TWI546076B

TWI546076B - 裙帶菜乙醇萃取物用於治療或預防ａ型流感病毒感染之用途

Info

Publication number: TWI546076B
Application number: TW103130802A
Authority: TW
Inventors: 吳彰哲; 邱雅凰; 王昱權
Original assignee: 國立臺灣海洋大學
Priority date: 2014-09-05
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2016-08-21
Also published as: TW201609121A

Description

裙帶菜乙醇萃取物用於治療或預防A型流感病毒感染之用途

本發明係關於一種裙帶菜乙醇萃取物用於治療或預防A型流感病毒感染之用途。

A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)，是黏液病毒科的一員，是一種封套的、負股的RNA病毒，其含有八段基因組。A型流行性感冒在過去曾在人類間造成數次大流行，分別為1918年、1957年、1968年及1977年，其中1918年的大流行在一年內造成四千萬人口的死亡，致死率將近50%，為流行性感冒病毒致死最嚴重的一次傳染(Palese P(2004)Nat Med 10：S82-87)。最近一次A型流感大爆發也在世界各地造成三十萬人的感染(Wu et al.,(2012)PLoS One 7：e49856)。

一旦流感病毒感染呼吸道上皮細胞後，免疫系統將迅速被激活。先天性免疫首先發生，病毒的單股RNA在內涵體時就被類鐸受體7(Toll-like receptor 7，TLR7)、TLR8以及細胞質中的視網酸調控基因(retinoid-inducible gene 1，RIG-1)蛋白辨識到，而TLR3則可以辨識到病毒複製過程中的雙股RNA，之後除了召集巨噬細胞，也會召集自然殺手細胞(natural killer cells，NK cells)，這些細胞受召集後可分泌干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)，為啟動後天性免疫的關鍵，另一參與流感病毒感染時的先天性免疫反應為嗜中性細胞(neutrophil)，其容易受流感病毒刺激而在肺部與呼吸道活化，但如果嗜中性細胞過量可能會導致肺部炎症、肺損傷、干擾肺泡上皮細胞屏障、肺部組織液洩漏及限制呼吸能力(Chen et al.,(2004)Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 287：L366-373；Tuvim MJ et al.,(2009)PLoS One4：e4176.)。細胞上的受體一旦辨識到病毒，使巨噬細胞活化並藉由NF-κB的路徑釋放促發炎酵素或細胞激素，包括一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧合酶-2(COX-2)、腫瘤壞死因子阿法(TNF-α)、干擾素阿法/貝塔(IFN-α/β)、介白素(IL-6)等，因此也會引發發炎反應(Osterlund et al.,(2010)J Virol 84：1414-1422；Wu et al.,(2012)PLoS One 7：e49856.)。情況嚴重者，會引起細胞激素風暴，造成過度的肺部發炎反應，若是持續處於這種狀態往往會提高致死的可能性(Walsh KB et al.,(2011)Proc Natl Acad Sci U S A 108：12018-12023)。

目前雖有疫苗可對抗流感病毒，但由於流感病毒極易產生變異，幾乎每年流行的病毒株都會有所改變，原施打的疫苗對不同抗原之病毒便不具免疫力，導致保護效果降低(Neumann et al.,(2009)Nature 459：931-939)。此外，目前雖有抗病毒藥物可供施用，例如，克流感，但已產生抗藥性問題。

裙帶菜(Undaria pinnatifida)屬褐藻類，是一年生的溫水性大型海藻，長度1-2米，寬度0.2-0.4米在台灣以東北角之潮下帶為主要分布區域，日本、韓國、中國亦可見其蹤跡。已有文獻報導，褐藻含有硫酸多醣(fucoidan)及藻褐素(fucoxanthin)，具有多重生理功效，例如，抗氧化、抗病毒、抗癌、抗凝血、神經保護作用、免疫調節作用等(Berteau and Mulloy,(2003)Glycobiology 13：29R-40R，Heo et al.,(2010)Food Chem Toxicol 48：2045-2051)。多數文獻報導裙帶菜水萃取物中的硫酸多醣之抗病毒活性，但針對裙帶菜酒精萃取物之相關研究，則少有深入探討。

本發明係關於一種裙帶菜(Undaria pinnatifida)乙醇萃取物用於製備治療或預防A型流感病毒之組合物的用途。

在部分具體實施例中，本發明之組合物可降低細胞感染A型流感病毒之比例。

在部分具體實施例中，本發明之組合物可降低發炎細胞之發炎反應，特別是降低發炎細胞產生一氧化氮(NO)的量或降低一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧合酶-2(COX-2)或介白素-6(IL-6)之基因表現量。

在部分具體實施例中，本發明之組合物可降低感染A型流感病毒之個體的肺損傷。

在部分具體實施例中，本發明之組合物可提高感染A型流感病毒之個體之存活率。

在部分具體實施例中，本發明之組合物可於病毒感染前或感染後投用。

本發明之各個具體實例的細節說明如後。本發明之其他特徵將會經由以下各個具體實例中的詳細說明及申請專利範圍而清楚呈現。

無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於前述說明即可利用本發明至最廣的程度。因此，可以理解以下的說明僅僅是作為例示說明之用，而非以任何方式限制其餘的揭露內容

連同附圖閱讀能幫助瞭解前面的發明內容以及接下來的本發明詳細描述。在此所呈現之較佳圖式及具體實施例係以闡述本發明為目的。應理解的是，本發明並不侷限於所示之精確排列及方式。

在圖式中：圖1顯示(A)抗壞血酸及(B)不同濃度的裙帶菜水萃取物及裙帶菜乙醇萃取物對於DPPH(α,α-二苯基-β-苦基苯肼)自由基之清除效果。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖2顯示(A)乙二胺四乙酸(EDTA)及(B)不同濃度的裙帶菜水萃取物及裙帶菜乙醇萃取物對於亞鐵離子(Fe²⁺)之螯合效果。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖3顯示(A)沒食子酸及(B)不同濃度的裙帶菜水萃取物對於超氧陰離子(O₂ ^-)之清除效果。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖4顯示(A)丁基羥基甲氧苯及(B)不同濃度的裙帶菜乙醇萃取物對於2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS⁺)自由基之清除效果。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖5顯示BHK-21細胞經不同濃度的裙帶菜水萃取物處理後之細胞存活率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖6顯示BHK-21細胞經不同濃度的裙帶菜乙醇萃取物與DMSO處理後之細胞存活率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示 P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖7顯示不同濃度的裙帶菜水萃取物於不同處理時點(預處理組、共同處理組及感染後處理組)產生的病毒斑抑制率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖8顯示不同濃度的裙帶菜乙醇萃取物於不同處理時點(預處理組、共同處理組及感染後處理組)產生的病毒斑抑制率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。

圖9顯示裙帶菜水萃取物及裙帶菜乙醇萃取物對於A型流感病毒核蛋白之基因表現量之影響。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖10顯示裙帶菜水萃取物及裙帶菜乙醇萃取物對於A型流感病毒M1抗原之蛋白表現量之影響。以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)及抗小鼠H1N1的M1抗體進行細胞的免疫螢光染色之結果。放大倍數200x。

圖11顯示RAW264.7細胞經不同濃度的裙帶菜水萃取物處理後之細胞存活率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖12顯示RAW264.7細胞經不同濃度之裙帶菜乙醇萃取物與DMSO處理後之細胞存活率。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示 P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖13顯示裙帶菜水萃取物對於脂多醣(LPS)所誘導的一氧化氮(NO)產生之影響。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖14顯示裙帶菜乙醇萃取物對於脂多醣(LPS)所誘導的一氧化氮(NO)產生之影響。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖15顯示裙帶菜乙醇萃取物對於脂多醣(LPS)所誘導的一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧合酶-2(COX-2)或介白素-6(IL-6)之基因表現量之影響。數值以每組實驗(n=3)平均值±SEM表示。以Student’s t-test進行結果的統計分析，其中相較於對照組，符號*表示P<0.05，符號**表示P<0.01，符號***表示P<0.001)。

圖16顯示小鼠之肺部組織組織病理染色結果。萃取物-H1N1組為小鼠在病毒感染(每隻小鼠1,000PFU)前經鼻投予裙帶菜乙醇萃取物(每隻小鼠0.25μg)；H1N1組為小鼠僅接受病毒感染，以及控制組為小鼠僅接受PBS處理。感染後5天犧牲小鼠取肺部組織，以石蠟包埋切片進行染色。放大倍數200x。

圖17顯示裙帶菜乙醇萃取物在受病毒感染後之小鼠產生的保護效果，其中(A)顯示存活率，(B)顯示體重變化。萃取物-H1N1組為小鼠在病毒感染(每隻小鼠1,000PFU)前經鼻投予裙帶菜乙醇萃取物(每隻小鼠0.25 μg)；H1N1組為小鼠僅接受病毒感染，以及控制組為小鼠僅接受PBS處理。每日監測存活率達14天。

除非另有指明，所有在此處使用的技術性和科學性術語具有如同本發明所屬技藝中之通常技術者一般所瞭解的意義。

除非文中有清楚指明者，於本文中所使用之單數形式「一」、「一種」、及「該」之涵義均為包括「至少一種」的複數形式。因此，例如，當提及「一成分」時，包括複數個該等成分及對該領域具有通常知識者所知之同等物。

裙帶菜又名海芥菜、海帶芽，屬褐藻門、褐子綱、海帶目、翅藻科、裙帶菜屬，是一年生的溫水性大型海藻，長度1-2米，寬度0.2-0.4米，其藻體葉狀體部分成羽狀互生，具典型異型世代交替生活史：大型的孢子體和小型的絲狀配子體交替。在台灣以東北角之潮下帶為主要分布區域，日本、韓國、中國亦可見其蹤跡。市場上多以切片處理成細長條狀販售，而稱為海帶芽。在一具體實例中，本發明使用的裙帶菜係經乾燥，或進一步磨成粉末。

此處所使用的「萃取物」指針對一材料進行萃取所得之產物，通常是藉由將所欲萃取的材料浸泡或混合於溶劑中而獲得的溶液或濃縮製劑。典型地，萃取物係製備自新鮮植物或經研磨或乾燥之植物樣本。

此處所述「裙帶菜水萃取物」係指以水萃取裙帶菜所得產物，可藉由一般在此技藝中已知的標準方法或技術製備而成。典型地，將裙帶菜洗淨、乾燥、磨成粉末，加入適當比例的水煮沸達一段適當時間，例如，1小時以上，特定而言，2小時以上，更特定而言，3小時以上，其可視水溫及裙帶菜的量而有變化。可於後續進行額外的濃縮或純化步驟，例如，抽氣過濾後的液體加入酒精，置於低溫(如4℃)沉澱隔夜，然後離心取出膠狀化的液體，可視需要再經冷凍乾燥，獲得裙帶菜水萃取物。

此處所述「裙帶菜乙醇萃取物」係指以乙醇萃取裙帶菜所得產物。本文所使用的「乙醇」或「酒精」可交互使用，以百分比表示的乙醇或酒精是指溶於水的體積百分比，例如，95%乙醇是指含有95%的乙醇及5%的水之溶液。在部分具體實施例中，本發明用以萃取裙帶菜之乙醇為70%以上的乙醇，較佳為95%乙醇或無水酒精。此外，裙帶菜與乙醇的比例可為約1：1至1：100(w/v，g/ml)，更具體為約1：1至1：50(w/v，g/ml)，再更為具體為約1：1至1：25(w/v，g/ml)，又更為具體為約1：1至1：10(w/v，g/ml)，例如，1：6(w/v，g/ml)。在部分具體實施例中，將植物樣本之全部或部分(視需要地經切碎或磨碎)與適當的溶劑混合或浸泡於其中，可加上攪拌，達一段足夠的時間，例如，6小時或以上、12小時或以上、16小時或以上、或24小時或以上，經由過濾移除固體殘留物(濾渣)，然後收集所獲得的液體(萃取液)，視需要重複浸泡或混合步驟，合併所得汁液，進一步予以濃縮、純化或分離。

在本文中所使用的「A型流感病毒感染」乙詞是指由A型流感病毒造成的感染。A型流感病毒的亞型是透過病毒封套醣蛋白血球凝集素(HA)及神經胺酸酶蛋白(NA)次型態的組合來決定。A型流感病毒有16 種不同的HA抗原(H1-H16)以及9種不同的NA抗原(N1-N9)。A型流感的亞型包括，但不限於：H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、以及H10N7。根據本發明的一特定具體實施例中的A型流感病毒的亞型為H1N1。

本發明非可預期地發現，裙帶菜乙醇萃取物具有優異的抗氧化效果，並可降低細胞感染A型流感病毒之比例及發炎細胞的發炎反應，亦在動物實驗證實可降低感染A型流感病毒之動物的肺損傷，及提高感染A型流感病毒之動物的存活率。

因此，本發明提供一種裙帶菜乙醇萃取物用於製備治療或預防A型流感病毒之組合物的用途。

在一具體實施例中，本發明之裙帶菜乙醇萃取物可用於抑制細胞受A型流感病毒之感染，例如，降低細胞感染病毒之比例。

在本發明中，吾人證實裙帶菜乙醇萃取物在各種處理時點(預處理組、共同處理組及感染後處理組)均可達優異的抑制病毒感染之效果，例如，裙帶菜乙醇萃取物於濃度0.01mg/ml(10μg/ml)時，於病毒感染細胞前、與病毒同時加入或病毒感染細胞後，可達病毒斑抑制率約74%、60%與40%(圖8)，其中又以病毒感染細胞前處理的效果最好。相較之下，裙帶菜水萃取物即使是在最高試驗濃度，無論在哪個時間點，病毒斑抑制率僅約35%(圖7)。此外，比較病毒的核蛋白(NP)基因表現量及M1抗原的蛋白表現，亦證實裙帶菜乙醇萃取物有顯著抑制效果；相較之下，裙帶菜水萃取物無顯著抑制效果(圖9及圖10)。

在另一具體實施例中，本發明之裙帶菜乙醇萃取物可用以降低發炎細胞之發炎反應。

當病毒被細胞的受體所辨識，便會去活化巨噬細胞，而巨噬細胞可以藉由NF-κB的路徑去釋放一些促發炎的細胞激素或蛋白質，包括一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧合酶-2(COX-2)或介白素-6(IL-6)等，而細胞激素會活化並啟動先天性免疫反應以抵禦病毒入侵，但若免疫反應過度會造成嚴重的發炎現象發生，例如，造成過度肺部發炎反應，常導致提高致死率。

在本發明中，吾人以細胞試驗證實裙帶菜乙醇萃取物可降低發炎細胞之發炎反應。具體而言，本發明之裙帶菜乙醇萃取物可降低巨噬細胞受誘導產生的一氧化氮之產量(圖14)；相較之下，裙帶菜水萃取物則未顯示顯著降低一氧化氮之產量的效果(圖13)。進一步分析各種促發炎細胞激素之產生，結果顯示，本發明之裙帶菜乙醇萃取物可顯著降低iNOS、COX-2、IL-6基因的表現量，例如，在濃度為31.25μg/ml時，分別降低約0.59倍、0.37倍(p<0.001)與0.75倍(p<0.01)(圖15)。

肺部發炎所造成的肺損傷是流感死亡的一個重要因子(Yu et al.,(2010)J Ethnopharmacol 127：280-285)，且肺部發炎程度與流感病毒感染具有正相關性。吾人進一步在動物試驗證實，本發明之裙帶菜乙醇萃取物具有降低肺部損傷的效果，例如，可減少肺泡中發炎細胞浸潤及支氣管水腫、黏液增厚的情形，並且可以提高小鼠的存活率與減少體重下降的百分率(圖17)。

本發明之組合物可依傳統上之常規方法，視需要與任何一種或多種載體調配而成。例如，將裙帶菜乙醇萃取物與適當載體混合，再將其製成所需劑型。

本文所使用的「載體」乙詞意指用以攜帶裙帶菜萃取物形成所欲調配物形式之非活性成分，包括任何標準藥學上可接受之載體，其可與調配物之活性成分相容，且對欲施用之個體無害，例如，水、生理鹽水、甘油、乙醇、葡萄糖水、葡聚糖、乳糖、蔗糖、甘露醇、其類似物或以上之組合。

本發明之組合物尚可包括黏結劑、潤滑劑、抗氧化劑、填充劑及保藏劑。可用的黏結劑包括阿拉伯膠、海藻酸鈉、乙基纖維素、洋菜、明膠、澱粉、羥基纖維素、羥丙基纖維素、其類似物或以上之組合。可用的潤滑劑包括硬脂酸、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、滑石、氫化油、臘、其類似物或以上之組合。可用的抗氧化劑包括生育醇、二丁基羥基甲苯、丁基羥基甲氧苯、抗壞血酸、其類似物或以上之組合。可用的填充劑包括微晶纖維素、乳糖、甘露醇、其類似物或以上之組合。可用的保藏劑包括苯甲酸及其鹽類、山梨酸及其鹽類、對羥基苯甲酸酯類、去水醋酸鈉、過氧化氫、次氯酸鈉、其類似物或以上之組合。

在一具體實例中，本發明之組合物係作為醫藥組合物，其可依投與途徑調配成各種劑型。例如，本發明之組合物可調配成噴霧劑，供鼻腔吸入。此外，膠囊或錠劑可用於口服投藥。膠囊可含有任何標準之醫藥可接受性物質，諸如，明膠或纖維素。錠劑可根據習知方法，將組合物與固態載體及潤滑劑共同壓製而調配。注射劑型使用之載體包括水溶液、等張鹽水或葡萄糖液或是其他熟知之醫藥可接受性載體。其他劑型包括乳膏、油劑、凝膠、乳液，可供局部施用。

根據本發明，裙帶菜乙醇萃取物可用以治療或預防A型流感病毒感染，可將裙帶菜乙醇萃取物投予需要的個體，包括已感染A型流感病毒、表現感染症狀或有感染可能的個體，可使該個體達到治癒、減輕、緩和、改善、改變或影響該病毒感染、其引發症狀或感染傾向之目的。在部分具體實施例中，本發明之裙帶菜乙醇萃取物係在感染前，或是在感染後，例如，感染後立即或是在感染症狀出現之後立即施用。

本發明通過下面的實施例進一步的說明，下面的實施例僅提供作為示範目的，而非限制本發明。本領域的技術人員應能根據本發明瞭解，不脫離本發明的精神和範圍，而對本發明所公開的特定具體實施例中進行許多改變，仍然能獲得相同或相似的結果。

實施例 1. 材料與方法 1.1 裙帶菜萃取及其抗氧化能力分析 1.1.1 裙帶菜乙醇萃取物

裙帶菜購自台灣基隆和平島，將乾燥的裙帶菜磨成粉，取100g裙帶菜粉末(g)與絕對酒精容量(ml)以1：6的比例混合(w/v)，避光於室溫下持續攪拌一天，之後進行抽氣過濾去除固體部分，抽氣過濾所得之液體則以減壓濃縮方式去除溶劑後便為裙帶菜乙醇萃取物(Park et al.,2010,Food Chem Toxicol 49：727-733)。

1.1.2 裙帶菜水萃取物

將乾燥的裙帶菜磨成粉，取100g裙帶菜粉末(g)與去離子水體積(ml)為1：10的比例混合(w/v)，於100℃下萃取1小時，抽氣過濾後得到的裙帶菜萃取液再加入四倍體積的絕對酒精，放在4℃一個晚上進行沉澱反應，之後離心後取出膠狀化的液體經冷凍乾燥便為裙帶菜水萃取物(Paradossi et al.,1999,Int J Biol Macromol 25：309-315)。

1.1.3 DPPH(α,α-二苯基-β-苦基苯肼)自由基清除能力測定

參考Shimada等人的分析方法(Shimada et al.,1992,J.Agric.Food Chem.40：945-948)，將裙帶菜萃取物配製成濃度為1mg/mL，並連續對半稀釋為八個濃度；正控制組之抗壞血酸配製成濃度500μM，並對半稀釋成250、125、62.5、31.25、15.625與7.8125μM之濃度。取100μL裙帶菜萃取物，並加入100μL濃度為0.1mM的DPPH甲醇溶液，避光靜置30分鐘後以517nm測定吸光值。將吸光值代入下列公式計算DPPH自由基清除率：DPPH清除率(%)=[1-(樣本_517nm/空白組_517nm(即未含有任何抗氧化劑之吸光值))x 100%。

1.1.4 螯合亞鐵離子能力測定

參考Dinis等人的分析方法(Dinis et al.,1994,Arch Biochem Biophys 315：161-169)，將EDTA及裙帶菜萃取物以PBS溶解後，連續對半稀釋成八個濃度。將八個不同濃度的待測物各取100μL並依序加入50μM菲洛嗪(ferrozine)之醋酸銨溶液(pH 7)及10μM硫酸鐵(亞鐵離子來源)，混合後反應2小時，在562nm下測定其吸光值，並將吸光值代入公式計算螯合亞鐵離子能力：亞鐵離子螯合率(%)=[1-(樣本_562nm/空白組_562nm(即未含有任何抗氧化劑之吸光值))x 100%。

1.1.5 超氧陰離子清除能力測定

參考Robak和Grygelwski的分析方法(Robak and Gryglewski,1988,Biochem Pharmacol 37：837-841)，以0.1M磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline，PBS，pH 7.4)配製成120μM之吩嗪甲基硫酸鹽(phenazine methosulphate，PMS)、936μM之還原態煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(nicotine amide adinine dinuclited reduced form，NADH)及300μM之硝基藍四氮唑(nitro blue tetrazolium，NBT)。接著將沒食子酸與裙帶菜萃取物以PBS溶解後，配製成濃度1mg/mL，並連續對半稀釋成八個濃度。將八個不同濃度的待測物各取50μL並依序與50μL PMS、50μL NADH及50μL NBT混合後反應5分鐘，於560nm下測定其吸光值，並將吸光值代入公式計算超氧陰離子清除率：超氧陰離子清除率(%)=[1-(樣本_560nm/空白組_560nm(即未含有任何抗氧化劑之吸光值))x 100%。

1.1.6 ABTS ⁺ 自由基清除能力測定

將7mM 2,2’-連氮基-雙-(3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS)溶液與2.4mM過硫酸鉀溶液(potassium persulfate,K₂S₂O₈)以1：1的比例混合，避光反應12至16小時，接著稀釋至OD₇₃₄為0.70後再與裙帶菜萃取物以1：1的比例混合，於37℃下避光反應10分鐘，再測OD₇₃₄之吸光值。標準品為丁基羥基甲氧苯(butylated hydroxyanisole，BHA)在濃度0.04mg/ml下以絕對酒精對半稀釋後進行檢測(Mogana et al.,2013,Evid Based Complement Alternat Med 2013：734824.)。

1.2 細胞培養 1.2.1 BHK-21細胞培養

幼倉鼠腎細胞BHK-21(ATCC CCL-10,baby hamster kidney cells)於培養皿中培養至八分滿後進行繼代培養。首先，吸除細胞培養液，用磷酸緩衝液(PBS)洗去殘留的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，接著加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)並置於37℃下反應5分鐘，再以0.5mL FBS中止胰蛋白酶-EDTA的作用。接著以RPMI-1640培養液清洗並收集細胞，在4℃下以1,000rpm離心5分鐘。去除上清液，將細胞懸浮於RPMI-1640培養液中，進行細胞計數，最後接種於細胞培養皿中。

1.2.2 RAW 264.7細胞培養

將老鼠巨噬細胞株RAW 264.7(ATCC TIB-71,mouse monocyte/macrophage)於培養皿中培養至八分滿後進行繼代培養。首先，吸除細胞培養液，用磷酸緩衝液(PBS)洗去殘留的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)，接著加入1mL胰蛋白酶-EDTA(Trypsin-EDTA)並置於37℃下反應5分鐘，再以0.5mL FBS中止胰蛋白酶-EDTA的作用。接著以DMEM培養液清洗並收集細胞，在4℃下以1,000rpm離心5分鐘。去除上清液，將細胞懸浮於DMEM培養液中，進行細胞計數，最後接種於細胞培養皿中。

1.2.3 細胞毒性測試(MTS檢測)

將BHK-21細胞以1×10⁴(細胞/孔)量接種於96孔盤中，置於5% CO₂之37℃培養箱中培養24小時後，吸除細胞培養液，以無菌PBS清洗後，加入不同濃度的裙帶菜萃取物(以含2%FBS之RPMI-1640培養液配製成不同濃度)，放入培養箱中培養48小時後，加入MTS試劑，接著置於培養箱中避光反應1小時後，測定490nm吸光值，以檢測在不同裙帶菜萃取物濃度下細胞的存活率。

1.2.4 病毒培養

將A型流感病毒液(H1N1)注射入蛋胚的尿囊膜後以蠟封住洞口，於培養箱中培養1至2天，再放入4℃等待凝結，最後將尿囊膜中液體抽出，並置於-80℃保存。

1.2.5 病毒斑分析(plaque assay)

繼代培養時將BHK-21細胞接種於6孔細胞培養盤中，並培養於含5% CO₂之培養箱。待細胞培養至6至7分滿時，吸除細胞培養液後，以PBS沖洗殘留的細胞液並加入不同稀釋倍數的病毒懸浮液，置於培養箱中進行病毒感染。感染1小時後，將病毒懸浮液吸除。加入含2% FBS與2%瓊脂糖凝膠(agarose gel)之RPMI-1640培養液，靜置待其凝固後置於培養箱中培養2至3天。接著加入2mL 10%福馬林(formalin)並於室溫下靜置1小時後將凝膠移除，以1%結晶紫(crystal violet)染色1小時後，以清水沖洗殘餘結晶紫，計算病毒斑數量，並定出病毒效價。單位以PFU/ml表示(PFU,plaque forming unit)(Weng et al.,2005,Antiviral Res 67：31-37)。

1.2.6 裙帶菜萃取物添加時間點對於抗病毒能力之影響

以最大濃度的裙帶菜萃取物進行試驗，依添加處理的時間點分為三大組：(1)預處理組：BHK-21細胞先加入裙帶菜萃取物並反應1小時，再添加病毒液(50PFU/孔)感染1小時；(2)共同處理組：同時加入病毒液(50PFU/孔)與裙帶菜萃取物並於37℃下共同培養1小時；(3)感染後處理組：細胞先添加病毒(50PFU/孔)培養1小時後，吸除培養液再加入裙帶菜萃取物培養1小時。

1.2.7 病毒斑抑制試驗(plaque inhibition assay)

將BHK-21細胞加入以不含FBS之RPMI-1640培養液稀釋成不同濃度的裙帶菜萃取物，於37℃下培養1小時。再加入病毒液(50PFU/孔)，並於37℃下感染1小時。吸除病毒懸浮液後，加入含2% FBS與2%瓊脂糖凝膠之RPMI-1640培養液，靜置待其凝固後置於培養箱中培養4天，然後以10%甲醛固定後將凝膠移除，接著以1%結晶紫染色，以清水沖洗殘餘結晶紫後計算病毒斑數量(Shih et al.,2003,J Med Virol 70：119-125)。

1.2.8 總RNA萃取

將細胞或以研磨棒研磨後之組織加入含2-巰基乙醇(beta-mercaptoethanol)之緩衝液將細胞裂解，以針頭來回抽吸使均質後，再加入等體積的70%酒精，混和均勻後，以RNeasy萃取套件(QIAGEN,Germantown,USA)進行總RNA萃取，最後取2μL RNA與DEPC(diethylpyrocarbonate)水稀釋10倍，測其在260nm與280nm波長之吸光值並換算成RNA濃度及純度。

1.2.9 反轉錄反應(reverse transcription,RT)

取100ng已定量好的RNA置於PCR管中，加入DEPC水將體積補至12.5μL，再加入1μL Oligo(dT)引子，於72℃反應2分鐘後立即置入冰浴，依序加入4μL 5倍緩衝液、1μL 10mM dNTP混合物、1μL M-MLV逆轉錄酶及0.5μL RNase抑制劑，均勻混合後於42℃反應1小時，接著於95℃反應5分鐘，以去除反轉錄酶的活性，所得到之cDNA保存於-20℃冰箱備用。

1.2.10 即時聚合酶連鎖反應(Real-time PCR)

取5μL經100倍稀釋之cDNA，接著加入12.5μL iQ^TM SYBR^® Green Supermix(Bio-Rad,Hercules,USA)及各0.5μL之10μM雙向引子，最後加入無菌水使反應總體積為25μL。以PCR反應器(iCycler iQ^® Multicolor Real-Time PCR Detection System，BIO-RAD)利用各引子最適黏合溫度進行聚合酶連鎖反應，並以即時定量聚合酶連鎖反應所得之Ct值進而計算各種細胞激素之表現情形。

1.2.11 免疫螢光染色(Immunofluorescence stain)

將BHK-21細胞以每孔1×10⁵細胞數接種在6孔盤中，待細胞培養至7至8分滿時，將細胞分為三組：(1)未感染、(2)僅病毒感染(M.O.I.=0.1)及(3)病毒感染後以裙帶菜萃取物處理。在37℃處理1小時後，置換培養液並培養48小時後，吸除培養液並以PBS清洗。加入1%甲醛(formaldehyde)於4℃固定12小時後，再以PBS清洗。接著，加入小鼠抗流感A/WSN/33 M蛋白抗體(Mouse anti-influenza A/WSN/33 M-protein antibody(1：500))，置於37℃反應1小時，以PBS清洗後，加入螢光異硫氰酸鹽-山羊抗小鼠抗體(FITC-goat anti mouse IgG)於37℃避光反應30分鐘後，再以PBS清洗，接著利用螢光顯微鏡觀察胞內螢光訊號之表現量。

1.2.12 一氧化氮濃度分析(NO assay)

參考Kim等人的分析方法(Kim et al.,2013,J Ginseng Res,37：54-63)，以每孔2x10⁵細胞數的RAW 264.7細胞接種於96孔盤中，待細胞貼覆2小時後以1μg/μL LPS進行刺激，同時加入不同濃度的人蔘鬚反應18小時，吸取上清液至ELISA盤中，加入25μL Griess試劑A及25μL Griess試劑B，避光反應10分鐘後檢測其550nm吸光值。

1.3. 動物實驗 1.3.1 流感病毒感染小鼠之動物模式

本實驗係使用購買自國家實驗動物中心之BALB/c品系小鼠，所有小鼠皆飼養於國立台灣海洋大學生命科學院動物房，維持在恆定溫度，且自由攝取飲水及飼料。將小鼠分成3組：(1)控制組：小鼠於未攻毒前鼻腔吸入PBS，攻毒時鼻腔吸入PBS；(2)病毒感染組：小鼠於未攻毒前鼻腔吸入PBS，攻毒時鼻腔吸入病毒；及(3)裙帶菜萃取物處理感染組：小鼠於未攻毒前鼻腔吸入裙帶菜萃取物，攻毒時鼻腔吸入病毒。

1.3.2 石蠟切片與免疫螢光染色

將小鼠肺臟泡在10%甲醛溶液中，於4℃靜置一天後，依序以70%、90%及100%酒精、以及二甲苯進行脫水。石蠟包埋後進行組織切片，將玻片置於50℃烘箱中烘片於4℃下保存或進行組織染色。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色(hematoxylin and eosin stain，H&E stain)

染色前先將包覆組織的石蠟以二甲苯脫蠟覆水，接著將玻片浸泡於蘇木精染色10秒後以流水沖洗15分鐘，接著以伊紅染色1分鐘後以流水沖洗，待玻片乾後，依序浸泡70%、90%、100%酒精及二甲苯5分鐘以進行脫水，待玻片乾後即可封片保存。

1.4 統計分析

本發明之實驗數據以平均值±標準差(mean±SD)表示。以Student’s t-test在雙尾及兩群體變異數不等的條件下，計算出p值。以p<0.05做為標準，當p<0.05時為有顯著差異。

2. 結果 2.1 抗氧化能力之測定

在抗氧化能力測定上，當裙帶菜水萃取物濃度為1mg/mL時，清除DPPH自由基、螯合亞鐵離子與清除超氧陰離子等三種抗氧化能力分別為32.59%(圖1)、60.08%(圖2)與56.40%(圖3)；而當裙帶菜乙醇萃取物濃度為1mg/ml時，清除DPPH自由基、螯合亞鐵離子與清除ABTS^-自由基等三種抗氧化能力分別為100.00%(圖1)、100.00%(圖2)與86.87%(圖4)。整體而言，裙帶菜乙醇萃取物抗氧化的能力較佳。

2.2 裙帶菜萃取物之抗A型流感病毒之細胞試驗 2.2.1 細胞毒性試驗

利用MTT試驗檢測裙帶菜萃取物對細胞存活率之影響。如圖5所示，裙帶菜水萃取物於濃度1mg/mL時，BHK-21細胞可達80%以上存活率，而裙帶菜乙醇萃取物濃度低於150μg/ml時，BHK-21細胞存活率達80%以上。此外，因裙帶菜乙醇萃取物係以DMSO回溶，故同時測試該裙帶菜乙醇萃取物濃度之相對應DMSO濃度是否會對細胞造成毒性，結果顯示當裙帶菜乙醇萃取物濃度為150μg/ml之相對應的DMSO濃度下，BHK-21細胞之存活率亦達80%以上(圖6)。

2.2.2 抑制病毒斑之形成

本試驗使用的A型流感病毒株之力價為5×10⁵PFU/ml。本試驗分析裙帶菜萃取物分別在病毒感染細胞前、與病毒同時加入或病毒感染細胞後之抗病毒能力。結果顯示，裙帶菜水萃取物於最高試驗濃度1mg/mL時，無論在哪個時間點，對病毒斑形成的抑制率僅約35%(圖7)。相較之下，裙帶菜乙醇萃取物於最高試驗濃度0.01mg/ml(10μg/ml)時，於病毒感染細胞前、與病毒同時加入或病毒感染細胞後病毒斑形成的抑制率分別可達約74%、60%與40%(圖8)。

由此可知，裙帶菜乙醇萃取物具有較佳的抗A型流感病毒感染細胞的能力，其中又以病毒感染細胞前處理的效果最好。

2.2.3 降低胞內A型流感病毒核蛋白基因之表現量

利用萃取胞內RNA再將其反轉錄成cDNA，最後利用Real-time PCR的方式確認裙帶菜水萃取物與乙醇萃取物對於降低細胞內A型流感病毒核蛋白的基因表現量之影響。

如圖9所示，於病毒感染細胞前分別投予裙帶菜水萃取物及裙帶菜乙醇萃取物，相較於細胞僅單獨受病毒感染，裙帶菜水萃取物(1mg/mL)組別之核蛋白基因表現量約下降0.09倍，其與控制組無顯著差異，而裙帶菜乙醇萃取物(31.25μg/mL)組別之核蛋白基因表現量則可下降約0.40倍(p<0.001)，具顯著差異。

由此可知，裙帶菜乙醇萃取物具有降低A型流感病毒感染細胞的能力。

2.2.4 降低胞內病毒抗原之表現

以免疫螢光染色法觀察在病毒感染細胞前以裙帶菜萃取物處理細胞，確認裙帶菜萃取物對於降低胞內病毒的M1抗原表現量之影響。如圖10所示，裙帶菜乙醇萃取物(31.25μg/mL)可明顯降低H1N1 M1抗原表現量，而裙帶菜水萃取物(1mg/mL)，對於H1N1 M1抗原的表現量並無明顯降低。此結果再次確認裙帶菜乙醇萃取物具有降低A型流感病毒感染細胞的能力。

2.3 裙帶菜萃取物之抗發炎能力分析 2.3.1 細胞毒性試驗

如圖11及圖12所示，裙帶菜水萃取物與乙醇萃取物於濃度31.25μg/mL時，RAW264.7細胞存活率皆可達80%以上。此外，因乙醇萃取物係以DMSO所溶解，進一步檢測相對應的DMSO濃度是否會對細胞造成毒性，結果顯示當DMSO濃度為31.25μg/ml其RAW264.7細胞之存活率亦達80%以上。

2.3.2 抑制一氧化氮及促發炎激素之產生

以不同濃度的裙帶菜萃取物混合LPS處理細胞，然後測定一氧化氮(NO)產量。由結果可知，裙帶菜水萃取物在不同濃度，相較於僅以LPS刺激之組別，其NO產量無顯著降低(圖13)。相較之下，裙帶菜乙醇萃取物在濃度31.25μg/mL、15.63μg/mL與7.81μg/mL時，相較於僅以LPS刺激之組別，其NO產量可分別降低32.74%(p<0.001)、16.97%(p<0.01)與5.76%(圖14)。

此外，利用即時PCR測定RAW264.7細胞之相關促發炎激素的表現量，以不同濃度的裙帶菜乙醇萃取物混合1μg/ml LPS處理，再與單獨LPS刺激之組別比較。結果顯示，當裙帶菜乙醇萃取物濃度為31.25μg/mL時，可有效降低iNOS、COX-2、IL-6基因的表現量，其分別降低約0.59倍、0.37倍(p<0.001)與0.75倍(p<0.01)(圖15)。

本試驗之結果顯示，裙帶菜乙醇萃取物具有抗發炎效果。

2.4 裙帶菜萃取物之抗A型流感病毒之動物試驗 2.4.1 小鼠肺組織病理切片與H&E染色

如圖16所示，單獨攻毒的組別其肺損傷情形較未攻毒的控制組嚴重，表示病毒感染對動物肺部造成損傷，而如以裙帶菜乙醇萃取物處理後再攻毒，則動物的肺損傷情形顯著降低，包括減少肺泡中發炎細胞浸潤及支氣管水腫、黏液增厚的情形。

2.4.2小鼠存活率與體重變化

將小鼠分成三個組別，分別為控制組、單獨攻毒組(H1N1)與裙帶菜乙醇萃取物處理後攻毒組(UE+H1N1)。如圖17(A)所示，單獨攻毒組在第八天的存活率為50%，而到第十天的存活率僅剩25%，其情況持續到第14天；相較之下，裙帶菜乙醇萃取物處理後攻毒組至第九天的存活率仍高達83.3%，並可持續到第14天。

此外，圖17(B)顯示體重變化的結果，單獨攻毒組在第四天時，動物的平均體重已減少17.5%，至第九天時體重已減少36%；相較之下，裙帶菜乙醇萃取物處理後攻毒組，在第八天時其體重下降至26.4%，其後體重便逐漸回增。

本試驗之結果顯示，裙帶菜乙醇萃取物具有降低肺部損傷的效果，並且可以提高小鼠的存活率與減少體重下降的百分率。

3. 結論

本研究首次提出，裙帶菜乙醇萃取物針對A型流感病毒具有優異的抗氧化及抗病毒活性，並有抑制發炎之效果，且在動物試驗證實預先以裙帶菜乙醇萃取物處理，具有降低肺部損傷的效果並可提高動物存活率及減少體重下降。綜合上述結果，裙帶菜乙醇萃取物可抑制A型流感病毒之感染並可降低感染後的肺部發炎反應，提高存活率。

Claims

一種裙帶菜(Undaria pinnatifida)乙醇萃取物用於製備治療或預防個體之A型流感病毒感染之組合物的用途。
如請求項1之用途，其中該組合物可降低細胞感染A型流感病毒之比例。
如請求項1之用途，其中該組合物可降低發炎細胞之發炎反應。
如請求項1之用途，其中該組合物可降低發炎細胞產生一氧化氮的量或降低一氧化氮合成酶(iNOS)或發炎細胞激素環氧合酶-2(COX-2)或介白素-6(IL-6)之基因表現量。
如請求項1之用途，其中該組合物可降低感染A型流感病毒之個體的肺損傷。
如請求項1之用途，其中該組合物可提高感染A型流感病毒之個體之存活率。
如請求項1之用途，其中該組合物係於病毒感染前或感染後投用。
如請求項1之用途，其中該組合物係以經鼻腔投與方式施用。
如請求項1之用途，其中該A型流感病毒為H1N1病毒。
如請求項1之用途，其中該組合物係作為醫藥組合物。
如請求項1-10中任一項之用途，其中該乙醇萃取物係以裙帶菜與乙醇混合或浸泡達足夠時間後，收集所得萃取液而得。