JP2007192734A - バイオチップの製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、ＤＮＡ等の選択結合性物質を、バリの出やすいプラスチック製基板に点着するにあたり、正確なスポット位置への点着を実現し、バイオチップを効率よく製造するための手段を提供する。
【解決手段】プラスチック製のバイオチップ基板の端面をストッパーに衝止して、基板を保持し、バイオチップ基板上の所望の位置に選択性結合物質を点着してバイオチップを製造する方法であって、前記ストッパーは、バイオチップ基板のバリを避ける構造を有していることを特徴とするバイオチップの製造方法。
【選択図】図１

Description

本発明は、バイオチップの製造方法に関し、詳しくは、ＤＮＡ等の選択結合性物質を、正確に点着し、バイオチップを効率よく製造することのできるバイオチップの製造方法に関する。

各種生物の遺伝情報解析の研究が始められている。ヒト遺伝子をはじめとして、多数の遺伝子とその塩基配列、また遺伝子配列にコードされる蛋白質およびこれら蛋白質から二次的に作られる糖鎖に関する情報が急速に明らかにされつつある。配列の明らかにされた遺伝子、蛋白質、糖鎖などの高分子体の機能は、各種の方法で調べることができる。主なものとして、核酸は、ノーザンブロッティング、あるいはサザンブロッティングのような、各種の核酸／核酸間の相補性を利用した方法により、各種遺伝子とその生体機能発現との関係を調べることができる。一方、蛋白質は、ウエスタンブロッティングに代表される蛋白質／蛋白質間の反応を利用し蛋白質の機能および発現について調べることができる。

近年、多数の遺伝子発現を一度に解析する手法として、ＤＮＡマイクロアレイ法（ＤＮＡチップ法）と呼ばれる新しい分析法が開発され、注目を集めている。これらの方法は、いずれも、核酸／核酸間ハイブリダイゼーション反応に基づく核酸検出・定量法である点で原理的には従来の方法と同じである。これらの方法は、蛋白質／蛋白質間あるいは糖鎖／糖鎖間や糖鎖／蛋白質間の特異的な反応に基づく蛋白質や糖鎖検出・定量に応用が可能である。これらの技術は、マイクロアレイ又はＤＮＡチップと呼ばれるガラスの平面基材片上に、多数のＤＮＡ断片や蛋白質、糖鎖が高密度に整列固定化されたものが用いられている点に大きな特徴がある。ＤＮＡチップの具体的使用法としては、例えば、研究対象細胞の発現遺伝子等を蛍光色素等で標識したサンプルを平面基材片上でハイブリダイゼーションさせ、互いに相補的な核酸（ＤＮＡあるいはＲＮＡ）同士を結合させ、その箇所を高解像度検出装置（スキャナー）で高速に読み取る方法や、電気化学反応にもとづく電流値等の応答を検出する方法が挙げられる。このようして、サンプル中のそれぞれの遺伝子量を迅速に推定できる。また、ＤＮＡチップの応用分野は、発現遺伝子の量を推定する遺伝子発現解析のみならず、遺伝子の一塩基置換（ＳＮＰ）を検出する手段としても大きく期待されている。

核酸等の選択結合性物質を基材上に固定化する技術として、スライドガラス等の平坦な基材の上に、ポリ−Ｌ−リシン、アミノシラン等をコーティングして、スポッターと呼ばれる点着装置を用い、各核酸を固定化する方法などが開発されている（例えば、特許文献１及び特許文献２参照）。また、ＤＮＡチップの基材として、ガラスやシリコンの他、成形の容易なプラスチック製の基材が用いられることが多くなっている。

ここで、スポッターによる点着は、スポット位置を正確に行う必要があることから、基材を固定するためのストッパー（突き当て）に基材を突き当てて行うのが通常である。しかし、プラスチック製の基材を用いる場合には、製造時のバリが発生することが多いため、ストッパーへの突き当てにより基材を固定化しても、バリにより、所望位置からスポット位置がずれてしまうことがあった。

特表平１０−５０３８４１号公報 特開２００１−１０８６８３号公報

本発明は、前記課題を解決するものであり、ＤＮＡ等の選択結合性物質を、バリの出やすいプラスチック製基板に点着するにあたり、正確なスポット位置への点着を実現し、バイオチップを効率よく製造するための手段を提供することにある。

上記課題を解決するため、本発明によれば、下記のものが提供される：
〔１〕 プラスチック製のバイオチップ基板の端面をストッパーに衝止して、基板を保持し、バイオチップ基板上の所望の位置に選択性結合物質を点着してバイオチップを製造する方法であって、前記ストッパーは、バイオチップ基板のバリを避ける構造を有していることを特徴とするバイオチップの製造方法。
〔２〕 ストッパーの突き当て面に溝が設けられてなることを特徴とする前記〔１〕記載のバイオチップの製造方法。
〔３〕 ストッパーの突き当て面のバイオチップ基板の周縁部端面が突き当たる箇所に、溝が設けられてなることを特徴とする前記〔１〕または〔２〕に記載のバイオチップの製造方法。
〔４〕 ストッパーの突き当て面の高さが、バイオチップ基板の端面の高さ未満であることを特徴とする前記〔１〕〜〔３〕のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
〔５〕 バイオチップ基板は、射出成形により作製されたものであることを特徴とする前記〔１〕〜〔４〕のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
〔６〕 バイオチップ基板は、表面に凹凸部を有する凹凸型基板であり、前記凹凸部を構成する凸部表面に選択結合性物質を点着してバイオチップを製造することを特徴とする前記〔１〕〜〔５〕のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。

本発明によれば、ＤＮＡ等の選択結合性物質を、バリの出やすいプラスチック製基板に点着するにあたり、正確なスポット位置への点着が可能であることから、被験物質を正確に且つ安定して検出することができるバイオチップを効率良く製造することができる。

本発明のバイオチップの製造方法は、プラスチック製のバイオチップ基板の端面をストッパーに衝止して、基板を保持し、バイオチップ基板上の所望の位置に選択性結合物質を点着してバイオチップを製造する方法であって、前記ストッパーは、バイオチップ基板のバリを避ける構造を有していることを特徴とするものである。

本発明においてストッパー（突き当て）とは、バイオチップ基板を固定するための部材を意味する。ストッパーの形状は、バイオチップ基板に選択性結合物質を点着（スポット）する際に、基板を突き当てて保持し固定することができるものであれば、バイオチップ基板の形状に合わせて適宜定めることができる。また、既存のスポッターにおけるストッパーをそのまま用いることもできる。
図１は、ストッパーにバイオチップ基板を突き当てた状態の一例を示す斜視図である。図１の例では、ストッパー１は、２本の直方体部材１１Ａ及び１１Ｂからなり、平板状のバイオチップ基板２をストッパー１の突き当て面１２に対して突き当てた場合に、バイオチップ基板２の周縁部を二方向から抑えることにより、バイオチップ基板２を固定し保持することができるものである。

本発明においては、ストッパーがバイオチップ基板のバリを避ける構造を有していることが必要である。バイオチップ基板のバリとは、バイオチップ基板の端面に生じる突起を意味し、射出成形をはじめとする金型を使用した成形方法による作製の際に、金型の隙間に対応して発生することが多い。バリの発生する位置は、用いる金型の種類によって異なるが、平板状のバイオチップ基板を用いる場合には、その端面に発生し、特に、図２に示すように、バリ２１は、バイオチップ基板２の周縁部端面に発生することが多い。

本発明においては、ストッパーが、上述のようにバイオチップ基板のバリを避ける構造を有することにより、バリの影響によるバイオチップ基板へのスポットの際のスポット位置のずれを防ぐことができる。
バリを避ける構造とは、上述したバイオチップ基板のバリが発生しやすい部分、例えばバイオチップ基板の周縁部端面に、ストッパーが接触しない構造を意味する。

バリを避ける構造として、例えば、ストッパーの突き当て面に溝を設ける構造を挙げることができる。溝の位置は、突き当て面にバイオチップ基板を突き当てた際にバリが接触する可能性のある部分に設けることができる。特に、バリの発生しやすいバイオチップ基板の周縁部端面が突き当たる箇所に溝を設けることが好ましい。この場合、ストッパーの突き当て面の高さをバイオチップ基板の周縁部端面高さよりも高く設定し、周縁部端面高さ部分に溝を設けることとなる。溝の幅、長さなどのサイズは、バイオチップ基板のバリに接触しないようなサイズで適宜設定することができるが、好ましくは、ストッパーの長さ方向に連続する幅０．１ｍｍ〜１ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ〜０．５ｍｍ、奥行き０．０１ｍｍ〜１ｍｍの溝、好ましくは０．１ｍｍ〜０．５ｍｍとすることができる。また、溝の高さは、バイオチップ基板の高さによって適宜設定することができ、通常は、底面から０．５ｍｍ〜５ｍｍの高さの部分に底面と水平に設けることができる。
具体例を図３の断面図で説明すると、ストッパー１の突き当て面１２に断面凹字型の溝１３を形成する。溝の断面形状は、バイオチップ基板のバリに接触しない構造であれば図３のような凹字型に限定されず、半円型、多角形型等であっても良い。

一方、バリを避ける構造として、ストッパーの突き当て面の高さを調整し、バイオチップ基板の端面高さ未満とすることもできる。具体的には、図４に示すように、バイオチップ基板２のバリ２１の位置がストッパーの突き当て面１２の上端１４より高い位置に来るように、ストッパーの突き当て面１２の高さＨ１をバイオチップ基板の周縁部の高さＨ２よりも低くなるように調節することができる。ストッパーとバイオチップ基板の間の高さの差は、バイオチップ基板のサイズ、及びバイオチップ基板におけるバリの位置等を勘案して適宜設定することができるが、例えば、０．０１ｍｍ〜３ｍｍ、好ましくは、０．２ｍｍ〜１ｍｍとすることができる。

本発明においてバイオチップ基板とは、バイオチップの材料を意味し、プラスチック製であることが必要である。ここでプラスチックとしては、特に限定されないが、ポリエチレンテレフタレート、酢酸セルロース、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、環状ポリオレフィン、シリコーンゴム等のポリマーなどを挙げることができる。この中でも、ポリメチルメタクリレート、ポリスチレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）エラストマーを特に好ましく用いることができる。

バイオチップ基板の形状は、通常、平板状である。平板状の基板の場合、その端面、特に周縁部端面にバリが発生していることが多いが、バリが発生していないものも本発明の対象とすることができる。
特に本発明の対象として、表面に凹凸部を有する凹凸型基板であることが好ましい。凹凸型基板の具体例は、図５に示すように、凸部２３及び凹部２４を備える凹凸部２２と、平坦部２５とを備える形のものが挙げられる。

バイオチップ基板は、各種製法にて製造することができる。例えば、射出成形法、射出圧縮法等の金型を用いる成形方法等により成型することができる。特に、金型を用いる成形方法により製造されたものは、バリが出やすいため、本発明の目的に鑑みてもっとも好ましい。
成型されたバイオチップ基板は、選択結合性物質をその表面に固定化するのに先立ち、必要に応じて各種の表面処理を施すことができる。かかる表面処理としては、具体的には例えば特開２００４−２６４２８９号公報に記載されるものなどを挙げることができる。

本発明において、選択結合性物質とは、被検物質と直接的又は間接的に、選択的に結合し得る各種の物質を意味する。バイオチップ基板の表面に結合しうる選択結合性物質の代表的な例としては、核酸、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質を挙げることができる。
核酸としては、ＤＮＡやＲＮＡでも良く、またＰＮＡでも良い。特定の塩基配列を有する一本鎖核酸は、該塩基配列又はその一部と相補的な塩基配列を有する一本鎖核酸と選択的にハイブリダイズして結合するので、本発明でいう「選択結合性物質」に該当する。

本発明において、バイオチップ基板に固定化できる選択結合性物質（例えば核酸）は、データとして必要なものを適宜選択することができるが、単なるダミーの選択結合性物質であっても良い。また、バイオチップ基板として凹凸型基板を用いる場合には、すべての凸部上面に選択結合性物質を結合する必要は無く、何も固定化していない凸部上面を有していても良い。

本発明の製造方法について、バイオチップ基板として凹凸型基板を用いる場合の例を挙げて説明する。
まず、原料であるプラスチック製のバイオチップ基板を用意し、基板をストッパーに衝止する。尚、適当なステージの周囲にストッパーを設ける形として、ステージ上にストッパーに衝止する形でバイオチップ基板を置いても良い。
次に、ＤＮＡ断片等の選択結合性物質を水性媒体に溶解あるいは分散した水性液を、バイオチップ基板の表面に滴下して点着（スポット）する。凹凸部を有する凹凸型基板の場合は、凸部上面に選択結合性物質を点着することが望ましい。
凸部上面に、選択結合性物質を点着する方法としては、特表平１０−５０３８４１号公報に示されるような、ピンを用いる方法でも良いし、いわゆるインクジェット方式も好ましく用いることができる。

本発明の製造方法により得られるバイオチップ（分析チップ）は、被検物質を分析するための各種用途にて利用することができる。
本発明において、バイオチップとは、被検物質が含まれる溶液を当該チップにアプライし、被検物質の存在の有無や、被検物質の量や、被検物質の性状等を測定するために用いるチップをいう。具体的には、バイオチップ表面に固定化された選択結合性物質と被検物質との反応により、被検物質の量や、被検物質の有無を測定するバイオチップが挙げられる。より具体的には、核酸を基板表面に固定化したＤＮＡチップ、抗体に代表されるタンパク質を基板表面に固定化したタンパク質チップ、糖鎖を基板表面に固定化した糖鎖チップ、及び基板表面に細胞を固定化した細胞チップ等が挙げられる。

本発明の製造方法において、バイオチップ基板として凹凸型基板を用いて、凹凸部を構成する凸部表面に選択結合性物質を点着して製造されたバイオチップは、被検物質を接触させて選択的に結合させ、前記バイオチップ上に前記選択結合性物質を介して結合した前記被検物質量を測定することにより、被検物質の分析に供することができる。また、このバイオチップの凹凸部の凹部に移動可能に格納された微粒子を更に含むことにより、被検物質が含まれる溶液をアプライした後に分析チップを揺動、回転等させることで、空隙内で微粒子（ビーズ、マイクロロッド）を運動させ、検体溶液と本発明のバイオチップとの十分な撹拌を達成し、より精密な分析を行うことができる。更に、得られるバイオチップに該チップの表面を覆い前記チップと接着されるカバー部材を更に備えることにより、被検物質が含まれる溶液や微粒子を簡便に封入し密閉保持することができ、その結果、被検物質と、チップに固定化された選択結合性物質との反応を、安定して行うことができる。

本発明のバイオチップを用いた測定方法に供せられる被検物質としては、測定すべき核酸、例えば、病原菌やウイルス等の遺伝子や、遺伝病の原因遺伝子等並びにその一部分、抗原性を有する各種生体成分、病原菌やウイルス等に対する抗体等を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。また、これらの被検物質が含まれる検体としては、血液、血清、血漿、尿、便、髄液、唾液、各種組織液等の体液や、各種飲食物並びにそれらの希釈物等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。更に、標識した抗体又は抗原を反応させ、チップに結合した標識を測定することもできる。

以上説明したように、本発明によれば、ＤＮＡ等の選択結合性物質を、バリの出やすいプラスチック製基板に点着するにあたり、正確なスポット位置への点着が可能であることから、被験物質を正確に且つ安定して検出することができるバイオチップを効率良く製造することができる。

本発明を以下の実施例によって更に詳細に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

参考例１（基板の作製）
公知の技術であるＬＩＧＡ（Lithographie Galvanoformung Abformung）法により、図６−１〜図６−４に示すカーボンブラックを含有したポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）製の射出成形基板を作製した。すなわち、図６−１及び図６−２に示す基板の場合、基板の外形は７５×２５×１ｍｍであり、その中心部に凸部の集団からなる３２個のサブブロックが存在する。そのサブブロック中には、直径０．１ｍｍの凸部がピッチ０．２４５ｍｍで、１７×１７の格子状に配置されている。基板全体には１７×１７×３２＝９２４８個の凸部が設けられている。また、サブブロック間は０．４８ｍｍのスペースが設けられている。さらに、凸部上面と底面との距離（深さ）は０．１ｍｍとなっている。一方、図６−３及び図６−４に示す基板の場合、サブブロックを有しないほかは上述の基板と同様に作製した。
なお、この基板の上端面の周りには、高さ３０μｍ〜１５０μｍのバリがあることが認められた。

（スポット液の調製および検出）
Ｃｙ３−ｄＣＴＰ（アマシャムファルマシアバイオテク製；製品番号ＰＡ５３０２１）を１０ｐＭの濃度で純粋にとかし、これをスポット溶液とした。また、凸部上面の蛍光検出は、ＤＮＡチップ用のスキャナー（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社のＧｅｎｅＰｉｘ ４０００Ｂ）を用いて行った。

実施例１
図７に示すような、ストッパーを有するステージを作製した。これをピン方式のスポッターに装着した。この時のストッパーの形状を図８に示す。ステージには１枚の基板がセット可能であった。まず、１枚の基板について、スポッターに基板を衝止し、すべての凸部の上面に完全にスポット可能なようにスポッターの調整（条件決め）を行った。その後に、１０枚の基板を同一の条件でスポッターに基板を衝止し、連続でスポットした。その結果、何れの基板でも、全ての凸部について蛍光が検出され、正常にスポットできていることが確認できた。
また、ストッパーの形状を図９に示すような形とした場合も同様な結果が得られた。

比較例１
図９に示すようなストッパーの形状を有するスポッターを用いた以外は、実施例１と同様な実験を行った。そのところ、１０枚の内、５枚しか正常にスポットできていなかった。不良の基板のスポット形状は、三日月状であったり、全くスポットされていないものもあった。これは、基板毎にバリの大きさが違うため、正確な位置に基板をセットできないためである。

図１は、本発明の製造方法に用いられるストッパーにバイオチップ基板を突き当てた状態の一例を示す斜視図である。 図２は、本発明におけるバイオチップ基板の一例を端面方向から見た図である。 図３は、本発明におけるストッパーの一例を概略的に示す図である。 図４は、本発明におけるストッパーの一例を概略的に示す図である。 図５は、本発明のバイオチップの一例を概略的に示す斜視図である。 図６−１は、実施例及び比較例で用いた第１の基板を表面上方より見た概略図である。 図６−２は、実施例及び比較例で用いた第１の基板の縦断面図である。 図６−３は、実施例及び比較例で用いた第２の基板を表面上方より見た概略図である。 図６−４は、実施例及び比較例で用いた第２の基板の縦断面図である。 実施例１に用いたストッパーの形状を示す図である。 実施例１に用いたストッパーの形状を示す断面図である。 比較例１に用いたストッパーの形状を示す断面図である。

符号の説明

１ ストッパー
１１Ａ、１１Ｂ 直方体部材
１２ 突き当て面
１３ 溝
１４ 上端
２ バイオチップ基板
２１ バリ
２２ 凹凸部
２３ 凸部
２４ 凹部
２５ 平坦部
Ｈ１ ストッパーの突き当て面の高さ
Ｈ２ バイオチップ基板の高さ
３ ステージ

Claims (6)

1. プラスチック製のバイオチップ基板の端面をストッパーに衝止して、基板を保持し、バイオチップ基板上の所望の位置に選択性結合物質を点着してバイオチップを製造する方法であって、前記ストッパーは、バイオチップ基板のバリを避ける構造を有していることを特徴とするバイオチップの製造方法。
2. ストッパーの突き当て面に溝が設けられてなることを特徴とする請求項１記載のバイオチップの製造方法。
3. ストッパーの突き当て面のバイオチップ基板の周縁部端面が突き当たる箇所に、溝が設けられてなることを特徴とする請求項１または２に記載のバイオチップの製造方法。
4. ストッパーの突き当て面の高さが、バイオチップ基板の端面の高さ未満であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
5. バイオチップ基板は、射出成形により作製されたものであることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。
6. バイオチップ基板は、表面に凹凸部を有する凹凸型基板であり、前記凹凸部を構成する凸部表面に選択結合性物質を点着してバイオチップを製造することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載のバイオチップの製造方法。

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