JP2007217410A - 抗ウイルス組成物、それを含む抗ウィルス剤及び抗ウイルス機能性食品 - Google Patents

Abstract

【課題】
ウイルス潜伏感染細胞からウイルスを排除し、根本的なウイルス感染症の治療に寄与する抗ウイルス組成物、及びこれを有効成分とする抗ウイルス剤並びに抗ウイルス機能性食品を提供すること。
【解決手段】
抗ウィルス剤は、ウイルス潜伏感染細胞から、フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス増殖阻害作用を有したり、また、フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス潜伏感染細胞からのウィルス誘導作用を有する。また、該抗ウイルス組成物を含有して、ウイルス治療用薬剤や抗ウイルス機能性食品を得る。特に、フコイダンは渇藻類由来の硫酸化多糖であり、プロアントシアニジンはピーナツ種皮抽出物に含まれるものであることが好ましい。
【選択図】 なし

Description

本発明は、ウイルス感染潜伏細胞からウィルスを誘導する作用を有したり、ウィルス増殖を阻害する作用を有する、抗ウイルス組成物、それを含む抗ウィルス剤及び抗ウイルス機能性食品に関する。

ウイルス感染症における最も大きな問題の一つは、ウイルスが生体の免役機構では排除できず、体内に長く潜伏感染することである。そのため、生体に長期間にわたって影響を与え、免疫系の細胞や中枢神経系の細胞に潜伏感染し、免疫状態の低下などにより再活性化し、治療困難な難治性の疾患を引き起こす。

例えばサイトメガロウイルスや、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６）などのβ―ヘルペスウイルスは樹状細胞や中枢神経系に潜伏しており、神経疾患や自己免疫疾患との関連性が指摘されている（非特許文献１、２）。

ＨＩＶ−１の治療においてはＨＩＶ−１感染細胞からのＨＩＶ−１産生を抑えるプロテアーゼ阻害剤が開発され、逆転転写酵素阻害剤２種とプロテアーゼ阻害剤（あるいは非ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤）１種との組み合わせによる多剤（３剤）併用療法（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ， ＨＡＡＲＴ）が奏効している。

しかし、投薬スケジュールを厳密に遵守することが、副作用、服薬条件などの問題で必ずしも容易でないことや、耐性の問題などから死亡数の減少が頭打ちになりつつある。ＨＡＡＲＴは決して根治療法ではなく、血中のウイルス量が検出限界以下となっても、服薬を中止すると直ちにリンパ節、中枢神経などに残存していたウイルスが再び増殖するリバウンドが起こる。そのため、ウイルスを体内から駆逐するためにはとてつもない長い年月を要することなど、従来の薬物療法には依然改善すべき問題が残されている（非特許文献３）。

生体は、感染初期に迅速に免疫応答を行うためのシステムを自然免疫として有している。この自然免疫における病原体の進入を感知するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、各々病原体特有の構成成分を特異的に認識する。ＴＬＲは、認識後、サイトカイン産生、あるいは種々の共刺激分子の発現増強を誘導し、Ｔリンパ球の活性化を惹起し、獲得免疫応答を誘導し、細菌やウイルス病原体を排除する。単球・マクロファージの細胞膜のＴＬＲ４―ＣＤ１４はグラム陰性菌の主要構成成分であるリポ多糖（ＬＰＳ）を認識し、転写因子ＮＦ−ｋＢを活性化し、炎症、自然免疫などに関与する遺伝子群を誘導する。ＴＬＲ２はグラム陽性菌の主要構成成分であるペプチドグリカンを認識する。このように、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４―ＣＤ１４は、病原体を特異的に認識し炎症を惹起し、自然免疫応答に重要な役割を担っている一方、獲得免疫応答を誘導するアジュバント受容体としても役割を担っている（非特許文献７）。

最近、単球やマクロファージ細胞のＴＬＲ２およびＴＬＲ４はリウマチ関節炎（ＲＡ）の病態（非特許文献８）のほか、全身性エリテマトーデス、心血管障害など慢性的で深刻な炎症を特徴とする疾患との関連性が強く指摘されている（非特許文献９）。この他、脂肪細胞においてもＴＬＲと病態との関連性が指摘されている。ＴＬＲ２あるいはＴＬＲ４−ＣＤ１４を介した慢性炎症は耐糖機能に影響を与え、その結果肥満や２型糖尿病のようなメタボリックシンドロームに関連することが明らかとなった（非特許文献１０）。さらに、ＴＬＲあるいはＣＤ１４を介する刺激は、炎症性サイトカインを産生させ、歯槽骨破壊を引き起こすことが知られている。しかし、ＴＬＲ２あるいはＴＬＲ４−ＣＤ１４を介したこれら疾患の炎症を惹起する病原体は、未だ特定されていない。

呼吸器感染にみられるように、炎症の場では細菌感染に先立ってウイルス感染が多く見られる。そのウイルス感染症における最も大きな問題の一つは、ウイルスが生体の免役機構では排除できず、体内に長く潜伏感染することである。そのため、生体に長期間にわたって影響を与え、免疫系の細胞や中枢神経系の細胞に潜伏感染し、免疫状態の低下などにより再活性化し、治療困難な難治性の疾患を引き起こす。例えばサイトメガロウイルスや、ヒトヘルペスウイルス（ＨＨＶ６）などのβ―ヘルペスウイルスは樹上細胞や中枢神経系に潜伏しており、神経疾患や自己免疫疾患との関連性が指摘されている（非特許文献２）。ＨＩＶ−１の治療においてはＨＩＶ−１感染細胞からのＨＩＶ−１産生を抑えるプロテアーゼ阻害剤が開発され、逆転転写酵素阻害剤２種とプロテアーゼ阻害剤（あるいは非ヌクレオチド系逆転写酵素阻害剤）１種との組み合わせによる多剤（３剤）併用療法（ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｔｈｅｒａｐｙ， ＨＡＡＴ）が奏効している。しかし、血中のウイルス量が検出限界以下となっても、服薬を中止すると直ちにリンパ節、中枢神経などに残存していたウイルスが再び増殖するリバウンドが起こる。そのため、ウイルスを体内から駆逐するためにはとてつもない長い年月を要する（非特許文献３）。

最近、ＴＬＲを介した坑ウイルス治療法の開発が進行している。イミダキノリン誘導体はＴＬＲ７を介して様々な炎症性サイトカインを誘導し、坑ウイルス効果を惹起する。そのため、イミダキノリン誘導体の一つイミキミドは、ヒトパピローマウイルス感染によるせん型コンジロームの治療に広く臨床応用されている。ＴＬＲはリガンドを認識すると、アダプター分子ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６依存的にＮＦ−ｋＢを活性化し、炎症性サイトカインを誘導する一方、ＩＲＦを活性化し、坑ウイルス作用を有するＩ型インターフェロンを（ＩＦＮ―α／β）誘導する（非特許文献１１）。

従って、ウイルス感染による種々の病態を改善するためには、ＴＬＲ介してＮＦ−ｋＢを活性化し、炎症性サイトカインによりウイルスを駆逐するとともに、ＩＦＮを誘導することが重要である。

近年、海藻や植物由来の様々なフィトケミカルの機能が注目され、機能性素材として期待されている。それらの中には抗ウイルス作用を有するものが報告されている。渇藻類に含まれるフコイダンは硫酸化多糖の総称であり、モズク、メカブ、ワカメなど様々な渇藻類から分離され、アポトーシスによる抗癌作用や免役賦活化作用等の種々の生理活性を有することが報告されている（非特許文献４）。

フコイダンは抗ウイルス作用として、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、エイズウイルス、ＨＴＬＶ−Ｉの増殖を阻害することが公知である（特許文献１、非特許文献５、６）。

プロアントシアニジンを含むブドウ抽出物は、ヘルペスウイルス、インフルエンザ、ＨＩＶ−１、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス（以下ＳＡＲＳ−ＣｏＶと表現する）の増殖を阻害することが公知である（特許文献２、３）。ピーナツ種皮抽出物は、ＨＩＶ−１増殖阻害を有することが公知である（特許文献４）。

しかし、これまでフコイダンやピーナツ種皮抽出物にはウイルスの根治療法となるウイルス潜伏感染細胞からウイルスを誘導する作用やウイルス潜伏感染細胞をアポトーシスにより死滅させる作用は報告されていない。さらに、これまでフコイダンにヒトＴＬＲを介してＮＦ−ｋＢを活性化し、ウイルスの根治療法となる潜伏感染細胞からウイルスを誘導する作用や、ＴＬＲを介するアジュバント作用やＩＦＮ誘導作用は報告されていない。
特開平８−２５３４１９号公報 特許第３４４８０５２号公報 特開２００５−３１４３１６号公報 特許第３０１０２５８号公報 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１９９４；９１：１１８７９−１１１８３ Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６：４１４５−４１５１ Ｃｕｒｒ Ｐｈａｒｍ Ｄｅｓ．２００４；１０：４１０３−４１２０ Ａｎｔｉｂｉｏｔ Ｋｈｉｍｉｏｔｅｒ．２００４；４９：２４−３０ Ｎｕｔｒ Ｃａｎｃｅｒ ２００５；５２：１８９−２０１ Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａ Ｂｕｌｌ（Ｔｏｋｙｏ）２００４；５２：１０９１−１０９４ Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｇｙ．２００１；２：６７９−６８０ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．２００４；５０（１２）：３８５６−６５ Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｉｎｖｅｓｔｉｇ Ｄｒｕｇｓ．２００６；１５：８５７−８７１ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．２００６；３４６（３）：７３９−７４５ Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４；５：１０６１−１０６８

本発明の目的は、食経験のある安全な食材の中からスクリーニングし、ウイルス潜伏感染細胞からウイルスを誘導する作用及び／又は潜伏感染細胞のウィルス増殖作用を阻害したり、アポトーシスにより死滅する作用を有する、安全で効果的な抗ウイルス組成物、及びこれを有効成分とする抗ウイルス剤並びに抗ウイルス機能性食品を提供することにある。

更に、本発明は、上記問題点の解決を意図するものであり、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４のいずれにもリガンドとして結合し、ＮＦ−ｋＢを活性化し、潜伏感染細胞よりウイルスの誘導作用を有するウイルスの誘導組成物を提供することを目的とする。更にまた、本発明は、ＩＦＮ―βおよびＩＦＮ―γ誘導作用を有し、経口的に利用できる安全で有効な粘膜アジュバント組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、食材の中から抗ウイルス作用を広くスクリーニングする過程で、フコイダンにおいてこれまで報告されているＨＩＶ−１の増殖阻害作用に加えて、潜伏感染細胞からＨＩＶ−１を誘導する作用を併せ持つ事を新たに見出した。

さらに、フコイダンにはこれまで報告されていないＳＡＲＳ−ＣｏＶ潜伏感染細胞をアポトーシスにより死滅させる作用を持つ事を見出した。

ピーナツ種皮抽出物は報告されているＨＩＶ−１増殖阻害作用に加えて、潜伏感染細胞からＨＩＶ−１を誘導する作用とＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖阻害作用を新たに見出し、本発明を完成するに至った。

また、本発明者らは鋭意研究した結果、フコイダンがＨＩＶ潜伏感染ヒト細胞株を用いた実験系において、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４のいずれにもリガンドとして作用し、ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６依存的にＮＦ−ｋＢの活性化を介してＨＩＶ誘導効果を促すこと、さらに、フコイダンはＩＦＮ―β産生に必須のＩＲＦ−３の活性化を誘導することを見出した。これらの事実はフコイダンが免疫誘導作用を有し、アジュバントとしての条件を満たしているものであり、さらに、フコイダンは抗原刺激後にヒトＴ細胞において、ＩＦＮ―γを誘導することを見出し、本発明を完成した。

本発明は、フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス増殖阻害作用を有することを特徴とする抗ウィルス組成物である。
また、フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス潜伏感染細胞からのウィルス誘導作用を有することを特徴とする抗ウィルス組成物である。
前記本発明において、好適には、フコイダンを有効成分として含有して、ヒトＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下「ＴＬＲ」と略す）及び／またはＣＤ１４を介して細胞内シグナルを活性化させることにより、ウィルス潜伏感染細胞からのウイルス誘導作用を有することを特徴とする抗ウィルス組成物である。
そして、ＴＬＲがＴＬＲ２またはＴＬＲ４であることが望ましい。
さらに、前記本発明において、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介してアダプター分子ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６依存的に転写因子ＮＦ−κＢを活性化させることにより、ウィルス潜伏感染細胞からのウイルス誘導作用を有することを特徴とする抗ウィルス組成物である。
さらに、他の本発明は、フコイダンを有効成分として含有し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ―β）産生に必須の転写因子ＩＲＦ−３の活性化誘導作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物である。
また、他の本発明は、フコイダンを有効成分として含有し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介して、粘膜アジュバントとすることを特徴とする、抗ウィルス組成物である。
また、他の本発明は、フコイダンを有効成分として含有し、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ―γ）の誘導作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物である。
好適には、上記フコイダンが、渇藻類由来の硫酸化多糖であり、プロアントシアニジンを含む植物抽出物が、ピーナツ種皮抽出物であることが望ましい。
さらに、好適には、前記ウィルスが、エイズウィルス（以下、「ＨＩＶ−１」と略す）または重症急性呼吸器症候群（以下、「ＳＡＲＳ」と略す）ウィルスであることで、より効果的であり、望ましい。
そして、上記本発明の各抗ウイルス組成物を含むことで、抗ウイルス剤または抗ウィルス機能性食品を得ることができる。

本発明の抗ウイルス組成物及びそれを含む抗ウイルス剤並びに抗ウイルス機能性食品を用いることにより、ウイルス潜伏感染からウイルスを誘導することや、潜伏感染細胞の増殖を阻害したり、アポトーシスにより根絶することが可能となり、根本的なウイルスの治療となる。そのことにより、ウイルス治療に掛かる医療費を抑制する上でも、また治療を受ける患者においてもＱＯＬ改善に著しく有益となる。
また、免疫誘導作用を有するので、免疫力を向上させることができる。

以下、本発明を詳細に説明する。本発明は、ウイルス増殖阻害作用と潜伏感染細胞からウイルスを誘導する作用及び／又は感染細胞をアポトーシスにより死滅させる作用を有するフコイダンやピーナツ種皮抽出物等を有効成分として共に含む組成物である。本発明に用いるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４のいずれにも作用するリガンドとしては、少なくともフコイダンを有効成分として含むものである。
本発明の組成物は、抗ウイルス機能性食品や抗ウイルス治療剤の他、ウイルス感染防止のための膣剤やゼリーとしても利用できる。ウイルスの最初の進入経路である気道及び鼻くう等の粘膜表面で利用できる安全かつ有効な粘膜アジュバントとしても利用できる。

さらに、本発明の組成物を用いることにより、当該組成物と抗ウイルス剤やワクチンとの併用による安全で効果的な新しいウイルス予防・治療法を提供することが可能となる。好ましくは、該アジュバント組成物は少なくとも前記のウイルスに対する免疫応答を誘導し得るウイルス抗原とフコイダンを含有する。

当該作用を有するフコイダンであればモズク、メカブ、コンブなど渇藻類由来のいずれでも良く、特に限定されるものではなく、特許文献５に記載の方法が使用できる。さらに、プロアントシアニジンを含む植物抽出物は、松樹皮抽出物、クランベリー抽出物、リンゴ抽出物、ブドウ種子抽出物、ピーナツ種皮抽出物のいずれでも良いが、特にピーナツ種皮抽出物が好ましい。ピーナツ種皮抽出物は特許文献６に開示された方法により調製することができる。あるいは、プロアントシアニジン３８％以上を含む標品として常盤植物化学研究所（千葉市）より入手することができる。
特開２００１−１８１３０３号公報 特開２００４−２６９４８７号公報

本発明で用いるフコイダンは以下の一般的方法により製造することができる。例えば、ワカメ芽株を乾燥後、粉末化し、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコールを使用して脱脂する。溶解液としては、水、緩衝液等目的に応じて行うことができる。通常粘性等を考慮し、最適溶解濃度を用いることが望ましい。抽出おいては、酢酸、クエン酸、シュウ酸など有機酸を用いて０．１〜０．２Ｎあるいはさらに、高濃度で抽出しても構わない。抽出液のｐＨは通常５以下、好ましくはｐＨ１〜４の範囲で前記の有機酸を用いて抽出する。加水分解は当該ｐＨ溶液を通常６０〜１００℃で加温し、目的のフコイダン液を抽出する。均一な分子量を必要とする場合、ゲルろ過や分子量分画膜を用いると良い。得られた組成物は脱塩後、凍結乾燥することによりフコイダン標品を得ることができる。

本発明の対象とするウイルスとしてはエイズウイルス（ＨＩＶ−１）、成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ＨＴＬＶ−Ｉ／ＩＩ）を含む各種レトロウイルス群、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）コロナウイルス、Ｂ型，Ｃ型肝炎ウイルス、パポーバウイルス、エプシュタインバーウイルス(ＥＢＶ)、サイトメガロウイルス、ヘルペスウイルス、バリセラゾースターウイルス（ＶＺＶ）を含むヘルペス群、ヒトパピローマウイルス、ボルナウイルス、インフルエンザウイルス、鳥インフルエンザウイルス、ライノウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、アデノウイルス、パラインフルエンザ、ロタウイルス、ＲＳウイルス、ノロウイルスなどのいずれかのウイルスを対象とする。

本発明に係る組成物の好ましい投与形態は機能性食品である。組成物のフコイダン量は通常０．００１〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％が好ましい。組成物のプロアントシアニジンを含むピーナツ種皮抽出物は通常０．００１〜１００重量％、好ましくは１〜９０重量％が好ましい。経口的に適用される投与形態としては、特に制限はなく、必要に応じて適宜選択されるが、一般には錠剤、カプセル、顆粒、細粒、散剤、ドリンク、トローチ、チューインガム、キャンディ等の形態として経口的に利用される。これらの形態においては、それぞれの形態を製造するに適したデンプン、乳糖、マンニット、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類などの賦形剤の他に、結合剤、崩壊剤、界面活性剤、潤沢剤、甘味料、着色料、香料等を使用できる。

本発明の組成物をウイルス感染防止のための膣投与に使用する場合、当該技術分野において適当であると知られている担体を含有する膣坐剤、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト、泡またはスプレー剤として使用することもできる。

以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明の範囲は以下に記載される具体例に制限されるものではない。
フコイダンおよびピーナツ種皮抽出物を披検物として、ＳＡＲＳ−ＣｏＶ増殖阻害作用を以下の方法により評価した。ＳＡＲＳ−ＣｏＶは、ＦＦＭ−１株（Ｄｒ．ＨＷ Ｄｏｅｒｒ，Ｆｒａｎｋｆｒｕｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｇｅｒｍａｎｙより分与）を用いた。培養細胞はＶｅｒｏ細胞（（株）大日本製薬より購入）を用い、５％ＣＯ_２存在下において３７℃で培養した。９０％コンフルエントに増殖した培養細胞に、細胞１個当たりのウイルス量を０．１（ＭＯＩ０．１，Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）となる条件でＴｕｃｋｅｒＰ．Ｃ．らの方法（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６１０６，１９９７）に従い感染と同時に披検物質を培養液１ｍｌ当たり各々１００，３０，３μｇ／ｍｌ加え、各２４，４８時間後に培養液を回収し、ウイルス量を測定した。

ウイルス力価は、以下のプラーク形成法により測定した。回収した培養上精を１％ウシ血清アルブミンを加えたＰＢＳ（−）（Ｍｇ^２＋，Ｃａ^２＋を含まない０．０５Ｍリン酸緩衝液、０．１５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）で１０倍段階希釈し、各０．２ｍｌずつをそれぞれの６穴プレートに摂取した。２５℃で６０分間感染させた後、０．１％メチロセルロースを加えたＤＭＥＭ(５％シ胎児血清含有)で４日間培養した。培養後、メチルセルロースを取り除き、細胞を２．５％クリスタルバイオレット（３０％エチルアルコール、１％シュウ酸アンモニュウム中）で染色し、ＰＢＳ（−）で３回洗浄、脱色後プラーク数の平均値（３個のウエル）から１ｍｌ中のウイルス量をＰＦＵ（Ｐｌａｑｕｅ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ）／ｍｌとして算出した。

また、上記の方法により披検物質のＳＡＲＳ−ＣｏＶの増殖を５０％阻害する濃度（ＩＣ５０：Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，μｇ／ｍｌ）を算出した。

その結果、フコイダンおよびピーナツ種皮抽出物のＳＡＲＳ−ＣｏＶに対するＩＣ５０は＞１００μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌであった(表１)。その過程で顕微鏡下においてプラークを観察した結果、ピーナツ種皮抽出物には見られなかったが、フコイダンにおいては対照（コントロール）と比較して、プラーク内の感染細胞がアポトーシスにより死滅する割合が著しく多いことが明らかとなった（図１）。この事は、フコイダンはＳＡＲＳ−ＣｏＶにおいて、潜伏感染している細胞をアポトーシスにより死滅させる作用があることを示唆した。これらの試験結果は、表１及び図１に示すとおりであった。

フコイダンおよびピーナツ種皮抽出物を披検物質として、ＨＩＶ−１増殖阻害作用を以下の方法により評価した。ＭＴ−４細胞にＨＩＶ−１を０．００１ＴＣＩＤ５０/個の割合で１時間感染させ、ＲＰＭＩ−１６４０培養液（１０％ウシ胎児血清、ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ含有）を用いて１回洗浄した。このＨＩＶ−１感染ＭＴ−４細胞を、ＲＰＭＩ−１６４０培養液で１ｘ１０^５個／ｍｌの濃度で浮遊させ、９６穴平底培養プレートに１穴あたり２００ｕｌの量で加え、さらに披検物質を段階希釈したものを加え３７℃で５％ＣＯ_２存在下で５日間培養した。５日培養後、ＨＩＶ−１感染によるバルーニングや巨核細胞出現などの細胞変性効果（ＣＰＥ）を各穴において顕微鏡下で観察した。ＣＰＥが認められた場合をＨＩＶ−１増殖阻害作用なし、ＣＰＥが認められなかった場合をＨＩＶ−１増殖阻害作用ありとして判定した。また、上記と同様にしてＭＴ−４細胞に対して細胞毒性を５０％細胞障害濃度として判定した。

フコイダン及びピーナツ種皮抽出物のＨＩＶ−１に対する最小増殖阻害濃度は、それぞれ１．０μｇ／ｍｌ及び１５．３μｇ／ｍｌであった。フコイダンおよびピーナツ種皮抽出物はＭＴ−４細胞に対して、５０％最小細胞障害濃度は＞４１３μｇ／ｍｌ及び２０３μｇ／ｍｌであった。試験結果は、以下の表２に示すとおりであった。

フコイダンおよびピーナツ種皮抽出物を披検物質として、ＨＩＶ−１潜伏感染細胞株に対するＨＩＶ−１誘導活性を以下の方法により評価した。ＨＩＶ−１潜伏感染細胞株として、Ｊ２２ＨＬ６０（単球系由来），ＯＭ１０．１（単球系由来），ＡＣＨ−２（Ｔ細胞由来），Ｕ１（単球系由来）を用いた。これらの潜伏感染細胞株をＲＰＭＩ−１６４０培養液で１ｘ１０^５個／ｍｌの濃度で浮遊させ、９６穴平底培養プレートに１穴あたり２００ｕｌの量で加え、さらに段階希釈した披検物質を加えて５％ＣＯ_２存在下で３７℃で５日間培養した。５日培養後、培養上精のＨＩＶ量をｐ２４量として、ＥＬＩＳＡにより測定した。その結果を図２に示した。

フコイダンは４種類のＨＩＶ−１潜伏感染細胞株において、細胞株による差はあるもののいずれの潜伏感染細胞株においてもＨＩＶ−１誘導作用が見出された。また、フコイダンとピーナツ種皮抽出物とは、潜伏感染細胞株によりＨＩＶ−１誘導作用の程度が異なっていた。ＡＣＨ−２においては、ピーナツ種皮抽出物はフコイダンよりＨＩＶ−１誘導作用が高かった（図３）。

ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）を対照として、フコイダン（０、０．１、０．５、１ｍｇ／ｍｌ）を披検物質として、ＨＩＶ−１潜伏感染細胞株に対するＨＩＶ−１誘導活性を次の方法により評価した。ＨＩＶ−１潜伏感染細胞株としてＡＣＨ２（Ｔ細胞由来）、Ｕ１（単核細胞由来）を用いた。これらの潜伏感染細胞株を１０％牛胎児血清を含むＲＰＭＩ−１６４０培養液で２ｘ１０^５個／ｍｌの濃度で浮遊させ、９６穴平底培養プレートに１穴あたり２００ｕｌの量で加え、さらに段階希釈した披検物質を加えて５％ＣＯ_２存在下で３７℃で５日間培養した。３日培養後、培養上精のＨＩＶ−１をＰ２４量として、蛍光法により測定した。その結果を図４に示した。
ＴＮＦαはＡＣＨ２及びＵ１のいずれもＨＩＶ−１誘導効果が見られた。５０ｎｇ／ｍｌ濃度のＬＰＳはＡＣＨ２に誘導効果が見られたが、Ｕ１では見られなかった。フコイダンは、ＡＣＨ２及びＵ１いずれにおいても濃度依存的にＨＩＶ−１誘導活性が見出された。しかし、フコイダンのＨＩＶ−１誘導効果はＡＣＨ２においてＵ１より高かった。
従って、フコイダンは潜伏感染細胞株におけるＨＩＶ−１誘導効果を有する。

実験に用いた一連のスモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）発現ベクターはｐＳｕｐｅｒＲｅｔｒｏ ｖｅｃｔｏｒ（Ｏｌｉｇｏｅｎｇｉｎｅ）とｐＣＳ−ｐｕｒｏ−ＰＲＥベクターを用いて構築した。ヒトＴＬＲ２；GCAGCTCAGGATCTTTAAA、ヒトＴＬＲ４；GGTGGCTGTGGAGACAAAT、ヒトＣＤ１４；GCTCGAGGACCTAAAGATAをそれぞれ標的配列とした。Ｐｅｎｉｌｌａ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（ＲＬ）のコードン配列を標的とするｓｉＲＮＡをコントロールとして、センス及びアンチセンスｓｈＲＮＡはＱＩＡＧＥＮ ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｔｏｏｌを用いて設計した。ＡＣＨ２細胞あるいはＵ１細胞にＴＬＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＴＬＲ４ ｓｉＲＮＡ、ＣＤ１４ ｓｉＲＮＡあるいはコントロールｓｉＲＮＡを発現するベクターをそれぞれ導入した。それらの細胞をＬＰＳ（５ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１ｎｇ／ｍｌ）、フコイダン（５０ｕｇ／ｍｌ）、を用いて３６時間刺激した後、培養上精中のＨＩＶｐ２４を測定した。それぞれのｓｉＲＮＡにおけるフコイダンおよびＬＰＳによるＨＩＶ−１ｐ２４の誘導活性は、ＴＮＦαによるＨＩＶ−１ｐ２４誘導活性を１００として相対的に示した。その結果、ＡＣＨ２およびＵ１いずれにおいても、フコイダンあるいはＬＰＳによるＨＩＶ−１ｐ２４誘導効果はＴＬＲ２ ｓｉＲＮＡ、ＴＬＲ４ ｓｉＲＮＡあるいはＣＤ１４ ｓｉＲＮＡのいずれにおいても、コントロールｓｉＲＮＡと比較して減少した（図５）。従って、フコイダンはＬＰＳと同様に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４を介して潜伏感染細胞からＨＩＶ−１を誘導することが明らかとなった。
フコイダンは、潜伏感染細胞株でのＨＩＶ−１誘導におけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４のリガンドである。

ＴＲＡＦ６およびＭｙＤ８８の遺伝子サイレンスの効率を確認するために、ＲＬ、ＭｙＤ８８あるいはＴＲＡＦ６発現ベクターを含む１ｕｇのプラスミド、１００ｎｇのＩｋＢレポーターｌｇｋ−ｌｕｃ、標準化のための１００ｎｇＢ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅプラスミドＥＦ１−ｌａｃＺを２９３Ｔ細胞（３０ｘ１０^４細胞／ウェル）にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクした。３６時間後に細胞を回収し、Ｄｕａｌ Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ （ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性を測定した。ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡおよびＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡは実施例５記載の方法と同様に、ヒトＴＲＩＦ６；AGGAGAAACCTGTTGTGAT、ヒトＭｙＤ８８；GGCAATGAAGAAAGAGTTC を標的配列として構築した。ＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡあるいはＴＲＩＦ６ ｓｉＲＮＡは２９３Ｔ細胞において、Ｌｕｃ発現をそれぞれ阻害し、それぞれのｓｉＲＮＡ阻害効果が確認された。
次に、ＡＣＨ２にＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡ、ＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡあるいはコントロールｓｉＲＮＡを発現するベクターをそれぞれ導入した。それらの細胞をＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）、フコイダン（５００ｕｇ／ｍｌ）で３６時間刺激した後、培養上精中のＨＩＶｐ２４を測定した。その結果、ＭｙＤ８８ ｓｉＲＮＡあるいはＴＲＡＦ６ ｓｉＲＮＡはＴＮＦαによるＨＩＶｐ２４量は抑制しなかったが、ＬＰＳおよびフコイダンによるＨＩＶｐ２４量を顕著に抑制した（図６）。従って、フコイダンを介するＨＩＶ−１誘導効果は、アダプター分子ＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６に依存することが明らかとなった。
フコイダンによるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４を介するＨＩＶ−１誘導効果は、アダプター分子ＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６に依存する。

ＡＣＨ細胞をＩｋＢ スーパーリプレッサーであるＩｋＢαＳＲ蛋白とコントロールとしてベクター単独を発現ベクターに組み込み、感染させた。フコイダン（０．５ｍｇ／ｍｌ）あるいはＴＮＦα（０．１ｎｇ／ｍｌ）で３日間刺激し、それぞれの細胞培養上精中のＨＩＶ−１ｐ２４を測定した。その結果を図４に示した。フコイダンあるいはＴＮＦαによるＨＩＶの誘導効果はＩｋＢαＳＲによって著しく抑制された（図７−Ａ）。
次に、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）あるいはフコイダン（５００ｕｇ／ｍｌ）を用いて経時的（０，５，１５，３０，６０分）にＡＣＨ２を処理した。それぞれの時間毎に細胞を回収し、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む溶解緩衝液で細胞を可溶化し、１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動を行った。次に、ＰＶＤＦ膜（ＰＡＬＬ Ｃｏ．，Ｔｏｋｙｏ）に転写後、リン酸化ＩｋＢαとその分解を、ＩｋＢαあるいはＧＡＰＤＨ（コントロール）に対する特異抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｉｎｃ，（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ））を用いてイミュノブロット法によりに検討した。その結果、フコイダンはＬＰＳと同様にＩｋＢαのリン酸化とＩｋＢαの分解が経時的に促進された（図７−Ｂ）。これらの結果は、フコイダンは、ＮＦ−ｋＢの活性化を介してＨＩＶ−１誘導効果を示すことが明らかとなった。
フコイダンは、ＮＦ−ｋＢの活性化を介してＨＩＶ−１誘導効果を示す。

Ｕ３７３／ＣＤ１４細胞をＬＰＳ（１ｕｇ／ｍｌ）で１時間、あるいはフコイダン（５００ｕｇ／ｍｌ）で1時間と2時間処理した後、細胞を回収し、ＩＲＦ−３のリン酸化をｐ３８６あるいはｐ３９６抗体を用いて、実施例４に記載の方法と同様にイミュノブロットによって検討した。その結果、コントロール（ｍｏｃＫ）と比較してＬＰＳおよびフコイダン処理１時間、２時間ともｐ３８６あるいはｐ３９６抗体でＩＲＦ−３のリン酸化が確認された。この結果、フコイダンはＩＮＦ−β産生に必須の転写因子ＩＲＦ−３のリン酸化を誘導することが明らかとなった（図８）。
フコイダンは、ＩＮＦ−β誘導に必須の転写因子ＩＲＦ−３の活性化を誘導する。

ヒト末梢血からファイコールによりリンパ球を分離し、ＣＤ４＋ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＳＡ， Ｏｓｌｏ， Ｎｏｒｕｗａｙ）を用いて、ＣＤ４＋Ｔ細胞を高純度に精製した。このＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＬＰＳ（１ｕｇ／ｍｌ）、 ｚｙｍｏｓａｎ（５０ｕｇ／ｍｌ）あるいはフコイダン（５００ｕｇ／ｍｌ）を用いて、坑ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）の存在下において２４時間処理を行った。全ＲＮＡは４８時間処理後に回収し、ＧＡＰＤＨをコントロールとしてＩＮＦ−γ ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲにより検出した。その結果、フコイダンはＬＰＳと同様に、坑ＣＤ３抗体刺激においてＩＮＦ−γ ｍＲＮＡの発現が検出された（図９）。
フコイダンは抗原刺激後のヒト細胞においてＩＮＦ−γを誘導する。

（散剤及び顆粒剤タイプの機能性食品）
フコイダン０．２ｇ、ピーナツ種皮抽出物０．２ｇ、トウモロコシデンプン０．８ｇ、乳糖０．８ｇを一包分として常法に従い調製し、散剤及び顆粒剤を製造した。

（硬質カプセルタイプの機能性食品）
フコイダン０．１ｇ、ピーナツ種皮抽出物０．１ｇ、トウモロコシデンプン０．１ｇ、乳糖０．１ｇを一錠分としてゼラチンカプセルに充填することによって、カプセル剤を製造した。

本発明の組成物を利用することによって、抗ウイルス作用を持つ機能性食品を製造する事が可能となり、これはいわゆる「健康食品産業」に応用可能である。また本発明の組成物を有効成分とする抗ウイルス薬剤については、それ自体でも効果を持ち、かつ従来用いられてきたワクチンなどと併用する事によってその効果を高めることが期待できる。前記薬剤は製薬などの産業上大いに利用可能である。

実施例１に示したフコイダン添加の有無のＳＡＲＳ−ＣｏＶ感染Ｖｅｒｏ細胞のプラークを示す。 実施例２に示した種々のＨＩＶ−１潜伏感染細胞株に対するフコイダンのＨＩＶ−１誘導作用を示す。 実施例３に示したフコイダンとピーナツ種皮抽出物のＨＩＶ−１潜伏感染細胞株でのＨＩＶ−１誘導作用の違いを示す。図中Ｆ：はフコイダンを、Ｐ：はピーナツ種皮抽出物をそれぞれ表す。 フコイダンが、潜伏感染細胞株におけるＨＩＶ−１誘導効果を示す。図中ＡはＡＣＨ２を、ＢはＵ１をそれぞれ示す。 フコイダンが、潜伏感染細胞株でのＨＩＶ−１誘導におけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４のリガンドであることを示す。図中の左グラフはＡＣＨ２を、右グラフはＵ１をそれぞれ示す。 フコイダンによるＡＣＨ２におけるＴＬＲ２、ＴＬＲ４及びＣＤ１４を介するＨＩＶ−１誘導効果は、ＭｙＤ８８およびＴＲＡＦ６アダプターに依存することを示す。 フコイダンがＮＦ−ｋＢの活性化を介してＨＩＶ−１誘導効果を示す。図中ＡはＩｋＢ スーパーリプレッサーであるＩｋＢαＳＲを発現ベクターを用いて感染させた後のＨＩＶ−１ｐ２４を、ＢはＩｋＢαのリン酸化と分解をそれぞれ示す。 フコイダンがＩＮＦ−β誘導に必須のＩＲＦ−３の活性化を誘導することを示す。図中ｍｏｃｋはコントロールを、Ｆｕｃｏ．はフコイダンを示す。 フコイダンがヒト細胞においてＩＮＦ−γを誘導することを示す。図中Ｍｏｃｋは対照、Ｚｙｍ．はｚｙｍｏｓａｎ、Ｆｕ．はフコイダンを示す。

Claims (12)

1. フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス増殖阻害作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物。
2. フコイダン又はプロアントシアニジンを有効成分として含有して、ウィルス潜伏感染細胞からのウィルス誘導作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物。
3. フコイダンを有効成分として含有して、ヒトＴｏｌｌ−ｌｉｋｅ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ（以下「ＴＬＲ」と略す）及び／またはＣＤ１４を介して細胞内シグナルを活性化させることにより、ウィルス潜伏感染細胞からのウイルス誘導作用を有することを特徴とする、請求項２記載の抗ウィルス組成物。
4. ＴＬＲがＴＬＲ２またはＴＬＲ４であることを特徴とする、請求項３記載の抗ウィルス組成物。
5. ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介してアダプター分子ＭｙＤ８８、ＴＲＡＦ６依存的に転写因子ＮＦ−κＢを活性化させることにより、ウィルス潜伏感染細胞からのウイルス誘導作用を有することを特徴とする、請求項３又は４記載の抗ウィルス組成物。
6. フコイダンを有効成分として含有し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介してＩ型インターフェロン（ＩＦＮ―β）産生に必須の転写因子ＩＲＦ−３の活性化誘導作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物。
7. フコイダンを有効成分として含有し、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４及び／またはＣＤ１４を介して、粘膜アジュバントとすることを特徴とする、抗ウィルス組成物。
8. フコイダンを有効成分として含有し、ＩＩ型インターフェロン（ＩＦＮ―γ）の誘導作用を有することを特徴とする、抗ウィルス組成物。
9. フコイダンが、渇藻類由来の硫酸化多糖であることを特徴とする、請求項１〜８いずれかの項記載の抗ウイルス組成物。
10. プロアントシアニジンを含む植物抽出物が、ピーナツ種皮抽出物であることを特徴とする、請求項１〜８いずれかの項記載の抗ウイルス組成物。
11. ウィルスが、エイズウィルス（以下、「ＨＩＶ−１」と略す）または重症急性呼吸器症候群（以下、「ＳＡＲＳ」と略す）ウィルスであることを特徴とする、請求項１〜１０いずれかの項記載の抗ウィルス組成物。
12. 請求項１から請求項１１のいずれかの項に記載の抗ウイルス組成物を含む、抗ウイルス剤または抗ウィルス機能性食品。

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