JP2007525209A - アリシクロバシラスsp.のポリペプチド - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、受託番号DSM15716下で寄託されたアリシクロバシラスsp. (Alicyclobacillus sp.)のゲノムに包含されるポリヌクレオチドによりコードされる機能的及び操作的ポリペプチドに関する。本発明はさらに、そのようなポリペプチドをコードするか、又はそれらの発現を促進する前記ポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドの構造体、並びに前記ポリペプチドの調製方法に関する。さらに、本発明は、前記ポリペプチド及びポリヌクレオチドを含んで成る組成物、及び前記ポリペプチドの使用に関する。さらに、本発明は、受託番号DSM15716下で寄託されるような細菌アリシクロバシラスsp.に関する。
次の文献に記載されるアリシクロバシラス種の属からのいくつかの酵素は知られている:Matzke など. ; Gene cloning, nucleotide sequence and biochemical properties of a cytoplasmic cyclomaltodextrinase (neopullulanase) from Alicyclobacillus acidocaldarius ATCC 2700 ; reclassification of a group of enzymes; Submitted (MAR-1999) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases 又は Koivula など. ; Cloning and sequencing of a gene encoding acidophilic amylase from Bacillus acidocaldarius. J. Gen. Microbiol. 139: 2399 (1993) 又は Bartolucci など. ; Thioredoxin from Bacillus acidocaldarius : characterization, high-level expression in Escherichia coli and molecular modeling ; Biochem. J. 328: 277 (1997) 又は Tsuruoka など. ; Collagenolytic Serine- Carboxyl Proteinase from Alicyclobacillus sendainensis Strain NTAP-1 : Purification, Charac- terization, Gene Cloning, and Heterologous Expression ; Submitted (MAY-2002) to the EMBL/GenBank/DDBJ databases; Eckert K. & Schneider E., A thermoacidophilic endoglucanase (ceIB) from Alicyclobacillus acidocaldarius displays high sequence similarity to arabinofu- ranosidases belonging to family 51 of glycosyl hydrolases ; Eur. J. Biochem. , 270: 3593-3602, 2003。
さらに、完全なゲノム配列決定は、Fleischmann など. ; Whole genome sequences and assembly of Haemophilus influenzae Rd ; Nature 269: 496-512; (1995)に記載のようにして、所定の微生物からのすべての遺伝子に基づく情報を得るための既知方法である。
それ自体のシグナルを欠いている細胞外レポーター遺伝子への翻訳的融合を用いて、シグナルペプチドをコードするヌクレオチドを包含する遺伝子を同定する方法であるシグナルトラッピングはまた、知られている(WO01/77315号)。
本発明者は、アリシクロバシラス株、すなわち低いpH(約4〜5)及び高い濃度(50〜60℃)で増殖するアリシクロバシラスsp. DSM 15716株を発現した。この株は、公開されている既知の株とDSM15716株との間のポリジーン距離が有意であり、そして増殖条件が産業用酵素のためのいくつかの用途のための条件に類似するので、興味あるものである。
(a)本発明のポリペプチドを発現し、そして分泌することができる、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んで成る菌株を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る、本発明のポリペプチドの調製方法を提供する。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含んで成る組成物、及び本発明のポリヌクレオチド及び賦形剤を混合することを含んで成る、そのような組成物の調製方法を提供する。
さらなる観点においては、本発明は、受託番号DSM15716下で寄託されるような細菌アリシクロバシラスsp.に関する。
最終の観点においては、本発明は、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列、又は本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の情報を包含する電子記憶媒体を提供する。
本出願は、本出願に添付され、そしてまた、本出願に付随するデータキャリヤー上に提供される配列列挙の形で情報を含む。データキャリヤーの内容物は、引用により本明細書に組込まれる。成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域は、配列番号26〜50の成熟ポリペプチドをコードする。従って、成熟ポリペプチドをコードする配列番号1の領域は、配列番号26に包含される成熟ポリペプチドをコードし、成熟ポリペプチドをコードする配列番号2の領域は、配列番号27に包含される成熟ポリペプチドをコードし、及び等々。
定義:
用語“同一性”とは、本明細書において使用される場合、2種のアミノ酸間又は2種のヌクレオチド配列間の相同性として理解されるべきである。本発明のためには、2種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、Vector NTI ver. 7.1のプログラムにおけるAlignX(Informax inc. , 7600 Wisconsin Avenue, Suite #1100, Bethesda, MD 20814, USA)を用いることによって決定された。アミノ酸一列整列を、Clustal W アルゴリズム (Nucleic Acid Research, 22 (22): 4673-4680,1994)を用いて創造した。
用語“成熟ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の領域”とは、本明細書において使用される場合、成熟ポリペプチドの最初のアミノ酸をコードするトリプレットから、成熟ポリペプチドの最後のアミノ酸をコードする最後のトリプレットまで計数するヌクレオチド配列の領域を意味する。
本発明は、受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.から得られるそれらの分泌されたポリペプチドに類似するポリペプチドに関する。特に、本発明は、受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.から得られる対応する分泌されたポリペプチドに対して少なくとも90%同一であり、そして前記ポリペプチドの同じ機能を示す単離された成熟機能的ポリペプチドに関する。
本発明のポリペプチドは特に、その特定の細胞のための機能の提供を伴って、アリシクロバシラスsp. DSM15716により分泌される。
(a)配列番号26〜50に包含される成熟ポリペプチドから成る群から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)(i)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖、から成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドから成る群から選択され、ここで前記ポリペプチドは配列番号26〜50に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する。
(a)DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から分泌される、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された成熟酵素のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る酵素;
(a)配列番号26〜40に包含される成熟酵素から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素;
(b)(i)成熟酵素をコードする配列番号1〜15の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜15の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖、から成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列をコードする酵素から成る群から選択された、単離された酵素であり、ここで前記酵素は配列番号26〜40に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、約10℃〜約80℃、特に約20℃〜約60℃の範囲内の温度で最適な酵素活性を示す酵素である。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号26〜50に包含される成熟酵素から選択された酵素の少なくとも20%、特に少なくとも40%、例えば少なくとも50%、特に少なくとも60%、例えば少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、例えば少なくとも90%、最も特定には少なくとも95%、例えば約又は少なくとも100%の酵素活性を示す酵素である。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号26〜50に包含される成熟ポリペプチドとは、多くとも10個のアミノ酸(例えば、10個のアミノ酸)、特に多くとも5個のアミノ酸(例えば、5個のアミノ酸)、例えば多くとも4個のアミノ酸(例えば、4個のアミノ酸)、例えば多くとも3個のアミノ酸(例えば、3個のアミノ酸)、特に多くとも2個のアミノ酸(例えば、2個のアミノ酸)、例えば1個のアミノ酸で異なる。
特に、本発明のポリペプチド、特に人工変異体を生成するために配列番号26〜50に包含される成熟ポリペプチドから成る群から選択されたそれらのポリペプチドにおける、そのような置換、欠失、及び/又は挿入の数は、多くとも10、例えば多くとも9、例えば多くとも8、より多くとも7、例えば多くとも6、例えば多くとも5、最も好ましくは多くとも4、例えば多くとも3、例えば多くとも2、特に多くとも1である。
(i)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖;
(iii)配列番号26〜50に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する分泌されたポリペプチドをコードする(i)又は(ii)のフラグメントから成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、少なくとも高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド(J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)。
もう1つの興味ある態様においては、ポリヌクレオチドプローブは、配列番号26〜50の群から選択されたを酵素をコードするヌクレオチド配列の相補的鎖である。さらに興味ある態様においては、ポリヌクレオチドプローブは、成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域から選択されたヌクレオチド配列の成熟ポリペプチドコード領域の相補的鎖である。
約15個〜約99個の長さのヌクレオチドである短いプローブに関しては、キャリヤー材料は、6×SSC及び0.1%SDSにより15分間、1度、及び6×SSCを用いて、計算されたTmよりも約5℃〜約10℃低い温度でそれぞれ15分間、2度、洗浄される。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られる酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、より特定には配列番号26に包含される成熟酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に 受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるグルタミン酸ペプチダーゼ、より特定には配列番号27に包含される成熟酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るグルタミン酸ペプチダーゼである。より特定には、成熟酸グルタミン酸ペプチダーゼは、配列番号27の位置33〜272からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。本明細書においては、グルタミン酸ペプチダーゼは、タンパク質又はペプチドを加水分解し、そして保存された活性部位残基Q及びEを含む酵素として定義される。
(アスペルギラス・ニガー(Aspergillus niger))アスペルギロペプシンII:配列番号55
TREMBL_Q9P8R1:
(スクレロチニア・スクレロチオラム(Sclerotinia sclerotiorum))エンドペプチダーゼEapC:配列番号56
TREMBL-Q00551:
(クリホネクトリア・パラシチカ(Cryphonectria parasitica))エンドペプチダーゼEapC:配列番号57
SWISSPROT_P15369:
(シロリジウム・リグニコラム(Scytalidium lignicolum))シタリドグルタミン酸ペプチダーゼ;配列番号58
(クリホネクトリア・パラシチカ(Cryphonectria parasitica))エンドペプチダーゼEapB:配列番号59
TREMBL_Q8X1C5:
(タラロミセス・エメルソニル(Talaromyces emersonii))パプスタチン−無感受性酸性プロテアーゼ(フラグメント);配列番号60
配列番号27:
本発明の配列:
o=Swissprot P24665において活性部位を形成するアミノ酸
/=Swissprot P24665においてジスルフィド結合を形成するシステイン残基
#=Swissprot P24665チモーゲンから除去されたプロペプチド
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られる多銅オキシダーゼ、より特定には配列番号28又は35に包含される成熟多銅オキシダーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る多銅オキシダーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるセリン−カルボキシルプロテアーゼ、より特定には配列番号29又は30に包含される成熟セリン−カルボキシルプロテアーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るセリン−カルボキシルプロテアーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるセリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、より特定には配列番号31に包含される成熟セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るセリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるジスルフィドイソメラーゼ、より特定には配列番号32に包含される成熟ジスルフィドイソメラーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るジスルフィドイソメラーゼである。より特定には、成熟ジスルフィドイソメラーゼは、配列番号32の位置31〜212からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。本明細書においては、ジスルフィドイソメラーゼは、活性構造を形成するために鎖内及び鎖間シスルフィド結合の転位を触媒する酵素として定義される。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるγ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、より特定には配列番号33に包含される成熟γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るγ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、より特定には配列番号34に包含される成熟エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られるペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、より特定には配列番号36に包含される成熟ペプチジル−プロリル−イソメラーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成るペプチジル−プロリル−イソメラーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られる酸性ホスファターゼ又はフィルターゼ又はホスホリパーゼC、より特定には配列番号37に包含される成熟酸性ホスファターゼ又はフィルターゼ又はホスホリパーゼCと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る酸性ホスファターゼ又はフィルターゼ又はホスホリパーゼCである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られる多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ、より特定には配列番号38又は39に包含される成熟多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼである。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、アリシクロバシラスsp.特に受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.の株から得られる亜硫酸オキシダーゼ、より特定には配列番号40に包含される成熟亜硫酸オキシダーゼと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る亜硫酸オキシダーゼである。より特定には、成熟亜硫酸オキシダーゼは、配列番号40の位置30〜214からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。亜硫酸オキシダーゼは、亜硫酸塩を硫酸塩に酸化する酵素として定義される。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号41、より特定には配列番号41に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号41の位置22〜257からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号42、より特定には配列番号42に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号42の位置25〜1130からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号43、より特定には配列番号43に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号43の位置42〜248からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号44、より特定には配列番号44に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号44の位置26〜172からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号45、より特定には配列番号45に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号45の位置31〜242からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号46、より特定には配列番号46に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号46の位置25〜280からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号47、より特定には配列番号47に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号47の位置26〜478からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号48、より特定には配列番号48に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号48の位置20〜340からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号49、より特定には配列番号49に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号49の位置30〜341からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリペプチドは、配列番号50、より特定には配列番号50に包含される成熟機能的ポリペプチドと、少なくとも90%、特に少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るか又はそれらから成る機能的ポリペプチドである。より特定には、成熟機能的ポリペプチドは、配列番号50の位置29〜400からの配列を含んで成るか又はそれらから成る。
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードするヌクレオチドを含んで成るか又はそれらから成るポリヌクレオチド、特に単離されたポリヌクレオチドに関する。特定の態様においては、ヌクレオチド配列は、遺伝子コードの縮重によりそれらとは異なるヌクレオチド配列を包含する配列番号1〜25で示される。さらなる態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域から選択されたヌクレオチド配列を含んで成るか、又はそれらから成り、そして配列番号1〜25に包含される親ヌクレオチド配列に比較して、少なくとも1つの修飾/突然変異を含んで成る修飾されたヌクレオチド配列である。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼをコードし、そして配列番号1の位置73〜2877のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、グルタミン酸ペプチダーゼをコードし、そして配列番号2の位置97〜816のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、多銅オキシダーゼをコードし、そして配列番号3の位置76〜945又は配列番号10の位置148〜1791のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、セリン−カルボキシルプロテアーゼをコードし、そして配列番号4の位置568〜1878又は配列番号5の位置73〜1599のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼをコードし、そして配列番号6の位置124〜1233のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、ジスルフィドイソメラーゼをコードし、そして配列番号7の位置91〜633のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼをコードし、そして配列番号8の位置88〜798のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼをコードし、そして配列番号9の位置79〜2304のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼをコードし、そして配列番号11の位置88〜735のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼCをコードし、そして配列番号12の位置82〜1824のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼをコードし、そして配列番号13の位置76〜750又は配列番号14の位置64〜972のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、亜硫酸オキシダーゼをコードし、そして配列番号15の位置88〜642のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号16の位置64〜771のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号17の位置73〜3390のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号18の位置124〜744のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号19の位置76〜516のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号20の位置91〜726のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号21の位置73〜540のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号22の位置76〜1431のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号23の位置58〜1020のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号24の位置88〜1023のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
特定の態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、成熟機能的ポリペプチドをコードし、そして配列番号25の位置85〜1197のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、より特定には少なくとも80%、より特定には少なくとも90%、より特定には少なくとも95%、より特定には少なくとも96%、より特定には少なくとも97%、より特定には少なくとも98%、より特定には少なくとも99%、又は最も特定には100%の同一性を有するヌクレオチド配列を含んで成るか又はそれらから成る。
(i)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖;
(iii)配列番号26〜50に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する分泌されたポリペプチドをコードする上記(i)又は(ii)のフラグメント(J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York)。
本発明はまた、適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を、制御配列と適合できる条件下で指図する、1又は複数の制御配列に作用可能に結合される本発明のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体に関する。
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、アスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼ及びフサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニジュランストリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギラス・オリザエTAKAアミラーゼ、アスペルギラス・ニガーグルコアミラーゼ、アスペルギキラス・ニジュランスアントラニル酸シンターゼ、フサリウム・オキシスポラムトリプシン−様プロテアーゼ及びアスペルギラス・ニガーα−グルコシダーゼについての遺伝子から得られる。
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo and Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990により記載されている。
本発明はまた、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクターにも関する。上記の種々のヌクレオチド及び制御配列は、1又は複数の便利な制限部位でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするためにそれらの部位を含むことができる組換え発現ベクターを生成するために一緒に連結され得る。他方では、本発明のヌクレオチド配列は、前記配列又は前記配列を含んで成る核酸構造体を、発現のための適切なベクター中に挿入することによって発現され得る。発現ベクターを創造する場合、そのコード配列はベクターに位置し、その結果、コード配列は発現のための適切な制御配列により作用可能に連結される。
本発明のベクターは好ましくは、宿主細胞ゲノム中へのベクターの安定した組み込み、又は細胞のゲノムに無関係に細胞におけるベクターの自律的複製を可能にする要素を含む。
本発明はまた、変異体の組換え生成において都合良く使用される、本発明の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞にも関する。本発明のヌクレオチド配列を含んでなるベクターは、そのベクターが染色体組み込み体として、又は前記のような自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞中に導入される。
宿主細胞は、単細胞微生物、例えば原核生物、又は単細胞微生物、真核生物であり得る。
宿主細胞は、真核生物、たとえば哺乳類、昆虫、植物、又は菌類細胞であり得る。
本発明はまた、受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp.、及びこの微生物を含んで成る組成物を提供する。
本発明はまた、(a)本発明の酵素を発現でき、そして分泌できる、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列を含んで成る株を培養し、そして(b)前記酵素を回収することを含んで成る本発明の酵素の生成方法にも関する。特定の態様においては、前記株は、野生型株、例えばアリシクロバシラスsp. DSM15716であり、そしてもう1つの態様においては、株は上記のような組換え宿主細胞である。
本発明はまた、酵素を、発現し、そして生成するために、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列により形質転換されている、トランスジェニック植物、植物部分又は植物細胞にも関する。1つの態様においては、植物は、回収可能な量での酵素の生成のための宿主として使用され得る。酵素は植物又は植物部分から回収され得る。他方では、組換え酵素を含む植物又は植物部分が、食品又は飼料の品質を改良するために、例えば、栄養価値、味のよさ及び流動性質を改良するために、又は抗栄養因子を破壊するために使用され得る。特に、酵素を発現する植物又は植物部分は、燃料−アルコール又は生物−エタノールの生成のための改良された出発材料として使用され得る。
双子葉植物の例は、タバコ、マメ科植物、たとえばハウチワマメ、ジャガイモ、テンサイ、エンドウ、豆及び大豆、並びにアブラナ科(ブラシカセアエ科(Brassicaceae))、たとえばカリフラワー、ナタネ及び密接に関連するモデル生物アラビドプシス・タリアナ(Arabidopsis Thaliana)である。
また、そのような植物、植物部分及び植物細胞の子孫も、本発明の範囲内に包含される。
選択マーカー遺伝子、及び発現構造体のいずれかの他の部分は、当業界において入手できるものから選択され得る。
本発明はまた、(a)酵素の生成のために適切な条件下で、本発明の酵素をコードするヌクレオチド配列を含んで成るトランスジェニック植物又は植物細胞を培養し;そして(b)前記酵素を回収することを含んで成る本発明の酵素を生成するための方法にも関する。
本発明は、本発明のポリペプチド及び好ましくは賦形剤を含んで成る組成物、及び本発明のポリペプチドと賦形剤とを混合することを含んで成る、そのような組成物の調製方法を提供する。特に、組成物は、少なくとも2種、好ましくは少なくとも3種、より好ましくは少なくとも5種、より好ましくは少なくとも10種、より好ましくは少なくとも15種、より好ましくは少なくとも20種の異なったポリペプチドを含んで成る。ほとんどの組成物は、アリシクロバシラスsp. DSM15716又はその変異体(1又は複数の遺伝子が欠失されているか、又は付加されている)のサンプルを発酵する場合、分泌されるすべてのポリペプチドを含んで成る。
さらなる態様においては、本発明の組成物は、ポリペプチドの他に、穀物又は穀粒を含んで成る飼料組成物である。
さらなる態様においては、本発明の組成物は、多糖、又は多糖の混合物を含んで成り、そして本発明のポリペプチドを含んで成る。
さらなる態様においては、本発明の組成物は、本発明のポリペプチドの他に、パルプを含んで成るパルプ組成物である。
さらなる態様においては、本発明の組成物は、本発明のポリペプチドの他に、オキシドレダクターゼエンハンサーを含んで成る殺生物組成物である。
さらなる観点においては、本発明は、本発明のポリペプチド又はポリヌクレオチド、又は前記ポリペプチド又はポリヌクレオチドを含んで成る組成物の種々の用途、特に(技術的)工程、例えば商業的研究目的のために産業又は家庭において行われる工程への使用を提供する。従って、本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明のポリヌクレオチドを、(技術的)産業的研究又は家庭工程に使用することを含んで成る方法を包含する。
もう1つの態様においては、本発明のポリペプチド又は組成物は、食品又は飼料添加物を調製するために使用される。
さらにもう1つの態様においては、本発明のポリペプチド又は組成物は、リグノール材料及びパルプの処理のために使用される。
本発明のポリペプチドは、洗剤組成物に添加され、そして従ってその組成物の成分に成ることができる。
本発明の洗剤組成物は、手動又は機械洗濯用洗剤組成物、例えば染色された布の前処理のために適切な洗濯用添加剤組成物及びすすぎ用布ソフトナー組成物として配合され得、又は一般的な家庭用硬質表面洗浄操作における使用のための洗剤組成物として配合され得、又は手動又は機械皿洗い操作のために配合され得る。
一般的に、選択された酵素の性質は、選択された洗剤と適合できるべきであり(すなわち、他の酵素及び非酵素の成分、等とのpH−最適適合性)、そして酵素は効果的な量で存在すべきである。
好ましい市販のプロテアーゼ酵素は、AlcalaseTM, SavinaseTM, PrimaseTM, DuralaseTM, EsperaseTM及びKannaseTM (Novo Nordisk A/S), MaxataseTM, MaxacalTM, MaxapemTM, ProperaseTM, PurafectTM, Purafect OxPTM, FN2TM及びFN3TM (Genencor International Inc.) を包含する。
好ましい市販のリパーゼ酵素は、LipolaseTM 及びLipolase UltraTM (Novo Nordisk A/S) を包含する。
市販のアミラーゼは、DuramylTM, TermamaylTM, FungamylTM 及びBAMTM (Novo Nordisk A/S), RapidaseTM 及びPurastarTM (Genencor International Inc.)である。
洗剤酵素は、1又は複数の酵素を含む別々の添加剤を添加することにより、又はそれらの酵素のすべてを含んで成る組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物に包含され得る。本発明の洗剤添加剤、すなわち別々の添加剤又は組合された添加剤が、例えば粒質物、液体、スラリー、等として配合され得る。好ましくは洗剤添加剤配合物は、粒質物、特に非−ダスチング粒質物、液体、特に安定された液体又はスラリーである。
洗剤組成物は、非イオン性、例えば半−極性及び/又はアニオン性及び/又はカチオン性及び/又は両性イオンであり得る1又は複数の界面活性剤を含んで成る。界面活性剤は典型的には、0.1〜60重量%のレベルで存在する。
洗剤は、1又は複数のポリマーを含んで成る。例としては、カルボキシメチルセルロース、ポリ(ビニルピロリドン)、ポリ(エチレングリコール)、ポリ(ビニルアルコール)、ポリ(ビニルピリジン−N−オキシド)、ポリ(ビニルイミダゾール)、ポリカルボキシレート(例えばポリアクリレート、マレイン酸/アクリル酸コポリマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸コポリマーを含んで成る。
本発明の洗剤組成物の酵素は、従来の安定剤、例えばポリオール、例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸又は硼酸誘導体、例えば芳香族硼酸エステル又はフェニル硼素酸誘導体、例えば4−ホルミルフェニル硼素酸を用いて安定化され得、そして前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合され得る。
洗剤組成物においては、いずれかの酵素、特に本発明の酵素は、洗浄液体1L当たり0.01−100mgの酵素タンパク質、好ましくは洗浄液体1L当たり0.05−5mgの酵素タンパク質、特に洗浄液体1L当たり0.1−1mgの酵素タンパク質に対応する量で添加され得ることが、現在企画される。
本発明の酵素はさらに、WO97/07202号(引例として本明細書組み込まれる)に開示される洗剤配合物に導入され得る。
次の微生物を、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, MascheroderWeg 1b, D-38124 Braunschweig, Germanyに、特許手続きのための微生物の寄託の国際認識に基づいてブダペスト条約に従って、出願人により寄託された:
2003年6月30日:アリシクロバシラスsp. CS81熱−好酸性物:DSM受託番号15716。
アリシクロバシラスsp. DSM15716からの染色体DNAを、標準の分子生物学技法(Ausuble など. 1995"Current protocols in molecular biology"Publ : John Wiley and sons)を用いることにより調製した。調製されたDNAを、Sau3Aにより部分的に切断し、そしてアガロースゲル上で分離した。3〜8kbのフラグメントを溶解し、そして沈殿し、そして適切な緩衝液に再懸濁した。
WO01/77315A1に記載されるようなTransposon Assisted Signal Trapping (TAST)の方法の背後にある基本的原理は、シグナルのないβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子と、選択されたゲノム内のすべての遺伝子をトランスポゾン標識を通して融合することである。従って、トランスポゾン標識を通して、シグナルのないβ−ラクタマーゼをコードする遺伝子により融合されたゲノムの遺伝子を含んで成る宿主細胞クローンを、アンピシリン含有培地において増殖する場合、β−ラクタマーゼを発現し、そして分泌するそれらのクローンのみが生存するであろう。
従って、TAST方法により得られる遺伝子は実際、分泌された機能的ポリペプチドをコードすることが結論づけられ得る。
WO01/77315A1の説明に従って、シグナルのないβ−ラクタマーゼを含むトランスポゾンの構成を、標準の分子生物学的技法を用いて行った。シグナルのないβ−ラクタマーゼはまず、プルーフリーディングポリメラーゼ(Pfu Turbo, Stratagene, USA)を用いて、PUC19からPCR増幅された。得られるPCRフラグメントは、クローニングを助けるために、制限部位NotI及びEcoRIを含んだ。エントランスポゾン及び抗生物質耐性マーカーCAT(トランスポゾンにおけるクロラムフェニコール耐性をコードする)を含むプラスミドpEntranceposon (Camr)を、Finnzymes, OY (EspooFinland)から得た。そのプラスミドを、制限酵素NotI及びEcoRIにより消化し、ゲル精製し、そしてシグナルのないβ−ラクタマーゼ含有フラグメントにより連結した。その連結物を用いて、エレクトロ−コンピテントDH10B細胞を形質転換し、そして組換えのプラスミド及びシグナルのないβ−ラクタマーゼを含むE. コリクローンを、制限分析により同定し、そしてSigA2と命名した。
pSigA4から調製されたトランスポゾンは、分泌シグナルが除去されているβ−ラクタマーゼをコードする5’−切断されたbla−遺伝子を担持する。β−ラクタマーゼは、タンパク質が細胞周辺に分泌される場合においてのみ、E. コリ上にアンピシリン耐性を伝達し、ところがβ−ラクタマーゼの細胞質発現はアンピシリン耐性を付与しない。シグナル配列がない場合、β−ラクタマーゼは細胞周辺に輸送されず、そして従ってクローンはアンピシリン含有培地上で増殖しないであろう。
エレクトロ−コンピテントE. コリDH10B細胞を、5μlのトランスポゾン標識されたプラスミドプールによるBiorad Gene Pulse装置(50μF、25mAmp, 1.8kV)におけるエレクトロポレーションにより形質転換し、1mlのSOC培地と共に混合し、37℃で1時間プレインキュベートし、そして25μl/mlのアンピシリン、50μl/mlのカナマイシン、10μl/mlのクロラムフェニコールを含むLB上にプレートし、そして2〜3日間インキュベートした。耐性形質転換体からの1056のコロニーを選択し、そしてプラスミドを、Qiaprep 96 Turbo Biorobotoキットを、その売主の説明書に従って適用することにより調製した。
1056のトランスポゾン標識されたプラスミドを、第1の反応においては、トランスポゾン標識された遺伝子を上流に読み取るA2upプライマーAGCGTTTGCGGCCGCGATCC(配列番号53)により、及び第2の反応においては、トランスポゾン標識された遺伝子を下流に読み取るBプライマーTTATTCGGTCGAAAAGGATCC(配列番号54)により配列決定した。
その得られる配列を、プログラムPhredPhrap(Brent Ewing, LaDeana Hillier, Michael C. Wendl, and Phil Green, Base-calling of automated sequencer traces using phred 1. Accuracy assessment (1998) Genome Research 8: 175-185; Brent Ewing and Phil Green, Base-calling of automated sequencer traces using phred 11. Error probabilities (1998) Genome Research 8: 186-194)を用いることにより、コンチグ(contig)にアセンブリーした。
得られる配列は、それらが前に説明されたように、アンピシリン耐性コロニーとして得られたので、損なわれない且つ機能的なポリペプチドをコードする機能的遺伝子であった。
ポリペプチド配列番号26〜50の機能を、既知機能の遺伝子又はポリペプチドとの配列比較により注釈した。本発明のポリペプチドを、コンチグの公開され、そして内部データベースからの密接に関連する配列の列挙に比較した。配列番号26〜50が由来するコンチグを続いて、プログラムBLASTX 2 Oa19MP-WashU [14-Jul-1998]を用いることにより、標準の公開されたDNA及びタンパク質配列データベースから入手できる配列に比較した。配列番号26〜40の配列一列整列の他のデータベースから既知機能を有するそれらの密接に関連する配列に対する注意した分析は、アミノ酸同一性の程度に基づいて、それらのポリペプチドの機能の予測を可能にした。
配列番号26〜50のポリペプチドを調製するために、それらのポリペプチドをコードする配列番号1〜25に包含される遺伝子を、適切な宿主株、例えばE. コリ、バチルス・サブチリス、バチルス・リケニホルミス又はバチルス・クラウジ、又はアリシクロバシラスsp. の誘導体における遺伝子発現のために適切なプロモーター、リボソーム結合部位及びターミネーターのDNAに、読取枠をコードするDNAを融合することによって発現する。プロモーターは、誘発性プロモーター又は構成的プロモーターのいずれかであり得る。配列番号26〜50のいずれのシグナル配列が、他の細菌の適切なシグナルペプチドと交換され得る。
適切な緩衝液中、セリン−カルボキシプロテアーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、その活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、不溶性色原体基質AZCL−コラーゲン(MegazymeTM)又はAzocoll (Sigma-Aldrich)及び酸性pH3〜5のpHでの適切な緩衝液を含むアガロースゲル上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば1日間インキュベートする。活性は、スポットの周囲の青色の円光として見える。AZCL−コラーゲン又はAzocollに代わるものとして、ラベルされていないコラーゲンを、寒天プレート上に添加し、この上で、酵素活性が透明な領域として検出され得る。
適切な緩衝液中、多−銅オキシダーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、Schneider など., Enzyme and Microbial Technology 25, (1999) p. 502-508に記載のようにして、その活性についてアッセイすることができる。
例えば、15μlであり得る適切な体積のそのようなサンプルを、適切な緩衝液、例えば0.1Mの酢酸ナトリウム緩衝液(pH5.5)中、適切な濃度、例えば1mMでABTS(2, 2’−アジノビス−3−エチルベンズチアゾリン−6−スルホン酸)を含むアガロース上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば16時間インキュベートする。活性は、サンプルの周囲での緑色の領域として見える。アッセイは上清液及び抽出物に対して行う。
適切な緩衝液中、セリンプロテアーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、その活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、不溶性色原体基質AZCL−カゼイン(MegazymeTM)又はAZCL−コラーゲン (MegazymeTM)及び適切なpHでの適切な緩衝液を含むアガロースゲル上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば1日間インキュベートする。活性は、スポットの周囲の青色の円光として見える。AZCL−カゼイン又はAZCL−コラーゲン (MegazymeTM)に代わるものとして、ラベルされていないカゼイン又はラベルされていないコラーゲンを、使用することができる。アガロースプレート上にスポットされたラベルされていないコラーゲン又はラベルされていないカゼイン上で、透明な領域がセリンプロテアーゼの存在下で形成する。
適切な緩衝液中、グルタミン酸ペプチダーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、その活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、不溶性色原体基質AZCL−コラーゲン(MegazymeTM)及び酸性pH3〜5のpHでの適切な緩衝液を含むアガロースゲル上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば1日間インキュベートする。活性は、スポットの周囲の青色の円光として見える。
:=Swissprot P24665においてジスルフィド結合を形成するシステイン残基
#=Swissprot P24665チモーゲンから除去されたプロペプチド。
適切な緩衝液中、酸性β−グルカナーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、その活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、不溶性色原体基質AZCL−β−グルカン(MegazymeTM)及び酸性pH3〜5のpHでの適切な緩衝液を含むアガロースゲル上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば1日間インキュベートする。活性は、スポットの周囲の青色の円光として見える。
適切な温度、例えば55℃で適切なpHでの適切な緩衝液中、酸性ホスファターゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、酵素活性を測定するためにパラ−ニトロフェノールホスフェート(pNPP)と共にインキュベートした。酵素反応の生成物は、p−ニトロフェノール及び無機ホスフェート又はPIである。NaOHを添加し、適切な反応時間の後、ホスファターゼアッセイを停止し、そしてp−ニトロフェノレートを形成する。p−ニトロフェノレートの吸光度を、405nmで光学的に測定する。代わるものとして、適切な温度、例えば55℃で適切なpHでの適切な緩衝液中、酸性ホスファターゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、酵素活性を測定するために、EnzChek Acid Phosphatase Assay Kit (E-12020) (Molecular Probes Europe BV; PoortGebouw, Rijnsburger- weg 10; 2333 AA Leiden, The Netherlands)と共に使用する。
適切な温度、例えば55℃での適切な緩衝液中、多糖デアセチラーゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、活性を測定するために使用した。細菌ムレイン、N, N’−ジアセチルキトビオース(Sigma)又はガラクトース五アセテート(Sigma)及び/又はセルロースアセテート(Sigma)を、この酵素型のための基質として使用することができる。酵素により基質から放されるアセテートを、酵素の物理的必要条件のために適合された酢酸アッセイキット(Biopharm)により測定することができる(Kosugi A, Murashima K, and Doi RH; Xylanase and Acetyl Xylan Esterase Activities of XynA, a Key Subunit of the Clostridium cellulovorans Cellulosome for Xylan Degradation ; Appl. Environm. I Microbiol. ; vol. 68; pp. 6399-6402; 2002)。
適切な温度、例えば55℃での適切な緩衝液(pH3〜5)中、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、MH Rashid, M Mori and J Sekiguchi; Glucosaminidase of Bacillus subtilis : cloning, regulation, pri- mary structure and biochemical characterization ; Microbiology; vol. 141; pp. 2391-2404; 1995に従って、活性を測定するために使用した。
適切な温度、例えば55℃での適切な緩衝液中、ペプチジルプロイル−イソメラーゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、活性を測定するために使用した。活性を、Fischer, G., Bang, H. and Mech, C.; Determination of enzymatic catalysis for the cis-trans-isomerization of peptide binding in proline-containing peptides. ; Biomed. Biochim. Acta; vol. 43; pp. 1101- 1111 ; 1984に従って決定することができる。このアッセイは、配列番号36に包含される特定のペプチジル−イソメラーゼを適合するために適切に修飾され得る。
適切な緩衝液中、酸性セルラーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、その活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、不溶性色原体基質AZCL−HE−セルロース(MegazymeTM)及び酸性pH、例えば3〜5のpHでの適切な緩衝液を含むアガロースゲル上にスポットする。プレートを、適切な温度、例えば55℃で適切な時間、例えば1日間インキュベートする。活性は、スポットの周囲の青色の円光として見える。
適切な温度、例えば55℃での適切な緩衝液中、多糖デアセチラーゼを合成し、そして分泌する宿主株の適切な体積の培養物流体又は細胞溶解物を、活性を測定するために使用した。キシランデアセチラーゼ活性を、Johnson など. 1988 (Johnson, K. G. , J. D. Fontana, and C. R. Mackenzie. 1988. Measurement of acetylxylan esterase in Streptomyces. Methods Enzymol. 160: 551-560)の方法により、カバノキキシランから調製される、アセチル化されたキシランから開放されるアセテートとして測定される。
適切な緩衝液中、フィターゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、そのフィターゼ活性についてアッセイすることができる。適切な体積のそのようなサンプルを、pH3.0〜3.5でのHCl、pH4.0〜5.5での酢酸ナトリウム、pH6.0〜6.5でのモルホリンエタンスルホン酸(MES)及びpH7.0〜9.0でのトリス−HClであり得る適切な緩衝液中、0.1Mの酢酸ナトリウム及び0.01%Tween−20(pH5.5)により希釈し、さらに、基質溶液(0.1Mの酢酸ナトリウム及び0.01%Tween−20(pH5.5)中、5mMのフィチン酸ナトリウム(Sigma))中に、26倍で希釈し、そして37℃でプレインキュベートし、反応を開始する。37℃で30分後、反応を、等体積の10%トリクロロ酢酸の添加により停止する。
適切な緩衝液中、ホスホリパーゼを合成し、そして分泌する宿主株の培養物流体又は細胞溶解物を、そのホスホリパーゼ活性についてアッセイすることができる。レシチンを、適切な体積のそのようなサンプルに添加する。レシチンを、一定のpH及び温度で加水分解し、そしてホスホリパーゼ活性を、遊離される脂肪酸の中和の間、滴定液(0.1NのNaOH)消化の速度として決定する。基質は大豆レシチン(L−α−ホスホチジル−コリン)であり、そして条件はpH8.00, 40.0℃、2分の反応時間である。単離(LEU)は、標準に対して定義される。
プロテアーゼSAVINNASETM (また、Novozymes A/Sからの、B. リケニホルミスからのスブチリシン309としても知られている)からのシグナルペプチドを、グルタミン酸ペプチダーゼをコードする遺伝子(配列番号2)に、PCRにより、読取枠を整合して融合した。得られるコード配列をコードするDNAを、バチルス・サブチリス宿主細胞ゲノム上に、相同組換えにより組込んだ。
グルタミン酸ペプチダーゼ(配列番号2)発現クローンの発酵を、6mg/lのクロラムフェニコールにより補充された100mlのPS−1培地をそれぞれ含む500mlのそらせ板付フラスコにおいて、回転振盪テーブル上で行った。クローンを37℃で6日間、発酵し、そしてサンプルを、3,4,5及び6日目に採取し、そしてタンパク質加水分解活性について分析した。活性を、pH3.4での0.1%AZCL−コラーゲン(MegazymeTM)LB-PG寒天プレート上で20μlの培養物流体のスポット試験として決定した(例7を参照のこと)。プレートを、55℃(一晩)でインキュベートし、そして活性はスポットの周囲の青色の円光として見えた。
精製:
培養ブイヨンを遠心分離し(20000×g、20分)、そして上清液を沈殿物から注意してデカントした。組合された上清液を、バシラス宿主細胞の残りを除くために、Seitz EKSプレートを通して濾過した。EKS濾液を、クエン酸によりpH4.0に調節し、そして水浴上で撹拌しながら70℃に加熱した。液溶が70℃に達した場合(25℃から70℃まで約15分かかる)、その溶液をすぐに氷上に置いた。この熱処理はいくらかの沈殿をもたらし、これは、もう1つのSeitz EKSフィルタープレート濾過により除去される。硫酸アンモニウムを、1.6Mの最終濃度まで、第2のEKS濾液に添加し、そしてプレートを、20mMのCH3COOH/NaOH, 1.6Mの(NH4)2SO4(pH4.5)において平衡化されたButyl Toyopearl Sカラムに適用した。Butylカラムを平衡化緩衝液により集中的に洗浄した後、酵素を、同じ緩衝液中、線状(NH4)2SO4グラジエント(1.6〜0M)により溶離した。
Pratazyme OL(架橋され、そして染色されたコラーゲン)アッセイを用いた。Protazyme OL錠剤(Megazymeからの)を、軽く撹拌しながら2.0mlの0.01%TritonX−100に懸濁した。500μlのこの懸濁液及び500μlのアッセイ緩衝液を、エパンドーフ管において混合し、そして氷上に置いた。20μlのプロテアーゼサンプル(0.01%TritonX−100に希釈された)を添加した。アッセイを、アッセイ温度に設定されたエパンドーフサーモミキサーにエパンドーフ管を移すことにより開始した。
基質:Protazyme OL 錠剤 (Megazyme T-PROL)。
温度:調節された。
アッセイ緩衝液:100mMの琥珀酸, 100mM のHEPES, 100mM のCHES, 100mMの CABS, 1 mM のCaCl2, 150mMの KCI, HCI 又は NaOH によりpH-値 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11.0 及び 12.0に調節された 0.01% Triton X-100。
上記プロテアーゼアッセイを、pH活性プロフィール、pH−安定性プロフィール及びpH3.0での温度−活性プロフィールを得るために使用した。pH安定性プロフィールに関しては、プロテアーゼをアッセイ緩衝液により5倍に希釈し、そして37℃で2時間インキュベートした。インキュベーションの後、プロテアーゼサンプルを、残留活性についてのアッセイの前、pH3のアッセイ緩衝液による希釈によりpH3.0に移行した。
SDS−PAGEにより決定されるようなA4プロテアーゼの相対分子量は、Mr=26kDaであった。
TermanylTM (Novozymes)からのシグナルペプチドを、酸性セルラーゼをコードスル遺伝子(配列番号1)にPCRにより読取枠を整合して融合した。得られるコード配列をコードするDNAを、バシラス・サブチリス宿主細胞ゲノム上に相同組換えにより組込んだ。その遺伝子構造体を、バシラス・リケニホルミスα−アミラーゼ遺伝子(amyL)、バシラス・アミロリケファシエンスα−アミラーゼ遺伝子(amyQ)及び安定化配列を含むバシラス・スワンギエンシスcryIII Aプロモーターからのプロモーターから成る三元プロモーターシステム(WO99/43835号に記載のような)の制御下で発現した。クロラムフェニコールアセチル−トランスフェラーゼをコードする遺伝子をマーカーとして使用した(Diderichsen など., A useful cloning vector for Bacillus subtilis. Plasmid, 30, p. 312,1993に記載される)。
Claims (62)
- 受託番号DSM15716として寄託された細菌アリシクロバシラスsp. (Alicyclobacillus sp.)から得られる対応する分泌されたポリペプチドに対して少なくとも90%同一であり、そして前記ポリペプチドの同じ機能を示す単離された成熟機能的ポリペプチド。
- 細菌性グルタミン酸ペプチダーゼ(EC3.4.23.19)。
- (a)配列番号26〜50の群に包含される成熟ポリペプチドの配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成るポリペプチド;
(b)(i)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖、から成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド;
(c)配列番号26〜50に包含される成熟ポリペプチドのフラグメント、から成る群から選択され、ここで前記ポリペプチドは配列番号26〜50に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する請求項1記載のポリペプチド。 - 前記ポリペプチドが、酸性エンドグルカナーゼ、酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、HtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ、フィターゼ、ホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ、キシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された機能を有する酵素である請求項1記載のポリペプチド。
- (a)配列番号26〜40に包含される成熟酵素から選択されたアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有する酵素;
(b)(i)成熟酵素をコードする配列番号1〜15の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜15の領域の群から選択されたヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖、から成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列をコードする酵素;
(c)配列番号26〜40に包含される成熟酵素のフラグメント、から成る群から選択され、ここで前記酵素は配列番号26〜40に包含されるその対応する成熟ポリペプチドの機能を有する請求項4記載の酵素。 - 前記緊縮条件が非常に高い請求項1記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、成熟ポリペプチドをコードする配列番号1〜25の領域の群から選択されたヌクレオチド配列、又は遺伝子コードの縮重によりそれらとは異なる配列から成るる請求項1記載のポリペプチド。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができる酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号26に包含される成熟酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項8記載の酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ。
- 配列番号26の位置25〜959からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項9記載の酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ。
- プロテアーゼ構造体にジスルフィド橋を有さないことにより特徴づけられる請求項2記載のグルタミン酸ペプチダーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができる請求項2記載のグルタミン酸ペプチダーゼ。
- 配列番号27に包含される成熟アスパルチルプロテアーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項12記載のグルタミン酸ペプチダーゼ。
- 配列番号27の位置33〜272の配列を含んで成るか、又はそれから成る請求項13記載のグルタミン酸ペプチダーゼ酵素。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができる多銅オキシダーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号28又は35に包含される成熟多銅オキシダーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項15記載の多銅オキシダーゼ。
- 配列番号28の位置26〜315、又は配列番号35の位置50〜597からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項16記載の多銅オキシダーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるセリン−カルボキシルプロテアーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号29又は30に包含される成熟セリン−カルボキシルプロテアーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項18記載のセリン−カルボキシルプロテアーゼ。
- 配列番号29の位置190〜626、又は配列番号30の位置25〜533からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項19記載のセリン−カルボキシルプロテアーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるセリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号31に包含される成熟セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項21記載のセリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ。
- 配列番号31の位置42〜411からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項22記載のセリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるジスルフィドイソメラーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号32に包含される成熟ジスルフィドイソメラーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項24記載のジスルフィドイソメラーゼ。
- 配列番号32の位置42〜411からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項25記載のジスルフィドイソメラーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるγ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号33に包含される成熟γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項27記載のγ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ。
- 配列番号33の位置30〜266からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項28記載のγ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号34に包含される成熟エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項30記載のエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ。
- 配列番号34の位置27〜768からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項31記載のエンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができるペプチジル−プロリル−イソメラーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号36に包含される成熟ペプチジル−プロリル−イソメラーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項33記載のペプチジル−プロリル−イソメラーゼ。
- 配列番号36の位置30〜246からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項34記載のペプチジル−プロリル−イソメラーゼ。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができる酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼCであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号37に包含される成熟酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼCを含んで成るか、又はそれから成る請求項36記載の酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC。
- 配列番号37の位置28〜608からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項37記載の酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC。
- DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から得ることができる多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼであることにより特徴づけられる請求項4記載の酵素。
- 配列番号38又は39に包含される多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼを含んで成るか、又はそれから成る請求項39記載の多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ。
- 配列番号38の位置26〜251又は配列番号39の位置22〜324からの配列を含んで成るか、又はそれらから成る請求項40記載の多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ。
- (a)DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から分泌される、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された成熟酵素のアミノ酸配列と少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る酵素;
(b)(i)DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から分泌される、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された成熟酵素をコードする前記株に包含されるヌクレオチド配列に対する相補的鎖;
(ii)DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から分泌される、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された成熟酵素をコードする前記株に包含されるヌクレオチド配列に含まれるcDNA配列に対する相補的鎖、から成る群から選択されたポリヌクレオチドプローブと、高い緊縮条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド;
(c)DSM受託番号15716として寄託されたアリシクロバシラスsp.の株から分泌される、酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから成る群から選択された成熟酵素のフラグメント、から成る群から選択された、
酸性エンドグルカナーゼ又は酸性セルラーゼ、アスパルチルプロテアーゼ、多銅オキシダーゼ、セリン−カルボキシルプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ又はHtrA−様セリンプロテアーゼ、ジスルフィドイソメラーゼ、γ−D−グルタミル−L−ジアミノ酸エンドペプチダーゼ、エンド−β−N−アセチルグルコサミニダーゼ、ペプチジル−プロリル−イソメラーゼ、酸性ホスファターゼ又はフィターゼ又はホスホリパーゼC、多糖デアセチラーゼ又はキシランデアセチラーゼ及び亜硫酸オキシダーゼから選択された機能を有する単離された酵素。 - 受託番号DSM15716として寄託された細菌株。
- 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチドを含んで成る組成物。
- 少なくとも2個、好ましくは少なくとも3個、より好ましくは少なくとも5個、より好ましくは少なくとも10個、より好ましくは少なくとも15個、より好ましくは少なくとも20個の異なった請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチドを含んで成る請求項44記載の組成物。
- アリシクロバシラスsp. DSM15716、又は1又は複数の遺伝子が欠失されているか又は付加されているその変異体のサンプルを発酵する場合に分泌されるすべてのポリペプチドを含んで成る請求項44記載の組成物。
- 1又は複数の追加の酵素をさらに含んで成る請求項44記載の組成物。
- 前記ポリペプチドの他に、界面活性剤を含んで成る洗剤組成物であることにより特徴づけられる請求項44記載の組成物。
- 前記ポリペプチドの他に、穀物又は穀粒を含んで成る飼料組成物であることにより特徴づけられる請求項44記載の組成物。
- 食品組成物であることにより特徴づけられる請求項44記載の組成物。
- 多糖又は多糖類の混合物をさらに含んで成る請求項44記載の組成物。
- 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチド及び賦形剤を混合することを含んで成る、請求項44記載の組成物の調製方法。
- 請求項1〜42のいずれかの1項記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド。
- 請求項53記載のポリヌクレオチドを含んで成る組成物。
- 宿主細胞においてポリペプチドの生成を方向づける1又は複数の制御配列に作用可能に連結される請求項53記載のヌクレオチド配列を含んで成る核酸構造体。
- 請求項55記載の核酸構造体を含んで成る組換え発現ベクター。
- 請求項55記載の核酸構造体を含んで成る組換え宿主細胞。
- 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)その野生型で、前記ポリペプチドを生成できる株を培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。 - 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチドの生成方法であって、
(a)請求項45記載の組換え宿主細胞を、前記ポリペプチドの生成の助けになる条件下で培養し;そして
(b)前記ポリペプチドを回収することを含んで成る方法。 - (i)アリシクロバシラスsp. DSM15716のゲノムからの遺伝子と、シグナルのないレポーターをコードする遺伝子とを、トランスポゾン標識を通して融合し、(ii)アリシクロバシラスsp. DSM15716の融合された遺伝子を含んで成る宿主細胞クローンを、前記レポーターの存在を表す培地において増殖し、(iii)前記レポーターを分泌するクローンを検出し、そして(iv)そのクローンに包含されるアリシクロバシラスsp. DSM15716の遺伝子及びポリペプチドを単離することを含んで成る請求項59記載の方法。
- 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチドのアミノ酸配列、又は請求項53記載のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の情報を含んで成る電子装置への使用のために適切な記憶媒体。
- 請求項1〜42のいずれか1項記載のポリペプチド、又は請求項53記載のポリヌクレオチドを産業用又は家庭用技術的方法に使用することを含んで成る方法。
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