JP2007530548A - ヒドロキシスチレンおよびそのアセチル化誘導体を製造する方法 - Google Patents

Abstract

非アミン塩基性触媒の存在下にてフェノール性基質を熱的脱炭酸化して、ビニルモノマーを製造する方法を提供する。脱炭酸反応の生成物は、同一反応器内でアセチル化剤の存在下にてさらにアセチル化される。

Description

本発明は、有機合成分野に関する。さらに具体的には、本発明は、単一反応器内で２工程プロセスにおいて、フェノール性基質を熱的塩基触媒脱炭酸化し、続いて得られた生成物をアセチル化することによって、ヒドロキシスチレンを製造する方法に関する。

４−ヒドロキシスチレン（ｐＨＳ）などのヒドロキシスチレンおよび４−アセトキシスチレン（ｐＡＳ）などのそのアセチル化誘導体は、多種多様な工業用途において潜在的な有用性を有する芳香族化合物である。例えば、これらの化合物は、樹脂、エラストマー、接着剤、コーティング、自動車仕上げ塗装およびインクの製造用のモノマーにおける用途、ならびに電子材料における用途を有する。これらの化合物は、エラストマーおよび樹脂配合物において添加剤として使用することもできる。

ヒドロキシスチレンおよびそのアセチル化誘導体を化学合成する多くの方法が知られている。しかしながら、これらの方法には、高価な試薬、厳しい条件が必要であり、一般に収率が３０〜６３％と比較的低い。例えば、ソルヴィッシュ（Ｓｏｖｉｓｈ）（非特許文献１）によって、ｐ−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）から４−ヒドロキシスチレン（ｐ−ビニルフェノールとしても知られる）を製造する方法が記載されている。ｐＨＣＡは、温度約２２５℃で銅粉末によってキノリン中で脱炭酸化される。４−ヒドロキシスチレンの収率は約４１％であった。

ピテ（Ｐｉｔｔｅｔ）らは、特許文献１において、ｐ−ビニルフェノールの製造方法を記述している。その方法では、最初に、エチレンジアミンを触媒として使用して、ｐ−ヒドロキシベンズアルデヒドをマロン酸と反応させ、ｐＨＣＡを生成し、それを温度１１５〜１２０℃にてその場で脱炭酸化し、純粋でないｐ−ビニルフェノールが形成される。ｐ−ビニルフェノールを反応混合物から単離し、水酸化ナトリウムまたは水酸化カリウムなどの塩基の存在下にて無水酢酸と反応させ、４−アセトキシスチレンを形成し、それを反応混合物から分離し、強塩基の存在下において加水分解して、精製ｐ−ビニルフェノールが得られる。４−ビニルフェノールの収率は約３１％であった。

シャデリ（Ｓｃｈａｅｄｅｌｉ）は、特許文献２において、ｐＨＣＡで開始して４−ヒドロキシスチレンを製造する方法を記述している。その方法では、アミン触媒、つまり１，８−ジアザビシクロ［５，４−０］ウンデカ−７−エンおよびヒドロキノンの存在下にて、ｐＨＣＡをジメチルスルホキシド中で１３５℃にて脱炭酸化し、４−ヒドロキシスチレンを生成する。この方法での収率は６３％であった。

ララ（Ｌａｌａ）らは、特許文献３において、非プロトン性溶媒中でアミン触媒を使用して、オルトまたはパラ−ヒドロキシアリールカルボン酸を熱的脱炭酸化して、ビニル誘導体を形成する方法を記述している。さらに、ヒドロキシアリールカルボン酸をその場で形成し、続いて熱的脱炭酸化することによってビニルヒドロキシアリール化合物を製造する方法が記載されている。ヒドロキシアリールカルボン酸は、塩基媒体中で脂肪族ジカルボン酸または脂肪族無水物をヒドロキシアリールアルデヒドと反応させることによって形成される。これらの方法における収率の範囲は１５〜６０％であった。

シュタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎｎ）は、特許文献４において、触媒の非存在下にて１５０℃でジメチルホルムアミド中でコーヒー酸を熱的脱炭酸化することによる３，４−ジヒドロキシスチレンの合成を記述している。この方法で得られる収率は記載されていない。

ムンテアーヌ（Ｍｕｎｔｅａｎｕ）ら（非特許文献２）は、双極性非プロトン性溶媒中で非アミン塩基触媒を使用して、および使用することなく、トランス−３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシケイ皮酸を熱分解することによる３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−ヒドロキシスチレンの製造を記述している。報告されている収率は９５％であった。他のケイ皮酸誘導体の熱的脱炭酸化は、その開示内容において記載されていない。

置換ケイ皮酸の熱的脱炭酸化が水性媒体中で研究されている。ピサロ（Ｐｙｙｓａｌｏ）ら（非特許文献３）は、ｐＨ１〜６の水性バッファー中での１００℃での置換ケイ皮酸誘導体の熱的脱炭酸化を記述している。コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら（非特許文献４）は、ｐＨ１〜１２の水性バッファー中でのｐ−ヒドロキシケイ皮酸の熱的脱炭酸化を記述している。脱炭酸化生成物の単離は、これらの開示内容において報告されていない。

米国特許第４，３１６，９９５号明細書 米国特許第５，２７４，０６０号明細書 豪州特許出願第７２４７１２９号明細書 米国特許第５，３２４，８０４号明細書 ソルヴィッシュ（Ｓｏｖｉｓｈ）、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２４：１３４５−１３４７（１９５９） ムンテアーヌ（Ｍｕｎｔｅａｎｕ）ら、Ｊ．Ｔｈｅｒｍａｌ Ａｎａｌ．３７：４１１−４２６（１９９１） ピサロ（Ｐｙｙｓａｌｏ）ら、Ｌｅｂｅｎｓｍｉｔｔｅｌ−Ｗｉｓｓｅｎｓｃｈｒａｆｔ ｕ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１０（Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）：１４５−１４７（１９７７） コーエン（Ｃｏｈｅｎ）ら、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８２：１９０７−１９１１（１９６０）

したがって、比較的安価な試薬、比較的穏やかな条件を使用し、高い収率が得られる、ヒドロキシスチレンおよびそのアセチル化誘導体を製造する方法が必要とされている。

本出願人は、比較的穏やかな条件の下で比較的安価な試薬を使用して、１００％までの収率でヒドロキシスチレンおよびそのアセチル化誘導体を製造する方法を発見することによって上記の問題を解決した。ヒドロキシスチレンは、非アミン塩基性触媒の存在下においてフェノール性基質を熱的脱炭酸化することによって製造される。アセチル化誘導体は、同一反応器内で得られたヒドロキシスチレンをアセチル化剤と反応させることによって形成される。

本発明は、非アミン塩基性触媒の存在下でフェノール性基質を熱的脱炭酸化する方法に関する。脱炭酸反応の生成物はさらに、同一反応器内でアセチル化剤の存在下にてアセチル化される。場合により重合防止剤または重合遅延剤が反応混合物に添加される。脱炭酸化またはアセチル化生成物の収率は一般に、６３％を超える。

したがって、
ａ）一般構造：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうち少なくとも１つはＯＨであり、そしてＲ_２およびＲ_４は両方同時にｔ−ブチルではない］
を有するフェノール性基質を準備する工程；
ｂ）ｉ）非アミン塩基性触媒；および
ｉｉ）少なくとも１種の極性有機溶媒または極性有機溶媒混合物；
を含んでなる反応混合物を準備する工程；
ｃ）フェノール性基質を脱炭酸化生成物に脱炭酸化するのに十分な時間、少なくとも約１００℃の温度で（ａ）のフェノール性基質を（ｂ）の反応混合物と接触させる工程；
を含んでなる、フェノール性基質を脱炭酸化してビニルモノマーを製造する方法を提供することは本発明の範囲内である。場合により脱炭酸化生成物は当技術分野でよく知られている手段によって回収される。

他の実施形態において、本発明は、
ａ）一般構造：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただしＲ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうち少なくとも１つがＯＨである］
を有するフェノール性基質を準備する工程；
ｂ）ｉ）非アミン塩基性触媒；および
ｉｉ）少なくとも１種の極性非プロトン性有機溶媒または極性非プロトン性有機溶媒混合物；
を含んでなる反応混合物を準備する工程；
ｃ）フェノール性基質を脱炭酸化して脱炭酸化生成物を生成せしめるのに十分な時間、少なくとも約１００℃の温度で（ａ）のフェノール性基質を（ｂ）の反応混合物と接触させる工程；
ｄ）（ｃ）の脱炭酸化生成物をアセチル化剤と接触させて、一般構造：

［式中、Ｒ_８、Ｒ_１０、およびＲ_１２は、Ｈ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_９およびＲ_１１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_１３およびＲ_１４は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_８、Ｒ_１０、またはＲ_１２のうちの少なくとも１つはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３である］
を有するアセチル化生成物を生成せしめる工程；
の連続した工程を含んでなる、フェノール性基質からアセチル化生成物を合成する方法を提供する。

本発明は、フェノール性基質を熱的非アミン塩基触媒脱炭酸化することによりヒドロキシスチレンを製造する方法を提供する。得られたヒドロキシスチレンは、アセチル化剤を添加することによって同一反応器内でアセチル化される。ヒドロキシスチレンおよびそのアセチル化誘導体が、樹脂、エラストマー、接着剤、コーティング、自動車仕上げ塗装、インクおよび電子材料の製造に使用されるモノマーとしての、およびエラストマーおよび樹脂配合物における添加剤としての用途を有することから、この方法は有用である。

以下の定義が本明細書において使用され、特許請求の範囲および明細書の解釈のために言及される。

「ｐ」はパラを意味する。

「ｐＡＳ」は、パラ−アセトキシスチレンに使用される略語であり、ｐ−アセトキシスチレンまたは４−アセトキシスチレンとしても表される。

「ｐＨＳ」は、パラ−ヒドロキシスチレンに使用される略語であり、ｐ−ヒドロキシスチレンまたは４−ヒドロキシスチレンとしても表される。

「ＣＡ」はケイ皮酸を意味する。

本明細書で使用される「収率」という用語は、化学反応で生成される生成物の量を意味する。収率は一般に、反応の理論収量のパーセンテージとして表される。「理論収量」という用語は、最初に存在する基質の量に対してされる予想される生成物の期待量および反応の化学量論を意味する。

本発明の溶媒に適用される「極性」という用語は、かなり大きな永久双極子モーメントを有する分子によって特徴付けられる溶媒を意味する。

本発明の溶媒に適用される「非プロトン性」という用語は、不安定な陽子供与体または受容体として働くことができない溶媒を意味する。

本発明の溶媒に適用される「プロトン性」という用語は、不安定な陽子供与体または受容体として働くことができる溶媒を意味する。

「極性有機溶媒混合物」という用語は、少なくとも１種の極性溶媒を含んでなる有機溶媒の混合物を意味する。

「極性非プロトン性有機溶媒混合物」という用語は、少なくとも１種の極性非プロトン性溶媒を含んでなる有機溶媒の混合物を意味する。

「ＴＡＬ」は、チロシンアンモニアリアーゼに使用される略語である。

「ＰＡＬ」は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼに使用される略語である。

「ＰＡＨ」は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼに使用される略語である。

「ＴＡＬ活性」という用語は、チロシンのｐＨＣＡへの直接変換を触媒するタンパク質の能力を意味する。

「ＰＡＬ活性」という用語は、フェニルアラニンのケイ皮酸への変換を触媒するタンパク質の能力を意味する。

「ｐａｌ」とは、ＰＡＬ活性を有する酵素をコードする遺伝子を表す。

「ｔａｌ」とは、ＴＡＬ活性を有する酵素をコードする遺伝子を表す。

「ＰＡＬ／ＴＡＬ活性」または「ＰＡＬ／ＴＡＬ酵素」という用語は、ＰＡＬ活性およびＴＡＬ活性のどちらも含むタンパク質を意味する。かかるタンパク質は、酵素基質としてチロシンとフェニルアラニンの両方に対して少なくともいくらかの特異性を有する。

「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」という用語は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの触媒変換を担うタンパク質系を意味する。Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系は、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ機能を果たす、当技術分野で公知のいくつかの酵素または酵素系のうちの１つである。本明細書で使用される「シンナメート４−ヒドロキシラーゼ」という用語は、ケイ皮酸のｐＨＣＡへの変換を生じさせる一般的な酵素活性を意味するのに対して、「Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系」は、シンナメート４−ヒドロキシラーゼ活性を有する特異的な二元タンパク質系を意味する。

本明細書に記載のすべての範囲は、その範囲の終端およびそのすべての中間範囲点も含む。

本発明は、
一般式：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、Ｒ_２およびＲ_４が両方同時にｔ−ブチルではないことが好ましい、ただし、Ｒ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうちの少なくとも１つはＯＨである］
を有する、ビニルモノマー、具体的にはヒドロキシスチレンを製造する方法を含んでなる。本発明の方法によって製造されるヒドロキシスチレンの例としては、限定されないが、４−ヒドロキシスチレン、３−メトキシ−４−ヒドロキシスチレン、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシスチレン、３，４−ジヒドロキシスチレン、２−ヒドロキシスチレンおよびα−シアノ−４−ヒドロキシスチレンが挙げられる。

さらに、反応器にアセチル化剤を添加することによって、得られたヒドロキシスチレンをアセチル化して、一般構造：

［式中、Ｒ_８、Ｒ_１０、およびＲ_１２は、Ｈ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_９およびＲ_１１は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_１３およびＲ_１４は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_８、Ｒ_１０、またはＲ_１２のうちの少なくとも１つはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３である］
を有するアセチル化生成物が得られる。

アセチル化生成物の例としては、限定されないが、４−アセトキシスチレン、３−メトキシ−４−アセトキシスチレン、３，５−ジメトキシ−４−アセトキシスチレン、３，４−ジアセトキシスチレン、２−アセトキシスチレン、およびα−シアノ−４−アセトキシスチレンが挙げられる。

フェノール性基質
本発明で使用されるフェノール性基質は、一般構造：

［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５は、Ｈ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４は、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうちの少なくとも１つはＯＨである］
を有する。適切なフェノール性基質の例としては、限定されないが、４−ヒドロキシケイ皮酸、フェルラ酸、シナピン酸、コーヒー酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸が挙げられる。立体障害のあるフェノールよりも生成物分解する傾向がある、立体障害のないフェノール基質でさえ、高収率の脱炭酸化生成物が得られることが発見された。本明細書において立体障害のあるフェノールは、Ｒ_２およびＲ_４位置の両方で、ｔ−ブチルなどの大きな嵩高い基として定義される。立体障害のないフェノールは、Ｒ_２およびＲ_４位置の両方で、大きな嵩高い基を保持しないフェノールである。立体障害のないフェノール基質としては、限定されないが、Ｒ_２またはＲ_４のうちの少なくとも１つが、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ_３、メチル、エチル、またはプロピルであるフェノールが挙げられる。さらに、生成物分解する傾向があるオルト非置換フェノール基質でさえ、高収率の脱炭酸化生成物が得られることが発見された。本明細書においてオルト非置換フェノールは、Ｒ_２またはＲ_４のうちの少なくとも１つがＨであるフェノールとして定義される。

これらのフェノール性基質は多くの方法で得ることができる。例えば、主にトランス形の４−ヒドロキシケイ皮酸（ｐＨＣＡ）は、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））およびＴＣＩアメリカ社（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）（オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ））などの会社から市販されている。さらに、ｐＨＣＡは、当技術分野で公知の方法を使用して化学合成によって製造することができる。例えば、米国特許第４，３１６，９９５号明細書にピテ（Ｐｉｔｔｅｔ）らによって、または米国特許第５，９９０，３３６号明細書にアレキサンドラトス（Ａｌｅｘａｎｄｒａｔｏｓ）によって記載されているように、マロン酸をパラ−ヒドロキシベンズアルデヒドと反応させることによって、ｐＨＣＡを製造することができる。代替方法としては、植物からｐＨＣＡを単離することもできる（Ｒ．ベンリエフ（Ｂｅｎｒｉｅｆ）ら，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４７：８２５−８３２（１９９８）および米国特許出願公開第２００２０１８７２０７号明細書）。一実施形態において、ｐＨＣＡの源は、生産宿主を使用した生物産生（ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）に由来する。他の実施形態において、生産宿主は、標準ＤＮＡ技術を使用して製造される組換え宿主細胞である。これらの組換えＤＮＡ技術は、参照により本明細書に組み込まれる、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ（１９８９）に記載されている。

一実施形態において、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００３００７９２５５号明細書にチー（Ｑｉ）らによって記載されているようにｐＨＣＡが生成される。開示内容に従って、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）活性をコードする少なくとも１つの遺伝子を発現するように遺伝子操作された組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡが生成される。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵性炭素源を、ＰＡＨによってチロシンに変換されるフェニルアラニンへと代謝する。生成されたチロシンは、ＴＡＬ酵素によってｐＨＣＡに変換される。ＴＡＬ活性を有する適切な酵素が使用される。例えば、ＰＡＬ活性とＴＡＬ（ＰＡＬ／ＴＡＬ）活性のどちらも有する酵素が使用される。米国特許第６，３６８，８３７号明細書にゲートンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）らによって記載されるように、向上したＴＡＬ活性を有するように、野生型酵母ＰＡＬ酵素の突然変異生成によって生成されたＴＡＬ酵素も使用することができる。代替方法としては、米国特許出願公開第２００４００２３３５７号明細書に記載される酵母トリコスポロン−クタネウム（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ ｃｕｔａｎｅｅｕｍ）からの誘導性ＴＡＬ酵素、またはキント（Ｋｙｎｄｔ）ら（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５１２：２４０−２４４（２００２））もしくはファング（Ｈｕａｎｇ）ら（米国特許出願公開第２００４００５９１０３号明細書）に記述されるような細菌ＴＡＬ酵素が使用される。

他の実施形態において、ｐＨＣＡは、参照により本明細書に組み込まれる上記のゲートンビー（Ｇａｔｅｎｂｙ）らにより開示されている方法のうちのいずれか１つによって生成される。例えば、ｐＨＣＡは、酵母ＰＡＬ活性をコードする遺伝子および植物Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系をコードする遺伝子を発現するように遺伝子操作された組換え微生物を使用して生成される。この形質転換された微生物は、グルコースなどの発酵性炭素源を、ＰＡＬ酵素によってケイ皮酸（ＣＡ）に変換されるフェニルアラニンへと代謝する。続いて、ＣＡは、Ｐ−４５０／Ｐ−４５０レダクターゼ系の作用によってｐＨＣＡに変換される。代替方法として、ＴＡＬ活性をコードする遺伝子を発現する組換え微生物を使用して、ｐＨＣＡを生成することができる。ＴＡＬ酵素は直接、チロシンをｐＨＣＡに変換する。上述のように、いずれかの適切なＴＡＬ酵素を使用することができる。

他の実施形態において、ｐＨＣＡは、参照により本明細書に組み込まれる、係属中かつ同一出願人による米国特許出願第６０／５６３６３３号明細書にベン−バサット（Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔ）により記載されているように２段階発酵を用いて生成される。第１段階は、芳香族アミノ酸チロシンを生成する向上した能力を有する微生物の生産宿主（過剰産生体（ｏｖｅｒ−ｐｒｏｄｕｃｅｒ））を提供することを含んでなる。これらの細胞は、生理学的ｐＨにて、チロシンが増殖培地に蓄積する時点まで増殖する。発酵の第２段階中に、細胞をｐＨ約８．０〜約１１．０でＴＡＬの源と接触させる。この段階中、チロシンは、比較的高い速度および収率でｐＨＣＡに変換される。代替方法として、２つの段階は、２つの別々の段階として行うことができ、チロシンを第１段階の発酵培地から単離し、次いでＴＡＬの源と接触させる。

ｐＨＣＡの生物産生に関しては、使用される微生物を発酵槽内で適切な増殖培地において培養する。攪拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、気泡発酵槽、またはそのいずれかの組み合わせを含む、いずれかの適切な発酵槽を使用することができる。微生物培養物の維持および増殖のための材料および方法は、微生物学または発酵科学の当業者にはよく知られている（例えば、ベイリー（Ｂａｉｌｅｙ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ、第２版、ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８６参照）。生物産生されたｐＨＣＡは、当技術分野で公知の方法を用いて、本発明で使用される発酵培地から単離される。例えば、遠心分離によって、発酵培地から固体が除去される。次いで、培地を酸性化することによって、ｐＨＣＡを沈殿させ、遠心分離によって回収する。所望の場合には、例えば有機溶媒抽出を用いて、ｐＨＣＡをさらに精製することができる。

同様に、フェルラ酸、シナピン酸、およびコーヒー酸は、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））およびＴＣＩアメリカ社（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）（オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ））などの会社から市販されている。代替方法としては、リグニン生合成経路の要素を含んでなるこれらの基質は、すべて天然植物産物であるため、植物組織から容易に単離することができる（例えばチャン（Ｊａｎｇ）ら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２００３）、２６（８）、５８５−５９０；マツフジ（Ｍａｔｓｕｆｕｊｉ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００３）、５１（１０）、３１５７−３１６１；国際公開第２００３０４６１６３号パンフレット；クテアウ（Ｃｏｕｔｅａｕ）ら、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （１９９８）、６４（１）、１７−２５；およびバルトロメ（Ｂａｒｔｏｌｏｍｅ）ら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ（１９９９）、７９（３）、４３５−４３９参照）。さらに、多くのより一般的なフェノール性基質についての化学合成法が知られている（例えば、国際公開第２００２０８３６２５号パンフレット（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ ｄｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔｓ，ａｎｄ ｕｓｅ ｔｈｅｒｅｏｆ ｆｏｒ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｄｅｍｅｎｔｉａ」）；特開２００２１５５０１７号公報（「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ ｆｒｏｍ ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ」）；およびタニグチ（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ）ら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （１９９９）、１９（５Ａ）、３７５７−３７６１参照）。アルキル化ｐＨＣＡ誘導体の製造は、豪州特許出願第７２４７１２９号明細書にララ（Ｌａｌａ）らによって記述されている。

非アミン塩基性触媒
本発明の方法では、非アミン塩基性触媒を使用する。非アミン塩基性触媒は、アミンを含有しない本発明の反応を促進することができる塩基性化合物である。比較として、アミン含有触媒の例は、ピリジンおよびエチレンジアミンである。実質的に、本発明の反応条件と適合性の非アミン塩基性触媒が使用され、金属塩および特にカリウム塩または酢酸塩が好ましい。本発明において特に適している触媒としては、限定されないが、酢酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび酸化マグネシウムが挙げられる。

本発明の非アミン触媒はすべて、例えば、ＥＭサイエンス社（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））またはアルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））から市販されている。

非アミン塩基性触媒の最適濃度は、基質の濃度、使用する溶媒の性質および反応条件に応じて異なる。一般に、反応混合物中で基質に対して約１モル％〜約３０モル％の濃度が好ましい。

有機溶媒
脱炭酸反応のみについては、極性非プロトン性有機溶媒およびプロトン性極性有機溶媒を含む多種多様な有機溶媒が使用される。単一のプロトン性極性溶媒または単一の極性非プロトン性溶媒を使用することができる。さらに、極性非プロトン性溶媒の混合物、プロトン性極性溶媒の混合物、極性非プロトン性溶媒とプロトン性極性溶媒との混合物、および非プロトン性もしくはプロトン性溶媒と非極性溶媒との混合物を使用することができ、極性非プロトン性溶媒またはその混合物が好ましい。適切な極性非プロトン性溶媒としては、限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、およびヘキサメチル亜リン酸トリアミドが挙げられる。適切なプロトン性極性溶媒としては、限定されないが、ジ（プロピレングリコール）メチルエーテル（ドワノール（Ｄｏｗａｎｏｌ）（商標）ＤＰＭ）、ジ（エチレングリコール）メチルエーテル、２−ブトキシエタノール、エチレングリコール、２−メトキシエタノール、プロピレングリコールメチルエーテル、ｎ−ヘキサノール、およびｎ−ブタノールが挙げられる。

２工程脱炭酸化−アセチル化プロセスに関しては、有機溶媒は、非プロトン性および極性の両方の最終的な特性を有するべきである。単一の極性非プロトン性溶媒を使用してもよいし、または極性非プロトン性溶媒の混合物を使用してもよい。代替方法としては、極性非プロトン性溶媒を非極性溶媒と組み合わせて使用することができる；しかしながら、プロトン性溶媒は、その反応性のためにアセチル化剤を消費する傾向があるため望ましくない。本発明の２工程プロセスにおいて特に適している溶媒としては、限定されないが、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、およびヘキサメチル亜リン酸トリアミドが挙げられる。

重合防止剤
本発明の方法において重合防止剤が有用であるが、必要ではない。本発明に記載の脱炭酸反応に必要な温度に耐性のある適切な重合防止剤が使用される。適切な重合防止剤の例としては、限定されないが、ヒドロキノン、ヒドロキノンモノメチルエーテル、４−ｔｅｒｔ−ブチルカテコール、フェノチアジン、Ｎ−オキシル（ニトロキシド）防止剤、例えば、プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５（ニューヨーク州タリータウンのチバ・スペシャリティ・ケミカルズ社（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）から市販されているビス（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）セバケート，ＣＡＳ＃２５１６−９２−９）、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（ＴＣＩアメリカ社（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）から市販されている４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イルオキシ，ＣＡＳ＃２２２６−９６−２）およびユビナル（Ｕｖｉｎｕｌ）（登録商標）４０４０Ｐ（マサチューセッツ州ウスターのＢＡＳＦ社（ＢＡＳＦ Ｃｏｒｐ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒ，ＭＡ）から市販されている１，６−ヘキサメチレン−ビス（Ｎ−ホルミル−Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）アミン）が挙げられる。

重合遅延剤
場合によっては、本発明の反応に重合防止剤と組み合わせて重合遅延剤を使用することも有利である。重合遅延剤は当技術分野でよく知られており、重合反応を遅くするが、重合をすべては防ぐことができない化合物である。一般的な遅延剤は、ジニトロ−オルト−クレゾール（ＤＮＯＣ）およびジニトロブチルフェノール（ＤＮＢＰ）などの芳香族ニトロ化合物である。重合遅延剤の製造方法は一般的であり、技術分野でよく知られており（例えば米国特許第６，３３９，１７７号明細書；パーク（Ｐａｒｋ）ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ（Ｋｏｒｅａ）（１９８８）、１２（８）、７１０−１９参照）、スチレン重合の制御でのその使用はかなり記録に残されている（例えばブッシュビー（Ｂｕｓｈｂｙ）ら、Ｐｏｌｙｍｅｒ（１９９８）、３９（２２）、５５６７−５５７１参照）。

反応条件
フェノール性基質、非アミン塩基性触媒、および有機溶媒を反応器に添加して、反応混合物を形成する。いずれかの適切な反応器が使用される。

反応温度は、基質の濃度、形成された生成物の安定性、触媒の選択および所望の収率に応じて異なる。一般に、少なくとも約１００℃の温度が適しており、少なくとも約１００℃〜約２００℃の範囲の温度が生成物の有効な生成と一致する。基質として４−ヒドロキシケイ皮酸を使用した反応では、好ましい温度範囲は約１２０℃〜約１５０℃である。それより低い安定性の生成物、例えばコーヒー酸を生成する基質には、範囲約１００℃〜約１２０℃の低い温度が使用される。それより高い安定性の生成物、例えば３，５−ジメチル−４−ヒドロキシケイ皮酸を生成する基質では、範囲約１５０℃〜約２００℃の高い温度が使用される。

反応は、気圧〜約１０００ｐｓｉｇ（６８９５ｋＰａ）の範囲の圧力で行われ、約５００ｐｓｉｇ（３４４７ｋＰａ）の圧力もまた使用することができる。窒素などの不活性ガスを使用して、圧力を調節することができる。高圧での反応には、限定されないが、振とう容器、ロッカー容器（ｒｏｃｋｅｒ ｖｅｓｓｅｌ）および攪拌オートクレーブを含む従来の圧力反応器が使用される。

反応に対する時間の制限はない；しかしながら、大部分の反応は４時間未満で行われ、反応時間約４５分〜約１８０分が一般的である。

ヒドロキシスチレンのアセチル化
一実施形態において、脱炭酸反応が終了した後に、アセチル化剤を反応混合物に直接添加することによって、脱炭酸化されたフェノール系生成物がアセチル化誘導体に変換される。一般に、アセチル化剤は過剰量で添加され、基質に比べて少なくとも１モル当量の濃度が好ましい。適切なアセチル化剤としては、限定されないが、無水酢酸、塩化アセチル、および酢酸が挙げられる。一実施形態において、アセチル化剤は無水酢酸である。

アセチル化反応は、温度範囲約２５℃〜約１５０℃、さらに温度範囲約１００℃〜約１４０℃、圧力範囲気圧〜約１０００ｐｓｉｇ（６８９５ｋＰａ）にて高収率で行われる。当業者には、基質と触媒の両方が可溶性である温度が使用されるべきであることは理解されよう。最も簡単な方法は、脱炭酸反応工程の終了直後にアセチル化剤を添加し、脱炭酸反応と同じ温度でアセチル化を行うことである。

脱炭酸化およびアセチル化生成物の単離および精製
反応の終了後に、当技術分野で公知の適切な方法を使用して、脱炭酸化生成物またはアセチル化生成物を単離する。例えば、反応混合物を氷水上に注ぎ、酢酸エチルまたはジエチルエーテルなどの有機溶媒中に抽出する。次いで、減圧での蒸発を用いて溶媒を除去することによって、生成物を回収する。一実施形態において、ヒドロキシスチレン生成物の生成物収率は、理論収量の少なくとも６３％である。他の実施形態において、アセチル化生成物の収率は、理論収量の少なくとも６３％である。

当技術分野でよく知られている再結晶化、真空蒸留、フラッシュ蒸留またはクロマトグラフィー技術を用いて、脱炭酸化生成物またはそのアセチル化誘導体をさらに精製する。

次いで、樹脂、エラストマー、接着剤、コーティング、自動車仕上げ塗装、インクの製造に使用されるモノマーとして、およびエラストマーおよび樹脂配合物における添加剤として、得られたヒドロキシスチレンまたはそのアセチル化誘導体を使用することができる。

本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。本発明の好ましい実施形態を示すこれらの実施例は、単に例証として示されることを理解されたい。上記の説明およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を把握し、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本発明に種々の変更および修正を加えて、種々の用途および条件にそれを適応させることができる。

使用される略語の意味は以下のとおりである：「ｍｉｎ」は分（間）、「ｈ」は時（間）、「ｓｅｃ」は秒（間）、「ｍＬ」はミリリットル、「Ｌ」はリットル、「μＬ」はマイクロリットル、「μｍ」はマイクロメートル、「ｍｏｌ」はモル、「ｍｍｏｌ」はミリモル、「ｇ」はグラム、「ｍｇ」はミリグラム、「ｐｐｍ」は百万分率、「Ｍ」はモル濃度、「ｍ」は重量モル濃度、「ｅｑ」は当量、「ｖ／ｖ」は容積対容積比、「Ｐａ」はパスカル、「ｍＰａ」はミリパスカル、「ｐｓｉｇ」はゲージｐｓｉ、「ＭＨｚ」はメガヘルツ、「ＴＬＣ」は薄層クロマトグラフィー、「ＨＰＬＣ」は高性能液体クロマトグラフィー、「ＬＣ−ＭＳ」は液体クロマトグラフィー−質量分析法、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴分光法、「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、「ＤＭＡｃ」はＮ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、「ＮＭＰ」は１−メチル−２−ピロリジノン、「ｎｄ」は未決定、「ｋＰａ」はキロパスカル、「ｒｐｍ」は毎分回転数、「ＵＶ」は紫外線を意味する。

一般的方法：
試薬：
別段の指定がない限り、パラ−ヒドロキシケイ皮酸は、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）（ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））およびＴＣＩアメリカ社（ＴＣＩ Ａｍｅｒｉｃａ）（オレゴン州ポートランド（Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ））から入手し；３，４ジヒドロキシケイ皮酸は、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。すべての溶媒は試薬用であり、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手した。塩基性触媒は、アルドリッチ社（Ａｌｄｒｉｃｈ）またはＥＭサイエンス社（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ニュージャージー州ギブスタウン（Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ））から入手した。重合防止剤プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５は、ニューヨーク州タリータウンのチバ・スペシャリティ・ケミカルズ社（Ｃｉｂａ Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手した。

分析方法：
ＴＬＣ法：
固体担体としてシリカゲル（Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ）６０Ｆ_２５４（ＥＭサイエンス社（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ））を使用して、ＴＬＣを行った。ｐＨＣＡの分析に移動相として、エチルアセテートとヘキサンの１：１混合物を使用し、エチルアセテートとヘキサンの１：４混合物をｐＨＳに使用した。その試料をｐＨＣＡおよびｐＨＳの基準試料と比較した。２５４ｎｍの紫外線ランプを使用して、ＴＬＣプレートを観察した。

ＨＰＬＣ法：
方法１：
逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ，ペンシルバニア州チャッズフォードのＭＡＣ−ＭＯＤアナリティカル社（ＭＡＣ−ＭＯＤ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．，Ｃｈａｄｄｓ Ｆｏｒｄ，ＰＡ）によって供給されている）と共に、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステム（デラウェア州ウィルミントンのアジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））を使用した。２種類の溶媒：溶媒Ａ、ＨＰＬＣグレードの水中の０．１％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を合わせた勾配を用いて、ＨＰＬＣ分離を達成した。移動相の流量は１．０ｍＬ／分であった。使用された溶媒勾配を表１に示す。温度４５℃および試料注入量５μＬを用いた。

各実施後に、Ａ９５％とＢ５％との溶媒混合物で、再度カラムを５分間平衡化した。

標準ｐＨＳ溶液を使用して、適切な較正曲線が形成された。ロイツェリッツ（Ｌｅｕｔｅｒｉｔｚ）ら（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｐｒｅｐｒｉｎｔｓ４３（２）：２８３−２８４（２００２））によって記載されている方法と同様な方法を用いて、アセトキシスチレンを使用して標準のためのｐＨＳを調製した。較正曲線を用いて、ＨＰＬＣピーク領域から各試料におけるｐＨＣＡおよびｐＨＳの重量％を決定した。サンプリングの時点での反応混合物のこの情報および全重量に関しては、ｐＨＣＡの転化率％およびｐＨＳの収率％を計算した。

方法２：逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ，アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって供給されている）と共に、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。２種類の溶媒：溶媒Ａ、ＨＰＬＣグレードの水中の０．１％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を合わせた勾配を用いて、ＨＰＬＣ分離を達成した。移動相の流量は１．２５ｍＬ／分であった。使用された溶媒勾配を表２に示す。温度４０℃および試料注入量１μＬを用いた。

上述のように、適切な較正曲線を形成し、それを用いて、ＨＰＬＣピーク領域から各試料におけるｐＨＣＡおよびｐＨＳの重量％を決定した。それぞれの時点での反応混合物のこの情報および全重量（脱炭酸化時のＣＯ_２の減少に対する補正を含む）に関しては、時間に対するｐＨＣＡおよびｐＨＳの重量およびモルを計算した。

方法３：逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＸＤＢ−Ｃ１８カラム，２．１×５０ｍｍ（アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって供給されている）と共に、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。２種類の溶媒：溶媒Ａ、ＨＰＬＣグレードの水＋０．０５％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル＋０．０５％トリフルオロ酢酸を合わせた勾配を用いて、ＨＰＬＣ分離を達成した。勾配は、４５分間にわたってＡ９５％からＡ０％となり、それを０．５分間維持し、次いで最初の状態に戻った。移動相の流量は０．８ｍＬ／分であった。温度６０℃および試料注入量１μＬを用いた。

方法４：逆相ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）ＳＢ−Ｃ１８カラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ，３．５μｍ，アジレント・テクノロジーズ社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって供給されている）と共に、アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＨＰＬＣシステムを使用した。２種類の溶媒：溶媒Ａ、ＨＰＬＣグレードの水中の０．１％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸を合わせた勾配を用いて、ＨＰＬＣ分離を達成した。移動相の流量は１．０ｍＬ／分であった。使用された溶媒勾配を表３に示す。温度４０℃および試料注入量１μＬを用いた。

上述のように適切な較正曲線を形成し、それを用いて、ＨＰＬＣピーク領域から各試料におけるｐＨＣＡおよびｐＨＳの重量％を決定した。それぞれの時点での反応混合物のこの情報および全重量（脱炭酸時のＣＯ２の減少に対する補正を含む）に関しては、時間に対するｐＨＣＡおよびｐＨＳの重量およびモルを計算した。

^１Ｈ ＮＭＲ：
ブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＤＲＸ（マサチューセッツ州ビルリカのブルカーＮＭＲ社（Ｂｒｕｋｅｒ ＮＭＲ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を使用して、５００ＭＨｚでプロトンＮＭＲデータを得た。

ＬＣ−ＭＳ方法：
ヒューレット・パッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ）ＬＣ／ＭＳＤシリーズ１１００装置（デラウェア州ウィルミントンのアジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ））をＬＣ−ＭＳ分析に使用した。２つの溶媒：溶媒Ａ、水中の０．０５％トリフルオロ酢酸および溶媒Ｂ、アセトニトリル中の０．０５％トリフルオロ酢酸からなる溶媒勾配でのＬＣ分離において、ゾルバックス・エクリプス（Ｚｏｒｂａｘ Ｅｃｌｉｐｓｅ）ＸＤＢ−Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×５０ｍｍ，ＭＡＣ−ＭＯＤアナリティカル社（ＭＡＣ−ＭＯＤ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｉｎｃ．））を使用した。勾配は、４．５分間にわたって溶媒Ａ９５％から溶媒Ａ０％となり、続いて溶媒Ａ０％で２．５分間、次いで溶媒Ａ９５％に戻り、流量は０．８ｍＬ／分であった。２２０ｎｍでの検出で、温度６０℃にてＬＣ分離を行った。

実施例１〜１３
パラ−ヒドロキシケイ皮酸の脱炭酸化による４−ヒドロキシスチレンの製造
これらの実施例の目的は、塩基性触媒および溶媒の種々の組み合わせを用いて、重合防止剤の存在下にて、パラ−ヒドロキシケイ皮酸の熱的塩基触媒脱炭酸化によって４−ヒドロキシスチレンを製造することである。

これらの実施形態において、溶媒１ｍＬ中で濃度１Ｍでパラ−ヒドロキシケイ皮酸をフェノール性基質として使用した。実施例で使用される塩基性触媒および溶媒を表４に示す。塩基性触媒は、フェノール性基質に対して３モル％の濃度で使用した。重合防止剤プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５をすべての反応において濃度１０００ｐｐｍで使用した。特注のミニブロック圧力反応器において、５００ｐｓｉｇ窒素下にて温度１５０℃で反応を行った。ミニブロック圧力反応器は、それぞれが別々の反応混合物を含有する１〜２ｍＬガラスバイアル８個を収容するように設計されたステンレス鋼製反応器である。反応器は、１２５０ｐｓｉｇで２６０℃の最大定格を有する。反応混合物を含有するガラスバイアルを反応器に装入した後、それを密閉し、窒素で加圧し、ブロックヒーターで加熱した。

１時間の反応時間後、反応器を減圧し、反応混合物の試料を上述のように方法１を用いて、ＨＰＬＣによって分析した。各実施例について、反応で消費されたフェノール性基質の量（ｐＨＣＡ転化率）および４−ヒドロキシスチレンの収率を表４にまとめる。

表４の結果から分かるように、酢酸カリウム、ナトリウムメトキシド、水酸化カリウム、および炭酸カリウムを塩基性触媒として使用して、ＤＭＦ、ＤＭＡｃ、およびＮＭＰにおいて最も高い生成物収率が得られた。

実施例１４
ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することによる４−ヒドロキシスチレンの製造
この実施例の目的は、重合防止剤（プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １０００ｐｐｍ）の存在下にて、ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウム（１０モル％）を使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化することによって、４−ヒドロキシスチレンを製造することである。三口丸底フラスコに、ｐＨＣＡ（５ｇ，３０．４５８ｍｍｏｌ，１当量）、ＤＭＦ３０ｍＬ（ｐＨＣＡの１Ｍ溶液を調製するため）、プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １０００ｐｐｍ（５ｍｇ）、および酢酸カリウム（０．３ｇ，１０モル％）を添加した。攪拌しながら、かつ還流冷却器を使用して、窒素下にて反応を行った。油浴および温度調節器（ガス温度過昇防止装置を備えた）を用いて、反応を１５０℃に加熱した。酢酸カリウムは室温では可溶性ではないが、熱を加えると溶解し、淡黄色の溶液が得られた。上記のようにＴＬＣによって、反応をモニターした。１５０℃で１．５時間後、ＴＬＣによって決定されるように、反応が終了した。加熱を止め、反応混合物を室温に冷却した。次いで、反応混合物を氷水１００ｍＬ上に注ぎ、それを塩化ナトリウムで飽和させ、酢酸エチル（７５ｍＬ分）で２回抽出した。２回の抽出から得られた有機層を合わせ、２％ＮａＨＣＯ_３溶液１００ｍＬで洗浄し、次いで水１００ｍＬで洗浄した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、回転蒸発器で蒸発させることによって濃縮した。残留物を−２０℃で一晩保存した。次いで、その残留物をさらに、減圧（１０Ｐａ）下にて乾燥させ、淡黄色／黄褐色固体３．４４ｇを得た（理論収量の９４％）。^１Ｈ ＮＭＲを用いて、生成物を分析した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ（ｐｐｍ）７．９９８（０．０４Ｈ，ｓ），７．２７５（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），６．７５８（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝９．１Ｈｚ），６．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および１１．０Ｈｚ），５．５７５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および１．１Ｈｚ），５．０４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０および１．４Ｈｚ）。

実施例１５
ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することによる４−ヒドロキシスチレンの製造
この実施例の目的は、重合防止剤（プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １００ｐｐｍ）の存在下にて、ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウム（３モル％）を使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化することによって、４−ヒドロキシスチレンを製造することである。

プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １００ｐｐｍ（０．５ｍｇ，ＤＭＦ中の２ｍｇ／ｍＬ溶液２５０μＬとして添加された）および酢酸カリウム３モル％（９０ｍｇ）を使用したことを除いては、実施例１４に記載のように反応を行った。実施例１４に記載のように生成物を単離し、その結果、鮮黄色の半固体３．８２ｇが得られた（理論収量の１０４．６％）。^１Ｈ ＮＭＲを用いて、生成物を分析した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ（ｐｐｍ）７．９９３（０．２２Ｈ，ｓ），７．２７５（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．７６（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），６．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および１０．９Ｈｚ），５．５７７（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および１．４Ｈｚ），５．０４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．０および０．７Ｈｚ）。

実施例１６
単一容器反応においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化し、続いてアセチル化することによる４−アセトキシスチレンの製造
この実施例の目的は、２工程の単一容器反応において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化し、続いて、得られた４−ヒドロキシスチレンを無水酢酸でアセチル化することにより４−アセトキシスチレンを製造することである。濃度１００ｐｐｍでプロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５を重合防止剤として使用した。

三口丸底フラスコに、ｐＨＣＡ（５ｇ，３０．４５８ｍｍｏｌ，１当量）、ＤＭＦ３０ｍＬ（ｐＨＣＡの１Ｍ溶液を調製するため）、プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １００ｐｐｍ（０．５ｍｇ，ＤＭＦ中の２ｍｇ／ｍＬ溶液２５０μＬとして添加された）、および酢酸カリウム（３０ｍｇ，１モル％）を添加した。攪拌しながら、かつ還流冷却器を使用して、窒素下にて反応を行った。油浴および温度調節器（ガス温度過昇防止装置を備えた）を用いて、反応を１５０℃に加熱した。酢酸カリウムは室温では可溶性ではないが、熱を加えると溶解し、淡黄色の溶液が得られた。上記のようにＴＬＣによって、反応をモニターした。１５０℃で２時間後、ＴＬＣによって決定されるように、反応が終了した様子であった。次いで、反応温度を１４０℃に下げ、無水酢酸（４．３２ｍＬ，４５．６８７ｍｍｏｌ，１．５当量）を反応混合物に一滴ずつ添加し、それを１４０℃に維持した。反応混合物の色は薄くなった。ＴＬＣを用いて決定されるように、反応は０．７５時間後に終了した。加熱を止め、反応混合物を室温に冷却した。反応混合物を−２０℃で一晩保存した。

４−ヒドロキシスチレンを単離するための実施例１４に記載の手順を用いて、４−アセトキシスチレンを単離し、淡黄色の半固体５．３９ｇが得られた（理論収量の１０９％）。^１Ｈ ＮＭＲを用いて、生成物を分析した。得られた収量が理論収量よりも高いこと、かつ生成物（つまり、淡黄色の半固体）の性質によって、生成物はいくらかの不純物を含有することが示唆されている。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）７．４０（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．６Ｈｚ），７．０４５（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．６９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．５および１１．０Ｈｚ），５．６９３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および０．７Ｈｚ），５．２３４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．９および０．８Ｈｚ），２．２９（２．６４Ｈ，ｓ）

実施例１７
単一容器反応においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化し、続いてアセチル化することによる４−アセトキシスチレンの製造
この実施例の目的は、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化し、続いて、２工程の単一容器反応において、得られた４−ヒドロキシスチレンを無水酢酸でアセチル化することにより４−アセトキシスチレンを製造することである。濃度１０００ｐｐｍでプロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５を重合防止剤として使用した。

プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １０００ｐｐｍ（５ｍｇ）を重合防止剤として使用したことを除いては、実施例１６に記載のように脱炭酸化およびアセチル化反応を行った。実施例１６に記載のように４−アセトキシスチレン生成物を単離し、その結果、黄色のオイル４．８２ｇ（理論収量の９７．５％）が得られた。^１Ｈ ＮＭＲを用いて、生成物を分析した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）７．４０（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．０４（２Ｈ，ＡＢｑ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），６．６９５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１７．６および１１．０Ｈｚ），５．６９５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１７．６Ｈｚ），５．２３５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ），２．２９（３Ｈ，ｓ）。

実施例１８
単一容器反応において３，４−ジヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化し、続いてアセチル化することによる３，４−ジアセトキシスチレンの製造
この実施例の目的は、２工程の単一容器反応において、３，４−ジヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化し、続いて、得られた３，４−ヒドロキシスチレンを無水酢酸でアセチル化することにより３，４−ジアセトキシスチレンを製造することである。濃度１０００ｐｐｍでプロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５を重合防止剤として使用した。

窒素下にて、かつ機械混合しながら、１Ｌ三口丸底フラスコに、プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ ０．５ｇ、酢酸カリウム２．７２５ｇ、および３，４−ジヒドロキシケイ皮酸５０．０ｇを添加した。次いで、ＤＭＦ（２８０ｍＬ）を添加し、その結果、暗褐色の溶液が得られた。水凝縮器を使用して、この反応混合物を１００℃に加熱した。試料を抜き取り、ＬＣ−ＭＳを使用してそれを分析することによって、反応の進行を一定間隔をあけて確認した。４．５時間後、３，４−ジヒドロキシスチレン中間体の理論収量の９６．６％が形成したことが決定された。反応をさらに４５分間加熱した。次いで、無水酢酸１３２．７ｍＬを１５分間にわたって反応混合物に添加した。反応をさらに１５分間続け、その後、反応混合物を４５分間にわたって室温に冷却した。

水約４００ｍＬを含有するビーカーに反応混合物を注ぎ、次いでジエチルエーテルで３回抽出した。これらの抽出から得られた、合わせた有機層を２％ＮａＨＣＯ_３溶液で３回抽出し、続けてブラインで１回抽出した。有機層をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、濾過し、回転蒸発器で４０℃で１時間蒸発させることによって濃縮し、暗褐色のオイル９５．２ｇが得られた。オイルを−２０℃で一晩保存した。次いで、１０５〜１０７℃、圧力１．３ｍＰａで真空蒸留を用いて、オイルを蒸留し、透明な粘性の液体４５．１１ｇ（理論収量の７９．１％）を得た。^１Ｈ ＮＭＲおよびＬＣ−ＭＳによって、３，４−ジアセトキシスチレン生成物を分析し、純度９９．７％であることが判明した。
^１Ｈ ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）：δ（ｐｐｍ）７．２６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝８および２Ｈｚ），７．２２（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ），７．１３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ），６．６５（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８および１１Ｈｚ），５．６８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１８および１Ｈｚ），５．２６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ），２．２７（３Ｈ，ｓ），２．２６（３Ｈ，ｓ）。

実施例１９
重合防止剤の非存在下でのパラ−ヒドロキシケイ皮酸の脱炭酸化による４−ヒドロキシスチレンの製造
この実施例の目的は、重合防止剤の非存在下でＤＭＡｃ中で塩基性触媒として酢酸カリウム（１モル％）を使用して、濃（ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄ）パラ−ヒドロキシケイ皮酸（４ｍまたは２．５４Ｍ）を熱的塩基触媒脱炭酸化することによって４−ヒドロキシスチレンを製造することである。

三口丸底フラスコに、ｐＨＣＡ（２０．０３５ｇ，１２２．０５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡｃ３０．０３４ｇ（ｐＨＣＡの２．５４Ｍ溶液を調製するため）を添加した。反応フラスコを１５０℃の予熱された油浴中に沈め、溶液は約１５分後にその温度に達した。酢酸カリウム（０．１２４ｇ，１モル％）を一度にすべて添加した。攪拌しながら、還流冷却器を使用して、窒素下にて反応を８時間行った。酢酸カリウムを添加する直前（時点０）で、かつ１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、および８時間の時点で、試料を採取し、上記の方法２を用いてｐＨＣＡおよびｐＨＳについてＨＰＬＣによって分析した。表５に示す結果から、ｐＨＣＡの転化は４時間後に本質的に完了しており、その時点でのｐＨＳの収率は８７．１％であることが示されている。

実施例２０〜２２
ＤＭＡｃ中で塩基性触媒として異なるレベルの酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することによる４−ヒドロキシスチレンの製造
これらの実施例の目的は、塩基性触媒として異なるレベルで酢酸カリウムを使用して、ＤＭＡｃ中で濃パラ−ヒドロキシケイ皮酸（２．５Ｍ）を熱的塩基触媒脱炭酸化することにより４−ヒドロキシスチレンを製造することである。

これらの実施例において、反応溶液に添加される酢酸カリウムの量を除いては、実施例１９に記載の手順と同じ手順を使用した。三口丸底フラスコに、ｐＨＣＡ（１９．１１ｇ，１１６．４ｍｍｏｌ）およびＤＭＡｃ３０．０ｇ（ｐＨＣＡの２．５Ｍ溶液を調製するため）に添加した。反応フラスコを１３５℃の予熱された油浴中に沈め、溶液は約１５分後にその温度に達した。酢酸カリウム（表６に示す量）を一度にすべて添加した。攪拌しながら、還流冷却器を使用して、窒素下にて４〜６時間反応を行った。酢酸カリウムを添加する直前（時点０）で、かつ１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、および６時間の時点で、試料を採取し、上記の方法２を用いてｐＨＣＡおよびｐＨＳについてＨＰＬＣによって分析した。酢酸カリウムを使用していない比較例２２については、時点０は、反応溶液の温度が１３５℃に平衡化した時点であると解釈した。

表６に示す結果から分かるように、実施例２０では２時間後にｐＨＳの収率９２．７％が得られ、実施例２１では、１時間後にｐＨＳの収率９０．４％が得られている。どちらの実施例からも、４時間未満でのｐＨＣＡの完全な転化が示されている。対照的に、塩基性触媒を使用しなかったことを除いて同じ条件で行われた比較例２２では、４時間後でさえｐＨＳの収率がわずか２９．３％、ｐＨＣＡの転化率がわずか３３．９％であることが示されている。

実施例２３
ジ（プロピレングリコール）メチルエーテル中で塩基性触媒として酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することによる４−ヒドロキシスチレンの製造
この実施例の目的は、プロトン性溶媒ジ（プロピレングリコール）メチルエーテル（ドワノール（Ｄｏｗａｎｏｌ）（商標）ＤＰＭ；ミシガン州ミッドランドのダウ・ケミカル社（Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ））中で塩基性触媒として酢酸カリウム（１０モル％）を使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸（２．５ｍ）を熱的塩基触媒脱炭酸化することによって４−ヒドロキシスチレンを製造することである。

三口丸底フラスコに、ｐＨＣＡ（１２．３１８ｇ，７５．０４ｍｍｏｌ）およびジ（プロピレングリコール）メチルエーテル３０．０５２ｇを添加した（ｐＨＣＡの２．５ｍ溶液を調製するため）。反応フラスコを１３５℃の予熱された油浴中に沈め、溶液は約１５分後にその温度に達した。溶液を加熱すると、ｐＨＣＡは完全に溶解した。酢酸カリウム（０．７３９ｇ，１０モル％）を一度にすべて添加した。攪拌しながら、還流冷却器を使用して、窒素下にて８時間反応を行った。塩基を添加すると固体が形成し、約３時間まで増加し、次いで、再び約５時間で完全に溶解した。酢酸カリウムを添加する直前（時点０）で、かつ１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、６時間、および８時間の時点で、試料を採取し、上記の方法２を用いてｐＨＣＡおよびｐＨＳについてＨＰＬＣによって分析した。その結果（表７参照）から、２時間後のｐＨＳの収率は６７．３％であることが示されている。追加の反応時間によって、収率が低下した。この結果から、プロトン性溶媒を熱的脱炭酸化反応に使用することができることが実証されている。

実施例２４
マイクロ波加熱を用いて、ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化することによる４−ヒドロキシスチレンの製造
この実施例の目的は、重合防止剤（プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １０００ｐｐｍ）の存在下で、ＤＭＦ中で塩基性触媒として酢酸カリウムを使用して、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化することによって４−ヒドロキシスチレンを製造することである。この実施例では、マイクロ波加熱を用い、その結果、温度が高いほど、反応時間が短くなる。

撹拌子を備えた５ｍＬバイオタージ（Ｂｉｏｔａｇｅ）試験管バイアル（バージニア州シャーロッツヴィルのバイオタージＡＢ社（Ｂｉｏｔａｇｅ ＡＢ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ））に、ｐＨＣＡ（１．００２ｇ，６．１０４ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ３ｍＬ（ｐＨＣＡの約２Ｍ溶液を調製するため）、プロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５ １０００ｐｐｍ（１ｍｇ）、および酢酸カリウム（６３ｍｇ，１０モル％）を添加した。窒素を試験管中に吹き込み、試験管をすぐにクリンプキャップした。密閉されたバイアルをバイオタージ・イニシエーター（Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ）６０マイクロ波反応器（バイオタージＡＢ社（Ｂｉｏｔａｇｅ ＡＢ））に入れた。１５０ワットの中間電力下にて、７０〜８０秒の昇温時間後に、試料温度が１９０℃に達した。短時間の間、約２００℃に上昇し過ぎたが、試料を１９０℃で３分間維持した。実施中、試料圧力は１６バール（１６００ｋＰａ）に達した。上記のように方法３を使用して、露出試料の定性的ＨＰＬＣによって、ｐＨＣＡの完全な転化が示され；紫外線スペクトル範囲２２０〜３１２ｎｍにわたって、ｐＨＣＡは検出されなかった。ｐＨＳによるピークは、２２０ｎｍで領域７３．３％であり、３１２ｎｍでは領域１００％であり、反応の優れた選択性が示されている。

実施例２５
単一容器反応においてパラ−ヒドロキシケイ皮酸を脱炭酸化し、続いてアセチル化することによる４−アセトキシスチレンの製造
この実施例の目的は、２工程の単一容器反応において、パラ−ヒドロキシケイ皮酸を熱的塩基触媒脱炭酸化し、続いて、得られた４−ヒドロキシスチレンを無水酢酸でアセチル化することにより４−アセトキシスチレンを製造することである。重合防止剤はこの実施例では使用せず、出発ｐＨＣＡは、チロシンの生物変換から誘導され、およそ純度８５％であった。

係属中かつ同一出願人による米国特許出願第６０／５６３６３３号明細書にベン・バサット（Ｂｅｎ Ｂａｓｓａｔ）らにより記載されている方法と同様な方法を用いて、出発ｐＨＣＡ材料を製造した。この方法は、グルコースからｐＨＣＡを生成するための２段階プロセスを含む。この実施例で使用される方法において、２つの段階は、２つの別々の工程として行われた。第１の段階では、チロシン過剰産生株を使用して発酵させることによってグルコースからチロシンを生成した。低速遠心分離を用いて、発酵ブロスからチロシンを分離した。得られた沈殿物を水に懸濁し、低速遠心分離を再び使用して分離した。チロシンの純度は、ＨＰＬＣを用いて９０〜９８％であると推定された。次いで、第２段階において、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有する酵素を含んでなる宿主細胞を使用してｐＨ１０．０で、チロシンをｐＨＣＡに変換した。ｐＨＣＡは発酵培地中に蓄積した。ｐＨＣＡ含有ブロス約７．５ｋｇを遠心し、固体を廃棄した。３５℃および６００ｒｐｍで操作される１４Ｌブラウン（Ｂｒａｕｎ）発酵槽、バイオスタット（ＢｉｏＳｔａｔ）Ｃ．Ｂ．（ドイツ，メルスンゲンのブラウン・バイオテック・インターナショナル社（Ｂｒａｕｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｍｅｌｅｓｕｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））に上清を移した。硫酸を使用して、溶液のｐＨを９．０に調節した。次いで、アルカラーゼ（Ａｌｃａｌａｓｅ）（登録商標）（デンマーク，バグスバード２８８０，クログシューヴェイ３６，ノボザイムズ社（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，Ｋｒｏｇｓｈｏｅｊｖｅｊ３６，２８８０Ｂａｇｓｖａｅｒｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ））０．２５４ｍＬおよびブロメライン（Ｂｒｏｍｅｌａｉｎ）（アクロスオーガニクス社（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ），ペンシルバニア州ピッツバーグのフィッシャー・サイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から入手された）０．１３４ｇを添加した。１時間インキュベートした後、溶液を滴定してｐＨ２．２とし、ｐＨＣＡを沈殿させた。得られた懸濁液を遠心し、固形分約４０％の湿ったケーク６００ｇとしてｐＨＣＡを回収した。ｐＨＣＡの他に、湿ったケークは、タンパク質、細胞壊死組織片、塩、ケイ皮酸約０．２１％、およびチロシン０．１％も含有した。その湿ったケークを窒素下にて８０℃で１２時間乾燥させて、ｐＨＣＡ約８５％を含有する乾燥ケーキを得た。

生物産生されたｐＨＣＡを以下のように抽出によって精製した。１Ｌ反応がまに、ｐＨＣＡを含有する乾燥ケーク１６３．８８ｇを添加した。その反応がまに、ＤＭＡｃ３５０ｍＬを添加し、機械攪拌しながら、内容物を２時間、６０℃に加熱した。混合物をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）Ｎｏ．４濾紙を通して濾過し、不溶物をＤＭＡｃ５０ｍＬで洗浄した。

オーバーヘッドスターラー、還流冷却器、添加漏斗、および温度プローブを備えた１Ｌ四口フラスコに、抽出から得られた、合わせた濾液および洗液を添加した。上述のようにＨＰＬＣ法４によって、反応混合物を分析し、ｐＨＣＡ１２２．９８ｇを含有することが見出された。その混合物に酢酸カリウム８．８ｇ（１０モル％）を添加し、混合物を窒素下にて３時間、１３５℃に加熱した。無水酢酸９１．７７ｇ、８４．９７ｍＬを８分間にわたって添加漏斗によって添加した。反応混合物をさらに０．５時間攪拌し、次いで室温に冷却した。２．８トル（０．３７ｋＰａ）および６５℃で回転蒸発器によって溶媒を除去した。固体を混合物から分離し、ワットマン（Ｗｈａｔｍａｎｎ）Ｎｏ．４濾紙を通して濾過除去した。固体をＤＭＡｃ３０ｍＬで洗浄した。２．５トル（０．３３ｋＰａ）および６５℃で回転蒸発器によって、溶媒が蒸留除去されなくなるまで、合わせた濾液をさらに濃縮した。

このようにして得られた未精製ｐＡＳ１５７．５ｇを、メチルヒドロキノン２００ｐｐｍを添加することによって安定化し、薄膜蒸発器（ＵＩＣ社，シャナホン通り１２２５，ジョリエット，ＩＩ６０４３６（ＵＩＣ Ｉｎｃ．１２２５Ｃｈａｎｎａｈｏｎ Ｒｄ．，Ｊｏｌｉｅｔ，ＩＩ６０４３６）から市販の表面積０．０４ｍ^２を有するモデルＫＤＬ−４）で蒸留した。流量２．０ｍＬ／分、攪拌速度３００ｒｐｍで２．００ｍｍＨｇ（０．２６７ｋＰａ）にて蒸留を行った。入口温度は７１℃であり、出口温度は７０℃であり、指形冷却器は１０℃に維持した。ｐＡＳは、オーバーヘッド中に残留ＤＭＡｃ１１２．９ｇと共にあり、重質留分（２７．６ｇ）は、最終蒸留中に形成したｐＡＳおよびそのオリゴマーを含有した。０．０２トル（２．７Ｐａ）および４５℃で蒸留することによってＤＭＡｃをオーバーヘッド留分から除去し、ｐＡＳ８６．２ｇ（収率７１％）を得た。

Claims (39)

1. ａ）一般構造：
   

   

   
   ［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５はＨ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４はＨ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７はＨ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうち少なくとも１つはＯＨであり、そしてＲ_２およびＲ_４は両方同時にｔ−ブチルではない］
   を有するフェノール性基質を準備する工程；
   ｂ）ｉ）非アミン塩基性触媒；および
   ｉｉ）少なくとも１種の極性有機溶媒または極性有機溶媒混合物；
   を含んでなる反応混合物を準備する工程；
   ｃ）フェノール性基質を脱炭酸化生成物に脱炭酸化するのに十分な時間、少なくとも約１００℃の温度で（ａ）のフェノール性基質を（ｂ）の反応混合物と接触させる工程；
   を含んでなる、フェノール性基質を脱炭酸化してビニルモノマーを製造する方法。
2. Ｒ_３がＯＨである請求項１に記載の方法。
3. フェノール性基質が４−ヒドロキシケイ皮酸、フェルラ酸、シナピン酸、コーヒー酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸よりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
4. 脱炭酸化生成物が４−ヒドロキシスチレン、３−メトキシ−４−ヒドロキシスチレン、３，５−ジメトキシ−４−ヒドロキシスチレン、３，４−ジヒドロキシスチレン、２−ヒドロキシスチレンおよびα−シアノ−４−ヒドロキシスチレンよりなる群から選択される請求項１に記載の方法。
5. 非アミン塩基性触媒がカリウムを含んでなる請求項１に記載の方法。
6. 非アミン塩基性触媒が酢酸塩である請求項１に記載の方法。
7. 非アミン塩基性触媒が金属塩である請求項１に記載の方法。
8. 非アミン塩基性触媒が酢酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび酸化マグネシウムよりなる群から選択される請求項７に記載の方法。
9. 非アミン塩基性触媒が反応混合物中で基質に対して約１モル％〜約３０モル％の濃度である請求項１に記載の方法。
10. 極性有機溶媒が非プロトン性である請求項１に記載の方法。
11. 極性非プロトン性有機溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、およびヘキサメチル亜リン酸トリアミドよりなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
12. 極性有機溶媒がプロトン性である請求項１に記載の方法。
13. プロトン性溶媒がジ（プロピレングリコール）メチルエーテル（ドワノール（Ｄｏｗａｎｏｌ）（商標）ＤＰＭ）、ジ（エチレングリコール）メチルエーテル、２−ブトキシエタノール、エチレングリコール、２−メトキシエタノール、プロピレングリコールメチルエーテル、ｎ−ヘキサノール、およびｎ−ブタノールよりなる群から選択される請求項１２に記載の方法。
14. 反応混合物が場合により重合防止剤を含んでなる請求項１に記載の方法。
15. 重合防止剤がヒドロキノン、ヒドロキノンモノメチルエーテル、４−ｔｅｒｔ−ブチルカテコール、フェノチアジン、Ｎ−オキシル（ニトロキシド）防止剤、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イルオキシ，ＣＡＳ＃２２２６−９６−２）およびユビナル（Ｕｖｉｎｕｌ）（登録商標）４０４０Ｐ（１，６−ヘキサメチレン−ビス（Ｎ−ホルミル−Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）アミン）よりなる群から選択される請求項１４に記載の方法。
16. 重合防止剤がプロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５（ビス（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）セバケート，ＣＡＳ＃２５１６−９２−９）である請求項１５に記載の方法。
17. 反応混合物が場合により重合遅延剤を含んでなる請求項１に記載の方法。
18. 重合遅延剤がジニトロ−オルト−クレゾール（ＤＮＯＣ）およびジニトロブチルフェノール（ＤＮＢＰ）よりなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
19. 脱炭酸化生成物の収率が６３％を超える請求項１に記載の方法。
20. 温度が約１００℃〜約２００℃である請求項１に記載の方法。
21. ａ）一般構造：
    

    

    
    ［式中、Ｒ_１、Ｒ_３、およびＲ_５はＨ、ＯＨ、またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_２およびＲ_４はＨ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_６およびＲ_７は、Ｈ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_１、Ｒ_３、またはＲ_５のうち少なくとも１つはＯＨである］
    を有するフェノール性基質を準備する工程；
    ｂ）ｉ）非アミン塩基性触媒；および
    ｉｉ）少なくとも１種の極性非プロトン性有機溶媒または極性非プロトン性有機溶媒混合物；
    を含んでなる反応混合物を準備する工程；
    ｃ）フェノール性基質を脱炭酸化して脱炭酸化生成物を生成せしめるのに十分な時間、少なくとも約１００℃の温度で（ａ）のフェノール性基質を（ｂ）の反応混合物と接触させる工程；
    ｄ）（ｃ）の脱炭酸化生成物をアセチル化剤と接触させて、一般構造：
    

    

    
    ［式中、Ｒ_８、Ｒ_１０、およびＲ_１２はＨ、Ｏ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３またはＯＣＨ_３であり；Ｒ_９およびＲ_１１はＨ、ＯＨ、ＯＣＨ_３または直鎖状もしくは分岐状アルキルであり；Ｒ_１３およびＲ_１４はＨ、ハロ、またはシアノであり、ただし、Ｒ_８、Ｒ_１０、またはＲ_１２のうちの少なくとも１つはＯ（Ｃ＝Ｏ）ＣＨ_３である］
    を有するアセチル化生成物を生成せしめる工程；
    の連続した工程を含んでなる、フェノール性基質からアセチル化生成物を合成する方法。
22. アセチル化剤が無水酢酸、塩化アセチル、および酢酸よりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
23. アセチル化剤が無水酢酸である請求項２１に記載の方法。
24. アセチル化生成物が４−アセトキシスチレン、３−メトキシ−４−アセトキシスチレン、３，５−ジメトキシ−４−アセトキシスチレン、３，４−ジアセトキシスチレン、２−アセトキシスチレン、およびα−シアノ−４−アセトキシスチレンよりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
25. アセチル化生成物が４−アセトキシスチレンである請求項２１に記載の方法。
26. フェノール性基質が４−ヒドロキシケイ皮酸、フェルラ酸、シナピン酸、コーヒー酸、２−ヒドロキシケイ皮酸、およびα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸よりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
27. 非アミン塩基性触媒がカリウムを含んでなる請求項２１に記載の方法。
28. 非アミン塩基性触媒が酢酸塩である請求項２１に記載の方法。
29. 非アミン塩基性触媒が金属塩である請求項２１に記載の方法。
30. 非アミン塩基性触媒が酢酸カリウム、炭酸カリウム、水酸化カリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウムおよび酸化マグネシウムよりなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
31. 非アミン塩基性触媒が反応混合物中で基質に対して約１モル％〜約３０モル％の濃度である請求項２１に記載の方法。
32. 極性非プロトン性有機溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、１−メチル−２−ピロリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルホスホルアミド、およびヘキサメチル亜リン酸トリアミドよりなる群から選択される請求項２１に記載の方法。
33. 反応混合物が場合により重合防止剤を含んでなる請求項２１に記載の方法。
34. 重合防止剤がヒドロキノン、ヒドロキノンモノメチルエーテル、４−ｔｅｒｔ−ブチルカテコール、フェノチアジン、Ｎ−オキシル（ニトロキシド）防止剤、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ（４−ヒドロキシ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−イルオキシ，ＣＡＳ＃２２２６−９６−２）およびユビナル（Ｕｖｉｎｕｌ）（登録商標）４０４０Ｐ（１，６−ヘキサメチレン−ビス（Ｎ−ホルミル−Ｎ−（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）アミン）よりなる群から選択される請求項３３に記載の方法。
35. 重合防止剤がプロスタブ（Ｐｒｏｓｔａｂ）（登録商標）５４１５（ビス（１−オキシル−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−４−イル）セバケート，ＣＡＳ＃２５１６−９２−９）である請求項３４に記載の方法。
36. 反応混合物が場合により重合遅延剤を含んでなる請求項２１に記載の方法。
37. 重合遅延剤がジニトロ−オルト−クレゾール（ＤＮＯＣ）およびジニトロブチルフェノール（ＤＮＢＰ）よりなる群から選択される請求項３６に記載の方法。
38. アセチル化生成物の収率が６３％を超える請求項２１に記載の方法。
39. 工程（ｃ）における温度が約１００℃〜約２００℃であり、そして工程（ｄ）における温度が室温〜約１５０℃である請求項２１に記載の方法。