JP2007533305A - 微小流動環境において細胞および生体分子を単離するための磁気装置 - Google Patents
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Abstract
Description
血液などの複雑な混合物から均一な細胞集団を分離するように工夫されているいくつかの方法がある。これらの細胞分離技法は、2つの広いカテゴリーに分類することができる:(1)種々の細胞特異的マーカーを使用して固定し、染色された細胞の選択に基づいた侵襲的方法;および(2)関心対象の細胞集団に特異的な生物物理的パラメーターを使用して生細胞を単離する非侵襲的方法。
本発明は、細胞、タンパク質、DNAおよび他の分子を単離、濃縮および精製するために使用される新規で、有用な磁気装置およびそれを使用する方法を特徴とする。一般に、本発明の装置は、磁気領域または磁気粒子が結合することができる障壁を含む。次いで、磁気粒子の表面の化学基、すなわち、捕獲部分を使用して粒子、例えば、関心対象の細胞または分子を複雑な試料から結合することができ、次いで結合した種を下流の回収またはさらなる分析のために選択的に放出することができる。
装置
本発明は、複数の磁気障壁を含む、典型的には、微小流動装置を特徴とする。最も簡単な態様において、本装置は、磁気粒子が磁気的に結合して、チャネルを通過する分析物が接触することができる型押し面を作製することができる磁気領域を有するチャネルを含む。これらの磁気粒子を適当な捕獲部分でコーティングすることによって、親和性機序によって所望の分析物に結合することができる。磁気粒子はチャネルを織ったように作製する働きをすることができ、チャネルの寸法に対して磁性粒子サイズおよび形状を適当に選択することによって、関心対象の分析物と磁気粒子の相互作用を増強する構成を提供することができる。磁気粒子は、磁場を形成するように作動されるチャネルの硬磁性領域または軟磁性領域に磁気的に結合することができる。また、これらの磁気粒子は、例えば、装置を流動する流体の全体の流速を増加することによって、磁場を低下することによって、または2つの何らかの組み合わせによって、チャネル内の規定された位置から放出することができる。一態様において、空間的に不均一な永久磁石または電磁石を使用して、組織化された、ある場合には、周期的な配列の磁気粒子を未構成の微小流動チャネルに作製することができる(Deng et al., Applied Physics Letters, 78, 1775 (2001))。電磁石を使用して、装置に不均一な磁場を作製することができる。不均一な磁場は、装置内に定期的な配列で磁気粒子を引き付ける高磁場強度または低磁場強度を作製する。他の外部磁場を使用して、磁気粒子が結合する磁気領域を作製することができる。硬磁性材料も装置の製造に使用することができ、それによって電磁石または外部磁場の必要性を除くことができる。一態様において、本発明の装置は、例えば、容量スループットを増加するために、磁気領域を有する複数のチャネルを含む。さらに、これらのチャネルは垂直方向に積層することができる。
種々の技法を使用して本発明の装置を製造することができ、使用する技法は、一部には、最適な材料に基づいて選択される。本発明の装置を製造するための例示的な材料には、ガラス、シリコン、スチール、ニッケル、他の金属、ポリ(メチルメタクリレート)(PMMA)、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリオレフィン、シリコーン(例えば、ポリ(ジメチルシロキサン))、セラミックおよびそれらの組み合わせが挙げられる。他の材料は当技術分野において公知である。これらの材料のチャネルを製造する方法は当技術分野において公知である。これらの方法には、フォトリソグラフィー(例えば、ステレオリソグラフィーまたはx線フォトリソグラフィー)、成形、エンボス加工、シリコンマイクロ加工、湿式または乾式化学エッチング、フライス加工、ダイアモンド加工、リソグラフィー、電鋳および成形(Lithographie Galvanoformung and Abformung)(LIGA)、ならびに電気メッキが挙げられる。例えば、ガラスには、フォトリソグラフィーおよび湿式(KOH)または乾式エッチング(フッ素または他の反応性ガスによる反応性イオンエッチング)を含む従来のシリコン製造技法を使用することができる。レーザーマイクロ加工などの技法を、光子吸収効率の高いプラスチック材料に採用することができる。この技法は、方法の段階的な性質のために低スループット製造に好適である。大量生産されるプラスチック装置には、熱可塑性射出成形および圧縮成形が好適である。コンパクトディスクを大量製造するために使用される従来の熱可塑性射出成形(形状の忠実性をサブミクロンで保持する)を使用しても本発明の装置を製造することができる。例えば、従来のフォトリソグラフィーによって装置の形状をガラスマスターに複製する。ガラスマスターを電鋳して、強靭で、耐熱衝撃性で、熱伝導性のハードモールドを形成する。このモールドは、形状をプラスチック装置に射出成形または圧縮成形するためのマスター鋳型として働く。装置を製造するために使用するプラスチック材料ならびに最終製品の光学的品質およびスループットの要件に応じて、圧縮成形または射出成形を製造方法として選択することができる。圧縮成形(ホットエンボス加工または凸版インプリンティングとも呼ばれる)は、高分子量ポリマーと適合性であるという利点を有し、小型構造物に優れているが、高アスペクト比の構造物を複製する際の使用は困難であり、サイクルタイムが長い。射出成形は高-アスペクト比構造物に効果があるが、低分子量ポリマーに最も好適である。
(式中、Fbは、容積Vbの常磁性実体に作用する磁力であり、Δχは磁気ビーズχbと周囲の媒体χfの磁化率の差であり、μoは自由空間の透磁率であり、Bは外部磁場であり、∇は勾配演算子である)である。磁場は、典型的には、捕獲部分に結合している広範囲の微粒子、コロイドおよび分子状常磁性実体の誘引および保持を可能にするように制御し、調節することができる。
磁場に応答する任意の磁気粒子を本発明の装置および方法に使用することができる。望ましい粒子は、例えば、化学反応、物理的吸着、エンタングルメントまたは静電相互作用によって化学的または物理的に改良することができる表面化学を有するものである。
本発明の方法は、例えば、混合物の一部としての分析物と装置の表面を接触させる段階を含み、試料中の所望の分析物(例えば、胎児細胞、病原体細胞、癌細胞または細菌細胞などの稀な細胞)は装置に保持される。次いで、関心対象の分析物を装置の表面に結合することができる。別の態様において、所望の分析物は、サイズ、形状または変形に基づいた分離によって装置に保持される。望ましくは、所望の分析物の少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、98%または99%が装置に保持される。装置の表面は、望ましくは、非標的分析物の非特異的結合を最小にするように設計される。例えば、非標的分析物の少なくとも99%、98%、95%、90%、80%または70%は装置に保持されない。装置の選択的な保持により、混合物、例えば、血液、痰、尿および土壌、大気または水試料から特定の分析物集団を分離することができる。
上記の明細書に記載する全ての刊行物、特許および特許出願は参照により本明細書に組み入れられる。本発明の範囲および精神から逸脱する事無く、本発明の記載されている方法およびシステムに種々の改良および変更を加えることができることは当業者に明らかである。本発明は具体的な態様に関連して記載されているが、特許請求されている本発明はこのような具体的な態様に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際、当業者に明らかであり、本発明を実施するための記載されている様式の種々の改良は本発明の範囲内であることが意図されている。
Claims (54)
- 試料中の1つ以上の所望の分析物を保持するための装置であって、チャネルに配置された磁気障壁の第1の領域および磁気相互作用によって該障壁の少なくとも1つに結合されている複数の磁気粒子を含む装置。
- チャネルが微小流動チャネルである、請求項1記載の装置。
- 磁気粒子が、1つ以上の分析物に結合することができる捕獲部分を含む、請求項1記載の装置。
- 捕獲部分が、第1の種類の分析物に特異的に結合する、請求項3記載の装置。
- 捕獲部分が、ホロ-トランスフェリンまたは抗CD71、抗CD36、抗GPAもしくは抗CD45抗体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項4記載の装置。
- 磁気障壁の第2の領域をさらに含み、複数の磁気粒子が、該第2の領域の該障壁の少なくとも1つに磁気相互作用によって結合されている、請求項1記載の装置。
- 第1の領域の障壁が第2の領域の障壁に散在している、請求項6記載の装置。
- 第1の領域の障壁が第1の種類の分析物に特異的に結合し、第2の領域の障壁が第2の種類の分析物に特異的に結合する、請求項6記載の装置。
- 磁気障壁の少なくとも一部が永久磁石を含む、請求項1記載の装置。
- 磁気障壁の少なくとも一部が非永久磁石を含む、請求項1記載の装置。
- 磁気障壁内で磁場を形成することができる磁力発生装置をさらに含む、請求項1記載の装置。
- 磁場発生装置が、1つ以上の障壁に磁場を独立に適用することができる、請求項11記載の装置。
- 障壁が二次元配列で整列されている、請求項1記載の装置。
- 1つ以上の分析物が障壁間を通過することができるように該障壁が配置されている、請求項1記載の装置。
- 1つ以上の分析物の少なくとも一部が障壁間を通過できないように該障壁が配置されている、請求項1記載の装置。
- 1つ以上の分析物が細胞を含む、請求項1記載の装置。
- 1つ以上の分析物が分子を含む、請求項1記載の装置。
- 複数の磁気障壁を含むチャネルを含む、試料中の1つ以上の分析物を保持するための装置であって、該障壁は複数の磁気粒子を含み、該磁気粒子は、1つ以上の分析物に結合することができる捕獲部分を含む装置。
- 複数の磁気障壁を含むチャネルを含む、試料中の1つ以上の分析物を保持するための装置であって、該障壁は複数の磁気粒子を含み、該1つ以上の分析物の少なくとも一部が該障壁の間を通過することができないように該障壁が配置されている装置。
- チャネルが複数の磁気位置領域をさらに含み、磁気障壁が磁気相互作用によって該位置に固定されている、請求項18または19記載の装置。
- 1つ以上の分析物が細胞を含む、請求項18または19記載の装置。
- 下記の段階を含む、試料中の第1の種類の分析物を保持するための方法:
(a)第1および第2の種類の分析物を少なくとも含む試料と、
(i)チャネルに配置されている第1の領域の磁気障壁;および
(ii)磁気相互作用によって該障壁の少なくとも1つに固定されている複数の磁気粒子
を含む装置とを提供する段階;
(b)該試料を該装置に導入する段階であって、該第1の種類の分析物が、該障壁の少なくとも1つとの相互作用によって該装置に保持される段階。 - 下記の段階を含む、試料中の第1の種類の分析物を保持するための方法:
(a)第1および第2の種類の分析物を少なくとも含む試料と、チャネルに配置されている第1の領域の磁気障壁を含む装置とを提供する段階であって、該障壁は複数の磁気粒子を含む段階;および
(b)該試料を該装置に導入する段階であって、該第1の種類の分析物が、該障壁の少なくとも1つとの相互作用によって該装置に保持される段階。 - 磁気粒子が、第1の種類の分析物に結合することができる捕獲部分でコーティングされる、請求項22または23記載の方法。
- 第1の種類の分析物の少なくとも一部が障壁の間を通過することができないように磁気障壁が配置されている、請求項22または23記載の方法。
- 第1の種類の分析物が粒子である、請求項22または23記載の方法。
- 粒子が細胞である、請求項26記載の方法。
- 細胞が細菌細胞、胎児細胞または血液細胞である、請求項27記載の方法。
- 粒子が細胞小器官である、請求項22または23記載の方法。
- 細胞小器官が核である、請求項29記載の方法。
- 粒子がウイルスである。請求項22記載の方法。
- 第1の種類の分析物が分子である、請求項22または23記載の方法。
- 分子が核酸、タンパク質、または超分子複合体である、請求項32記載の方法。
- 試料中の第1の種類の分析物の少なくとも60%が保持される、請求項22または23記載の方法。
- 試料中の第2の種類の分析物の少なくとも70%が保持されない、請求項22または23記載の方法。
- 捕獲部分が、ホロ-トランスフェリンまたは抗CD71、抗CD36、抗GPAもしくは抗CD45抗体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項22または23記載の方法。
- 捕獲部分が抗体、タンパク質、ペプチド、または核酸を含む、請求項24記載の方法。
- 磁気相互作用によって磁気粒子が結合されている第2の領域の磁気障壁をさらに含み、第2の領域の該障壁に結合されている磁気粒子が、第3の種類の分析物に選択的に結合する捕獲部分でコーティングされている、請求項22または23記載の方法。
- 第1の領域の障壁が、第2の領域の障壁に散在している、請求項38記載の方法。
- 磁気障壁が永久磁石を含む、請求項22または23記載の方法。
- 磁気障壁が非永久磁石を含む、請求項22または23記載の方法。
- 装置が、磁気障壁に磁場を形成することができる磁力発生装置をさらに含む、請求項22または23記載の方法。
- 磁場発生装置が、1つ以上の障壁に独立に磁場を適用することができる、請求項42記載の方法。
- 障壁が二次元的配列で整列されている、請求項22または23記載の方法。
- 標識部分と装置内に保持されている第1の種類の分析物を接触させる段階をさらに含む、請求項22または23記載の方法。
- 磁気相互作用を妨害して、それによって障壁から第1の種類の分析物を放出する段階をさらに含む、請求項22または23記載の方法。
- チャネルが微小流動チャネルである、請求項22または23記載の方法。
- 第1の種類の分析物が捕獲部分に特異的に結合される、請求項24記載の方法。
- 候補薬化合物が磁気粒子に結合される、請求項24記載の方法。
- 第1の種類の分析物が細胞であり、捕獲部分に結合している該第1の種類の細胞に対する候補薬化合物の影響を判定する段階をさらに含む、請求項49記載の方法。
- 捕獲部分が細胞表面受容体を含む、請求項24記載の方法。
- 試料が、細胞表面受容体の候補リガンドを含む、請求項51記載の方法。
- 装置が、磁気相互作用によって障壁の少なくとも1つに結合されている第2の複数の磁気粒子をさらに含み、該磁気粒子が、第1の種類の分析物に結合することができる第2の捕獲部分でコーティングされている、請求項24記載の方法。
- 段階(a)(ii)の複数の粒子および第2の複数の粒子が同じ障壁に配置されている、請求項53記載の方法。
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