ES2860715T3 - Procedimiento para el enfoque automático de sustratos en la microscopía de fluorescencia - Google Patents

Abstract

Procedimiento para el examen automatizado de material biológico (6) con un microscopio (8), sobre cuya mesa en cruz (9) el material biológico (6) está dispuesto entre un portaobjetos (1) o una placa de análisis y al menos una cobertura (4), en el que el material biológico (6) está expuesto, en el que al menos una imagen del material biológico (6), ampliada con la ayuda del objetivo (10) del microscopio (8), se registra con una unidad de registro de imágenes (17) y se transmite a una unidad de evaluación, y en el que un dispositivo para el enfoque automático (11) del material biológico (6) detecta una identificación (7), determina una posición y/o ubicación de la identificación (7) y, en base a la posición y/o ubicación detectada de la identificación de identificación (7), enfoca el material biológico (6) mediante un movimiento específico de la mesa en cruz, caracterizado porque el material biológico (6) se proporciona sobre biochip (2) producido por fragmentación y división de un cubreobjetos, sobre el que se dispone el material biológico (6), y porque la identificación (7) se detecta sobre una superficie del biochip (2), - en donde se determina un intervalo objetivo, basado en la determinación de una ubicación y/o una posición de la identificación, - en donde el intervalo objetivo tiene una distancia máxima y mínima al objetivo, - y en donde se lleva a cabo un enfoque del material biológico sobre el biochip, por medio de que se recogen unas imágenes en al menos dos planos diferentes dentro del intervalo objetivo y se evalúan las mismas.

Description

DESCRIPCIÓN

Procedimiento para el enfoque automático de sustratos en la microscopía de fluorescencia

La invención se refiere a un un procedimiento para el examen automatizado de material biológico con un microscopio, en cuya mesa en cruz el material biológico está dispuesto entre un portaobjetos o una placa de análisis y al menos una cubierta, con al menos una fuente de luz para exponer el material biológico, así como con una unidad de registro de imágenes, que registra al menos una imagen del material biológico ampliada con la ayuda del objetivo del microscopio y la transmite a una unidad de evaluación. La solución técnica descrita proporciona una identificación que puede ser detectada por un dispositivo para enfocar automáticamente el material biológico, en donde el enfoque puede llevarse a cabo mediante un movimiento selectivo de la mesa en cruz basado en la detección de la identificación.

La microscopía de fluorescencia representa un procedimiento estándar en el diagnóstico médico para examinar muestras de pacientes. A este respecto, también en este campo se están realizando esfuerzos para seguir desarrollando esta tecnología, aumentando el grado de automatización con el fin de minimizar la probabilidad de errores y mejorar la rentabilidad de la microscopía.

Para lograr un aumento del grado de automatización en el laboratorio, es concebible, por un lado, automatizar aún más el procesamiento de las muestras a examinar, en particular los pasos de dilución e incubación, o, por otro lado, configurar más eficazmente el proceso de la evaluación principalmente visual de las muestras procesadas. La invención, que se explicará con más detalle a continuación, se encuentra en el campo de la evaluación de muestras o de la diagnosis, en donde ya se conoce en principio, también en relación con la microscopía de fluorescencia, la generación de datos de imágenes digitales de las muestras que se van a examinar y su transferencia a una unidad de procesamiento de datos, en la que está instalado un software especial de laboratorio, para la elaboración de un diagnóstico y su evaluación con la ayuda de un ordenador.

En una microscopía de fluorescencia de este tipo, al menos parcialmente automatizada, la generación y selección de imágenes de alta calidad tiene una importancia destacada, especialmente para poder garantizar una alta calidad constante a hora de elaborar un diagnóstico de laboratorio. Una característica de calidad esencial de las imágenes recogidas es, en última instancia, su nitidez, por lo que el enfoque del material biológico que se va a examinar es de especial importancia. Para enfocar el material biológico o los sustratos que se van a examinar, se suele recoger un gran número de imágenes en diferentes planos, de las que se descartan las de baja calidad durante la evaluación electrónica.

Con respecto al enfoque automatizado de los microscopios, se conocen diferentes soluciones técnicas. Los sistemas de autoenfoque activos, que se utilizan generalmente en los microscopios de luz reflejada, se caracterizan porque se proyecta un punto de luz o una identificación sobre la superficie de la muestra que se va a examinar o sobre un cubreobjetos que cubre la muestra con la ayuda de una fuente de luz auxiliar, se evalúa la forma, la posición o el tamaño del punto de luz y se enfoca sobre la superficie de la muestra o del cubreobjetos en función de la evaluación. Un sistema de autoenfoque activo de este tipo es conocido, por ejemplo, del documento DE 3446727 C2 y está destinado a permitir un enfoque automático rápido.

En los microscopios de luz transmitida, generalmente se utilizan sistemas de autoenfoque pasivos en lugar de activos. Los sistemas de autoenfoque pasivos, como los conocidos por ejemplo del documento DE 3439304 C2, determinan el plano focal, es decir, el plano en el que se ha capturado la imagen más nítida, sobre la base de una comparación de los datos de la imagen recogidos. Sin embargo, estos sistemas suelen ser comparativamente lentos, ya que hay que realizar un gran número de búsquedas para conseguir un resultado satisfactorio.

Otro sistema específico de autoenfoque activo es conocido del documento DE 102010035104. En esta publicación se describe un dispositivo para el enfoque automático de sustratos débilmente iluminados, cuyo objetivo es garantizar un rápido enfoque de la imagen. El enfoque comparativamente rápido pretende, por un lado, aumentar la eficacia de la microscopía automática y, por otro, minimizar el blanqueo de los colorantes fluorescentes durante el enfoque. La solución técnica descrita se caracteriza por el hecho de que, primero, se toman varias imágenes en modo de luz transmitida y se determina la imagen más nítida a partir de ellas utilizando procedimientos de evaluación conocidos. Tras desconectar la fuente de luz transmitida, la mesa en cruz del microscopio se desplaza al plano focal determinado en el modo de luz transmitida. A continuación se activa una fuente de luz de excitación para producir una imagen de fluorescencia. Sin embargo, dado que la fluorescencia en diferentes planos puede variar con respecto al grosor del sustrato, regularmente es necesario ajustar el plano focal en la fluorescencia todavía con respecto al plano focal determinado en el modo de luz transmitida. Sin embargo, para determinar el plano focal exacto, sólo es necesario adquirir unas pocas imágenes en un área de búsqueda comparativamente pequeña, debido al preenfoque realizado previamente en el modo de luz transmitida. Las imágenes de fluorescencia, que finalmente se encuentran en el plano focal exacto, se registran con la ayuda de una cámara digital y se transfieren a una unidad de procesamiento de datos para su posterior diagnóstico.

El documento DE 102005036529 A1 describe un procedimiento para enfocar un microscopio sobre material biológico, que está aplicado directamente a un portaobjetos. El material biológico se expone a este respecto, en donde se registra una imagen del material biológico con una unidad de registro de imágenes y con la ayuda del objetivo y se transmite a una unidad de evaluación. Además de esto, se detecta una identificación para el enfoque automático.

Una de las metas del desarrollo posterior de los sistemas de autoenfoque en microscopía de fluorescencia es, siempre, minimizar el tiempo necesario para el enfoque o el número de imágenes tomadas durante el enfoque y que no se utilicen para el examen posterior del sustrato. Para ello, se conoce otro procedimiento para enfocar automáticamente un sustrato en microscopía de fluorescencia del documento DE 10100247 A1, con el que se puede determinar el enfoque del objetivo con gran precisión y, sin embargo, en un periodo de tiempo comparativamente pequeño. En este caso se describe un microscopio de interferencia, en el que una superficie de la unidad de portaobjetos está provista de un revestimiento que puede ser detectado por microscopía de luz. La luz reflejada es detectada por un detector y la posición de la fase en el área del objeto del microscopio de interferencia se deduce sobre la base de las señales de detección. De este modo, finalmente es posible ajustar el microscopio de interferencia de forma adecuada.

Los microscopios descritos anteriormente con enfoque automático o al menos parcialmente automatizado se utilizan ampliamente, para visualizar proteínas específicas utilizando anticuerpos. De este modo, se determina en qué tejido está presente una proteína específica y en qué compartimento de una célula está localizada. En muchos casos, para esta tinción de anticuerpos se utiliza tejido fijado, consistente en secciones de tejido. Estas secciones de tejido se generan preparando primero una sección congelada de un tejido sano y aplicándola a la superficie de un portaobjetos de vidrio, en particular un portaobjetos de microscopio o un cubreobjetos. A continuación, el tejido se descongela y se seca. Por lo general, en los sistemas de ensayo conocidos, las secciones de tejido se fijan a portaobjetos estándar, utilizándose un portaobjetos estándar distinto para cada sección de tejido.

Además de la posibilidad descrita anteriormente de examinar una muestra de paciente con la ayuda de una sección de tejido dispuesta sobre un portaobjetos estándar, se conoce la llamada tecnología de biochips de la empresa Euroimmun AG. A diferencia de la técnica convencional de inmunofluorescencia indirecta, en la que una sección de tejido siempre se fija a un portaobjetos estándar proporcionado para el examen, esta tecnología ofrece la posibilidad de estandarizar la determinación de autoanticuerpos y anticuerpos de infección, debido a una miniaturización de las muestras a examinar. El trabajo en el laboratorio se simplifica de esta manera y se hace más eficiente.

En el caso de los biochips de la empresa Euroimmun se trata de soportes comparativamente pequeños con material biológico. Aquí se aprovecha el efecto de que se pueden producir secciones de tejido muy pequeñas y utilizarlas para un examen, siempre que se apliquen a un sustrato que lleve la sección y, junto con este sustrato, se fijen a su vez a un portaobjetos del microscopio o a una placa de análisis. Mientras que en el caso de un cubreobjetos estándar se trata de una placa de vidrio rectangular o redonda de unos 100 pm a 200 pm de grosor, a menudo con una superficie de 18 x 18 mm2 , los biochips son fragmentos de cubreobjetos recubiertos con un material biológico adecuado y, por tanto, tienen una superficie mucho menor. En comparación con los cubreobjetos estándar, los biochips se caracterizan, por un lado, por requerir mucho menos espacio y, por otro, por reducir considerablemente la cantidad de tejido necesario.

En la producción de un biochip, una sección congelada del tejido requerido también se aplica primero a un cubreobjetos estándar, luego se descongela parcialmente y se seca. A continuación, se fragmenta el cubreobjetos con el tejido, utilizando una punta de diamante o un láser para crear líneas de entalladura en la zona de la sección de tejido, a lo largo de las cuales se rompe el cubreobjetos recubierto y se divide por lo tanto en segmentos. Para permitir un examen mejorado, en particular más eficaz, los biochips se aplican a campos de reacción adecuados de un portaobjetos de microscopio. En este contexto, es concebible proporcionar una pluralidad de campos de reacción para los correspondientes biochips en un portaobjetos, en donde también se puede prever más de un biochip, preferiblemente con diferentes tejidos, en un campo de reacción. Para que el examen de la muestra de un paciente sea especialmente eficaz, se forman unos Biochip-Mosaike™ adecuados, proporcionando una pluralidad de campos de reacción con los correspondientes biochips sobre un portaobjetos.

Independientemente de si se utiliza una sección de tejido situada en un cubreobjetos estándar o bien un biochip o Biochip-Mosaike™ especial para examinar una muestra del paciente, el proceso básico es el mismo tanto para el procesamiento de la muestra, en particular la dilución del suero del paciente y la incubación de la sección de tejido, como para el examen visual con ayuda de un microscopio.

Durante el procesamiento de la muestra, el tejido se incuba con suero diluido del paciente para analizar la presencia de anticuerpos específicos y un conjugado, habitualmente anticuerpos derivados de animales, que se marcan con un agente fluorescente y están dirigidos contra los anticuerpos que se sospecha están presentes en el suero del paciente. Siempre que el suero del paciente tenga anticuerpos contra los antígenos de la sección de tejido, tanto estos anticuerpos se unen a la sección de tejido como los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia se unen a los anticuerpos humanos adheridos a la sección de tejido. Finalmente, con la ayuda de un microscopio de fluorescencia, se puede comprobar el colorante fluorescente unido a las estructuras tisulares correspondientes.

Antes de la microscopía, la sección de tejido incubada se recubre con un medio de cobertura, como glicerina tamponada con PH, y se cubre con un cubreobjetos. El cubreobjetos está dispuesto de tal manera que se encuentra a una distancia segura de la superficie de la sección de tejido, pero la visualización con el microscopio es posible sin problemas.

Como ya se ha indicado, una de las metas en el perfeccionamiento de máquinas automáticas para el examen de muestras de pacientes es fundamentalmente hacer que todos los pasos del procedimiento, desde la recepción de la muestra hasta la elaboración de un diagnóstico de laboratorio, sean lo más eficientes posible y, al mismo tiempo, eliminar en gran medida las posibles fuentes de error. Sobre la base de este esfuerzo general para hacer el trabajo de laboratorio más eficaz e incluso más fiable, la presente invención se basa en la tarea específica de perfeccionar las soluciones técnicas conocidas del estado de la técnica para la microscopía automática de material biológico, de tal manera que una automatización de la microscopía de un portaobjetos con biochips ubicados sobre el mismo, en particular con mosaicos de biochips, sea posible de manera ventajosa. En particular, el proceso de focalización del material biológico dispuesto sobre el/los biochip(s) ha de ser realizable por medios relativamente sencillos y, al mismo tiempo, ha de llevarse a cabo rápidamente y con alta calidad. La solución técnica a indicar está pensada para integrarse fácilmente en los sistemas conocidos de microscopía automática de material biológico y para representar un apoyo para el personal que trabaja en el laboratorio. Otra tarea que subyace a la presente invención es minimizar el número de imágenes recogidas durante el enfoque y que no son necesarias posteriormente para una evaluación de la imagen.

La tarea anterior se resuelve con ayuda de un procedimiento según la reivindicación 1. Unas formas de realización ventajosas de la invención son el objeto de las reivindicaciones dependientes y se explican con más detalle en la siguiente descripción con referencia parcial a las figuras.

Se da a conocer un dispositivo para el examen automatizado de material biológico con un microscopio, sobre cuya mesa en cruz se dispone el material biológico entre un portaobjetos o una placa de análisis y al menos una cubierta, con al menos una fuente de luz para exponer el material biológico, así como con una unidad de registro de imágenes, que registra al menos una imagen del material biológico ampliada con ayuda del objetivo del microscopio y la transmite a una unidad de evaluación, en donde está prevista una identificación, que puede ser reconocida por un dispositivo para enfocar automáticamente el material biológico, y el enfoque puede llevarse a cabo mediante el movimiento selectivo de la mesa en cruz sobre la base del reconocimiento de la identificación, de tal manera que el material biológico se dispone sobre un biochip que se produce mediante la fragmentación y división de un cubreobjetos y que se aplica al portaobjetos, y en donde la identificación se encuentra en un lado del biochip vuelto hacia el material biológico.

La solución técnica asegura que el enfoque del material biológico dispuesto sobre un biochip es altamente preciso y a la vez comparativamente rápido. Mediante la previsión de una identificación sobre el biochip, que preferiblemente ya se aplica al cubreobjetos antes de la subdivisión del propio cubreobjetos durante la producción del biochip, es posible un enfoque sencillo y fiable del material biológico, como se explicará en detalle más adelante. La aplicación de la identificación integrada en el proceso de fabricación del cubreobjetos ofrece aquí la ventaja de que la identificación es mucho más fácil de aplicar al cubreobjetos, aún no fragmentado, que a los biochips comparativamente pequeños.

Para que el proceso de enfoque sea eficaz, es esencial que la identificación esté situada sobre la superficie del biochip, que es relativamente plana en comparación con la superficie del material biológico y, por tanto, permite una determinación precisa de la distancia. A este respecto, es posible, en principio, proporcionar la identificación en un lado del biochip que esté vuelto hacia el material biológico o en un lado posterior del biochip que esté alejado de ese lado.

En un primer paso, inmediatamente antes del inicio del proceso de enfoque, se lleva a cabo la detección de la identificación, en particular la determinación de la distancia entre la lente y la identificación. A partir de la determinación de la posición y/o la ubicación de la identificación, en particular la distancia entre la identificación y el objetivo, se determina un intervalo objetivo. El intervalo objetivo tiene aquí una distancia máxima y mínima desde el objetivo, entre las que se encuentra la identificación y el material dispuesto sobre la superficie del biochip. En una forma de realización específica, después de que se determine el intervalo objetivo, tiene lugar además una focalización del material biológico dentro del intervalo objetivo. Como la búsqueda del enfoque se limita así al intervalo objetivo, el proceso de enfoque puede acortarse considerablemente.

La focalización de la identificación tiene lugar preferiblemente en un modo de luz transmitida, lo que tiene la ventaja, entre otras, de que el material biológico marcado con colorantes fluorescentes se ilumina sólo durante un corto período de tiempo en el rango de la longitud de onda de excitación y, por lo tanto, el desvanecimiento prematuro del colorante fluorescente puede ser contrarrestado de manera adecuada.

Sin embargo, es igualmente concebible en principio operar el enfoque en modo de fluorescencia. Esto es posible gracias al procedimiento de enfoque según la invención, sobre todo por el hecho de que el espacio de tiempo requerido para el proceso de enfoque se acorta en comparación con los procedimientos conocidos. Alternativa o adicionalmente, se utiliza una fuente de haz auxiliar, como un láser, para la detección de la identificación. El haz de un láser utilizado de este modo se refleja preferiblemente en la identificación y se recibe en un dispositivo receptor. A partir de la evaluación de la trayectoria del haz y/o del tiempo de recorrido, se puede determinar por lo tanto la distancia entre la identificación y el objetivo. Esto es posible porque la fuente del haz auxiliar, en particular el láser, está en una posición definida con respecto al objetivo.

Se puede utilizar cualquier patrón como identificación que sea reconocida por el dispositivo de enfoque. De manera ventajosa, son adecuadas las líneas de rejilla que tienen un espaciado equidistante en al menos una dirección de extensión. Estas líneas de rejilla se aplican al cubreobjetos o al biochip antes de que el material biológico, que es preferentemente la sección congelada de un tejido, se aplique al biochip. La identificación se lleva a cabo aquí de tal manera, que se puede excluir en gran medida cualquier interferencia entre la identificación y el material biológico aplicado al biochip.

Un perfeccionamiento especial prevé que estén previstos al menos tres contornos como identificación del biochip, cuyos centros son equidistantes. Tales contornos son reconocidos por el dispositivo de enfoque, de modo que el objetivo del microscopio puede enfocarse sobre la superficie del biochip o sobre el material biológico allí ubicado después de que se haya realizado el enfoque. En cualquier caso, con la ayuda de una identificación prevista sobre el biochip, según la invención, se asegura que la posición y/o la ubicación del biochip, en particular la distancia a la superficie del biochip desde el objetivo del microscopio se detecte de forma fiable. Los contornos previstos sobre la superficie del biochip se implementan preferentemente como círculos, cuyos centros son equidistantes entre sí. En este contexto, es concebible que una identificación de este tipo se aplique en la forma deseada a la superficie del biochip antes o después de la fragmentación del cubreobjetos,con ayuda de un dispositivo adecuado. Sin embargo, es igualmente concebible recubrir la superficie al menos parcialmente de forma plana y prever unas plantillas correspondientes para generar la identificación deseada, o bien generar unos contornos de identificación correspondientes tras el recubrimiento en plano, por ejemplo, mediante decapado.

En otra forma de realización, se prevé que una zona que rodea la identificación esté fijada no recogiendo ninguna imagen de la unidad de recogida de imágenes y/o no utilizando o descartando o borrando las imágenes recogidas en la unidad de evaluación durante el procesamiento. Mediante la previsión de una zona correspondiente alrededor de la identificación prevista sobre la superficie del biochip, se garantiza que las zonas de tejido o las células, que dado el caso puedan reaccionar con la identificación, no se tengan en cuenta en el examen del material biológico o en el diagnóstico de una muestra del paciente.

Según otro perfeccionamiento, está previsto que la identificación se implemente en forma de un recubrimiento en plano de la superficie del biochip. De manera ventajosa, en particular tres zonas del biochip están provistas de una identificación en plano. En un perfeccionamiento muy especial, toda la superficie del biochip destinada a la identificación está provista de una correspondiente identificación en plano. Mediante un recubrimiento de la superficie del biochip en todo o en parte, también se genera una señal correspondiente en el sensor de distancia sobre la base de la reflexión o la transmisión en la capa.

Ventajosamente, son adecuadas unas identificaciones, que presentan silicio, para la detección durante el trabajo con un microscopio automático. Alternativa o adicionalmente, es concebible que la identificación comprenda un metal, preferiblemente cromo. Asimismo, se pueden concebir capas dieléctricas, cuyas propiedades de reflexión espectrales estén optimizadas para el sensor de distancia y no influyan negativamente en el análisis de la imagen. Siempre que se utilice un metal o un dieléctrico para la identificación sobre la superficie del biochip, es concebible depositarlo por vapor o pulverizarlo sobre la superficie. Con respecto a la producción de un biochip identificado de forma correspondiente, esto tiene la ventaja de que la deposición de vapor de metal es fiable y puede llevarse a cabo de forma relativamente económica. En una forma de realización especial, también se pueden elaborar aquí contornos especiales a partir de la zona superficial totalmente depositada por vapor mediante decapado.

Según otra forma de realización, es concebible que el dispositivo para enfocar automáticamente el material biológico comprenda al menos una fuente de luz láser o una fuente de radiación policromática y un detector que reciba, al menos parcialmente, la luz reflejada por la identificación y, sobre la base de la luz recibida, genere una señal que se evalúe y, teniendo en cuenta la señal evaluada, tenga lugar el movimiento específico de la mesa en cruz para enfocar el material biológico. Cuando se utiliza una fuente de luz láser así como un detector, es ventajoso recubrir la superficie del biochip al menos parcialmente con un metal, como por ejemplo cromo, y así reflejar los rayos láser. Con la ayuda de la fuente de luz láser descrita del detector, es preferiblemente posible determinar la posición y/o ubicación de la superficie del biochip, sobre la que está dispuesto el material biológico.

La invención se caracteriza por un procedimiento para el examen automático de material biológico. El procedimiento según la invención con un microscopio, sobre cuya mesa en cruz se dispone el material biológico entre un portaobjetos o una placa de análisis y al menos una cobertura, en el que el material biológico se expone a la luz, en el que al menos una imagen del material biológico, ampliada con la ayuda del objetivo del microscopio, se registra con una unidad de registro de imágenes y se transmite a una unidad de evaluación, y en el que se detecta una identificación con un dispositivo para enfocar automáticamente el material biológico, se determina una posición y/o ubicación de la identificación, y sobre la base de la posición y/o ubicación detectada de la identificación, se lleva a cabo un enfoque del material biológico mediante el movimiento específico de la mesa en cruz, se ha perfeccionado de tal manera que el material biológico se proporciona sobre un biochip producido por fragmentación y división de un cubreobjetos, y que se aplica al portaobjetos, y que la identificación se detecta sobre una superficie del biochip. Según la invención, se determina un intervalo objetivo basado en la determinación de una ubicación y/o una posición de la identificación. El intervalo del objetivo tiene una distancia máxima y una distancia mínima al objetivo. Además, según la invención, el enfoque del material biológico sobre el biochip se realiza recogiendo imágenes en al menos dos planos diferentes dentro del intervalo objetivo y evaluando las mismas.

El procedimiento según la invención prevé determinar, basándose en la posición y/o ubicación detectada de la identificación, un intervalo objetivo, dentro del cual se traslada la mesa en cruz durante el enfoque. Mediante la previsión de un intervalo objetivo basado en la posición detectada y/o de la ubicación de la superficie del biochip que soporta el material biológico, se puede determinar de manera preferida un intervalo que incluya una zona por encima y por debajo de la superficie del biochip. Durante el proceso de enfoque, la mesa en cruz se mueve de tal manera, que el plano de enfoque se desplaza entre los límites del intervalo. De manera preferente, el recorrido de la mesa en cruz se limita por lo tanto a un valor adecuado durante el enfoque.

Basándose en la posición y/o ubicación detectada de la identificación, la mesa en cruz se traslada de esta manera desde al menos una primera posición, en la que el objetivo está a una primera distancia del material biológico, a una segunda posición, en la que el objetivo está a una segunda distancia del material biológico, y asimismo se registra respectivamente al menos una imagen del material biológico en dos planos diferentes entre la primera y la segunda posición y se transmite a la unidad de evaluación. En este contexto, es fácilmente concebible que cuando al menos dos imágenes son recogidas en planos diferentes, estas imágenes tengan diferente nitidez. Mediante la evaluación de las imágenes recogidas dentro del intervalo objetivo en al menos dos planos diferentes utilizando procedimientos conocidos de evaluación de datos de imagen, se puede determinar finalmente de forma preferida la imagen más nítida. La selección de la imagen más nítida se utiliza a su vez para determinar el plano focal.

Con el procedimiento descrito, es por tanto ventajosamente posible determinar un plano focal sobre la base de una comparación de las imágenes recogidas en la unidad de evaluación. Las imágenes recogidas y que se encuentran igualmente dentro del plano focal se transmiten finalmente a un dispositivo para establecer diagnósticos. Preferiblemente, se trata aquí de una unidad de procesamiento de datos, en particular un ordenador, en el que está instalado un software de laboratorio. Con la ayuda del software del laboratorio, las imágenes recogidas para una muestra específica del paciente se asignan a un juego de datos del paciente y se archivan de forma correspondiente. El médico encargado de elaborar un diagnóstico puede visualizar rápidamente en una pantalla todos los datos relativos a la muestra del paciente examinada de forma relativamente sencilla.

A continuación, la invención se explica con más detalle en base a unos ejemplos de realización, sin limitar la idea general de la invención, en base a las figuras. Aquí muestran:

la Fig. 1: portaobjetos con biochips;

la Fig. 2: vista en corte del campo de reacción de un portaobjetos con biochip;

la Fig. 3: vista en planta sobre un biochip con identificación;

la Fig. 4: representación esquemática de un microscopio con enfoque automático;

la Fig. 5: vista frontal de un microscopio con enfoque automático;

la Fig. 6: vista lateral de un microscopio con enfoque automático y

la Fig. 7: vista isométrica de un microscopio con enfoque automático.

La figura 1 muestra en primer lugar un portaobjetos de microscopio 1 con biochips 2 dispuestos sobre el mismo. Para ello, el portaobjetos de microscopio 1 tiene diez campos de reacción 3, que están diseñados como pequeñas depresiones en comparación con la superficie restante del portaobjetos de microscopio 1. Los biochips 2 están dispuestos sobre los campos de reacción 3. En principio, es concebible prever uno o también varios biochips 2 sobre un campo de reacción 3. En este contexto, es posible, por supuesto, adaptar el tamaño de los campos de reacción 3 de una forma adecuada.

En el caso de los biochips 2 se trata de pequeños portadores con material biológico que se han fabricado recubriendo un cubreobjetos estándar con una sección de tejido y luego fragmentando el cubreobjetos. Mientras que en el caso de un cubreobjetos estándar se trata de una plaquita de vidrio rectangular o redonda de unos 100 pm a 200 pm de grosor, que suele tener una superficie de 18 x 18 mm2, los biochips 2 son fragmentos de cubreobjetos recubiertos con un material biológico adecuado, por lo que tienen una superficie muchas veces menor. Dependiendo del perfil de examen respectivo, así como de la solicitud del cliente, se puede prever una pluralidad de campos de reacción 3 para los correspondientes biochips 2 sobre un portaobjetos 1. A este respecto, también es concebible prever más de un biochip con diferentes tejidos sobre un campo de reacción 3.

Durante un examen en el laboratorio, las secciones de tejido dispuestas sobre los campos de reacción 3 del portaobjetos 1 y recubiertas de tejido se incuban con diferentes fluidos, en particular con una muestra del paciente. Una vez finalizada la incubación y antes de la microscopía, la sección de tejido incubada se recubre con una glicerina tamponada con pH como medio de cobertura y se cubre con un cubreobjetos 4. El cubreobjetos 4 está dispuesto de tal manera que, aunque se encuentre a una distancia segura de la superficie de la sección de tejido, pueda ser visualizado sin problemas con un microscopio.

La figura 2 muestra una vista en sección muy ampliada de un campo de reacción 3 de un portaobjetos de microscopio 1. Sobre el campo de reacción 3 del portaobjetos de microscopio 1 hay un biochip 2 recubierto con una parte de una sección de tejido 6. La sección de tejido está recubierta con un medio de cobertura 5 y cubierta por un cubreobjetos 4. En el lado vuelto hacia el microscopio, la superficie del biochip 2 que soporta la sección de tejido 6 tiene una identificación 7 en forma de líneas.

De forma complementaria a esto, la figura 3 muestra una vista en planta del biochip 2 dispuesto sobre el campo de reacción 3 del portaobjetos. Las líneas utilizadas como identificación 7 están dispuestas a modo de grupos con varios círculos concéntricos sobre la superficie. Durante la microscopía, la identificación 7 se detecta mediante un dispositivo de enfoque automático del material biológico 6 presente en el biochip, y se realiza el enfoque. Opcionalmente, la extensión de la identificación 7 en la dirección Z se tiene en cuenta durante el proceso de enfoque, para conseguir optimizar el proceso de enfoque. De esta manera, la identificación prevista en el biochip 2 sirve para detectar el plano focal. En la identificación 7 es esencial que la misma no reaccione con el material biológico 6 presente sobre el biochip 2.

Como alternativa al modo de realización de la identificación 7 en forma de grupos de círculos concéntricos mostrado en la figura 3, es concebible aplicar líneas paralelas o un patrón de rejilla a la superficie del biochip 2. Asimismo, son posibles identificaciones en plano 7, en particular con un metal o dieléctrico.

Además de esto, una identificación 7 prevista de acuerdo con la invención puede preverse en la cara superior del biochip 2, es decir, en la cara vuelta hacia al tejido 6 situado por encima, o en la cara posterior, es decir, sobre la superficie vuelta hacia el portaobjetos de microscopio 1. En cada caso, es esencial que la identificación 7 pueda ser detectada de forma fiable por el dispositivo de enfoque automático del material biológico 6 situado sobre el biochip 2. Dependiendo del modo de realización y de la disposición de la identificación 7, la extensión de la identificación 7 en la dirección Z y/o el grosor del biochip 2, que soporta el tejido, se tiene en cuenta asimismo a la hora de establecer el plano focal.

Para examinar una muestra de un paciente, está previsto un portaobjetos 1 equipado con una pluralidad de biochips 2 cubiertos con un cubreobjetos 4, como se muestra en la figura 1. Sobre los distintos biochips 2 se encuentran aquí diferentes tejidos 6 o material biológico. El portaobjetos 1 con los biochips 2 se coloca y bloquea en la mesa en cruz 9 de un microscopio 8. En este contexto, es concebible que el portaobjetos 1 se coloque en la mesa en cruz 9 manualmente o con la ayuda de un dispositivo de manipulación 13. En particular, en el caso de los microscopios 8 operados en un laboratorio al menos parcialmente automatizado, los portaobjetos incubados 1 con los biochips 2 se almacenan en cajas de portaobjetos adecuadas 12 y se mueven entre éstas y la mesa en cruz 9 de forma automatizada, con la ayuda de un dispositivo de manipulación 13. Un dispositivo de manipulación adecuado 13 comprende preferentemente una pinza, en donde la pinza puede moverse en relación con la mesa en cruz 9 o junto con la mesa en cruz.

En cualquier caso, los portaobjetos 1 tienen unas marcas 14 en forma de inscripción o código, que permiten identificar con precisión la muestra del paciente situada en los biochips 2 y, preferiblemente, también los tipos de tejido situados sobre los biochips 2.

La figura 4 muestra un diagrama esquemático de un microscopio de fluorescencia 8 con un dispositivo de luz transmitida, una mesa en cruz desplazable verticalmente 9 y una cámara digital 17 para el registro de imágenes. Además de esto, está previsto un dispositivo de luz de excitación que comprende un divisor de haz dicromático 18 y una fuente de luz de excitación 16. El divisor de haz 18 refleja la luz de excitación emitida desde la fuente de luz de excitación 16 en dirección al material biológico 6 dispuesto sobre el biochip 2. En cambio, la luz transmitida emitida desde la fuente de luz transmitida 15 y redirigida por un espejo de desviación 23, se transmite desde la dirección del biochip 2 que contiene el material biológico 6. El divisor de haz dicromático 18 está diseñado preferentemente como un filtro de paso por reflexión y refleja todas las longitudes de onda por debajo de 510 nm. En términos simplificados, el divisor de haz dicromático 18 actúa así como un espejo de desviación para la luz de excitación, mientras que la luz con la longitud de onda de fluorescencia pasa por el divisor de haz 18 sin obstáculos. De forma complementaria al divisor de haz o filtro de paso por reflexión 18, que refleja completamente la luz de excitación, está previsto preferiblemente un filtro de bloqueo de paso largo 19, que filtra la luz con longitudes de onda inferiores a 510 nm.

En el ejemplo de realización aquí descrito, el colorante fluorescente utilizado es la fluoresceína, cuyo máximo de absorción es de 485 nm y cuyo máximo de emisión es de 514 nm. Un aspecto esencial de la tecnología descrita es que la cámara digital 17 dispuesta en la dirección de la trayectoria del haz detrás del filtro de bloqueo de paso largo 19 debe recoger imágenes en la fluorescencia así como imágenes en la luz transmitida. Por esta razón, la fuente de luz transmitida 15 está diseñada como un LED con una longitud de onda de 520 a 535 nm. La luz de esta longitud de onda pasa a través del divisor de haz 18 y del filtro de bloqueo 19.

Para el proceso de enfoque, el dispositivo de luz transmitida utiliza la fuente de luz transmitida 15 para generar luz que tiene la longitud de onda en el rango de la longitud de onda de emisión del colorante fluorescente utilizado. En este caso, la luz emitida por la fuente de luz transmitida 15 es enfocada mediante una óptica adecuada 22 y, a continuación, desviada verticalmente hacia arriba por el espejo deflector 23, para irradiar desde abajo a través del biochip 2 con el material biológico 6 situado sobre el mismo.

En el caso del material 6 utilizado, que se aplica al biochip 2, se trata, por ejemplo, de células epiteliales humanas cultivadas a las que se unen anticuerpos contra los núcleos celulares, que se han teñido con anticuerpos antihumanos marcados con fluoresceína. Dado que el máximo de absorción, es decir, la longitud de onda de excitación de la fluoresceína, está en 485 nm, el colorante no es excitado hasta llegar a la fluorescencia mediante la luz transmitida. Como se puede ver además en la figura 4, la luz transmitida emitida desde la fuente de luz transmitida 15 en la dirección horizontal es primero enfocada por la óptica 22 y, a continuación, desviada en la dirección vertical mediante el espejo de desviación 23. La luz transmitida pasa a través del biochip 2 que contiene el material biológico 6 dispuesto en la mesa en cruz 9, es enfocada por el objetivo 20 del microscopio 8 y pasa, sin obstáculos, a través del divisor de haz dicromático 18 y el filtro de bloqueo de paso largo 19, para llegar después al sensor de la cámara digital 17. La cámara digital 17 produce la imagen de luz generada de las paredes celulares del material biológico 6, con un tiempo de exposición relativamente corto de unos 10 ms.

Con el fin de minimizar el número de imágenes recogidas en diferentes planos perpendiculares al eje z y necesarias para el enfoque en modo de luz transmitida, el biochip 2 tiene una identificación 7 sobre su superficie y el microscopio 8 tiene un dispositivo para detectar esta identificación. Antes de iniciar el proceso de enfoque en el modo de luz transmitida, se determina primero la distancia de la identificación 7 al objetivo 20 y/o su posición con respecto al objetivo 20. Para ello, está prevista una fuente de luz o de haz, que emite luz, que finalmente es reflejada por la identificación 7 y detectada por un sensor adecuado. Teniendo en cuenta el tiempo de propagación y/o la trayectoria del haz, se determina la distancia de la identificación 7 al objetivo 20 y/o su posición respecto al objetivo 20. Opcionalmente, el grosor de la identificación 7, es decir, su extensión en la dirección z, también se tiene en cuenta para la antes mencionada determinación de la distancia y/o de la posición. Teniendo en cuenta la distancia establecida de la identificación 7 al objetivo, la mesa en cruz 9 se desplaza en la dirección z por medio de un motor 24 de tal manera, que el enfoque en el modo de luz transmitida se realiza sólo dentro de una determinada zona meta. Dentro de esa zona meta, que representa un intervalo de distancia de unos pocos micrómetros en la dirección z, se registran unas cuantas imágenes, preferiblemente tres, en diferentes planos en el modo de luz transmitida. A continuación de ello, o al menos parcialmente de forma simultánea, se establecen unos valores de la nitidez respectiva de cada imagen individual mediante un sistema de procesamiento de datos conectado (no mostrado), con ayuda del conocido procedimiento de diferencia suma-módulo (SMD). La imagen, para la que este valor es máximo, se identifica como la imagen más nítida y la posición vertical correspondiente (en la dirección z) de la mesa en cruz se establece como plano focal.

Independientemente del tipo y del modo de realización de la identificación sobre el biochip, las zonas de las imágenes que representan el campo cercano de la identificación no se consideran preferiblemente a la hora de establecer el plano focal. Esto se hace para asegurar que las porciones del material biológico 6 situado sobre el biochip 2, que pueden ser objeto de interferencia por la identificación, no se consideren en la evaluación.

Después de que se haya desconectado la fuente de luz transmitida 15, la mesa en cruz 9 se mueve respecto al plano focal establecido en la luz transmitida. Para generar una imagen de fluorescencia, se conecta la fuente de luz de excitación 16, que está ejecutada como un LED. La luz emitida se enfoca mediante una óptica adecuada 21 e incide en el divisor de haz dicromático 18 descrito anteriormente, que refleja la luz de excitación hacia abajo y la dirige de esta forma, a través del objetivo 16, hacia el material biológico 6 sobre el biochip 2. Allí, la luz de excitación incide sobre el colorante fluorescente que, como resultado de esta excitación, emite luz difusa a la longitud de onda principal de 514 nm. Una pequeña porción de esta radiación fluorescente se emite en dirección verticalmente ascendente, pasa por el objetivo 16 y atraviesa el divisor de haz dicromático 18 y el filtro de bloqueo de paso largo 19, para ser registrada por la cámara digital 17.

Debido a un largo tiempo de exposición de aproximadamente 500 ms, la cámara 17 genera una imagen de fluorescencia. Dado que la localización de la fluorescencia varía dentro de la altura del material biológico 6, el plano focal en la fluorescencia puede diferir del plano focal encontrado en la luz transmitida. Para determinar el plano focal exacto, seguidamente también se registran algunas imágenes de fluorescencia en una zona de búsqueda que sólo tiene unos pocos micrómetros de tamaño. Al igual que en la luz transmitida, la posición de la mesa en cruz se modifica aquí en la dirección vertical (dirección z) mediante un motor para cada imagen. La imagen de fluorescencia más nítida se establece mediante el procedimiento de la diferencia suma-módulo (SMD).

Debido al enfoque inicial realizado en la luz transmitida, la zona en la que debe establecerse el plano focal en la fluorescencia es comparativamente pequeña. De este modo, se pueden minimizar los tiempos durante los cuales el colorante fluorescente se excita para emitir radiación y, por tanto, se consume al menos parcialmente. Además, los tiempos de exposición en la luz transmitida son considerablemente más cortos que en la fluorescencia. Para lograr una reducción adicional del tiempo necesario para el autoenfoque, la identificación 7 prevista sobre los biochips garantiza que sólo sea necesario registrar unas pocas imágenes, preferiblemente 3, en la luz transmitida. Sin la previsión de una identificación adecuada, normalmente se registran unas 100 imágenes en la luz transmitida durante el enfoque. La duración del enfoque de la luz transmitida se reduce así de 100 x 10 ms = 1 s a 3 x 10 ms = 30 ms, teniendo en cuenta el tiempo de exposición respectivo.

Si todo el proceso de autoenfoque se realizara en la luz de fluorescencia, la duración del enfoque aumentaría incluso a unos 200 x 500 ms = 100 s. Incluso si, debido al largo tiempo de exposición en la fluorescencia, los cálculos para la nitidez de la imagen (SMD) pueden discurrir en paralelo al registro de imágenes y, por lo tanto, el registro de imágenes puede detenerse tan pronto como se haya encontrado la imagen más nítida, seguiría siendo necesario un tiempo de exposición acumulado de unos 50 s de media.

Las figuras 5, 6 y 7 ilustran cada una un microscopio de fluorescencia 8 para el examen automatizado de muestras biológicas 6. Los componentes idénticos están provistos a su vez con los mismos símbolos de referencia. El microscopio 8 mostrado tiene un dispositivo para enfocar automáticamente el material biológico 6, que está diseñado para detectar una identificación 7 prevista sobre los biochips 2 dispuestos sobre los portaobjetos 1 y, sobre la base de esta detección en la dirección z, determinar una zona meta, dentro de la cual se encuentra el plano focal. Sólo se necesitan unos pocos registros de imágenes para determinar con exactitud el plano focal, por lo que el enfoque automático puede acelerarse considerablemente en comparación con los sistemas conocidos.

El microscopio de fluorescencia 8 tiene un alojamiento, al que se puede fijar una caja de portaobjetos 12 que sirve para almacenar y proporcionar varios portaobjetos 1. Con la ayuda de un dispositivo de manipulación 13, que está ejecutado como una pinza fijada a la mesa en cruz 9, los portaobjetos 1 necesarios para un examen pueden extraerse específicamente de la caja de portaobjetos 12 y depositarse de nuevo en la misma. Tanto la caja de portaobjetos 12 como los portaobjetos individuales 1 tienen una marca en forma de inscripción o código, con el fin de garantizar una clara identificación en cada caso. La puesta a disposición, el procesamiento y el examen de las muestras se controlan con la ayuda de un software de laboratorio, que también se utiliza para archivar y emitir los resultados del examen. En la preparación para el procedimiento de microscopía, se extrae de la caja de portaobjetos 12 un denominado portador 25, en el que se sujetan los portaobjetos 1 necesarios, y se retiene en la posición deseada sobre la mesa en cruz 9 con ayuda del dispositivo de manipulación 13.

La configuración de un portador 25 puede verse a modo de ejemplo en la Figura 8. El portador 25 mostrado está ejecutado en forma de marco y dispone de cinco alojamientos para portaobjetos 1. Los portaobjetos 1 con los biochips 2 dispuestos sobre ellos sobre diez campos de reacción 3 respectivamente se sujetan de forma segura mediante el portador 25 y pueden almacenarse de esta manera, y transportarse de forma fiable.

Después de retirar un portador 25 de la caja de portaobjetos 12 mediante el dispositivo de manipulación 12 en forma de pinza, el posicionamiento se realiza de tal manera que, en última instancia, el biochip 2 destinado a ser examinado se encuentra por debajo del objetivo 10 del microscopio. Por encima del objetivo 16 se encuentra la cámara digital 17, con la que se recogen las imágenes necesarias. La disposición de las fuentes de luz transmitida y de excitación 15, 16 y de los demás componentes ópticos corresponde a la explicada en relación con la descripción de la figura 4.

El proceso de autoenfoque ya descrito, que incluye la detección de la identificación 7 sobre los biochips, así como la recogida de imágenes en diferentes planos, tiene lugar primero en una zona central del biochip examinado en cada caso. A continuación de ello, enfoque adicionales y registros de imágenes ligados a ellas se llevan a cabo en otras dos zonas del biochip 2, situadas a la izquierda o a la derecha del centro, respectivamente. Para ello, la mesa en cruz 9 se traslada respectivamente en dirección horizontal.

En cada caso, es esencial que la identificación 7 sobre los biochips 2 se detecte primero durante el proceso de enfoque, para, de esta manera, limitar razonablemente la zona horizontal en la que se espera que se sitúe el plano focal y para optimizar el proceso de enfoque automatizado con relación al tiempo requerido.

Lista de símbolos de referencia

1 Portaobjetos

2 Biochip

3 Campo de reacción

4 Cubreobjetos

5 Medio de cobertura

6 Material biológico

7 Identificación

8 Microscopio

9 Mesa en cruz

10 Objetivo

11 Dispositivo de enfoque automático

12 Caja de portaobjetos

13 Dispositivo de manipulación

14 Marca

15 Fuente de luz transmitida

16 Fuente de luz de excitación

Cámara digital

Divisor de haz dicromático

Filtro de bloqueo de paso largo Objetivo

Óptica de la fuente de luz de excitación Óptica de la fuente de luz transmitida Espejo de desviación

Motor

Portador

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. - Procedimiento para el examen automatizado de material biológico (6) con un microscopio (8), sobre cuya mesa en cruz (9) el material biológico (6) está dispuesto entre un portaobjetos (1) o una placa de análisis y al menos una cobertura (4), en el que el material biológico (6) está expuesto, en el que al menos una imagen del material biológico (6), ampliada con la ayuda del objetivo (10) del microscopio (8), se registra con una unidad de registro de imágenes (17) y se transmite a una unidad de evaluación, y en el que un dispositivo para el enfoque automático (11) del material biológico (6) detecta una identificación (7), determina una posición y/o ubicación de la identificación (7) y, en base a la posición y/o ubicación detectada de la identificación de identificación (7), enfoca el material biológico (6) mediante un movimiento específico de la mesa en cruz, caracterizado porque el material biológico (6) se proporciona sobre biochip (2) producido por fragmentación y división de un cubreobjetos, sobre el que se dispone el material biológico (6), y porque la identificación (7) se detecta sobre una superficie del biochip (2),

- en donde se determina un intervalo objetivo, basado en la determinación de una ubicación y/o una posición de la identificación,

- en donde el intervalo objetivo tiene una distancia máxima y mínima al objetivo,

- y en donde se lleva a cabo un enfoque del material biológico sobre el biochip, por medio de que se recogen unas imágenes en al menos dos planos diferentes dentro del intervalo objetivo y se evalúan las mismas.

2. - Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque, en base a la posición detectada y/o a la ubicación de la identificación (7), se determina una zona meta, dentro de la cual se traslada la mesa en cruz (9) durante el enfoque.

3. - Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque, sobre la base de la posición detectada y/o la ubicación de la identificación (7), la mesa en cruz (9) se traslada al menos desde una primera posición, en la que el objetivo (10) está a una primera distancia del material biológico (6), a una segunda posición, en la que el objetivo (10) está a una segunda distancia del material biológico (6), y se registra al menos una imagen del material biológico (6) en cada uno de los dos planos diferentes entre la primera y la segunda posición, y se transmite a la unidad de evaluación.

4. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utiliza luz de diferentes longitudes de onda para detectar la identificación (7) y para exponer el material biológico (6).

5. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque durante el enfoque y mientras la mesa en cruz (9) se encuentra dentro de la zona meta, el material biológico (6) se expone y se registra respectivamente al menos una imagen del material biológico (6) en dos planos diferentes dentro de la zona meta y se transmite a la unidad de evaluación.

6. - Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque un plano focal se determina sobre la base de una comparación de las imágenes registradas en la unidad de evaluación.

7. - Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque las imágenes que se encuentran en el plano focal se transmiten a un dispositivo para establecer diagnósticos.