JP2008249806A - 焦点位置決め冶具 - Google Patents

Abstract

【課題】焦点位置決め冶具において、共焦点蛍光顕微鏡の所定被検物位置に配置された焦点位置決め冶具に対してこの共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点がより正確に位置決めされるようにする。
【解決手段】励起光Ｌｅの照射を受けて蛍光Ｌｋを発する蛍光基板１０と、励起光Ｌｅを透過させ蛍光Ｌｅを遮断する蛍光基板１０上に配されたマスクフィルタ２０とを備え、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂが上記焦点位置決め冶具１００に対して正しく位置決めされたときにのみ、蛍光基板１０から発せられた蛍光Ｌｋがマスクフィルタ２０に形成された開口部２１を通して共焦点蛍光顕微鏡２００で検出されるように焦点位置決め冶具１００を構成する。この焦点位置決め冶具１００を共焦点蛍光顕微鏡２００の所定被検物位置Ｐｏに配置して、開口部２１を通った蛍光Ｌｅが共焦点蛍光顕微鏡２００で検出されるように上記物点側焦点Ｆｂの位置を定める。
【選択図】図１

Description

本発明は、焦点位置決め冶具に関し、詳しくは、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置決めするために用いられる焦点位置決め冶具に関するものである。

従来より、被検物上の照明された１点から発せられる光をこの１点と光学的に共役なピンホールに結像させ、このピンホールを通して被検物上の１点の状態を検出する共焦点顕微鏡が知られている（特許文献１参照）。このような共焦点顕微鏡は、物点側の焦点（以後、物点側焦点という）を被検物上の１点に位置させ、この物点側焦点と共役な関係にある像点側焦点をピンホールに位置させて被検物上の１点の状態を検出するものである。

また、ガラス板上にマイクロ流路が形成されたマイクロ流路基板を用い、マイクロ流路内に収容された試料流体を電気泳動させながら励起光の照射を受けた試料流体中の測定対象物質から発せられる蛍光を検出して測定対象物質を分析する分析手法が知られている。

上記測定対象物質は、励起光の照射を受けると励起されて蛍光を発するように処理されたものである。

また、上記マイクロ流路基板は、例えば、ガラス板から構成されており、ガラス板に形成されたマイクロ流路（キャピラリーともいう）を有するものである。

上記マイクロ流路は、幅方向に１００μｍ、厚み方向に１５μｍの程度の大きさからなる溝が１方向に延びるように形成されており、上記分析手法においては、この微小な領域から発せられる蛍光が検出される。

ここで、上記共焦点顕微鏡は、厚みの小さい微小領域から発せられる光を正確に検出するのに適しているので、この共焦点顕微鏡を上記マイクロ流路に収容された試料流体から発せられる蛍光の検出に適用することが検討されている。

上記測定対象物質から発せられる蛍光を検出するには、測定対象物質を含む試料流体がマイクロ流路内に収容されているマイクロ流路基板を所定被検物位置に配置する。そして、蛍光を検出するための共焦点顕微鏡である共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点をマイクロ流路基板に対して移動させつつ、励起光の照射によりマイクロ流路基板から蛍光が発せられる位置を探し出し、蛍光が発せられる位置に物点側焦点を位置させてマイクロ流路に共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置決めすることが考えられる。

そのような場合には、測定対象物質の経時変化や励起光の繰り返し照射による測定対象物質の劣化によりこの測定対象物質から発せられる蛍光の発光光量が低下してしまうため、位置決めを行う度にマイクロ流路に収容される測定対象物質を入れ換えなければならない。そのため、マイクロ流路基板を用いる代わりに、励起光の照射を受けて蛍光を発する蛍光物質からなる蛍光基板を備えた焦点位置決め冶具を用いる方式も知られている（特許文献２参照）。

この焦点位置決め冶具は、マイクロ流路基板と同形状の蛍光基板と、マイクロ流路基板上のマイクロ流路以外の領域に対応する蛍光基板上の領域を覆う金属膜マスクとから構成されたものである。なお、この金属膜マスクは、励起光および蛍光を遮断するものである。

上記焦点位置決め冶具を共焦点蛍光顕微鏡の所定被検物位置に配置し、励起光の照射を受けて蛍光が発せられる位置に共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置決めすることにより、間接的に、所定被検物位置に配置されたマイクロ流路基板のマイクロ流路に共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点の位置を合わせることができる。
特開２００３−２２８００４号公報 特開２００２−１８２３２３号公報

ところで、上記のような焦点合せ冶具を用いると、励起光の照射を受けた蛍光基板から発せられる蛍光の光強度が、金属膜マスクで反射される励起光の光強度に対して極めて小さくなる。そのため、マイクロ流路に対応する領域である蛍光基板上の金属膜マスクが設けられていない開口部に、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点が位置決めされた状態であっても、その周辺に配された金属膜マスクで反射された励起光の一部が上記共焦点蛍光顕微鏡の備える励起光カットフィルタを通過して蛍光とともに検出されることがある。そのような場合には、マイクロ流路に対する共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点の位置決め精度が低下してしまう。

なお、このような問題は、励起光の照射を受けて蛍光を発する領域に共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置させるときに一般に生じる問題である。

本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであり、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点のより正確な位置決めに用いることができる焦点位置決め冶具を提供することを目的とするものである。

本発明の焦点位置決め冶具は、励起光の照射を受けて蛍光を発する蛍光基板と、この蛍光基板上に配された、開口部を有するマスクフィルタとを備え、共焦点蛍光顕微鏡における所定被検物位置に配置されてこの共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置決めするために用いられる焦点位置決め冶具であって、マスクフィルタが励起光を透過させ蛍光を遮断するものであり、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点が焦点位置決め冶具に対して正しく位置決めされたときにのみ蛍光基板から発せられた蛍光が開口部を通して共焦点蛍光顕微鏡で検出されるように構成されたものであることを特徴とするものである。

前記蛍光基板は、励起光の照射を受けて励起光の波長よりも長波長の蛍光を発するものとすることができる。

前記蛍光基板は、ルビー材料とすることができる。このルビー材料は、酸化アルミニウムを主成分とする結晶である。純粋な酸化アルミニウムの結晶は無色であるが、ルビー材料は微量のクロム（Cr）が加わることにより赤色を呈するようになったものである。

前記マスクフィルタは、誘電体多層膜とすることができる。

前記位置決めは、物点側焦点の位置を、焦点位置決め冶具に対して水平方向およびこの水平方向と直交する垂直方向へ相対的に移動させて実施されるものとすることができる。

前記共焦点蛍光顕微鏡は、マイクロ流路中を電気泳動せしめられる試料流体から発せられる蛍光を検出するものとすることができる。

本発明の焦点位置決め冶具によれば、マスクフィルタを励起光を透過させ蛍光を遮断するものとし、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点が焦点位置決め冶具に対して正しく位置決めされたときにのみ蛍光基板から発せられた蛍光が開口部を通して共焦点蛍光顕微鏡で検出されるようにしたので、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を励起光の照射を受けて蛍光を発する領域へより正確に位置決めすることができる。

すなわち、焦点合せ冶具の開口部の周辺に配されたマスクフィルタによる励起光の反射を抑制することができるので、開口部から発せられた蛍光が検出されるときの励起光の混入を抑制することができる。これにより、開口部に対する物点側焦点の位置決めをより正確に行うことができる。

前記蛍光基板をルビー材料とすれば、蛍光基板の経時変化や励起光の繰り返し照射によって生じる蛍光の発光光量の減少を防止することができ、継続的な使用における蛍光基板からの蛍光の発光光量の減少を防ぐことができる。

前記マスクフィルタを誘電体多層膜とすれば、より確実に励起光を透過させ蛍光を遮断することができる。

以下、本発明の実施の形態について、図面を用いて説明する。図１は共焦点蛍光顕微の所定被検物位置に配置された本発明の焦点位置決め冶具を示す図、図２は上記焦点位置決め冶具を通る励起光および蛍光の光路を示す拡大断面図、図３は縦軸を透過率εと光強度Ｅを兼ねるものとし、横軸を波長λに定めた座標上にマスクフィルタの分光透過特性と励起光および蛍光の光強度の波長分布を示す図である。

図示の焦点位置決め冶具１００は、共焦点蛍光顕微鏡２００における所定被検物位置Ｐｏに配置されてこの共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側の焦点（以後、物点側焦点Ｆｂという）を位置決めするために用いられるものである。

上記焦点位置決め冶具１００は、励起光Ｌｅの照射を受けて蛍光Ｌｋを発する蛍光基板１０と、蛍光基板１０上に配されたマスクフィルタ２０とを備えている。マスクフィルタ２０は、上記励起光Ｌｅを透過させ上記蛍光Ｌｋを遮断する部材で形成されたものでありあり、開口部２１を有するものである。上記マスクフィルタ２０は、蛍光基板１０上の励起光Ｌｅが入射する側に配置されている。

上記焦点位置決め冶具１００は、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂが焦点位置決め冶具１００に対して正しく位置決めされたときにのみ、蛍光基板１０から発せられた蛍光Ｌｋが開口部２１を通して共焦点蛍光顕微鏡２００で検出されるように構成されている。

上記蛍光基板１０は、ルビー材料からなるものであり、励起光Ｌｅの照射を受けてこの励起光Ｌｅの波長よりも長波長の蛍光Ｌｋを発するものである。ここでは、励起光Ｌｅのピーク波長は６３５ｎｍであり、この励起光Ｌｅの照射を受けた蛍光基板１０から発せられる蛍光Ｌｋのピーク波長は６７０ｎｍである。

図３に示すように、マスクフィルタ２０は、曲線ｆｍで表されるフィルタ特性を有するものであり、図中符号Ｌｅで示すピーク波長６３５ｎｍの励起光Ｌｅを透過させ、図中符号Ｌｋで示すピーク波長６７０ｎｍの蛍光Ｌｋを遮断するものである。

なお、上記図３では、曲線ｆｍについては縦軸として透過率εを適用し、図中符号Ｌｅで示す励起光の光強度の波長分布と図中符号Ｌｋで示す蛍光の光強度の波長分布については縦軸として光強度Ｅを適用する。

上記共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂの位置決めは、この物点側焦点Ｆｂの位置を焦点位置決め冶具１００に対して水平方向（図１中矢印Ｘ−Ｙ方向）および水平方向と直交する垂直方向（図１中矢印Ｚ方向）に相対的に移動させて実施されるものである。

次に、上記共焦点蛍光顕微鏡２００の構成について説明する。

共焦点蛍光顕微鏡２００は、所定被検物位置Ｐｏへ励起光Ｌｅを照射する励起光照射部２１０と、所定被検物位置Ｐｏにおいて上記励起光Ｌｅの照射受けた被検物から発せられた蛍光Ｌｋを検出する蛍光検出部２３０とから構成されている。

励起光照射部２１０は、レーザ光Ｌｚを射出するレーザ光源２１２と、レーザ光源２１２から射出されたレーザ光Ｌｚを収束させる収束レンズ２１４と、収束レンズ２１４を通ったレーザ光Ｌｚ中の不要な波長成分を遮断して上記励起光Ｌｅの波長範囲内の光成分を透過させる波長フィルタ２１６と、上記波長フィルタ２１６によって抽出された励起光Ｌｅを反射させるダイクロイックミラー２１８と、ダイクロイックミラー２１８で反射された励起光Ｌｅを焦点位置決め冶具１００上の１点に集光させる物点側集光レンズ２２２とを備えている。

上記ダイクロイックミラー２１８は、励起光Ｌｅを反射し蛍光Ｌｋを透過させるものである。

なお、励起光照射部２１０と蛍光検出部２３０は、上記ダイクロイックミラー２１８および物点側集光レンズ２２２を共用している。

蛍光検出部２３０は、上記集光された励起光Ｌｅの照射を受けた被検物から発せられる蛍光Ｌｋを集光する物点側集光レンズ２２２と、物点側集光レンズ２２２から射出された蛍光Ｌｋを透過させ励起光Ｌｅを反射させるダイクロイックミラー２１８と、このダイクロイックミラー２１８を通った蛍光Ｌｋに混入したノイズ光を遮断し蛍光Ｌｋを通すノイズ光カットフィルタ２３２と、ピンホールＨｏが形成されたピンホール板２３６と、ノイズ光カットフィルタ２３２を通った蛍光Ｌｋをピンホール板２３６上に形成されたピンホールＨｏに集光させる像点側集光レンズ２３４と、ピンホールＨｏを通った蛍光Ｌｋを検出する検出部２３８とを備えている。

物点側集光レンズ２２２と像点側集光レンズ２３４は、上記被検物上の１点をピンホールＨｏに結像させる結像光学系２４６を構成するものである。結像光学系２４６に関し、物点側焦点Ｆｂに位置する上記被検物上の１点と像点側焦点Ｆｚに位置するピンホールＨｏとは共役な位置関係にある。

なお、励起光照射部２１０から射出された励起光Ｌｋは上記物点側焦点Ｆｂに集光される。

上記位置決め冶具１００は、上記所定被検物位置Ｐｏに配置されたマイクロ流路基板３００上の幅１００μｍ、深さ１５μｍ程度の溝からなるマイクロ流路３１０（図１参照）に上記共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂの位置を定めるために用いられるものである。

上記マイクロ流路基板３００は、２枚のガラス板から構成されており、一方のガラス板に形成されたマイクロ流路が上記２枚のガラス板の間に挟まるように、２枚のガラス板を互いに貼り合わせて１枚の基板として形成されたものである。

上記マイクロ流路基板３００は以下のように使用されるものである。

すなわち、上記マイクロ流路基板３００のマイクロ流路３１０には、励起光Ｌｅの照射を受けると蛍光Ｌｋを発するように処理された測定対象物質を含む試料流体が収容可能となっている。

この試料流体が収容されたマイクロ流路基板３００に対し、上記マイクロ流路３１０中の固定された１点に上記共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを位置させて、この共焦点蛍光顕微鏡２００が上記マイクロ流路３１０中の１点から発せられる蛍光Ｌｋを検出可能な状態にしておく。そして、マイクロ流路３１０の両端に電位差を与えて上記試料流体をマイクロ流路３１０に沿って電気泳動させる。ここで、共焦点蛍光顕微鏡２００により上記固定された１点に励起光Ｌｅを照射しつつ上記測定対象物質が上記１点を通過する状態を検出する。励起光Ｌｅの照射を受けて蛍光Ｌｋを発生する測定対象物質が上記１点を通過する状態を検出して得られたデータを分析することにより上記測定対象物質を特定することができる。

ここで、上記マイクロ流路基板３００の代わりに、励起光Ｌｅの照射を受けたときに安定的に蛍光を発生させることができる上記位置決め冶具１００を用いることにより、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを、関節的に、上記マイクロ流路基板３００のマイクロ流路３１０へ位置合わせすることができる。

すなわち、マイクロ流路基板３００を所定被検物位置Ｐｏに配置したときのマイクロ流路３１０に対する共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂの位置と、位置決め冶具１００を所定被検物位置Ｐｏに配置したときの開口部２１に対する共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂの位置とが一致するように上記開口部２１を形成しておく。そして、上記位置決め冶具１００を所定被検物位置Ｐｏに配置して共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを開口部２１に位置させることにより、上記マイクロ流路基板３００を所定被検物位置Ｐｏに配置したときに共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂをマイクロ流路３１０に位置させることができる。

以下、上記共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを、所定被検物位置Ｐｏに配置された焦点位置決め冶具１００の開口部２１に位置させる位置決めについて説明する。

はじめに、共焦点蛍光顕微鏡２００における所定被検物位置Ｐｏに焦点位置決め冶具１００を配置する。

次に、励起光照射部２１０により励起光Ｌｅを焦点位置決め冶具１００へ照射する。ここで、図２中の２点鎖線で示すように励起光Ｌｅは焦点位置決め冶具１００のマスクフィルタ２０を透過して蛍光基板１０に入射する。このときには、物点側焦点Ｆｂが、蛍光基板１０から外れた図中の座標点Ｊ１（Ｘ１，Ｙ１，Ｚ１）に、すなわち、蛍光基板１０の外部に位置している。上記励起光Ｌｅの照射を受けた蛍光基板１０からは蛍光Ｌｋが発せられるが、この蛍光Ｌｋはマスクフィルタ２０で遮断されるため焦点位置決め冶具１００の上部、すなわち、蛍光の検出側、励起光の入射側へ伝播されることはない。

なお、上記マスクフィルタ２０の表面は、励起光Ｌｅを反射しないように処理されており、マスクフィルタ２０による励起光Ｌｅの反射は生じない。

次に、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを焦点位置決め冶具１００に対して図中のＸ-Ｙ平面に沿って相対的に移動させ、蛍光基板１０から外れた座標点Ｊ２（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ１）に位置させる。ここで、上記蛍光基板１０から外れた座標点Ｊ２に向けて集光される励起光Ｌｅの照射を受けた蛍光基板１０から発せられた蛍光Ｌｋの一部は開口部２１を通して外部へ射出される。この外部へ射出された一部の蛍光Ｌｋは蛍光検出部２３０では殆ど検出されない。すなわち、上記共焦点蛍光顕微鏡２００において、座標点Ｊ２（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ１）に位置する物点側焦点ＦｂとピンホールＨｏとが共役な位置関係となっているため、励起光Ｌｅの照射を受けて上記物点側焦点Ｆｂ以外の位置から発せられた蛍光ＬｋはピンホールＨｏで遮断され蛍光検出部２３０では殆ど検出されない。

つづいて、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを、焦点位置決め冶具１００に対して図中のＺ軸方向に沿って移動させ、蛍光基板１０の内部に位置する座標点Ｊ３（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）に定める。上記蛍光基板１０の内部の座標点Ｊ３に向けて集光される励起光Ｌｅの照射を受けた蛍光基板１０から発せられる蛍光Ｌｋは、開口部２１を通して外部へ射出される。ここで、上記座標点Ｊ３から発生し開口部２１を通って外部へ射出された蛍光Ｌｋの殆どが蛍光検出部２３０によって検出される。すなわち、励起光Ｌｅが集光される蛍光基板１０の内部の座標点Ｊ３（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）に位置する物点側焦点ＦｂとピンホールＨｏとが共役な関係となっているので、上記励起光Ｌｅが集光される座標点Ｊ３２（Ｘ２，Ｙ２，Ｚ２）から発せられた蛍光Ｌｋの大部分がピンホールＨｏを通り蛍光検出部２３０で検出される。すなわち、蛍光基板１０の内部に物点側焦点Ｆｂを位置させて検出された蛍光の光強度は、蛍光基板１０の外部に物点側焦点Ｆｂを位置させて検出された蛍光の光強度よりも極めて大きくなる。

上記のことにより、共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを、焦点位置決め冶具１００の開口部２１の位置に合わせることができる。これにより、間接的に、上記共焦点蛍光顕微鏡２００の物点側焦点Ｆｂを、上記所定被検物位置Ｐｏに配置されたマイクロ流路基板３００のマイクロ流路３１０内に位置させることができる。

上記のように、本発明の焦点位置決め冶具によれば、励起光Ｌｅの反射等による蛍光検出のＳ/Ｎを低下させることなく、共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点の位置合わをより正確に行うことができる。

なお、上記蛍光基板はルビー材料からなるものとする場合に限らず、所定波長の励起光の照射を受けて所定波長の蛍光を発するものであればどのような材料であってもよい。

また、マスクフィルタは誘電体多層膜とする場合に限らず、所定の光透過特性および光遮断特性を有するものであれば、どのような構成からなるものであってもよい。

蛍光基板は、励起光の照射を受けてこの励起光の波長よりも長波長の蛍光を発するものに限らず、励起光の照射を受けてこの励起光の波長よりも短波長の蛍光を発するものであってもよい。

共焦点蛍光顕微の所定被検物位置に配置された本発明の焦点位置決め冶具を示す図 焦点位置決め冶具を通る励起光および蛍光の光路を示す拡大断面図 マスクフィルタの分光透過特性、および励起光や蛍光の光強度の波長分布を示す図

符号の説明

１０ 蛍光基板
２０ マスクフィルタ
２１ 開口部
１００ 焦点位置決め冶具
２００ 共焦点蛍光顕微鏡
２１０ 励起光照射部
２３０ 蛍光検出部
Ｌｅ 励起光
Ｌｋ 蛍光
Ｌｚ レーザ光
Ｆｂ 物点側焦点
Ｐｏ 所定被検物位置

Claims (4)

1. 励起光の照射を受けて蛍光を発する蛍光基板と、該蛍光基板上に配された、開口部を有するマスクフィルタとを備え、共焦点蛍光顕微鏡における所定被検物位置に配置されて該共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点を位置決めするために用いられる焦点位置決め冶具であって、
   前記マスクフィルタが前記励起光を透過させ前記蛍光を遮断するものであり、
   前記共焦点蛍光顕微鏡の物点側焦点が前記焦点位置決め冶具に対して正しく位置決めされたときにのみ前記蛍光基板から発せられた蛍光が前記開口部を通して前記共焦点蛍光顕微鏡で検出されるように構成されたものであることを特徴とする焦点位置決め冶具。
2. 前記蛍光基板がルビー材料からなるものであることを特徴とする請求項１記載の焦点位置決め冶具。
3. 前記マスクフィルタが誘電体多層膜であることを特徴とする請求項１または２記載の焦点位置決め冶具。
4. 前記位置決めが、前記物点側焦点の位置を、前記焦点位置決め冶具に対して水平方向および該水平方向と直交する垂直方向へ相対的に移動させて実施されるものであることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項記載の焦点位置決め冶具。

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