JP2008073045A - 全長抗体の製造方法並びに該方法の実施のためのe.コリ菌株 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するE.コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するE.コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該E.コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法によって解決される。
【選択図】なし
Description
− BLR:Novagen
− K802:CGSC*#5610
− WCM100:EP0338410号B1に従って製造できる
− MM28:CGSC*#5892
− RV308:ATCC**#31608;EP0677109号B1
− RR1:ATCC**#31434
− EP497757号B1に従って製造されるE.コリ菌株
− E.コリ菌株の"漏出性(Leaky)"突然変異体
* 大腸菌ストックセンター(E.coli Genetic Stock Center)CGSC(830 Kline Biology Tower,MCD Biology Department,266 Whitney Ave.,PO box 208103,Yale University,New Haven)から購入できる
** LGC Promochem(Mercatorstr.51,46485 Wesel,ドイツ在)から購入できる
概念"漏出性"突然変異体とは、細胞外膜もしくは細胞壁の構造要素における突然変異に基づき、ペリプラズム性のタンパク質の培地への放出が高まったE.コリ−突然変異体をまとめたものを表す(Shokri他著、Appl.Microbiol.Biotechnol.,2003,60,654−664)。好ましい代表は、以下の遺伝子:omp遺伝子、tol遺伝子、excD遺伝子、excC遺伝子、lpp遺伝子、env遺伝子及びlky遺伝子に突然変異を有するE.コリ菌株である。
− JF733=CGSC*#6047
− A592=CGSC*#4923
− A593=CGSC*#4924
− A586=CGSC*#4925
− CAG12184=CGSC*#7437
− G11e1=CGSC*#5169
− JE5511=CGSC*#6673
− E610=CGSC*#6669
− E623=CGSC*#6671
− JE5505=CGSC*#6672
− PM61=CGSC*#6628
− PM61R=CGSC*#6629
− JP1228=CGSC*#6703
− 207=CGSC*#6686
− AE84064=CGSC*#6575
ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するE.コリ菌株を、全長抗体の製造のために使用できることは、以下の理由からまったく驚くべきことである。E.コリのペリプラズムへの組み換えタンパク質の分泌は、通常は、宿主細胞のSec装置によって行われる。その際、所望のタンパク質の遺伝子を、通常E.コリからSec装置を利用して排出されるようなタンパク質のシグナル配列と機能的に結合させる。ペリプラズム中への分泌が行われた後に、シグナルペプチダーゼ(例えばE.コリの場合にはLepB)によってそれぞれのシグナルペプチドが開裂される。タンパク質は、このように折り畳まれていない状態で細胞質膜を通じて輸送される。ペリプラズムにおいて、これらのタンパク質は、その際、ペリプラズム性のシャペロン、例えばジスルフィド−イソメラーゼ(Dsb−タンパク質)又はペプチジルプロリル−シス,トランス−イソメラーゼ(例えばFkpA)によって、正しい二次構造、三次構造及び四次構造に折り畳まれて会合される。この過程は、全長抗体の製造においては特に費用のかかるものである。それというのも係るタンパク質では、個々のタンパク質鎖が、Sec系によってまず、i)互いに独立してペリプラズム中に輸送され、ii)そこで正しく折り畳まれねばならず、iii)ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成され、iv)2つの軽鎖が2つの重鎖と正しい形で会合され、かつv)ペプチド内のジスルフィド結合が正しく形成されねばならないからである。従って、当業者は、今までは、該タンパク質を培地中に遊離させることは、係る複雑なフォールディング過程と会合過程で阻まれ、従って正しく折り畳まれた抗体をより高い収率で発酵培地中に放出させることは不可能であるということから出発している。全長抗体をペリプラズムで製造する場合でさえ高い収率の正しく折り畳まれた抗体は、付加的にペリプラズム性のシャペロンを同時発現させた場合にのみ得られると教示しているのだからなおさらである(WO02/061090号)。
本実施例は、抗組織因子(αTF)IgG1−抗体の製造を記載している。
配列番号2を有するDNA断片(重鎖)を、遺伝子合成によって製造し、そして該DNA断片は、E.コリのompA遺伝子のシグナル配列と、抗αTF抗体の重鎖のための読み枠とからなる遺伝子融合物を含む。このDNA断片を、まず制限酵素EcoRI及びPstIで切断し、そして同じ制限酵素で切断されている発現ベクターpJF118utとライゲーションした。このクローニングから得られた、重鎖のための遺伝子の発現がtacプロモーターの制御下にあるプラスミドを、pHC−Anti−TF(図2)と呼称した。
Claims (16)
- 正しく折り畳まれた会合された全長抗体をE.コリ菌株によって製造するための方法において、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するE.コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するE.コリ菌株を、培養培地中で発酵させ、その際、該E.コリ菌株が、全長抗体を培養培地中に分泌し、そしてその全長抗体を培養培地から分離することを特徴とする方法。
- 請求項1記載の方法において、E.コリ菌株が、BLR、K802、WCM100、MM28、RV308、RR1、EP497757号B1に従って製造されるE.コリ菌株、E.コリ菌株の"漏出性"突然変異体の群から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項2記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の遺伝子:omp遺伝子、tol遺伝子、excD遺伝子、excC遺伝子、lpp遺伝子、env遺伝子及びlky遺伝子の1つに突然変異を有することを特徴とする方法。
- 請求項2又は3記載の方法において、"漏出性"突然変異体が、以下の群:JF733、A592、A593、A586、CAG12184、G11e1、JE5511、E610、E623、JE5505、PM61、6628、PM61R、JP1228、207、AE84064からのE.コリ菌株であることを特徴とする方法。
- 請求項1から4までのいずれか1項記載の方法において、抗体が、ペリプラズム性のシャペロンを同時発現させることなく160mg/lより高い収率で得られることを特徴とする方法。
- 請求項1から5までのいずれか1項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列が、E.コリのphoA遺伝子もしくはompA遺伝子のシグナル配列又は配列番号1の配列を有するシグナル配列から選択されることを特徴とする方法。
- 請求項1から6までのいずれか1項記載の方法において、軽鎖と重鎖の遺伝子の5′末端が、読み枠内で、シグナルペプチドをコードする異なるシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
- 請求項7記載の方法において、抗体の一方の鎖をコードする遺伝子の5′末端が、読み枠内で、E.コリのphoA遺伝子もしくはompA遺伝子のシグナル配列と機能的に結合されており、かつ抗体のもう一方の鎖をコードする遺伝子の5′末端が、読み枠内で、配列番号1のシグナル配列と結合されていることを特徴とする方法。
- 請求項1から8までのいずれか1項記載の方法において、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、1つのオペロンにまとめられていることを特徴とする方法。
- 請求項1から9までのいずれか1項記載の方法において、16〜150時間の時間にわたり発酵させることを特徴とする方法。
- 請求項1から10までのいずれか1項記載の方法において、発酵を、10〜70%飽和の、有利には30〜60%飽和の、特に有利には45〜55%飽和の酸素分圧(pO2)で行うことを特徴とする方法。
- 請求項1から11までのいずれか1項記載の方法において、培養培地中のpH値が、pH6〜pH8、有利にはpH6.5〜pH7.5、特に有利にはpH6.8〜pH7.2であることを特徴とする方法。
- 請求項1から12までのいずれか1項記載の方法において、温度を、遺伝子発現の誘導前に、30℃から25℃に、有利には30℃から20℃に低下させることで、"封入体"の形成を回避することを特徴とする方法。
- 請求項1から13までのいずれか1項記載の方法において、全長抗体の培養培地からの分離を、第一段階においては、遠心分離もしくは濾過のような分離法によって行い、次いで抗体を限外濾過によって濃縮させ、引き続き沈降、クロマトグラフィーもしくは限外濾過によって、特に有利には親和性クロマトグラフィーによって更に精製することを特徴とする方法。
- 正しく折り畳まれた全長抗体の製造のための、ペリプラズム性のタンパク質を培地中に放出するE.コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子を有するE.コリ菌株。
- 請求項15記載のE.コリ菌株であって、シグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の重鎖をコードする遺伝子並びにシグナルペプチドをコードするシグナル配列と機能的に結合された、抗体の軽鎖をコードする第二の遺伝子が、E.コリにおいて機能的な発現シグナル、有利にはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターを備えていることを特徴とするE.コリ菌株。
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