JP2014082957A - 細胞計数装置及び細胞計数プログラム - Google Patents

Abstract

【課題】時系列的に得られた複数の細胞画像に基づいて、精度良く細胞数を計数する。
【解決手段】細胞計数装置１００において、画像取得部１２０は、時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得する。細胞認識部１３０は公知の手法により細胞の境界を特定し、この境界に基づいて初期細胞数計数部１４０は初期細胞数を決定する。母細胞検出部２００の円形状パターン検出部２１０は、細胞分裂直前の母細胞が球形状になることを利用して母細胞を検出し、新規母細胞検出部２３０は、検出された母細胞のうち、当該フレームで新規に出現した母細胞を検出する。細胞数計数部２５０は、初期細胞数に、新規に検出された母細胞の数を加算することで、細胞数を算出する。
【選択図】図２

Description

本発明は、細胞画像群に基づいて、細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムに関する。

いわゆるライフサイエンス分野においては、以前より、顕微鏡を用いて撮影された細胞の画像（以降、細胞画像と称する）に基づいた種々の細胞解析が行われている。例えばＥＳ細胞やｉＰＳ細胞等の幹細胞の研究においては、細胞分裂メカニズムの解明や、創薬開発等を目的とした細胞解析が行われている。より詳しくは、タイムラプス（微速度撮影）により時系列で撮像された複数の細胞画像（以降、細胞画像群と称する）に基づいて、細胞の分裂過程や形態的特徴変化等を観察し、細胞毎の性質の違いを調べるといった解析（以降、細胞解析と称する）が、以前より行われている。

上述したような細胞解析に関しては、従来では目視によって行われていた個々の細胞のスクリーニング等の煩雑な作業を、画像認識等の画像処理技術を応用することで自動化することが可能になりつつある。このような画像処理技術を応用すれば、細胞画像中に含まれる個々の細胞を自動的に認識し、その形態的特徴、細胞数及びその変化、並びに、個々の細胞を追跡することによる細胞の移動量等を把握することができる。特に細胞分裂に伴う細胞数の変化は、細胞の活性度合いを表す重要な指標となるものである。一方で、目視による細胞分裂の確認、細胞数計数及び確認記録作業は単調かつ非常に手間のかかる煩雑な作業である。したがって、画像認識技術及び画像追跡技術を応用した細胞数計数の自動化が望まれている。

ところで、細胞解析対象となる細胞画像の取得には、細胞を蛍光プローブ等の外部試薬で染色し、励起光を当てることで蛍光を得る蛍光顕微鏡が用いられる場合も多い。しかしながら、光毒性や外部試薬の影響を考慮して、細胞に対する負荷が少ない明視野顕微鏡により撮影された画像が用いられる場合もある。明視野顕微鏡の一種である位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡は、光の回折や干渉現象を利用した顕微鏡であり、異なる屈折率を持つ物質間を透過する光の位相差（光路差）をコントラストとして得ることができる顕微鏡である。したがって、このような顕微鏡は、透明な細胞や微生物等を対象物とした観察に適した顕微鏡である。以上のことから、明視野顕微鏡画像に基づく精度の良い細胞解析、又は細胞計数処理が望まれている。

一般に、細胞画像中から細胞の個々の領域を特定（以降、細胞認識と称する）し、細胞数を計数する場合、細胞画像から細胞境界線上にあるエッジ成分を所定のエッジ抽出処理等により抽出し、このエッジ成分を手がかりに細胞領域を切り分けることが行われている。しかしながら、明視野顕微鏡を用いて収集した細胞画像は、細胞内に含まれる細胞核等の内部構造に起因するエッジ成分と、細胞境界線上にあるエッジ成分とが混在し、精度良く細胞境界線上のエッジ成分だけを得ることは困難である。このため、正確に細胞領域を特定することは難しく、例えば一つの細胞領域が複数の細胞領域として誤認識されてしまったり、複数の細胞領域が一つの細胞領域として誤認識されてしまったり等の種々の誤認識が生じる可能性が大きい。その結果、正確な細胞数の計数は困難である。

明視野顕微鏡に基づく細胞画像から細胞数を精度良くカウントするための技術が提案されている。例えば特許文献１に開示されている技術は、明視野顕微鏡によるタイムラプス（微速度撮影）画像において細胞数をカウントすることで細胞の成育状況を観察する細胞観察装置に係るものである。この細胞観察装置は、細胞数のカウントにおいて、まずタイムラプス画像列の最初のフレームに写っている細胞の数を初期値として算出する。次に細胞観察装置は、タイムラプス画像列内においてハロ（アーティファクト）と呼ばれる強いコントラストが発生している細胞を分裂期にある細胞として検出し、これら細胞の追跡を行い細胞分裂が完了したか否かを確認する。続いて細胞観察装置は、細胞分裂が確認できた細胞の数を細胞数の初期値に順次加算していくことにより、観察中の細胞数の総数を更新する。

特開２０１０−００４７８８号公報

上述の特許文献１に係る技術で用いられているハロは、細胞の分裂期の細胞境界線上においてのみ現れるに限らず、分裂期にない細胞境界線上においても現れる。また細胞の分裂が進み多数の細胞が密集して隣り合う場合などにおいては、密着した細胞間の境界線上に強くハロが現れる。このため、ハロに基づいて分裂期の細胞を精度良く抽出することは難しい。

本発明は、時系列的に得られた複数の細胞画像に基づいて、精度良く細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムを提供することを目的とする。

前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、細胞計数装置は、時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得する画像取得部と、前記細胞画像群のうち所定の第１の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第１の数を決定する第１の計数部と、前記細胞画像群のうち前記第１の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第２の数を決定する母細胞検出部と、前記第１の数と前記第２の数とに基づいて、前記第１の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第２の計数部と、を備える。

前記目的を果たすため、本発明の一態様によれば、細胞計数プログラムは、時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得することと、前記細胞画像群のうち所定の第１の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第１の数を決定することと、前記細胞画像群のうち前記第１の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第２の数を決定することと、前記第１の数と前記第２の数とに基づいて、前記第１の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出することと、をコンピュータに実行させる。

本発明によれば、時系列的に得られた複数の細胞画像に基づいて、精度良く細胞数を計数するための細胞計数装置及び細胞計数プログラムを提供できる。

図１は、一実施形態に係る細胞計数装置を備えた顕微鏡システムの一構成例を示す図である。 図２は、一実施形態に係る細胞計数装置の一構成例を示す機能ブロック図である。 図３は、明視野顕微鏡を利用した撮影で得られる細胞分裂の過程にある細胞画像の一例を示す模式図である。 図４は、明視野顕微鏡を利用した撮影で得られる細胞分裂の過程にある細胞画像の一例を示す模式図である。 図５は、明視野顕微鏡を利用した撮影で得られる細胞分裂の過程にある細胞画像の一例を示す模式図である。 図６は、母細胞領域の検出のためのフィルタ処理において利用される円形状カーネルの一例を示す図である。 図７は、一実施形態に係る細胞計数装置による細胞計数処理の一例を示すフローチャートである。

以下、本発明の一実施形態に係る細胞計数装置及び細胞計数プログラムについて、図面を参照して説明する。本発明の一実施形態に係る細胞計数装置を備えた顕微鏡システムの構成例を図１に示す。この図に示されるように、顕微鏡システム１は、顕微鏡１０と、顕微鏡１０に設けられた撮像部２０と、本実施形態に係る細胞計数装置を含む制御装置３０と、入力装置４０と、表示装置５０とを備える。

顕微鏡１０は、例えば明視野顕微鏡である。顕微鏡１０は、細胞の画像が得られれば、蛍光顕微鏡や、共焦点レーザ走査型顕微鏡等でもよい。ただし、明視野顕微鏡であるとき、本実施形態に係る細胞計数装置は顕著な効果を奏する。顕微鏡１０は、明視野顕微鏡のうち、位相差顕微鏡や微分干渉顕微鏡であることが好ましい。撮像部２０は、例えばＣＣＤカメラ等であり、顕微鏡による細胞の拡大画像を撮像する。このようにして得られた細胞の画像を以降、細胞画像と称する。撮像部２０として、細胞画像が得られれば、フォトマル等を利用する共焦点レーザ走査型顕微鏡による画像取得が用いられてもよい。

制御装置３０は、例えばＰＣで構成される。制御装置３０は、ＣＰＵ３２と、メモリ３４と、ＨＤＤ３６と、インターフェース（Ｉ／Ｆ）３８とを含む。制御装置３０は、顕微鏡１０、撮像部２０、入力装置４０、表示装置５０に接続されている。制御装置３０は、撮像部２０の動作や、顕微鏡１０の動作を制御する。また、制御装置３０は、撮像部２０で得られた画像の画像処理を含む各種演算を行う。また、本実施形態に係る細胞計数装置は、制御装置３０が含むＣＰＵ３２、メモリ３４、ＨＤＤ３６等により実現されている。この細胞計数装置は、ＨＤＤ３６に記録された細胞計数プログラムに従ってＣＰＵ３２が演算を行うことで、撮像部２０から入力された顕微鏡１０により取得された細胞画像について、細胞の計数を行う。なお、メモリ３４は、必要な情報やＣＰＵ３２の演算結果等を一時記憶する。また、細胞計数装置は、Ｉ／Ｆ３８を介して、例えば記録メディアに記録された細胞画像や、ネットワークを介して取得された細胞画像について細胞の計数を行うこともできる。細胞計数装置による細胞計数結果は、Ｉ／Ｆ３８を介して外部の記録メディアやネットワークに出力されてもよい。細胞計数プログラムは、Ｉ／Ｆ３８を介して接続された記録媒体や、ネットワークを介して接続されたサーバに記録されていてもよい。

入力装置４０はキーボードやマウス等を含む。入力装置４０にはユーザの指示が入力される。入力装置４０は、入力されたユーザの指示を制御装置３０に出力する。表示装置５０は、例えば液晶ディスプレイといったディスプレイ等であり、制御装置３０による制御情報や、撮像部２０で取得された細胞画像等を表示する。また、表示装置５０は、本実施形態に係る細胞計数装置に係る設定情報や計数結果等の各種情報を表示する。この他に、制御装置３０には、プリンタなどの出力装置が接続されてもよい。

本実施形態に係る細胞計数装置について説明する。細胞計数装置１００の機能ブロック図を図２に示す。この図に示されるように、細胞計数装置１００は、制御部１１０と、画像取得部１２０と、細胞認識部１３０と、初期細胞数計数部１４０と、初期細胞数記録部１５０と、前フレーム画像記録部１６０と、細胞追跡部１７０と、消失細胞記録部１８０と、母細胞検出部２００と、新規母細胞記録部１９０と、細胞数計数部２５０とを備える。細胞計数装置１００には、例えば撮像部２０と、出力部３００とが接続されている。

制御部１１０は、当該細胞計数装置１００の各部に接続され、それら各部を統括的に制御するシステムコントローラである。画像取得部１２０は、例えば撮像部２０から例えば顕微鏡を用いて撮像された細胞画像を取得する。

撮像部２０は、例えばＣＣＤ等の撮像素子とＡ／Ｄ変換器とを有し、明視野顕微鏡の一種である位相差顕微鏡（Ｐｈａｓｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）に取り付けられたカメラである。このカメラは、位相差顕微鏡を利用した撮影で取得した細胞の位相差像をデジタル信号に変換し、例えば８ビット（２５６階調）のモノクロ原画像信号として出力する。このカメラは、カラー画像を出力するカメラ等でもよい。

撮像部２０は、タイムラプス（微速度撮影）によって、例えば所定の撮影周期によって決められた複数の時点において観察対象の細胞群を撮像する。この撮像によって、時系列に従って撮像された複数の細胞画像を含む細胞画像群が得られる。この細胞画像群が細胞計数装置１００に入力される。

前記位相差顕微鏡は、光の回折現象を利用した顕微鏡であり、異なる屈折率を持つ物質間を透過する光の位相差（光路差）をコントラストとして得ることができる顕微鏡である。したがって、位相差顕微鏡は、透明な細胞や微生物等を対象物とした観察に適している顕微鏡である。位相差顕微鏡を利用した撮影で取得した画像は、背景領域と試料との境界線上においてハロ（アーティファクト）と呼ばれる強いコントラストが発生するという特徴を有する。細胞画像においてこのハロは、主に背景領域と個々の細胞領域との境界部分にオーラ状の光として出現する。

なお、撮像部２０による撮影において、位相差顕微鏡の代わりに、例えば微分干渉顕微鏡（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｔｒａｓｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ;ＤＩＣ）等、他の明視野顕微鏡が利用されても勿論よい。

本実施形態においては、細胞分裂が始まる前から例えば３０分間隔で１回ずつ細胞群の撮影が行われるものとする。それらの撮影によって収集された複数の細胞画像を個々に識別可能とするために、個々の細胞画像に対しては、撮影された順番に画像番号が付与されるものとする。すなわち、例えば画像番号Ｎの細胞画像は、撮影開始からＮ×３０分後に撮影された画像信号である等とする。なお、撮影開始時点の細胞画像は、画像番号Ｎ＝０である。

細胞認識部１３０は、細胞計数装置１００に入力された各細胞画像に対して後述する“領域分割処理”を行って領域分割する。細胞認識部１３０は、この領域分割によって生じた各分割領域について、細胞領域であるか背景領域（非細胞領域）であるかを判定する。すなわち、細胞認識部１３０は、細胞画像中の個々の細胞が位置する細胞領域を特定する“細胞認識処理”を行う。細胞認識部１３０によって領域分割されて、各分割領域が細胞領域であるか背景領域であるかが特定された細胞画像である分割領域画像は、初期細胞数計数部１４０、前フレーム画像記録部１６０、及び細胞追跡部１７０に出力される。

上述の“領域分割処理”は、処理対象の細胞画像を構成する画素集合を、互いに特徴が類似しており、かつ空間的に近接している１つ以上の画素集合（領域）に分割する処理である。一般に、位相差顕微鏡を通して撮影した細胞画像において、細胞境界線上は輝度が高く、細胞内部は輝度が低い。本実施形態においては、この特徴に鑑みて、細胞認識部１３０は、公知の領域分割手法の一つであるウォーターシェッド法（分水嶺領域分割法）を用いた領域分割処理を行うことで、細胞画像を細胞領域毎に切り分ける（分割する）。ウォーターシェッド法によれば、画像の輝度値勾配に基づく分割が行われ、画像中の輝度値が高く輝度値勾配の高い部分、すなわち細胞の境界線部分を分割線にした分割がなされる。

上述した領域分割処理によって生じた個々の分割領域に対して、細胞認識部１３０は、公知のラベリング処理によって領域番号として領域ＩＤ＝Ｎｓ（Ｎｓは０以上の整数）を付与する。細胞認識部１３０は、領域ＩＤを画素値として領域毎に分割した細胞画像を生成する。ここで、背景領域は領域ＩＤ＝０を付与するものとしている。

なお、領域分割手法として利用される公知技術は、ウォーターシェッド法に限定されるものではなく、細胞領域を適切な精度で領域分割することができる技術であれば、どのような技術が適用されてもよい。

上述の“細胞認識処理”では、領域分割処理によって生じた各分割領域について、細胞領域であるか背景領域（非細胞領域）であるかが特定される。ここで、背景領域は、細胞領域と異なり、領域内の輝度値の変動が極度に少ない。そこで、細胞認識部１３０は、各分割領域内に含まれるエッジ強度の平均値等を算出し、その値が非常に小さい領域を背景領域であると特定することができる。

初期細胞数計数部１４０は、予め初期画像として設定された所定の画像番号Ｎｉの細胞画像について、分割領域画像に基づきカウントした分割領域画像中の細胞領域の数を計数し、初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）として決定する。初期細胞数計数部１４０は、決定した初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）を初期細胞数記録部１５０に出力する。初期細胞数記録部１５０は、初期細胞数計数部１４０が決定した初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）を記録する。また、初期細胞数記録部１５０は、細胞数計数部２５０の要求に応じて、記録した初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）を細胞数計数部２５０に出力する。ここで、できるだけ精度良く領域分割され、正確に細胞数がカウントされるように、画像番号Ｎｉは、細胞数が少なく、かつ細胞が分散して位置している等、条件の良い画像番号が選択されることが望ましい。本実施形態においては、画像番号Ｎｉ＝０（撮影開始時の細胞画像に相当）とする。撮影開始時は、細胞数が少なく分散して位置しているので、初期細胞数を計数するのに適している。このように、初期細胞数計数部１４０は、細胞画像群のうち所定の第１の時点において撮像された細胞画像中に存在する細胞数を計数して第１の数を決定する第１の計数部として機能する。ここで、例えば初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）は、第１の数に相当する。

前フレーム画像記録部１６０は、現時点で処理対象としている現フレームの細胞画像（画像番号Ｎｒの細胞画像）に対する、１フレーム過去に取得した細胞画像（例えば画像番号Ｎｒ−１の細胞画像）についての領域分割画像を記録する。前フレーム画像記録部１６０は、撮像部２０による撮像で細胞画像が新たに取得される毎に、所定のタイミングで領域分割画像を更新する。前フレーム画像記録部１６０が記録した過去フレームの細胞画像の領域分割画像は、後述する細胞追跡部１７０による処理が実行される前に、細胞追跡部１７０へ出力される。前フレーム画像記録部１６０は、細胞追跡部１７０による処理が終了した後に、細胞認識部１３０から出力された時点において処理対象となっている細胞画像（画像番号Ｎｒの細胞画像）についての領域分割画像を、上書きして更新する。

細胞追跡部１７０は、細胞認識部１３０から現フレームの細胞画像（画像番号Ｎｒの細胞画像）の領域分割画像を読み込むと共に、前フレーム画像記録部１６０から過去フレームの細胞画像（例えば１フレーム前の画像番号Ｎｒ−１の細胞画像）の領域分割画像を読み込む。細胞追跡部１７０は、前フレームの領域分割画像と現フレームの領域分割画像とを比較することで、現フレームの領域分割画像中の領域から、前フレームの各領域の移動先に相当する領域を特定する追跡処理を行う。具体的には、細胞追跡部１７０は、前フレームの領域と現フレームの領域との間で類似度を評価し、最も類似した領域同士を移動前後の領域として特定する。本実施形態では、類似度の評価に各領域同士の重心間距離が用いられており、重心間距離が小さい場合、類似性が高いと評価される。なお、類似度の評価には、重心間距離に限らず、各領域に対応する細胞画像上の画素値に基づき算出した領域内の輝度平均値、勾配、領域形状等どのような評価手段も適用され得る。

一般に、細胞はフレーム間で不規則に移動して位置を変える。このため、細胞の移動の仕方によっては、現フレーム画像においては細胞が画面外へ移動し、現フレーム中から対応する領域が見つからないことが起こり得る。細胞追跡部１７０は、領域追跡結果に基づき、細胞が撮影画角から外れ画面枠外へ移動し現フレームにおいて対応する領域が見つからない（消失する）ケースをカウントし、消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）を決定する。細胞追跡部１７０は、消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）を消失細胞記録部１８０に出力する。消失細胞記録部１８０は、細胞追跡部１７０から入力された消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）を画像番号Ｎｒと共に記録する。また、消失細胞記録部１８０は、細胞数計数部２５０からの要求に応じて、消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）を細胞数計数部２５０に出力する。このように、細胞追跡部１７０は、細胞画像群に含まれる各細胞の位置を時系列に沿って追跡し、細胞画像の画像範囲外へ移動する消失細胞を検出して計数し、第３の数を決定する細胞追跡部として機能する。ここで、例えば消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）は、第３の数に相当する。

一般に細胞分裂の結果生じる２つ以上の細胞を“娘細胞”と呼称する。また、細胞分裂前の細胞を対義的に“母細胞“と呼称する。母細胞検出部２００は、分裂直前の状態にある母細胞のうち新規に出現した母細胞を検出する（ここで、過去フレームにおいて検出済みの母細胞は、現フレームにおける検出対象には含まない）。一般に、細胞の形状は、細胞周期（細胞分裂から次の分裂が起きるまでの過程）のうちＭ期（細胞分裂が行われる期間）の直前の段階において、急激に丸みを帯び球形状に変形すると共に厚みを増す。

明視野顕微鏡を利用して撮影した細胞分裂の過程にある細胞画像の一例の模式図を図３乃至図５に示す。これら図を参照して細胞分裂について説明する。母細胞５１０は、図３に示す状態から図４に示す状態へ遷移する。このとき、とりわけ位相差顕微鏡を利用した撮影で取得された細胞画像においては、当該細胞領域の境界線近傍にハロ（アーティファクト）が強く現れ、円形状を示す母細胞境界線（図４における黒太線で描かれた円５１１）上の輝度値が増す。その後、この母細胞５１０は細胞分裂を行い、図５に示すように２個の娘細胞５２１及び娘細胞５２２が生じる。

本実施形態において、母細胞検出部２００は、母細胞が細胞分裂直前の段階において略円形状を呈するという性質に鑑みて、画像中から円形状をパターン認識することで新規に出現した分裂直前の母細胞を検出する。より詳しくは、現フレームにおける細胞画像中に存在する細胞分裂直前の母細胞領域を特定した後、これらの母細胞領域の中で、前フレーム画像中で特定した母細胞位置との比較を行い、新規に発生した母細胞を特定する。すなわち、検出対象としている分裂直前の母細胞には、前フレームにおいて検出済みで現フレームにおいても継続して存在する母細胞は含まれず、新たに円形状に変形した出現直後の母細胞のみが含まれる。

母細胞検出部２００は、円形状パターン検出部２１０と、前フレーム母細胞位置記録部２２０と、新規母細胞検出部２３０とを含む。円形状パターン検出部２１０には、画像取得部１２０が接続されている。円形状パターン検出部２１０は、新規母細胞検出部２３０に接続されている。新規母細胞検出部２３０と前フレーム母細胞位置記録部２２０は相互に接続されている。新規母細胞検出部２３０は、新規母細胞記録部１９０に接続されている。

以下、母細胞検出処理の詳細について説明する。まず画像取得部１２０によって取得された現フレームにおける細胞画像（画像番号Ｎｒの細胞画像）は円形状パターン検出部２１０に転送される。円形状パターン検出部２１０は、円形状パターン検出処理により、細胞画像中の円形状をなす母細胞の位置Ｐ（Ｎｒ）を特定する。

円形状パターン検出処理について説明する。円形状パターン検出部２１０では、細胞分裂直前の細胞の円形状をモデル化して作成した“円形状カーネル”が予め設定されている。円形状パターン検出部２１０は、この円形状カーネルを利用して細胞画像中の全画素を対象としたフィルタ処理を行い、その出力の値を評価することで、細胞画像中に存在する略円形状を呈する母細胞領域を検出する。

母細胞領域の検出のためのフィルタ処理において利用する円形状カーネルの一例を図６に示す。同図に示す“Ｒ１”は円形状カーネルの内側半径を示しており、同図に示す“Ｒ１＋Ｗ”は円形状カーネルの外側半径を示している。内側半径Ｒ１は、細胞画像中に存在する平均的な母細胞領域の大きさより若干小さめの寸法に設定されており、内外半径差Ｗは、母細胞境界線上に現れるハロの平均的な幅より若干大きめに設定されている。内側半径Ｒ１及び内外半径差Ｗは、いずれも予め設定されるパラメータである。円形状カーネル自体の“縦×横”の寸法は、例えば“２×（Ｒ１＋Ｗ）画素”である。

本実施形態においては、前記円形状カーネルにおいて、“内側半径Ｒ１以上で外側半径（Ｒ１＋Ｗ）以下”の領域内のフィルタ係数について１が設定され、それ以外のフィルタ係数には０が設定される。円形状パターン検出部２１０は、細胞画像に対して、まず上述した構成の円形状カーネルに基づくフィルタ処理を行う。このフィルタ処理の出力値は、円形状カーネルにおいて“フィルタ係数＝１”の領域内に位置する画素の画素値を積算した“輝度累積値”をフィルタ係数合計で除算した“輝度平均値”にあたる。円形状パターン検出部２１０は、このフィルタ処理を、細胞画像を構成する全画素について実行し、それぞれの画素について輝度平均値を算出する。さらに円形状パターン検出部２１０は、輝度平均値が予め設定した閾値より大きく、かつ、近傍画素の輝度平均値よりも高い値を示す（ピーク値を示す）画素を検出する。円形状パターン検出部２１０は、この検出した画素の位置が略円形状を呈する母細胞領域の中心座標、すなわち母細胞位置であると特定する。円形状パターン検出部２１０は、検出した母細胞位置Ｐ（Ｎｒ）を新規母細胞検出部２３０に転送する。

なお、分裂直前の母細胞においては、円形状にハロが出現する。そこで、このハロの高い輝度値も利用して母細胞を検出することもできる。このように高い輝度値を利用することにより、母細胞を検出する精度がさらに向上し得る。

母細胞検出処理では、現フレームにおける処理において、１フレーム前の細胞画像に基づいて検出した母細胞位置が利用される。そこで、前フレーム母細胞位置記録部２２０は、現フレームに対して１フレーム前の母細胞位置を逐次記録する。

新規母細胞検出部２３０は、まず前フレーム母細胞位置記録部２２０から、前フレーム処理時に予め記録しておいた、１フレーム前の細胞画像中から検出した母細胞位置Ｐ（Ｎｒ−１）を取得する。次に新規母細胞検出部２３０は、現フレームにおける母細胞位置Ｐ（Ｎｒ）と前フレームにおける母細胞位置Ｐ（Ｎｒ−１）とを比較し、前フレーム母細胞位置Ｐ（Ｎｒ−１）から所定の閾値以上の距離にある現フレームにおける母細胞位置を新規母細胞位置Ｐ´（Ｎｒ）として抽出する。すなわち、前フレーム母細胞位置Ｐ（Ｎｒ−１）から所定の閾値未満の距離にある現フレームにおける母細胞位置Ｐ（Ｎｒ）は、前フレームから継続して存在する既存の母細胞であるとみなして、新規母細胞位置Ｐ´（Ｎｒ）から除外する。新規母細胞検出部２３０は、抽出した新規母細胞位置Ｐ´（Ｎｒ）の数である新規母細胞数Ｃｐ（Ｎｒ）を決定し、新規母細胞数Ｃｐ（Ｎｒ）を現フレーム画像番号Ｎｒと共に新規母細胞記録部１９０へ転送する。

また、新規母細胞検出部２３０は、現フレーム母細胞位置Ｐ（Ｎｒ）を前フレーム母細胞位置記録部２２０に転送する。前フレーム母細胞位置記録部２２０は、新規母細胞検出部２３０における次フレームでの処理において前フレーム母細胞位Ｐ（Ｎｒ−１）として利用するために、新規母細胞検出部２３０より転送された母細胞位置Ｐ（Ｎｒ）を上書き記録する。このように、例えば母細胞検出部２００は、細胞画像群のうち第１の時点以降に撮像された細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第２の数を決定する母細胞検出部として機能する。ここで、例えば新規母細胞数Ｃｐ（Ｎｒ）は、第２の数に相当する。

新規母細胞記録部１９０は、新規母細胞検出部２３０から入力された新規母細胞数Ｃｐ（Ｎｒ）を記録する。また、新規母細胞記録部１９０は、細胞数計数部２５０からの要求に応じて、新規母細胞数Ｃｐ（Ｎｒ）を細胞数計数部２５０に出力する。

細胞数計数部２５０は、初期細胞数記録部１５０によって記録された初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）と、消失細胞記録部１８０によって記録された画像番号ｎ（ｎはＮｉからＮｒまで）の消失細胞数Ｃｅ（ｎ）と、新規母細胞記録部１９０によって記録された画像番号ｎ（ｎはＮｉからＮｒまで）の新規母細胞検出数Ｃｐ（ｎ）とに基づき、現フレームにおける細胞画像中に存在する細胞数Ｃtotal（Ｎｒ）を下記式（１）に従い算出する。

細胞数計数部２５０は、算出した細胞数Ｃtotal（Ｎｒ）を出力部３００に転送する。このように、細胞数計数部２５０は、第１の数と第２の数とに基づいて、第１の時点以降の任意の細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第２の計数部として機能する。ここで、例えば初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）は第１の数に相当し、新規母細胞数Ｃｐ（Ｎ）は第２の数に相当する。出力部３００は、例えば、現フレーム画像番号Ｎｒと共にその際の細胞数Ｃtotal（Ｎｒ）を所定の記録媒体に書き込む。

本実施形態に係る細胞計数装置１００による細胞計数処理の一例を図７に示すフローチャートを参照して説明する。ステップＳ１０において細胞計数装置１００は、微速度撮影によって撮像された細胞画像群を取得する。ここで、微速度撮影によって収集された細胞画像群とは、所定の撮影周期に従って複数の時点において観察対象の細胞群を撮像した複数の細胞画像である。なお、細胞計数装置１００は、全ての細胞画像を含む細胞画像群を一度に取得してもよいし、細胞画像群を構成する細胞画像を、逐次順に取得してもよい。

ステップＳ２０において細胞計数装置１００は、細胞画像群の中から時系列に従って順に、解析の対象とする細胞画像を取得する。ステップＳ３０において細胞計数装置１００は、細胞画像中の個々の細胞が位置する細胞領域を特定する“細胞認識処理”を行う。

ステップＳ４０において細胞計数装置１００は、現フレームに係る画像番号Ｎが、初期画像番号Ｎｉであるか否かを判定する。ここで、本実施形態では、例えば初期画像番号Ｎｉ＝０である。画像番号Ｎが初期画像番号Ｎｉでないとき、処理はステップＳ６０に進む。一方、画像番号Ｎが初期画像番号Ｎｉであるとき、処理はステップＳ５０に進む。ステップＳ５０において細胞計数装置１００は、初期画像番号Ｎｉに対応する分割領域画像に基づいて分割領域画像中の細胞領域の数をカウントし、その結果を初期細胞数Ｃinit（Ｎｉ）として記録する。

ステップＳ６０において細胞計数装置１００は、現フレームにおける画像番号Ｎが撮影開始から２枚目以降を表す番号であるか否かを判定する。２枚目以降でないと判定されたとき、処理はステップＳ１００に進む。一方、２枚目以降であると判定されたとき、処理はステップＳ７０に進む。ステップＳ７０において細胞計数装置１００は、現フレーム画像番号Ｎｒの領域分割画像と前フレーム画像番号Ｎｒ−１の領域分割画像とを比較し、細胞の移動を追跡する追跡処理を行う。すなわち、前フレーム画像番号Ｎｒ−１の各領域の移動先に相当する領域を、現フレーム画像番号Ｎｒの領域分割画像中の領域から特定する。

ステップＳ８０において細胞計数装置１００は、ステップＳ７０における領域追跡結果に基づいて、画面外へ移動して消失したために、前フレーム画像番号Ｎｒ−１にはあるが現フレーム画像番号Ｎｒにおいて対応する領域が見つからない細胞が存在するか否かを判定する。画面外に移動した細胞がないとき、処理はステップＳ１００に進む。一方、画面外に移動した細胞があるとき、処理はステップＳ９０に進む。ステップＳ９０において細胞計数装置１００は、細胞が現フレーム画像番号Ｎｒにおいて消失するケースをカウントし、その結果である消失細胞数Ｃｅ（Ｎｒ）を画像番号Ｎｒと関連付けて記録する。

ステップＳ１００において細胞計数装置１００は、次フレーム画像番号Ｎｒ＋１における処理時に用いるために、現フレーム画像番号Ｎｒに対する領域分割画像を前フレーム画像として記録する前フレーム画像記録処理を行う。ステップＳ１１０において細胞計数装置１００は、現フレーム画像番号Ｎｒにおける細胞画像中から円形状のパターンを認識することで分裂直前の母細胞を検出する母細胞検出処理を行う。ステップＳ１２０において細胞計数装置１００は、予め記録されている前フレーム画像番号Ｎｒ−１における母細胞位置と現フレーム画像番号Ｎｒにおける母細胞位置との比較により、新規に発生した母細胞を検出する新規母細胞検出処理を行う。ここで、新規母細胞には、前フレームにおいて検出済みであり現フレームにおいても継続して存在する母細胞は含まれず、新たに円形状に変形した出現直後の母細胞のみが含まれる。

ステップＳ１３０において細胞計数装置１００は、新規母細胞が検出されたか否かを判定する。新規母細胞が検出されていないとき、処理はステップＳ１５０に進む。一方、新規母細胞が検出されたと判定されたとき、処理はステップＳ１４０に進む。ステップＳ１４０において細胞計数装置１００は、ステップＳ１２０において検出した新規母細胞の数を記録する。

ステップＳ１５０において細胞計数装置１００は、上記式（１）に基づき現フレーム画像番号Ｎｒにおける細胞数Ｃtotal（Ｎｒ）を算出する。細胞計数装置１００は、現フレーム画像番号Ｎｒと算出された細胞数Ｃtotal（Ｎｒ）とを出力する。

ステップＳ１６０において細胞計数装置１００は、次フレーム画像番号Ｎｒ＋１の細胞画像が存在するか否かを判定する。次フレームの画像が存在するとき、処理はステップＳ２０に戻る。一方、次フレーム存在しない場合、処理は終了する。

本実施形態によれば、例えば明視野顕微鏡を用いて取得された細胞画像群に基づいて、精度良く細胞数が計数され得る。本実施形態では、細胞が分裂の直前において球形に変形することに基づいて母細胞の検出が行われている。したがって、本実施形態によれば、ハロ等を利用した輝度値に基づいて母細胞が検出されるよりも精度良く母細胞が検出され得る。また、細胞の形状が不規則であることによる母細胞の検出の困難さも排除される。また、本実施形態では、細胞が移動して視野から外れる場合も考慮されており、消失する細胞数が細胞数から減算されている。以上のことから、本実施形態によれば、精度良く細胞数が計数され得る。

なお、上述の実施形態では、円形をした母細胞が検出されたら、細胞数が増加したと計数されているが、母細胞が２つの娘細胞に分裂したことが確認されてから、その後に、細胞数が増加したとされるように設定されてもよい。このようにすると、母細胞が分裂しないことにより発生する細胞計数の誤差を低減することができる。また、母細胞が２つの娘細胞に分裂後、再び１つの細胞に融合することもあるので、このような場合に細胞数の増加が計数されないように設定されてもよい。

また、本実施形態では、視野外から視野内に移動する細胞は考慮されていないが、これは、細胞分裂を繰り返し、細胞数が増えているときには、視野内から視野外に移動する細胞が多く、視野外から視野内に移動する細胞はほとんどないことに基づく。視野外から視野内に移動する細胞が多い状況で本細胞計数装置１００が用いられる場合、母細胞と無関係に新たに出現した細胞を検出して、視野外から視野内に移動する細胞を考慮する構成とされてもよい。

なお、図７のフローチャートで示された処理順序は一例であり、趣旨から逸脱しない範囲で処理順序は適宜交換可能である。例えばステップＳ６０乃至ステップＳ９０の処理とステップ１００乃至ステップＳ１４０の処理との順序は交換可能である。

以上、本発明の一実施形態を説明したが、本発明は上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で、種々の変形及び応用が可能なことは勿論である。上述した実施形態には種々の段階の発明が含まれており、開示した複数の構成要件の適当な組み合わせにより種々の発明が抽出され得る。例えば、実施形態に示す全構成要件からいくつかの構成要件が削除されても、発明が解決しようとする課題の欄で述べた課題が解決でき、発明の効果の欄で述べられている効果が得られる場合には、この構成要件が削除された構成も発明として抽出され得る。

１…顕微鏡システム、１０…顕微鏡、２０…撮像部、３０…制御装置、３２…ＣＰＵ、３４…メモリ、３６…ＨＤＤ、３８…インターフェース、４０…入力装置、５０…表示装置、１００…細胞計数装置、１１０…制御部、１２０…画像取得部、１３０…細胞認識部、１４０…初期細胞数計数部、１５０…初期細胞数記録部、１６０…前フレーム画像記録部、１７０…細胞追跡部、１８０…消失細胞記録部、１９０…新規母細胞記録部、２００…母細胞検出部、２１０…円形状パターン検出部、２２０…前フレーム母細胞位置記録部、２３０…新規母細胞検出部、２５０…細胞数計数部、３００…出力部。

Claims (8)

1. 時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得する画像取得部と、
   前記細胞画像群のうち所定の第１の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第１の数を決定する第１の計数部と、
   前記細胞画像群のうち前記第１の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第２の数を決定する母細胞検出部と、
   前記第１の数と前記第２の数とに基づいて、前記第１の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出する第２の計数部と、
   を備える細胞計数装置。
2. 前記母細胞検出部は、円形の細胞を前記細胞分裂直前の前記母細胞として検出する請求項１に記載の細胞計数装置。
3. 前記母細胞検出部は、さらに細胞境界線上の輝度値に基づいて前記細胞分裂直前の前記母細胞を検出する請求項１又は２に記載の細胞計数装置。
4. 前記細胞画像群に含まれる各細胞の位置を前記時系列に沿って追跡し、前記細胞画像の画像範囲外へ移動する消失細胞を検出して計数し、第３の数を決定する細胞追跡部をさらに備え、
   前記第２の計数部は、さらに第３の数に基づいて前記現細胞数を算出する、
   請求項１乃至３のうち何れか１項に記載の細胞計数装置。
5. 前記第１の時点は、前記細胞画像が最初に撮像された時点である請求項１乃至４のうち何れか１項に記載の細胞計数装置。
6. 前記細胞画像は、明視野顕微鏡により取得された画像である請求項１乃至５のうち何れか１項に記載の細胞計数装置。
7. 前記第１の計数部は、前記第１の時点における前記細胞数を前記第１の数とし、
   前記母細胞検出部は、各々の前記細胞画像において、新たに発生した前記母細胞の細胞数を前記第２の数とし、
   前記第２の計数部は、前記第１の数に前記細胞画像毎に得られた前記第２の数を加算することで前記現細胞数を算出する、
   請求項１乃至６のうち何れか１項に記載の細胞計数装置。
8. 時系列に沿って撮像された生細胞の経時的変化を表す複数の細胞画像を含む細胞画像群を取得することと、
   前記細胞画像群のうち所定の第１の時点において撮像された前記細胞画像中に存在する細胞数を計数して第１の数を決定することと、
   前記細胞画像群のうち前記第１の時点以降に撮像された前記細胞画像中から、細胞の形状に基づいて、細胞分裂直前の母細胞を検出して計数し、第２の数を決定することと、
   前記第１の数と前記第２の数とに基づいて、前記第１の時点以降の任意の前記細胞画像の取得時点における現細胞数を算出することと、
   をコンピュータに実行させるための細胞計数プログラム。

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