（Ｓ２４８）。図７に示したループ計算の閾値の初期値は例えば０に設定されて、閾値設定Ｓ２４２では、閾値がインクリメントされる。

本実施の形態においては、さらに精度を高めるための工夫を行う。上記のノイズ除去を行った場合であっても、いまだ背景差分画像にノイズが残存している場合がある。このとき、針状結晶のものも含む粒子の像には、位相差顕微鏡１０の反射（あるいはハロー）が付随していて、候補領域内の画素値に位置的な変化が見られるが、ノイズにはこのような変化が見られない。そこで、その像を取得した画像データにおいて、変化又は変動が一定値より小さい候補領域の画素値を０にする。この処理を、本発明では不変ノイズ除去と呼ぶ。ここで、この一定値（変動閾値）は、画像の撮影条件などによって大きく変動するが、実験的に定めることができる。

図６には、候補領域の閾値決定の処理（Ｓ２４０）の後の処理についても記載されている。候補領域ごとに決定した閾値によって２値化を行う（Ｓ２５４）ことにより、各候補領域が、その候補領域に関連した閾値によって２値化が行われ、領域候補のすべてについてこれを繰り返す（Ｓ２５６）。これにより、背景差分画像内の全ての候補領域について２値化が行われる。このとき、上述の不変ノイズ除去の処理を行う場合、各候補領域の変化量について、変動閾値との比較を実行し（Ｓ２５０）、変動閾値より小さな変動しか示さない候補領域内の全ての画素値は、０にする（Ｓ２５２）。この処理により、２値化処理（Ｓ２５４）と合わせて、位相差顕微鏡の像において粒子であると観察されるもののみ０でない値を有する画像（２値画像）が得られる。

このようにして得られた２値画像は、画像データとしては粒子の位置を正確に反映した画像となっている。次に、この２値画像において粒子数を積算する（図２，Ｓ２６）。この処理には、ラベリング処理を用いる。

図８のフローチャートに、ラベリング処理も含む粒子数を積算する処理を示す。また、図９は、注目画素と、近傍の画素と関係を示す説明図であり、図１０は、ラベリング処理において用いられる条件を説明するための説明図である。本実施の形態では、注目画素の近傍画素における近傍の連結成分（図９（ａ））と８近傍の連結成分（図９（ｂ））を検出して行う。具体的には、画像を２回ラスタ走査して４近傍の連結成分を探し（図８，Ｓ２６２、Ｓ２６４）、さらに１回ラスタ走査して８近傍の連結成分を探す（Ｓ２６６）。４近傍の連結成分は、ラスタ走査を行うときに次の４つの条件に応じた処理を注目画素に行いながら操作を行い、それを２回繰り返すことにより得られる：
条件１．上隣りが白画素の場合：上隣りの画素と同じラベルをその画祖に付加する（図１０（ａ））
条件２．上隣りも左隣も白画素でそれぞれ異なるラベルが付加されている場合：その画そのラベルを記録する（図１０（ｂ））
条件３．上隣りが黒画素で左隣が白画素の場合：左隣の画素と同じラベルを付加する（図１０（ｃ））
条件４．上隣りも左隣も黒画素の場合：新しいラベルを付加（図１０（ｄ））。

図１１に、一度目の走査後のラベリング例と、二度目の走査後のラベリング例を示す。この画像の例においては、左上から右方向に主走査を行い、上から下に副走査をおこなって注目画素を移動させる。図１１は、これに伴い、上記４つの条件の処理を各注目画素に一度適用した結果（図１１（ａ））と、もう一度適用した結果（（図１１（ａ））とを示している。

この後、８近傍の連結成分を探す処理を行う。図１２にこの処理の様子を示す。この処理は、注目画素のラベルと左下のラベルを比較し、また、注目画素のラベルと右下の画素のラベルとを比較し、注目画素のラベルが左下および右下の両画素のラベルと同じになるように統一してゆく。図１２（ａ）はこのときにラベルが統一されてゆく様子を示している。その結果、図１２（ｂ）に示すように、８近傍の画素が連結されたラベリング処理が行われる。

このようなラベリング処理を経て、各ラベリングされた領域の数を集計することにより、２値画像に含まれる粒子の数とする。なお、以上の処理においては、画像中の粒子が形状に関係なく集計される。このため、処理の対象となる画像（第１〜第３の画像のうちのいずれか）に見られる粒子が、針状結晶であるかどうか関係なく、係数される。

次に、針状領域計数処理（図２、Ｓ３０）について説明する。針状領域計数処理の一態様として、アスベスト結晶を計数する場合について図２、図１３，図８，図１５を参照して説明する。

針状領域計数処理は、図２に示したように、アスベスト結晶候補を特定する処理（Ｓ３２）と、アスベスト結晶を検出する処理（Ｓ３４）と、アスベスト結晶数を積算し、結晶を識別する処理（Ｓ３６）とにより構成される。

図１３を参照して、アスベスト結晶候補を特定する処理について説明する。アスベスト結晶は、第１の撮影条件によって撮影した第１の画像と、第２の撮影条件によって撮影した第２の画像とを用いて測定を行う。上述のように、これらの画像は、例えばアナライザー方位を変更して撮影した二つの画像の組である。これらの画像は、原理的には全く同じ撮影域の画像が取得可能であるが、顕微鏡を用いて測定を行う実際の用途では、機械的な振動やアナライザーなどの回転部品の影響により、画像の取得される位置を微細に見た場合には移動してしまうことがある。このような移動は平行にシフトする移動が多いが、このような撮影域の微細な移動であっても、針状領域を計数する処理においては影響が生じうる。本実施の形態では、このような意図しないシフト移動に対して位置補正処理（あるいは位置合わせ処理）Ｓ３２０を行い、その後に二つの画像を対象とした処理を行う（Ｓ３３０）。

位置補正処理Ｓ３２０は、第１の画像と第２の画像のグレースケール化によって開始する。グレースケール化は、三原色データ（ＲＧＢデータ）を用いた場合にしばしば見られる一貫性の乏しいデータのバラツキを排除して、シフトベクトルを正確に求めるために実行する。よって、好ましくは、グレースケール化の際に、ＲＧＢデータを用いて一つの値を算出する。なお、位置補正のためにグレースケール化するが、後の処理（Ｓ３３０）ではグレースケール化していない画像を対象とする。

第１および第２の画像をグレースケール化した後、一定以上の画素値の画素について、シフトベクトルを計算する（Ｓ３２４）。シフトベクトルは、一方の画像の画素を他方の画像の画素に重ね合わせるために必要なベクトルであり、グレースケール化した一方の画像のある画素でのデータと同じ画素値が、もう一方の値の近傍のいずれの画素位置に出現するかによって各画素について算出することができる。具体的には、一方の画像の注目画素（ｘ_1,i、ｙ_1,i）の画素値と同じ画素値が得られるもう一方の画像上での画素を、対応する注目画素（ｘ_2,i、ｙ_2,i）の位置の近傍４８画素（縦横７画素ずつの範囲）から探索する。こうして、同じ画素値を得るためのシフトの位置補正に必要な移動量（Δｘ_i、Δｙ_i）の画像内の二つの方向ｘとｙの集合ＳｘおよびＳｙ：
を得る。ここで、（Δｘ_i、Δｙ_i）＝（ｘ_2,i−ｘ_1,i、ｙ_2,i−ｙ_1,i）であり、また、ｎは画素数である。

これらの集合は、本実施の形態ではばらつきの大きなデータになる。この原因は、アナライザー方位を変更した２回の撮影の際に、偏光方向の差によって生じる微妙な誤差が生じているためではないかと本願発明者は推測している。画像全体では一つのベクトルによって位置合わせをする必要があるが、ばらつきが大きい場合の所に適するよう、統計量として中央値を算出して用いる。

中央値を求めるためには、まず、シフトベクトルの各成分の集合をソートしたデータ列を
とし、各集合の中央値を
により算出する（Ｓ３２６）。このようにして算出された中央値の作るシフトベクトルだけグレースケール化していない第２の画像をシフトして（Ｓ３２８）、新たな第２の画像とする。以後特にことわらない限りこの新たな第２の画像を単に第２の画像という。

次に、二つの画像を対照とした処理Ｓ３３０について説明する。第１の画像と第２の画像との対応する画素において、ＲＧＢの値同士の差を算出し、それぞれを二乗して和をとる（Ｓ３３２）。この値は、ＲＧＢ空間における距離の二乗に対応する。そして、距離の値が一定値（ｔ_d）となる画素を白に、それに満たない画素を黒とする（Ｓ３３４）。

このようにして２値画像を算出する各段階における画像の例を、図１４に示す。図１４（ａ）および図１４（ｂ）はこの処理に用いた第１の画像および第２の画像であり、図１４（ｃ）および図１４（ｄ）は、それぞれ、ｔｄを１００とした場合およびｔｄを１０００とした場合の第１の画像および第２の画像からアスベスト結晶候補を特定する処理Ｓ３２によって得られた２値画像である。本実施形態では、ｔｄを小さい値、例えば１００に設定する。ｔｄを大きな値、例えば１０００とすると、例えばアスベストを計数する場合に針状領域として選択されなかった領域にアスベストと判定すべきものが含まれている可能性が増大するためである。

次に、図１５を参照して、アスベスト結晶を検出する処理について説明する。２値画像における針状領域に対して、まず、矩形域を設定する（Ｓ３４２）。この矩形域は、針状領域に外接する長方形または正方形の四角形である。矩形は任意の方向に向けることができるため、無数の設定方法があるが、ここでは、画像データの画素位置を与えるｘ―ｙ座標に合わせて方向を決める。この処理を行うことにより、針状領域の含まれるｘ座標の範囲が矩形域のｘ方向の長さとなり、ｙ座標の範囲がｙ方向の長さとなる。このようにしてアスペクト比が算出できる（Ｓ３４４）。アスペクト比は、針状領域に対応させて適当な記憶部に格納しておく。

次いで、画像を回転させる。本実施の形態では、３０度刻みで回転させる。画像の回転は、回転変換によって容易に与えられる（Ｓ３４６）。アスペクト比の測定を各角度について行い、１８０度回転した時点でこの処理ループを終了する（Ｓ３４８）。その後、格納した各回転角度でのアスペクト比から最大値を選ぶ。

本実施の形態では、針状領域は、形状に注目して選択が行われる。例えば、本実施形態が用いられるアスベストの定性分析では、アスペクト比が３以上か未満かによって、その粒子をカウントするかどうかが決まる。本実施の形態では、これに対応して、針状領域として選択するための基準値を、アスペクト比を３に近く３より小さな値、例えば２．０に設定する。そして、その基準値とアスペクト比の最大値とを比較して（Ｓ３５０）、基準値を上回る場合には、その針状領域をマークする（Ｓ３５２）。この処理を、針状領域が撮影域に無くなるまで繰り返す（Ｓ３５４、Ｓ３５６）。

アスペクト比を本来の基準値から小さく設定するのは、選択からもれることを防止する意味があるが、本実施の形態では、単なる選択漏れの防止以外に、位相差顕微鏡の反射の影響によって画像上で針状領域となる形状が、針状結晶の周りに観察される反射部分の形状も含んだ、ややアスペクト比の小さい形状と判定されるためでもある。

表１〜３は、それぞれ、クリソタイル、アモサイト、クロシドライトにおいてアスペクト比基準値を変化させた場合の検出失敗数と誤検出数とを示すデータである。アスベストの種類によって違いは見られるが、いずれも、アスペクト比基準値２．０前後の値では検出失敗数と誤検出数がともに少ない値になっており、本実施形態の分析手法が利用可能であることが分かる。

本発明においては、分析方法や分析装置のみならず、標本を後に観察者がレビューする前のスクリーニング方法として上記実施形態の手法を用い、観察者が画像に基づいて針状領域の判定を再度実施するための計数処理を行ったり、あるいは、特に針状領域の観察のための位置を特定したりするように実施することもできる。この態様では、観察者が取得済みの画像をレビューしたり、画像観察者が直接顕微鏡で像を観察してレビューするようにして、針状結晶の判定を再度実施することを補助することもできる。前者の場合には、針状領域を識別して画像と対応させるための情報（画像対応情報）を適当な記憶手段の一部を画像リレーション格納部として用いて、例えば観察者から針状領域の選択を受け付けたり、一定以上のアスペクト比の針状領域が見つかった場合に順番に表示するなどの規則に応じて針状領域が選択されたりすることによって針状領域が特定されると、それに応じた画像を画像リレーション格納部の情報に基づいて特定し、画像を事後的に呼び出して表示部に表示させることができる。これにより、観察者は、判定された針状領域の画像を呼び出して、その画像に基づいてレビューすることができる。また、後者の場合には、針状領域を特定する情報と針状領域の標本における位置を特定するための位置情報とを対応させる。例えば、針状領域を適当なＩＤによって識別し、各ＩＤに応じて撮影域を特定するステージのエンコーダの情報や、その撮影域内での針状領域の位置を示す座標データを、座標データ格納部に保持する。そして、針状領域の選択を受け付けたり、所定の規則に応じて針状領域が選択されたりすると、その位置データ格納部から、選択された針状領域に対応する位置情報を呼び出す。最初の画像の撮影の段階で用いた顕微鏡それ自体を利用したり、あるいは、位置の特定が可能な工夫のされたプレパラートを用いて他の顕微鏡を用いて目視観察を行う。すなわち、その位置情報に対応した観察が可能となるように、例えば、コンピュータ３０の機器制御インターフェースから制御可能なオートステージのある顕微鏡が用いられて観察可能にされていたり、あるいは、観察者に移動先の座標を表示部３２に示して観察者が手動でステージを移動させることができる。そうして、観察者が、針状領域と判定された対象を顕微鏡の接眼レンズを通じて、あるいは、図１のカメラ１８からの直接の映像を通じて目視観察することができる。

以上のような実施の形態に記載した分析手法を実際のアスベストの標準試料によって確認を行った。標準試料は、日本において商業的に使用されているアスベストであるクリソタイル、アモサイト、クロシドライトのそれぞれについての試料（社団法人日本作業環境測定協会）を利用した。
表４は、実施例に用いた画像の枚数である。

また、表５は、これらの画像に対して本発明の実施の形態の手法によって粒子数の計測を行った結果である。粒子計測については、９９％を超える高い精度で目視計測の粒子が判定されている。実際の目視観察においても、手法の性質上視野に存在する粒子の全数が補足されるとは限らないため、本実施の形態における粒子計測は十分な精度で分析の事前処理に用いる処理としては十分なものである。特に、数千個の粒子を目視観察により顕微鏡観察する従来の公定法による判定と異なり、本実施の形態では、計算機による処理によって粒子の数を適切に計数できるため、針状領域の目視判定に観察者が重点を置いた観察が可能になり、十分な効果がある。

次に、アスベスト結晶計測についての実施例について説明する。表４に示した画像について、針状領域計数処理Ｓ３０を実施した。
表６は、各サンプルについて、実際のアスベスト数と測定によって得られたアスベスト数とを示している。これらには、画像一枚あたりの平均検出失敗数と、平均誤検出数も記載されている。このように、結晶数の計測においても、本実施の形態の分析手法によって観察者による目視観察を十分に補助しうる程度の実用性があることが確かめられた。

以上、本発明の実施の形態につき述べたが、本発明は既述の実施の形態に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づいて各種の変形、変更および組み合わせが可能である。例えば、図２および図３に関連して、撮影域の移動を画像が取得された直後に行うこととしているが、撮影域ごとに画像取得Ｓ１２〜標本分析処理Ｓ１４までを実行して、その後に撮影域を移動させることもできる。

また、位相差顕微鏡を用いた実施の形態を主に説明したが、他の方式の撮影装置を用いることもできる。例えば、位相差顕微鏡の代わりに偏光顕微鏡を用いて、偏光顕微鏡に備えられる偏光子と検光子を互いの角度を保って回転させたり、あるいは、ステージを回転させて取得される二つの画像を少なくとも用いて標本を分析することができる。また、画像が光学顕微鏡により得られるもの以外でも、撮影条件によって針状結晶の像や像近傍のデータが異なりうる任意の画像取得手段を用いることも、本願の特許請求の範囲に記載された範囲にある。

また、位相差顕微鏡を用いた実施の形態においてアナライザーの方位を互いに直交する二つの方位になるように用いる例を説明したが、この方位は互いに直交である任意の角度の組合せとすることができ、例えば、結晶の方向とアナライザーの方位との関係によって色調の差が大きく異なる場合には、さらに他の方位による画像を加えることもできる。
また、針状結晶のまたは像近傍のデータが変わりうる撮影条件には、例えばアスベストを検出するための浸液の屈折率に温度依存性があることを利用して標本の温度を変更して撮影することなども可能であり、このように、撮影するための装置の条件に限定されず、針状結晶の像任意の条件を含む。

図１は、本発明の実施の形態の一つである分析装置１００の構成を示すブロック図である。 図２は、本願のある実施の形態における処理フローの全体を示すフローチャートである。 図３は、本願のある実施の形態における画像取得処理を説明するフローチャートである。 図４は、粒子候補領域を特定する処理を説明するフローチャートである。 図５は、標本の撮影画像をグレースケール化した画像（ａ）と、背景の撮影画像をグレースケール化した画像（ｂ）と、これらから生成した背景差分画像（ｃ）である。 図６は、粒子検出処理を説明するフローチャートである。 図７は、粒子検出処理において、判別分析によって候補領域の閾値を決定する処理を説明するフローチャートである。 図８は、粒子数を積算する処理を説明するフローチャートである。 図９は、注目画素と、近傍の画素と関係を示す説明図である。 図１０は、ラベリング処理において用いられる４近傍での連結処理の条件を説明するための説明図である。 図１１は、一度目の走査後のラベリングによって画素中の連結成分が連結される中間段階の様子を示し（ａ）、二度目の走査後のラベリングによって画素中の連結成分が連結される様子を示す（ｂ）。 図１２は、８近傍での連結処理の条件を説明するための説明図（ａ，ｂ）と、その結果得られるラベリングが行われた画素の例を示す説明図（ｃ）である。 図１３は、本発明の実施の形態において、アスベスト結晶となる候補を特定する処理を説明するフローチャートである。 図１４は、本発明の実施の形態において、アスベスト結晶の候補を特定する処理における各段階における画像の例であり、図１４（ａ）および図１４（ｂ）は標本の画像であり、図１４（ｃ）および図１４（ｄ）は、それぞれ、ｔｄを１００とした場合およびｔｄを１０００とした場合の２値画像である。 図１５は、本発明の実施の形態において、アスベスト結晶を検出する処理を説明するフローチャートである。

符号の説明

１００ 分析装置
１０ 顕微鏡
２０ 記憶手段
３０ コンピュータ

Claims (18)

1. 未知試料の標本を撮影した画像により該標本中の針状結晶を分析する標本分析方法であって、
   前記標本のある撮影域の画像を第１の撮影条件の下で取得して第１の画像とするステップと、
   前記標本の前記撮影域の画像を第２の撮影条件の下で取得して第２の画像とするステップであって、前記第１の撮影条件と前記第２の撮影条件は、撮影した画像上における前記針状結晶の像または像近傍のデータが互いに異なるデータとなる条件であり、
   前記第１の画像、前記第２の画像、または、前記標本の前記撮影域を撮影した第３の画像のいずれかの画像を原画像として、該原画像において背景の画素値と異なる画素値を有する領域の数を計数して、少なくとも計数した結果を保存または出力する粒子領域計数ステップと、
   前記第１の画像と第２の画像とのデータの差に基づいて差分画像を求めて、該差分画像に基づいて針状領域を選択して、該選択された針状領域の数を計数して、少なくとも計数した結果を保存または出力する針状領域計数ステップと
   を含んでなる画像に含まれる標本の分析方法。
2. 前記粒子領域計数ステップは、
   前記原画像をグレースケール化してグレースケール画像とするステップと、
   該グレースケール画像から、グレースケール化された背景レベルの画素値の画素に囲まれた候補領域に関連付けられた閾値を該候補領域の画素値の統計に基づいて定める閾値決定ステップと、
   関連付けされている閾値に基づいて該候補領域ごとに２値化を行って２値画像を得る２値化ステップと、
   該２値画像における前記異なる画素値の各領域にラベリングを行って、各領域を計数するステップと
   を含む、請求項１に記載の標本の分析方法。
3. 前記閾値決定ステップは、
   前記グレースケール画像から背景レベルを減算して背景を画素値０とした背景差分画像を得る差分画像算出ステップと、
   前記背景レベルの画素に囲まれた領域を、該背景差分画像において画素値が０または０に近い値となる画素によって囲まれた領域とするステップと
   をさらに含む、請求項２に記載の標本の分析方法。
4. 前記閾値決定ステップが、当該候補領域の画素値の分布においてある閾値によって隔てられる二つのクラスにおけるクラス内分散とクラス間分散とをそれぞれ算出するステップと、該クラス内分散に対する該クラス間分散の比を算出するステップと、候補領域に関連付けて該閾値を再設定するステップとを含み、該比が最大または極大となるように閾値を定める判別分析法に基づくステップである、請求項２に記載の標本の分析方法。
5. 前記２値化ステップが、候補領域内の画素値の変動量が所定の変動閾値より小さい場合に、当該候補領域の画素値を０とする不変ノイズ除去ステップを含む、請求項４に記載の標本の分析方法。
6. 前記差分画像算出ステップが、画素値が一定値以下の背景差分画像における画素のデータを０として新たな背景差分画を得るノイズ除去ステップを含み、
   該新たな背景差分画像を対象にして前記閾値設定ステップおよび前記不変ノイズ除去ステップが実行される、請求項５に記載の標本の分析方法。
7. 前記第１の画像と前記第２の画像の互いの位置合わせを行うステップをさらに含む請求項１に記載の標本の分析方法。
8. 前記位置合わせを行うステップは、
   前記第１の画像の各画素の画素値を、前記第２の画像の対応する画素およびその近傍の画素の画素値と比較し、等しい画素値となるのに必要な画素位置のシフトベクトルを算出するステップと、
   前記第１の画像の所定の領域の全画素について前記シフトベクトルを算出して、該シフトベクトルの各成分の分布の中央値を算出するステップと、
   前記第１の画像または第２の画像の画素位置を前記各成分の分布の中央値の作るベクトルだけシフトさせるステップと
   を含む、請求項７に記載の標本の分析方法。
9. 前記針状領域計数ステップは、
   前記第１の画像と前記第２の画像との間の色調変化量を算出して前記差分画像を求めるステップと、
   該差分画像を所定の色調変化閾値に基づいて２値化して色調２値画像を得るステップと
   を含む、請求項１に記載の標本の分析方法
10. 前記針状領域計数ステップは、
    前記差分画像において色調変化量が大きい領域の形状のアスペクト比を算出するステップと、
    該アスペクト比を所定のアスペクト比閾値と比較するステップと、
    該差分画像における色調変化量が大きい領域から、該アスペクト比閾値以上のアスペクト比を有する領域を選択して、前記針状領域とするステップと、
    前記差分画像に基づいて各針状領域にラベリングを行って、針状領域を計数するステップと
    を含む、請求項１に記載の標本の分析方法。
11. 前記アスペクト比を算出するステップが、
    前記差分画像を回転させた複数の画像に対して前記色調変化量が大きい領域の形状に外接する矩形域を決定するステップと、
    該矩形域それぞれのアスペクト比のうちの最大のものを前記色調変化量が大きい領域のアスペクト比として算出するステップと
    を含む、請求項１０に記載の標本の分析方法。
12. 前記針状領域係数ステップが、前記ラベリングに基づいて、各針状領域に識別のための識別子を関連付け、各針状領域の画像を呼び出し可能とするステップをさらに含む、請求項１０に記載の標本の分析方法。
13. 前記未知試料は、粉砕された建材の未知試料であり、
    前記標本は、該粉砕された建材の試料を、該試料に含まれ得る種類のアスベスト結晶の屈折率とほぼ一致させた既知の屈折率を有する浸液中に浸漬して準備された標本であり、
    前記第１の撮影条件と第２の撮影条件とが、位相差顕微鏡を用いて、標本からの光路に挿入する偏光子の方位が互いに異なるようにして前記標本を撮影する条件であり、
    該針状領域が、粉砕した建材の試料中におけるアスベスト結晶である可能性を示す情報を対応させるステップをさらに含み、
    前記粒子領域係数ステップは、計数した領域の数を、前記標本における観察対象の粒子数として出力または保存するステップである、請求項１に記載の標本の分析方法。
14. 未知試料の標本を撮影した画像により、該標本中の針状結晶を分析する標本分析装置であって、
    複数の撮影条件により未知試料の標本を撮影して画像データを取得するようにされた画像取得部と、
    該画像取得部によって第１の撮影条件により取得した前記標本のある撮影域の第１の画像データを格納するための第１の画像記録部と、
    該画像取得部によって第２の撮影条件により取得した前記撮影域の第２の画像データを格納するための第２の画像記録部と、ここで、前記第１の撮影条件と前記第２の撮影条件は、撮影した画像上における前記針状結晶の像または像近傍のデータが互いに異なるデータとなる条件であり、
    前記第１の画像、前記第２の画像、または、前記標本の前記撮影域の第３の画像のいずれかの画像を原画像として、該原画像において背景の画素値と異なる画素値の領域の数を少なくとも計数してその結果を出力する粒子領域計数部と、
    前記第１の画像記録部および第２の画像記録部から読み込んだ第１の画像と第２の画像とのデータの差の差に基づく差分画像を生成し、該差分画像に基づいて、針状領域を選択する針状領域選択部と、
    選択された針状領域を計数して、その結果を出力する針状領域計数部と、
    少なくとも前記針状領域計数部又は前記粒子領域計数部のいずれかの出力をデータとして格納するための計数結果記録部と
    を備えてなる分析装置。
15. 前記針状領域計数部が各針状領域にラベリングを行って針状領域を計数し、該ラベリングに基づいて各針状領域に識別のための識別子を関連付けるものである、請求項１４に記載の針状領域の分析装置。
16. 請求項１５に記載の分析装置からの針状領域を識別するための情報と、該針状領域に関連する前記第１の画像、前記第２の画像、または、前記第３の画像の少なくともいずれかの画像との画像対応情報を格納する画像リレーション格納部と、
    針状領域の選択を受け付ける入力手段または所定の規則に応じて針状領域を選択する選択手段と、
    該画像リレーション格納部の前記画像対応情報を参照して、前記第１の画像記録部、前記第２の画像記録部、または、前記第３の画像を格納する記録部のいずれかから選択された針状領域に対応する前記画像を呼び出すデータ呼び出し部と、
    該画像を表示する表示部と
    を備えてなる標本のレビュー装置。
17. 請求項１５に記載の分析装置からの針状領域を識別するための情報と、該針状領域の前記標本における位置を特定するための位置情報とを対応させて格納する位置データ格納部と、
    針状領域の選択を受け付ける入力手段または所定の規則に応じて針状領域を選択する選択手段と、
    該該位置データ格納部から、選択された針状領域に対応する位置情報を呼び出すデータ呼び出し部と、
    呼び出された位置情報に応じて前記画像取得部に関連する標本観察装置を制御するようにされた観察装置制御部か、または、呼び出された位置情報を観察者に提示するための位置情報表示部の少なくともいずれかと
    を備えてなる標本のレビュー装置。
18. 演算装置と記憶装置とを備えるコンピュータによって請求項１〜１３のいずれかに記載の分析方法を実行するためのコンピュータプログラム。