CN103080807B - 用来在荧光显微术中对培养基进行自动聚焦的方法和设备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用来对生物材料（6）进行自动检验的装置和方法，其包括显微镜（8），在该显微镜的十字工作台（9）上，生物材料（6）设置在载片（1）或分析板与至少一个盖片（4）之间；至少一个用于对生物材料（6）进行照明的光源（15、16）以及摄影单元（17），该摄影单元拍摄至少一张生物材料（6）的借助显微镜（8）的物镜（10）放大的图片并传递给分析处理单元。在此设置标记（7），该标记能由用来对生物材料（6）进行自动聚焦的装置（11）识别，从而能在识别该标记（7）的基础上通过十字工作台（9）的有针对性的运动来实施聚焦。所述技术方案的特征在于：生物材料（6）设置在通过破碎和分割覆盖玻璃制成的生物芯片（2）上，该生物芯片安置在载片（1）上，而且标记（7）位于生物芯片（2）的表面上。

Description

用来在荧光显微术中对培养基进行自动聚焦的方法和设备
技术领域
本发明涉及用来对生物材料进行自动检验的方法以及设备，其包括：显微镜，生物材料在该显微镜的十字工作台上设置在载片或者分析板(Analyseplatte)与至少一个盖片之间；至少一个用于对生物材料进行照明的光源以及摄影单元，该摄影单元拍摄至少一张借助显微镜的物镜放大的生物材料的图片并且传递给分析处理单元。所介绍的技术方案设置有一个标记，该标记能够由用来对生物材料进行自动聚焦的装置识别，其中，能够通过以对所述标记的识别为基础使十字工作台有针对性地运动来实施聚焦。
背景技术
荧光显微术在医学诊断领域中是用来检验患者试样的标准方法。在这种情况下，在这个领域中对这种技术的进一步开发的努力还在于：提高自动化程度，以便因此最小化误差概率并且改善显微术的经济性。
为了实现对实验室中自动化程度的提高，一方面可考虑进一步自动化对需检验的试样的处理、特别是稀释步骤以及培养步骤，或另一方面更有效地设计对经过处理的试样的特别是视觉分析处理的过程。在下文中还将进一步阐述的本发明涉及到试样分析处理或者诊断领域，其中，在荧光显微术方面也基本上已知生成需检验的试样的数码图像数据并且为了完成诊断而将这些图像数据传递给其上安装有专用实验室软件的数据处理单元而且进行计算机辅助的分析处理。
在这种至少部分自动化的荧光显微术中，特别是为了在完成化验诊断时能够保障高质量保持不变，生成和选择高质量的图片具有突出的重要性。所拍摄图片的重要的质量特征最终在于它们的清晰度，因而需检验的生物材料的聚焦具有特别的重要性。为了对需检验的生物材料或者培养基进行聚焦通常情况下在不同的平面中拍摄大量的图片，在电子分析处理期间这些图片中在质量上不合格的图片又被废弃。
在用于显微镜的自动聚焦方面已知有各种不同的技术方案。其中，通常用在入射光显微镜中的主动式自动聚焦系统在这里的出众之处在于：借助辅助光源在需检验的试样的表面上或在覆盖试样的覆盖玻璃上投射光点或记号，分析处理所述光点的形状、位置或大小并且在分析处理的基础上聚焦在试样表面上或覆盖玻璃表面上。例如由DE3446727C2已知一种这样构造的主动式自动聚焦系统并且应该能够实现快速自动聚焦。
在透射光显微镜中通常情况下用被动式自动聚焦系统代替主动式自动聚焦系统。如其例如由DE3439304C2已知的那样，在对拍摄的图像数据进行比较的基础上测算出聚焦面，即在其内拍摄到最清晰的图片的平面。可是因为为了达到令人满意的结果必须实施多次搜索，所以这种系统经常较慢。
由DE102010035104已知另外一种特殊的主动式自动聚焦系统。在该文献中介绍了一种用来对微弱发光的培养基进行自动聚焦的装置，该装置应该保障快速的图像聚焦。较快的聚焦一方面应该提高自动显微术的效率而另一方面应该使荧光染料的褪色在聚焦期间最小化。所介绍的技术方案的出众之处在于：首先在透射光模式中进行多次拍摄并且借助已知的分析处理方法从中确定最清晰的图片。在切断透射光源之后，使显微镜的十字工作台向在透射光模式中确定的聚焦面运动。为了生成荧光图像，现在激活激发光源。但是由于荧光在不同的平面内能够关于培养基的浓度发生变化，所以通常情况下还需要相对在透射光模式中确定的聚焦面对荧光中的聚焦面进行调整。不过为了确定精确的聚焦面，由于之前在透射光模式中完成的预聚焦，只需在比较小的搜索范围内拍摄少量的图片。最终借助数码相机拍摄位于精确的聚焦面内的荧光图像并且为了进行进一步诊断而传递给数据处理单元。
进一步开发荧光显微术中的自动聚焦系统的目的始终是：使用于聚焦所需的时间或者在聚焦期间所拍摄的以及不被用于之后的培养基检验的图片的数量最小化。为此由DE10100247A1已知用来在荧光显微术中对培养基进行自动聚焦的另一种方法，通过该方法物镜焦点高度准确并且尽管如此在比较短的时间间隔内也可确定。在这种情况中介绍了一种干涉显微镜，在该干涉显微镜中载片单元的面设有光学显微镜可探测到的涂层。反射的光由探测器探测并且借助探测信号推断出在干涉显微镜的目标区域内的相位。通过这种方式最后能够以适宜的方式对干涉显微镜进行校准。
为了借助抗体使特殊的蛋白质可见，此前所介绍的自动聚焦或至少部分自动聚焦的显微镜得到多次应用。通过这种方式确定了在哪种组织中具有特异的蛋白质以及该蛋白质定位在细胞的哪个区间内。在很多情况下由组织切片构成的固定的组织被用于这种抗体染色。通过如下方式生成所述的组织切片：首先制造健康的组织的冷冻切片并置于载物玻璃的表面上，特别是载片的或覆盖玻璃的表面上。接着使所述组织解冻并干燥。通常情况下，组织切片在已知的测试系统中固定在标准载片上，其中，为每个组织切片才用一个单独的标准载片。
除了此前介绍的借助设置在标准载片上的组织切片对患者试样进行检验的可能性以外，还已知了欧蒙股份公司(EuroimmunAG)的所谓的生物芯片技术。这个技术与总是将组织切片固定在为检验而准备的标准载片上的传统的间接免疫荧光技术不同，该技术由于需检验的试样的小型化而提供了使自身抗体与感染抗体的确定标准化的可能性。通过这种方式使实验室内的工作得到简化而且效率更高。
欧蒙公司的生物芯片涉及的是带有生物材料的比较小的载体。在这种情况下充分利用了如下效果：只要将组织切片置于承载切片的培养基上并且与该培养基又共同固定在载片上或分析板上，则为了检验就可以制造和采用很小的组织切片。标准覆盖玻璃是指约100微米至200微米的薄的、矩形的或圆形的、通常面积为18×18平方毫米的玻璃片，而生物芯片则是涂敷有适宜的生物材料的覆盖玻璃碎片，因此这些碎覆盖玻璃碎片通常具有较小的表面。因此与标准覆盖玻璃相比，生物芯片的出众之处一方面在于明显小得多的空间需求，另一方面在于所需组织的量得到明显减少。
在制造生物芯片时，首先同样将所需组织的冰冻切片置于标准覆盖玻璃上，然后使其部分解冻并干燥。接着通过在组织切片的区域内用金刚石刀或者激光生成缺口线，沿着这些缺口线使涂层的覆盖玻璃断裂并且这样分成切片，使带有组织的覆盖玻璃成碎片。为了能够实现更好的、特别是更有效的检验，将生物芯片置于载片的合适的反应区(Reaktions-feld)上。就此而论，可考虑在一个载片上设置多个用于相应的生物芯片的反应区，其中，也可以在一个反应区上设置一个以上的生物芯片，优选带有不同的组织。为了特别有效地设计对患者试样的检验，通过在一个载片上准备大量的、带有相应的生物芯片的反应区而构成适宜的生物芯片－马赛克TM(Biochip-MosaikeTM)。
为了检验患者试样，不论是采用位于标准覆盖玻璃上的组织切片还是采用生物芯片或者特殊的生物芯片－马赛克TM，在原则上试样的处理过程、特别是患者血清的稀释过程以及组织切片的培养过程和借助显微镜的视觉检验过程都是相同的。
在处理试样期间，在应该检验是否存在特异抗体的、稀释的患者血清中以及在一种结合物(Konjugat)中培养组织，该结合物包括通常从动物身上获得的抗体，这些抗体被用荧光材料做了记号并且是针对患者血清中被怀疑的抗体。只要患者血清具有抗组织切片的抗原的抗体，则不仅这种抗体结合在组织切片上而且被荧光标记的二次抗体(Sekundaerantikoerper)也结合在黏附在组织切片上的人体抗体上。借助荧光显微镜最终可以发现结合在相应的组织结构上的荧光染料。
在用显微镜检验之前，为培养的组织切片涂敷封固剂，诸如经过PH缓冲处理的(pH-gepuffert)甘油，并且用覆盖玻璃覆盖所述组织切片。如此设置覆盖玻璃，使得它虽然与组织切片的表面保持安全距离，但是可以毫无问题地用显微镜进行观察。
发明内容
如已经提及的那样，进一步开发用来检验患者试样的自动设备的目的基本上在于：尽可能高效率地设计从输入试样到完成实验诊断的所有方法步骤并且同时尽可能地消除可能的错误根源。从使实验室的工作更加高效和更加可靠这个普遍的愿望出发，本发明的特殊目的在于，如下地进一步改进现有技术中已知的用于生物材料的自动显微术的技术方案，即，能够以有利的方式使带有位于其上的生物芯片、特别是生物芯片－马赛克的载片的显微术自动化。首先，应该可以用比较简单的方法实现对设置在生物芯片上的生物材料进行聚焦的过程并且同时应该快速且高质量地完成。需阐述的技术方案应该可以简单地整合到已知的用于生物材料自动显微术的系统中并且辅助在实验室工作的人员。本发明的另一个目的在于，使在聚焦期间拍摄的图片数量和之后图像分析处理所不需要的图片数量最小化。
上述目的通过用来对生物材料进行自动检验的设备得以实现，该设备包括：显微镜，所述生物材料在该显微镜的十字工作台上设置在载片或分析板与至少一个盖片之间；至少一个用于对所述生物材料进行照明的光源；以及摄影单元，该摄影单元拍摄至少一张所述生物材料的借助所述显微镜的物镜放大的图片并传递给分析处理单元，其中，设置有标记，该标记能够由用来对所述生物材料进行自动聚焦的装置识别，并且能够在识别所述标记的基础上通过所述十字工作台的有针对性的运动来实施聚焦，其特征在于：所述生物材料设置在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的生物芯片上，该生物芯片安置在所述载片上，而且所述标记位于所述生物芯片的表面上，其中，可以在确定所述标记的位置和/或方位的基础上确定目标间隔，在该目标间隔内完成对所述生物芯片上的生物材料的聚焦，其中，对生物芯片上的生物材料的聚焦通过对在目标间隔内在至少两个不同平面内拍摄的图片进行分析处理来实现。另外，所述目的还通过用来对生物材料进行自动检验的方法得以实现，其包括：显微镜，所述生物材料在该显微镜的十字工作台上设置在载片或分析板与至少一个盖片之间，在该方法中，所述生物材料被照明，用摄影单元拍摄所述生物材料的至少一张借助所述显微镜的物镜放大的图片并传递给分析处理单元，而且利用用来对所述生物材料进行自动聚焦的装置探测标记，确定该标记的方位和/或位置并且在所探测到的所述标记的方位和/或位置的基础上通过所述十字工作台的有针对性的运动来对所述生物材料实施聚焦，其特征在于：在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的的生物芯片上提供所述生物材料，所述生物材料设置在该生物芯片上，而且在所述生物芯片的表面上探测所述标记，其中，在确定所述标记的位置和/或方位的基础上确定目标间隔，在该目标间隔内完成对所述生物芯片上的生物材料的聚焦，其中，对生物芯片上的生物材料的聚焦通过对在目标间隔内在至少两个不同平面内拍摄的图片进行分析处理来实现。本发明的有利的实施方式在下文中部分参照附图来作进一步阐述。
本发明涉及一种用来对生物材料进行自动检验的设备，其包括显微镜，生物材料在该显微镜的十字工作台上设置在载片或分析板与至少一个盖片之间；该设备还包括至少一个用于对生物材料照明的光源以及摄影单元，该摄影单元拍摄至少一张生物材料的借助显微镜的物镜放大的图片并传递给分析处理单元，其中，设置有标记，该标记能够由用来对生物材料进行自动聚焦的装置识别，而且能够通过十字工作台在所述标记的识别为基础上的有针对性的运动来实施聚焦，并且如此改进，使得生物材料设置在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的生物芯片上，该生物芯片安置于载片上，而且标记位于所述生物芯片的朝向生物材料的那侧上。
利用根据本发明的技术方案保障了对设置在生物芯片上的生物材料高度准确地但尽管如此仍然比较迅速地完成聚焦。如在下文中还将详细阐述的那样，通过在生物芯片上设置优选在制造生物芯片时在分割本来的覆盖玻璃之前就已经涂敷在所述覆盖玻璃上的标记，可以对生物材料进行简单而可靠的聚焦。将涂敷标记整合在覆盖玻璃的制造过程中在此提供的优点是：在还未成碎片的覆盖玻璃上涂敷标记明显地比在较小的生物芯片上涂覆标记简单。
对有效的聚焦过程重要的是：标记位于生物芯片的表面上，该表面与生物材料的表面相比比较平坦并且这样能够实现精确的距离确定。在这种情况下原则上可以将标记设置在生物芯片的朝向生物材料的那侧上或者设置在生物芯片的背向该侧的背面上。
在聚焦过程开始前的第一步是进行对标记的探测，特别是确定物镜与标记之间的距离。在确定标记的位置和/或方位、特别是标记与物镜之间的距离的基础上确定目标间隔。目标间隔在此具有至物镜的最大距离和最小距离，标记和设置在生物芯片的表面上的试样位于这些距离之间。在本发明的一个特别的实施方式中，在确定目标间隔之后继续在所述目标间隔之内对生物材料进行聚焦。因为通过这种方式对焦点的搜索限制在所述目标间隔上，所以能够明显缩短聚焦过程。
优选在透射光模式中实施对标记的聚焦，这另外具有的优点是：用荧光染料标记的生物材料仅仅短时间地在激发波长的范围内被照射并且因此能够以适当的方式抵抗荧光染料的提早褪色。
然而原则上同样可考虑在荧光模式中实施聚焦。根据本发明的聚焦方法主要能够通过如下方式得以实现，即，使得聚焦过程所需时间相对众所周知的方法缩短。作为备选或补充的是，为了探测标记采用辅助辐射源、诸如激光器。这种所采用的激光器的射线优选通过标记反射并且由接收装置接收。这样根据对光程和/或渡越时间的分析处理可以确定标记与物镜之间的距离。因为辅助辐射源、特别是激光器位于相对物镜的一个限定的位置中，所以这一点是可能的。
任意一种图案都可以用作由用来聚焦的装置识别的标记。按照有利的方式，至少沿延伸方向具有等距离的网格线适合。在优选为一种组织的冷冻切片的生物材料被置于生物芯片上之前，在覆盖玻璃上或者生物芯片上安置这样的网格线。在这种情况下如此构造所述标记，使得标记与安置在生物芯片之上的生物材料之间的影响能够被尽可能排除。
本发明的一种特殊的改进方案设定：作为生物芯片的标记设置有至少三个轮廓，它们的中心点等距地间隔开。这种轮廓被用来聚焦的装置识别，因而显微镜的物镜可以在聚焦完成后被精确地调整到生物芯片的表面上或者位于那里的生物材料上。在任何情况下借助根据本发明的设置在生物芯片上的标记保障了生物芯片的位置和/或方位、特别是生物芯片表面到显微镜物镜的距离被可靠识别。设置在生物芯片表面上的轮廓优选构造成圆圈，它们的中心彼此等距地间隔开。就此而论可考虑在覆盖玻璃破碎之前或之后借助适宜的装置将这样的标记以所期望的形式涂敷在生物芯片的表面上。然而同样可考虑将表面至少部分地涂敷成平面并且为了生成所期望的标记而设置相应的模板或可以在平面涂敷之后例如通过蚀刻生成相应的标记轮廓。
在本发明的另一种实施方式中设定：确定包围所述标记的区域，在该区域内摄影单元不拍摄图片和/或被拍摄的图片在分析处理单元中在处理时不被使用或被废弃或被删除。通过设置围绕被设置在生物芯片表面上的标记的相应区域来保障在对生物材料进行检验时或者在对患者试样做出诊断时不考虑可能情况下与所述标记发生反应的组织区域或者细胞。
根据本发明的另一种改进方案设定：所述标记构造成生物芯片表面的平面涂层的形式。在这种情况下，以有利的方式为特别是生物芯片的三个区域设置平面的标记。在一种十分特殊的设计方案中，生物芯片的整个为了标记而设置的表面都设有相应的平面标记。借助生物芯片的表面的完全平面的或部分平面的涂层，然后同样基于涂层上的反射或透射而在测距传感器中生成相应的信号。
含有硅的标记有利地适于在用自动显微镜工作期间的识别。为此备选或补充可考虑所述标记具有金属、优选铬。同样可考虑介电层，这些介电层的光谱反射性能为了测距传感器而被最佳化并且不对图像分析产生不良影响。如果将金属或电介体用于生物芯片表面上的标记，可考虑将金属或电介体汽化渗镀或溅镀到所述表面上。在制造被作了相应标记的生物芯片方面，这一点具有的优点是：金属的汽化渗镀可靠地完成而且实施成本较低。在一种特殊的实施方式中，此处还可以在完全气相喷镀的表面区域中通过蚀刻雕出特殊的轮廓。
根据本发明的另一种实施方式可考虑：用来对生物材料进行自动聚焦的装置具有至少一个激光光源或多色的辐射源和探测器，该探测器至少部分地接收被标记反射的光线并且在接收到的光线的基础上产生信号，该信号被分析处理并且在考虑到被分析处理的信号的情况下为了对生物材料进行聚焦而使十字工作台有针对性地运动。在使用激光光源以及探测器时有利地适合于：至少部分地用金属诸如铬涂敷生物芯片的表面并且这样反射激光束。借助所描述的探测器的激光光源可以以优选的方式确定生物芯片的表面的位置和/或方位，在该表面上设置有生物材料。
另外，本发明的出众之处在于用来自动检验生物材料的方法。根据本发明的方法包括显微镜，生物材料在该显微镜的十字工作台上设置在载片或分析板与至少一个盖片之间，在该方法中生物材料被照明，在该方法中用摄影单元拍摄至少一张生物材料的借助显微镜的物镜放大的图片并传递给分析处理单元，而且在该方法中利用用来对生物材料进行自动聚焦的装置探测标记、确定该标记的方位和/或位置，并且在所探测到的标记的方位和/或位置的基础上通过使十字工作台有针对性地运动来实施对生物材料的聚焦，如此改进该方法，即，在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的生物芯片上提供所述生物材料，该生物芯片安置在载片上，而且探测在生物芯片的表面上的标记。
根据本发明的方法的一种有利的改进方案设定：在所述标记的被探测到的方位和/或位置的基础上确定目标间隔，在聚焦期间中十字工作台在该目标间隔内移动。通过与承载生物材料的生物芯片表面的被探测到的位置和/或方位相关地设置目标间隔，能够以优选的方式确定一个间隔，该间隔包括生物芯片表面之上和之下的区域。在聚焦过程期间使十字工作台如此移动，使得聚焦面在间隔界限之间运动。由此通过优选的方式将十字工作台在聚焦期间的移动位移限定在适当的值上。
这样在所述标记的被探测到的方位和/或位置的基础上，十字工作台从物镜具有到生物材料的第一距离的至少第一位置中移动进入所述物镜具有到所述生物材料的第二距离的第二位置中，并且此外在所述第一与第二位置之间的两个不同的平面内分别拍摄至少一张所述生物材料的图片并传递给分析处理单元。在这种情况下能够容易理解在拍摄至少两张在不同平面内的图片时，这些图片具有不同的清晰度。通过用众所周知的图像数据分析处理方法来分析处理在目标间隔内在至少两个不同平面内拍摄的图片，最后能够以优选的方式确定最清晰的图片。再通过选出最清晰的图片来确定聚焦面。
因此用所介绍的方法能够以有利的方式在对所拍摄的图片在分析处理单元中进行比较的基础上确定聚焦面。那些被拍摄的而且也位于聚焦面之内的图片最终被传送给用来完成诊断的装置。优选此处涉及的是数据处理单元，特别是其上安装有实验室软件的电脑。借助该实验室软件，将为特殊的患者试样所拍摄的图片归入患者数据记录并相应地存储。对完成诊断负责的医生能够以比较简单的方式允许将整个关于被检验的患者试样的数据迅速地显示在显示屏上。
附图说明
下文将参照附图借助实施例进一步阐述本发明而不制约本发明的一般思想。附图中：
图1为带有生物芯片的载片；
图2为带有生物芯片的载片的反应区的剖视图；
图3为带有标记的生物芯片的俯视图；
图4为带有自动聚焦的显微镜的示意图；
图5为带有自动聚焦的显微镜的前视图；
图6为带有自动聚焦的显微镜的侧视图，以及
图7为带有自动聚焦的显微镜的等轴图。
具体实施方式
首先，图1示出的是一个其上设置有生物芯片2的载片1。为此载片1具有十个反应区，这些反应区相对载片1的其余的表面构造成小的凹部。在反应区3上设置有生物芯片2。原则上可考虑在一个反应区3上设置一个或也可以是多个生物芯片2。就此而论，当然可以以适当的方式使反应区3的大小相匹配。
生物芯片2涉及的是带有生物材料的小载体，其通过将组织切片涂敷在标准覆盖玻璃上并且接着使覆盖玻璃成碎片而制成。标准覆盖玻璃涉及的是约100微米至200微米的薄的、矩形的或圆形的玻璃板，该玻璃板通常具有18×18平方毫米的面积，而生物芯片2则是涂敷有适当的生物材料的覆盖玻璃碎片，这些覆盖玻璃碎片因此具有小得多的表面。与相应的检验特性(Untersuchungsprofil)以及客户需求相关地可以在一个载片1上为相应的生物芯片2设置大量的反应区3。在这种情况下同样可考虑在一个反应区3上又设置一个以上的带有不同组织的生物芯片。
在实验室中检验期间用各种不同的液体、特别是患者试样来培养布置在载片1的反应区3上的而且涂敷有组织的组织切片。在培养结束之后并且在用显微镜检验之前，为所培养的组织切片涂敷经过pH缓冲处理的、作为封固剂的甘油并且用覆盖玻璃4覆盖所述组织切片。如此布置覆盖玻璃4，使得该覆盖玻璃虽然与组织切片的表面具有安全的距离，但是可以毫无问题地用显微镜进行观察。
图2示出的是载片1的反应区3的大幅放大的剖视图。在载片1的反应区3上有涂敷有组织切片6的一部分的生物芯片2。所述组织切片涂覆有封固剂5并且通过覆盖玻璃4覆盖。生物芯片2的承载组织切片6的表面在朝向显微镜的南侧上具有线条形式的标记7。
作为对此的补充，在图3中示出的是设置在载片的反应区3上的生物芯片2的俯视图。用作标记7的线条按照具有数个同心圆的组的方式布置在表面上。在用显微镜检验期间，标记7借助用来对位于生物芯片上的生物材料6进行自动聚焦的装置得到识别并实施聚焦。作为可选，在聚焦过程期间考虑标记7沿Z方向的膨胀，以便实现聚焦的最佳化。因此设置在生物芯片2上的标记用来探测聚焦面。对标记7来说重要的是该标记不与位于生物芯片2上的生物材料6发生反应。
作为在图3中所示出的、同心圆组形状的标记7的实施形式的备选方案，可考虑在生物芯片2的表面上设置平行的线或网格图案。同样可以是平面的标记7，特别是含有金属或电介体。
另外，根据本发明所设置的标记7或者可以设置在生物芯片2的上侧上，即在朝向位于其上的组织6的那侧上，或者可以设置在背侧上，即朝向载片1的表面上。始终重要的是：标记7可以由用来对位于生物芯片2上的生物材料6进行自动聚焦的装置可靠地识别。此外，在测算聚焦面时根据标记7的实施形式和设计结构考虑所述标记7沿Z方向的膨胀和/或承载组织的生物芯片2的厚度。
为了对患者试样进行检验，设置有根据图1所示的、配备有大量的由覆盖玻璃4覆盖的生物芯片2的载片1。在这种情况下，在不同的生物芯片2上安置有各种不同的组织6或者生物材料。带有生物芯片2的载片1定位且锁定在显微镜8的十字工作台9上。就此而论可考虑将载片1手动地或借助操纵装置13定位在十字工作台9上。特别是在至少部分自动化的实验室内运行的显微镜8中，经过培养的、带有生物芯片2的载片1储存在适宜的载片箱12内并且在这个载片箱与十字工作台9之间借助操纵装置13来自动运动。适合的操纵装置13优选具有抓取装置，其中所述抓取装置或可以相对十字工作台9运动或可以与所述十字工作台共同运动。
在任何情况下，载片1都具有标题形的或代码形的记号14，该记号能够准确地鉴定位于生物芯片2上的患者试样以及优选还有位于生物芯片2上的组织类型。
图4示出的是荧光显微镜8的示意图，其包括透射光装置、可竖直移动的十字工作台9和用来摄影的数码相机17。另外设置有带有二色分光镜18和激发光源16的激发光装置。分光镜18将由激发光源16发射的激发光向设置在生物芯片2上的生物材料6的方向反射。与此相反，由透射光源15发射的并通过转向镜23改变方向的透射光从带有生物材料6的生物芯片2的方向中透射出来。二色分光镜18优选构造成反射滤光镜并且反射所有小于510纳米的波长。简而言之，二色分光镜18因此对于激发光起到转向镜的作用，而具有荧光波长的光线畅通无阻地穿过该分光镜18。作为分光镜或者完全反射激发光的反射滤光镜18的补充，优选还设置有长通闭塞滤光镜(Langpasssperrfilter)19，该长通闭塞滤光镜滤除波长在510纳米以下的光线。
在这里介绍的实施例中，荧光染料使用的是荧光素，该荧光素的吸收峰值为485纳米而该荧光素的发射峰值为514纳米。所介绍的技术的基本观点在于：沿光路的方向设置在长通闭塞滤光镜19之后的数码相机17不但必须在荧光中拍摄图片而且还必须在透射光中拍摄图片。由于这个原因，透射光源15构造成波长在520至535纳米内的LED。这种波长的光线不但穿过分光器18而且还穿过闭塞滤光镜19。
为了聚焦过程，透射光装置借助透射光源15生成具有的波长在所采用的荧光染料的发射波长范围内的光线。在这种情况下，由透射光源15发射的光线通过适宜的镜组22聚焦而且接着通过转向镜23转向为竖直向上，以便从下侧发射穿过带有位于其上的生物材料6的生物芯片2。
所采用的、涂敷在生物芯片2上的试样6涉及的是例如培养的人的上皮细胞，抗细胞核抗体接合在这些上皮细胞上，它们被用荧光素标记的抗人体抗体(Anti-Human-Antikoerper)着色。由于吸收峰值、即荧光素的激发波长为485纳米，染料不通过透射光激发成荧光。如另外在图4中可以看到的那样，由透射光源15沿水平方向发射的透射光首先通过镜组22聚束并且然后通过转向镜23转向为竖直方向。透射光穿过设置在十字工作台9上的、带有生物材料6的生物芯片2，通过显微镜8的物镜20聚束并且畅通无阻碍地穿过二色分光镜18以及长通闭塞滤光镜19，以便然后到达数码相机17的传感器。数码相机17以约10毫秒的相对短的曝光时间生成生物材料6的细胞壁的、用透射光生成的图片。
为了使在透射光模式中聚焦所需的、在不同的垂直于z轴线的平面内拍摄的图片的数量最小化，生物芯片2在它的表面上具有标记7而且显微镜8具有用来识别该标记的装置。在透射光模式中的聚焦过程开始之前，现在首先测算标记7到物镜20的距离和/或其相对物镜20的位置。为此设置有发射光线的光源或者辐射源，所述光线最终由标记7反射并且由适当的传感器探测。在考虑渡越时间和/或光程的情况下测算标记7到物镜20的距离和/或其相对物镜20的位置。作为可选，在上述的对距离和/或位置进行测算时还考虑标记7的厚度、即该标记沿z方向的延伸。在考虑所测算的标记7到物镜的距离的情况下，十字工作台9借助电动机24如此沿z方向移动，使得透射光模式中的聚焦仅仅在一个确定的目标区域内实施。在这个沿z方向具有几微米的距离间隔(Abstands-intervall)的目标区域内，在透射光模式中拍摄少量的，优选三张在不同平面中的图片。在此之后或至少部分同步地通过相连接的数据处理设备(未示出)借助已知的相邻像素灰度方差法(Sum-Modulus-Difference-Verfahren)(SMD)来测算每张单独的图片的相应的清晰度的值。所述值最大的图片鉴定为最清晰的图片而且十字工作台的附属的(沿z方向的)竖直位置确定为聚焦面。
在测算聚焦面时，优选与生物芯片上的标记的种类和实施形式无关地不考虑图片中反映标记附近区域的区域。这样做是为了确保在分析处理时不考虑位于生物芯片2上的生物材料6的、可能受到标记影响的部分。
在切断透射光源15之后，使十字工作台9向在透射光中测算的聚焦面运动。为了生成荧光图像，接着接通构造为LED的激发光源16。所发射的光线通过适宜的镜组21聚焦并且投射到已经介绍的二色分光镜18上，该二色分光镜将激发光线向下反射并且这样穿过物镜20引导到生物芯片2上的生物材料6上。在那里所述激发光线投射到荧光染料上，该荧光染料由于所述激发而发射主波长为514纳米的漫射光线。为了由数码相机17拍摄，荧光辐射的一小部分竖直向上地射出，穿过物镜20且穿过二色分光镜18以及长通闭塞滤光镜19。
由于约500毫秒的长的曝光时间，相机17生成荧光图像。由于荧光的位置在生物材料6的高度内变化，所以所述荧光内的聚焦面相对在透射光中发现的聚焦面具有偏差。为了确定精确的聚焦面，现在也在只有几个微米大的搜索区域内拍摄几份荧光图像。如在透射光中那样，在此为了每张图片，十字工作台位置沿竖直方向(z方向)电动驱动地发生变动。借助相邻像素灰度方差法(SMD)测算最清晰的荧光图像。
由于首先实施的透射光中的聚焦，其内必须在荧光中测算聚焦面的区域比较小。通过这种方式为了发出辐射而激发荧光染料的并因此至少部分被使用的时间可以最小化。此外，透射光中的曝光时间明显比荧光中的短。为了实现自动聚焦所需的时间的进一步减小，借助设置在生物芯片上的标记7保障只必须拍摄少数几张、优选3张透射光中的图片。在未设置相应的标记的情况下，在聚焦期间通常拍摄约100张透射光中的图片。因此透射光聚焦的持续时间在考虑到相应的曝光时间的情况下从100×10毫秒＝1秒缩短到3×10毫秒＝30毫秒。
如果在荧光光线中实施整个自动聚焦过程，聚焦的持续时间甚至会上升到约200×500毫秒＝100秒。即使是在由于在荧光中的曝光时间长而对图像清晰度的计算(SMD)能够与图像拍摄同时进行而且因此一旦获得了最清晰的图片就能马上中断图像拍摄的情况下，平均还是需要约50秒的累计曝光时间。
图5、6和7分别示出的是用来对生物试样6进行自动检验的荧光显微镜8。相同的构件依然设有相同的附图标记。所示出的显微镜8具有用来对生物材料6进行自动聚焦的装置，该装置如此构造，使得它识别设置在生物芯片2上的标记7，这些生物芯片设置在载片1上，并且以这个识别为基础沿z方向确定目标区域，聚焦面位于该目标区域之内。为了精确地确定聚焦面，只需再进行少量的图像拍摄，从而与已知的系统相比，所述自动聚焦能够明显地加快速度。
荧光显微镜8具有一个容纳部，用于储存和提供多个载片1的载片箱12可固定在该容纳部上。借助被构造成固定在十字工作台9上的抓取装置的操纵装置13可以将用来检验而需要的载片1有针对性地从载片箱12中取出并且接着又放到这个载片箱中。为了分别保证明确的鉴定，不但载片箱12而且各个载片1都具有一个标题形的或代码形的记号。借助实验室软件对试样的准备、处理和检验进行控制，检验结果也通过该实验室软件存储及输出。
为了准备用显微镜进行检验的过程，将其内固定有所需的载片1的所谓的托架25从载片箱12中取出并且借助操纵装置13将该托架锁定在十字工作台9上的所期望的位置上。
图8示例性示出托架25的构造。所示出的托架25构造成框架形的并且具有五个用于载片1的容纳部。带有设置在其上的生物芯片2的载片1通过所述托架25安全地固定并且通过这种方式能够被可靠地储运和运输，所述生物芯片分别设置在十个反应区3上。
在通过抓取装置形式的操纵装置12从载片箱12中取出托架25之后如此完成定位，即，使得为了检验所设置的生物芯片2最终处于显微镜的物镜10的下方。数码相机17位于所述物镜20的上方，通过该数码相机拍摄所需的图片。透射光源以及激发光源15、16以及其余的光学构件的设置结构与在图4的说明中相关阐述的设置结构相符。
已经介绍过的、包括生物芯片上的标记7的探测以及不同平面内的图片的拍摄在内的自动聚焦过程，首先在每次检验的生物芯片的中心区域内进行。在此之后，还在所述生物芯片2的两个另外的、位于中心左侧或者右侧的区域内继续进行聚焦以及与此相关的图像拍摄。为此十字工作台9相应地沿水平方向移动。
始终重要的是：在聚焦时首先对生物芯片2上的标记7进行探测，以便这样以合理的方式限定所述聚焦面预计位于其内的水平区域以及在所需的时间方面最佳化自动聚焦过程。
附图标记列表
1载片
2生物芯片
3反应区
4覆盖玻璃
5封固剂
6生物材料
7标记
8显微镜
9十字工作台
10物镜
11用来自动聚焦的装置
12载片箱
13操纵装置
14记号
15透射光源
16激发光源
17数码相机
18二色分光镜
19长通闭塞滤光镜
20物镜
21激发光源的镜组
22透射光源的镜组
23转向镜
24电动机
25托架

Claims (20)

1.用来对生物材料(6)进行自动检验的设备，其包括：显微镜(8)，所述生物材料(6)在该显微镜的十字工作台(9)上设置在载片(1)或分析板与至少一个盖片(4)之间；至少一个用于对所述生物材料(6)进行照明的光源(15、16)；以及摄影单元(17)，该摄影单元拍摄至少一张所述生物材料(6)的借助所述显微镜(8)的物镜(10)放大的图片并将图片传递给分析处理单元，其中，设置有标记(7)，该标记能够由用来对所述生物材料(6)进行自动聚焦的装置(11)识别，并且能够在识别所述标记(7)的基础上通过所述十字工作台(9)的有针对性的运动来实施聚焦，其特征在于：所述生物材料(6)设置在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的生物芯片(2)上，该生物芯片安置在所述载片(1)上，而且所述标记(7)位于所述生物芯片(2)的表面上，其中，可以在确定所述标记的位置和/或方位的基础上确定目标间隔，在该目标间隔内完成对所述生物芯片上的生物材料的聚焦，其中，对生物芯片上的生物材料的聚焦通过对在目标间隔内分别在至少两个不同平面内拍摄的图片进行分析处理来实现。
2.如权利要求1所述的设备，其特征在于：所述生物芯片(2)的标记(7)构造成网格线图案。
3.如权利要求1所述的设备，其特征在于：所述生物芯片(2)的标记(7)具有至少三个轮廓，这些轮廓的中心点等距地间隔开。
4.如权利要求3所述的设备，其特征在于：所述轮廓构造成圆圈。
5.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：确定包围所述标记(7)的区域，在该区域内不拍摄图片和/或拍摄的图片在分析处理单元中在处理时不被使用。
6.如权利要求1所述的设备，其特征在于：标记(7)至少局部地平面地覆盖生物芯片(2)。
7.如权利要求1或6所述的设备，其特征在于：标记(7)平面地覆盖所述生物芯片(2)的朝向所述生物材料(6)的那侧。
8.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述标记(7)具有硅。
9.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述标记(7)具有金属。
10.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述标记(7)具有电介体。
11.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述标记(7)具有铬。
12.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述标记(7)被汽化渗镀和/或喷镀在所述生物芯片(2)上。
13.如权利要求1至4之任一项所述的设备，其特征在于：所述用来对所述生物材料(6)进行自动聚焦的装置(11)具有至少一个激光辐射源或多色辐射源和探测器，该探测器至少部分地接收由所述标记(7)反射的辐射并且在接收到的辐射的基础上产生信号，该信号被分析处理并且在考虑到被分析处理的信号的情况下为了对所述生物材料(6)进行聚焦而进行所述十字工作台(9)的有针对性的运动。
14.用来对生物材料(6)进行自动检验的方法，其包括：显微镜(8)，所述生物材料(6)在该显微镜的十字工作台(9)上设置在载片(1)或分析板与至少一个盖片(4)之间，在该方法中，所述生物材料(6)被照明，用摄影单元(17)拍摄所述生物材料(6)的至少一张借助所述显微镜(8)的物镜(10)放大的图片并将图片传递给分析处理单元，而且利用用来对所述生物材料(6)进行自动聚焦的装置(11)探测标记(7)，确定该标记(7)的方位和/或位置并且在所述标记(7)的被探测到的方位和/或位置的基础上通过所述十字工作台的有针对性的运动来对所述生物材料(6)实施聚焦，其特征在于：在通过破碎和分割覆盖玻璃而制成的的生物芯片(2)上提供所述生物材料(6)，所述生物材料(6)设置在该生物芯片上，而且在所述生物芯片(2)的表面上探测所述标记(7)，其中，在确定所述标记的位置和/或方位的基础上确定目标间隔，在该目标间隔内完成对所述生物芯片上的生物材料的聚焦，其中，对生物芯片上的生物材料的聚焦通过对在目标间隔内分别在至少两个不同平面内拍摄的图片进行分析处理来实现。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于：在所述标记(7)的被探测到的方位和/或位置的基础上确定目标区域，在该目标区域内，所述十字工作台(9)在聚焦期间移动。
16.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于：在所述标记(7)的被探测到的方位和/或位置的基础上，使所述十字工作台(9)至少从所述物镜(10)具有到所述生物材料(6)的第一距离的第一位置中移动到所述物镜(10)具有到所述生物材料(6)的第二距离的第二位置中，而且在所述第一位置与所述第二位置之间的两个不同的平面内分别拍摄至少一张所述生物材料(6)的图片并将图片传递给所述分析处理单元。
17.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于：为了探测所述标记(7)以及为了照明所述生物材料(6)采用不同波长的光线。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于：在聚焦期间以及在所述十字工作台(9)在所述目标区域内的期间，对所述生物材料(6)进行照明，并且在所述目标区域内部的两个不同的平面中分别拍摄至少一张所述生物材料(6)的图片并传递给所述分析处理单元。
19.如权利要求14或15所述的方法，其特征在于：在所述分析处理单元中比较所拍摄的图片的基础上确定聚焦面。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于：将处于所述聚焦面内的图片传递给用来完成诊断的装置。
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